ES2322432T3

ES2322432T3 - Nuevo anticuerpo, inmunoensayo y procedimiento para la deteccion del cancer de protasta.

Info

Publication number: ES2322432T3
Application number: ES01972118T
Authority: ES
Inventors: Kim Pettersson; Hans Lilja; Timo Lovgren; Pauliina Niemela
Original assignee: Arctic Partners Oy AB
Current assignee: Arctic Partners Oy AB
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2009-06-22
Anticipated expiration: 2021-09-26
Also published as: US7872104B2; WO2002027323A1; ATE425460T1; US20040101914A1; DE60137949D1; AU2001291911A1; EP1320756B1; EP1320756A1; JP5254517B2; FI20002127A0; JP2004509934A

Abstract

Anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se enlaza con afinidad elevada a formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no escindidas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA), caracterizado porque dicho anticuerpo, que se puede obtener por inmunización con una forma no disociada de PSA y que se selecciona por su reactividad diferencial con las formas intactas y escindidas interiormente, no se enlaza a un PSA cortado (PSA-N) escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, en el que dicho PSA-N se ha formado mediante escisión o escisiones de enlaces peptídicos internos de SCINT PSA, dando lugar a PSA de doble cadena o multicadena.

Description

Nuevo anticuerpo, inmunoensayo y procedimiento para la detección del cáncer de próstata.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inmunorreactivos de afinidad elevada que son específicos para la forma o formas de una sola cadena intactas (es decir, no escindidas internamente) del antígeno específico de la próstata (PSA o hK3). Asimismo, se refiere a la diferenciación de hombres afectados por cáncer de próstata y hombres sanos asintomáticos o de condiciones prostáticas benignas mediante un inmunoensayo analíticamente sensible, utilizando los inmunorreactivos mencionados anteriormente, para la determinación específica de la forma o formas de una sola cadena, intactas (no escindidas internamente) de PSA libre, no complejado (SCINT PSA libre), o combinando el resultado de dicho inmunoensayo con inmunoensayos que miden cualquier otra forma de kallicreínas prostáticas, PSA o hK2, ya sea formando diversos cocientes de los mismos o combinándolos con otros elementos, por ejemplo utilizando regresión logística y/o redes neuronales artificiales. La presente invención puede ser utilizada para la detección del cáncer de próstata tanto en el análisis de individuos asintomáticos como a la hora de distinguir el cáncer de otras condiciones benignas en hombres que presentan síntomas clínicos (por ejemplo, síntomas del tracto urinario inferior, LUTS). Además, la presente invención se puede utilizar para mejorar la división en etapas y la clasificación del cáncer de próstata, así como para proporcionar medios mejorados para detectar la recurrencia del cáncer en una etapa temprana y para proporcionar medios mejorados para controlar la respuesta terapéutica en diversas etapas de la enfermedad. Los especímenes biológicos adecuados para las determinaciones por inmunoensayo son principalmente suero, plasma o muestras de sangre entera, pero la presente invención también se puede aplicar a otros fluidos biológicos, tales como muestras de orina y de fluido seminal.

Antecedentes

El antígeno específico de la próstata (PSA; también designado hK3) y la kallicreína glandular humana 2 (hK2) son dos proteasas de serina relacionadas muy expresadas, principalmente en el tejido prostático. [Wang et al, Invest Urol 1979; 17: 159-163, Lilja J Clin Invest 1985; 76: 1899-1903, Chapdelaine et al, FEBS Lett 1988; 236: 205-208]. El gen del PSA está localizado en el brazo largo del cromosoma 19 y presenta >84% de identidad de secuencia de nucleótidos con la hK2. Las dos proteínas también muestran una extensa similitud en la secuencia de aminoácidos (79%), pero las relaciones de expresión son bastante diferentes (niveles de ARNm de hK2 en \sim10-20% de los niveles de ARNm de PSA) [Schedlich et al, DNA 1987; 6:429-437]. El PSA se sintetiza como una preproforma de 261 aminoácidos a partir del cual se escinde el péptido de señal de 17-21 aminoácidos y se libera en el proceso de secreción. La forma zimógena restante de PSA se activa hacia una proteasa de serina activa por escisión de propéptido de 3-7 aminoácidos [Lövgren et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997; 238; 549-555]. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que la hK2 recombinante convierte in vitro el proPSA recombinante inactivo en PSA maduro activo [Lövgren et al, Biochem Biophys Res Commun 1997; 238: 549-555, Takayama et al, J Biol Chem 1997; 272: 21582-21588, Kumar et al, Cancer Res 1997; 57:3111-3114]. En consecuencia, la hK2 es probablemente un activador fisiológico de proPSA. El PSA enzimáticamente activo se segrega en el fluido seminal en concentraciones elevadas (0,2-5 mg/ml) [Christensson et al, Eur J Biochem 1990; 194:755-763, Ahlgren et al, 1995 J Androl 16:491-498]. En el semen, el PSA degrada las proteínas formadoras de gel derivadas de la vesícula seminal semenogelina I y II, provocando la licuefacción del semen y la liberación de espermatozoides progresivamente motrices [Lilja J Clin Invest 1985; 76:1899-1903]. La acción del PSA genera la hidrólisis de los enlaces peptídicos, principalmente los C-terminales, de determinados residuos de tirosina y glutamina en semenogelina I y II [Malm et al, The Prostate 2000; en imprenta]. En cambio, la hK2 genera patrones de escisión inequívocamente diferentes en la semenogelina I y II en comparación con los generados por la acción del PSA, aunque actualmente no está claro si la acción de la hK2 sobre las proteínas de gel tiene importancia fisiológica [Lövgren et al, Eur. J. Biochem. 1999; 262; 781-789].

Se ha puesto de manifiesto que el PSA enzimáticamente activo manifiesta una especificidad de substrato única con una similitud limitada con las proteasas de tipo quimiotripsina [Lilja et al, J Biol Chem 1989; 264:1894-1900 Christensson et al, Eur J Biochem 1990; 194: 755-763, Malm et al, The Prostate 2000; en imprenta]. La forma activa de cadena única del PSA forma complejos covalentes estables con diversos inhibidores extracelulares de proteasa, tales como \alpha_{1}-antiquimiotripsina (ACT), \alpha_{2}-macroglobulina (AMG), proteína de la zona de gestación (PZP), inhibidor de proteína C (PCI), y \alpha_{1}-antitripsina (API) [Christensson et al, Eur J Biochem 1990; 194: 755-763, Stenman et al, Cancer Res 1991; 51:222-226, España et al, Thromb Res 1991; 64:309-320, Christensson y Lilja, Eur J Biochem 1994; 220:45-53, Zhang et al, Prostate 1997; 33:87-96]. En la sangre, la principal forma inmunodetectable de PSA está enlazada covalentemente, formando un complejo con ACT y únicamente una fracción menor se encuentra en una forma libre, no complejada (PSA-F) [Stenman et al, Cancer Res 1991; 51: 222-226, Lilja et al, Clin Chem 1991; 37: 1618-1625].

El LNCaP (cáncer de nódulo linfático de la próstata) es una línea celular humana de adenocarcinoma prostático metastásico que fue aislada en 1977 a partir de una biopsia de aspiración con aguja de un paciente con cáncer prostático metastásico confirmado. Se han encontrado diversas formas de PSA libre en medio de cultivo celular usado de células LNCaP. Corey et al, y Väisänen et al, han descrito células LNCaP que producen formas zimógenas de PSA (proPSA) y una forma madura intacta de PSA. Sin embargo, las células LNCaP no parecen producir ninguna forma escindida internamente de PSA, a diferencia del PSA procedente de fluido seminal, que existe parcialmente como formas enzimáticamente inactivas debido a la presencia de una o varias escisiones, principalmente entre la Lys_{145} y la Lys_{146} [Christensson et al, Eur J Biochem 1990; 194:755-763]. La forma zimógena de PSA también se ha encontrado en el suero de pacientes con cáncer de próstata. Dado que de la forma zimógena del PSA es enzimáticamente inactiva, no puede formar complejos con serpinas y es probable que permanezca en una forma libre en circulación. Existen otras referencias en sentido contrario sobre la naturaleza de la forma libre de PSA que se encuentra en el suero, las cuales afirman que es una forma escindida e inactiva que resulta de la escisión o escisiones internas, o que representa una forma madura no fragmentada pero enzimáticamente inactiva de PSA.

La incidencia de cáncer de próstata ha aumentado durante la última década, principalmente debido a la mayor esperanza de vida y al aumento de los análisis. Este hecho subraya la necesidad de enfoques diagnósticos mejorados y de nuevos tratamientos. El análisis del PSA en suero está bien establecido en la diagnosis y el control de los pacientes de cáncer de próstata (PCa) [Oesterling, J Urol 1991; 145:907-923]. Sin embargo, también se encuentran concentraciones elevadas de PSA en suero en pacientes con otras enfermedades prostáticas, por ejemplo hiperplasia benigna de la próstata (BPH) [Hudson et al, J Urol 1989; 142: 1011-1017]. El descubrimiento de diversas formas moleculares diferentes de PSA en suero ha mejorado significativamente la especificidad de la diagnosis y el control para el PCa. Los pacientes con BPH presentan proporciones más elevadas de PSA libre con respecto al total (es decir, PSA-F + PSA-ACT + otros complejos de PSA-serpina cuantitativamente menos importantes), o de PSA libre con respecto a complejado en suero, que los pacientes con PCa. Este hecho ha comportado la utilización del PSA libre con respecto al total (también designado PSA libre porcentual) a efectos de distinguir entre BPH y PCa en hombres con niveles de PSA moderadamente elevados en suero [Stenman et al, Cancer Res 1991; 51: 222-226, Christensson et al, J Urol 1993; 150: 100-105]. Aunque esto ha mejorado la especificidad para el PCa, sigue existiendo una superposición considerable entre los dos grupos de hombres y, en consecuencia, una gran necesidad de marcadores que proporcionen una discriminación aún más mejorada entre los hombres con cáncer y los hombres normales o con condiciones
benignas.

Las inmunizaciones de ratones con PSA purificado han dado lugar a la generación de anticuerpos monoclonales contra el PSA y la hK2. Muchos anticuerpos monoclonales reaccionan con el PSA y la hK2 debido a la amplia identidad en la estructura primaria de las dos proteínas. Sin embargo, nosotros et al hemos desarrollado inmunoensayos específicos que miden selectivamente el PSA libre, el PSA complejado y la hK2. Actualmente, no hay inmunoensayos disponibles que reconozcan específicamente diversas formas candidato de PSA libre.

Wang et al, (Eur. J. Biochem. vol. 267, 2000, pp 4.040-4.045) dan a conocer un antígeno específico de la próstata asociado a la hiperplasia prostática benigna (BPSA) que presenta una inmunorreactividad única con los anticuerpos monoclonales anti-PSA.

Objetivo y sumario

El objetivo de la presente invención consiste en permitir la determinación de formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no disociadas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA) a partir de una muestra que contiene dicho antígeno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un inmunoensayo para la determinación cuantitativa de SCINT PSA en una muestra que contiene dicho antígeno.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para diferenciar pacientes con cáncer de próstata (PCa) de pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH) y/o sujetos masculinos sanos sin PCa.

De este modo, la presente invención se refiere a un anticuerpo, enlazándose dicho anticuerpo con alta afinidad a las formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no disociadas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA). El anticuerpo, que se puede obtener por inmunización con una forma no escindida de PSA y se selecciona por su reactividad diferencial con las formas intacta e internamente escindida, no se enlaza a un PSA cortado (PSA-N), escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, habiéndose formado dicho PSA-N por escisión o escisiones internas de enlaces peptídicos de SCINT PSA que resultan en PSA de doble cadena o multicadena.

La presente invención también se refiere a un inmunoensayo para la determinación cuantitativa en una muestra de formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no disociadas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA), o alternativamente formas cortadas de PSA (PSA-N) escindidas entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, en el que dicho PSA-N se ha formado mediante escisión o escisiones internas de enlaces peptídicos de SCINT PSA, dando lugar a formas de antígeno específico de la próstata (PSA) de doble cadena o multicadena, pudiendo darse el SCINT PSA o el PSA-N en forma libre y/o complejada. El inmunoensayo utiliza un anticuerpo que se enlaza con alta afinidad a dicho SCINT PSA, pero no se enlaza al PSA escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para obtener un valor de marcación útil para diferenciar pacientes con cáncer de próstata (PCa) de pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH) y/o sujetos masculinos sanos sin PCa.

\newpage

El procedimiento comprende las siguientes etapas:

a): el antígeno específico de la próstata (SCINT PSA) humano de una cadena intacto, es decir no escindido internamente, libre y/o complejado, se determina utilizando un anticuerpo según la invención, y

b): se establece un valor de marcador que es una función del SCINT PSA determinado.

Breve descripción de las tablas y dibujos

Figuras 1a-1d. Cuatro procedimientos de barrido utilizados en la búsqueda de nuevos anticuerpos anti-PSA.

Figura 2. Mapeo de epítopes de Mab nuevos y previamente caracterizados en relación entre ellos en un modelo 2-D de PSA. Los círculos superpuestos indican que los MAb no se pueden disponer en sándwich entre sí. Los círculos que contactan indican una interferencia detectable (competición) en el enlazamiento a PSA, mientras que los círculos no superpuestos indican que los MAb detectan epítopes independientes y pueden disponerse en sándwich en otros anticuerpos en los otros círculos no superpuestos. Los anticuerpos situados en círculos blancos son específicos para el PSA, mientras que los anticuerpos en los círculos negros reaccionan con la hK2. Los círculos de anticuerpo (rayados) indican los nuevos anticuerpos desarrollados en este estudio.

Figura 3. Grupos de epítopes de PSA en una estructura de modelo 3-D. Los anticuerpos que se enlazan a secuencias peptídicas lineales se mapean en este modelo. Se muestran siete dominios antigénicos independientes. Mab 5A10 se enlaza a la secuencia peptídica que consiste en los aminoácidos 84-91, Mab 2E9 aa 80-83, Mab 10 aa 150-164, Mab 3C1 y Mab 4H5 aa 1-11 (es decir, aa 3,5-6, y 8-11), y Mab H164 y Mab 2C1 aa 50-64, tal como se ha referenciado anteriormente [Piironen et al, Protein Science 1998; 7:259-69]. E73 se enlaza a la secuencia peptídica aa 215-229. El nuevo Mab 5H6 se mapea a un epítope situado muy cercano al epítope del Mab E73, ya que 5H6 estaba enlazado a la secuencia peptídica adyacente aa 225-237. Los MAb 4D4 y 5C3 estaban enlazados a la secuencia peptídica 136-144, que es un epítope antigénico previamente no reconocido en PSA. El lugar de escisión interna entre Lys145 y Lys146 también se indica en la figura, así como el lugar catalíticamente activo cercano a los epítopes del Mab 4D4 y del Mab 5C3.

Figuras 4a-4c. La reactividad de los anticuerpos con la reactividad de PSA de cada anticuerpo con una isoenzima se comparó a la reactividad mediana de todos los anticuerpos con esa isoenzima. La reactividad con la isoforma intacta A se fijó como 100%. Los grupos de anticuerpos se numeran 1-5 en base a las regiones de enlace de anticuerpos según la nomenclatura de epítopes ISOBM. Los grupos A-E se utilizaron en 1 ng/pocillo y los Eu-MAb en 50 ng/pocillo.

Figura 5. Curva estándar del ensayo de SCINT-PSA libre.

Tabla 1. Resumen de los resultados de inmunizaciones y fusiones.

Tabla 2. Resumen de características de anticuerpos.

Tabla 3. Discriminación de cánceres y no cánceres utilizando parámetros individuales o combinados en el intervalo de PSA-T por debajo de 5 \mug/ml. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo Mann-Whitney-U no paramétrico.

Tabla 4. Discriminación de cánceres y no cánceres utilizando parámetros individuales o combinados en el intervalo de PSA-T por debajo de 10 \mug/ml. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo Mann-Whitney-U no paramétrico.

Tabla 5. Discriminación de cánceres y no cánceres utilizando parámetros individuales o combinados sin restricciones en cuanto a las concentraciones de PSA-T. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo Mann-Whitney-U no paramétrico.

Descripción detallada de la invención

El diseño y desarrollo de procedimientos analíticos que se ocupen de la naturaleza de las diferentes formas de PSA libre puede añadir nueva información discriminatoria a la diagnosis del cáncer de próstata. Un anticuerpo anti-proPSA permitiría la medición específica y sensible de las formas zimógenas de la proteína. A pesar de la naturaleza altamente inmunogénica del PSA de LNCaP, fuimos incapaces de generar anticuerpos específicos o con una fuerte preferencia por el zimógeno de PSA, por ejemplo, anticuerpos que reconozcan específicamente todo el propéptido de PSA o partes del mismo. El objetivo del presente proyecto consistía en desarrollar anticuerpos anti-PSA contra diversas formas de PSA producidas por la línea celular LNCaP del cáncer metastásico y emplear dichos anticuerpos en inmunoensayos a efectos de proporcionar una detección específica y mediciones cuantitativas de las concentraciones de diferentes fracciones de PSA que pueden ser enzimáticamente inactivas (y en consecuencia incapaces de formar los enlaces covalentes con los diferentes ligandos complejantes de tipo serpina, tales como ACT, AMG o API, por ejemplo, formas zimógenas de PSA {por ejemplo, proPSA}, formas maduras de una cadena inactivas, diversas formas internamente escindidas u otras formas inactivas restantes en forma no complejada en suero debido a razones todavía no identificadas).

Se da a conocer:

1. El desarrollo y producción de anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente y con una elevada afinidad la forma o formas de PSA de una cadena maduras intactas (es decir, internamente no escindidas) y/o zimógenas, pero que no reconocen formas de dos cadenas o multicadena internamente escindidas.

2. optimización de un inmunoensayo de dos lugares altamente sensible utilizando anticuerpos que reconocen selectivamente la forma o formas de una cadena, maduras intactas (es decir, internamente no escindidas) o zimógenas y combinadas con anticuerpos que reconocen PSA libre no complejado (PSA no complejado intacto de una cadena libre, o SCINT PSA). Este ensayo es aplicable a muestras de suero, plasma o sangre entera, así como a otros fluidos biológicos.

3. Aplicación de este ensayo a una población de estudio (N = 281) de muestras de suero o plasma obtenida en hombres asintomáticos con una edad comprendida entre 50 y 66 años que presentaban inicialmente una concentración de PSA total de 3 \mug/l o superior. La diagnosis del PC se basó en la biopsia sextante. Se estudió el rendimiento de este ensayo, solo o en combinación con otras formas de kallicreínas (PSA o hK2), a efectos de separar los no cánceres de los PC, y se comparó con otros procedimientos de diagnóstico establecidos.

4. Diseño de un inmunoensayo de dos lugares altamente sensible para la medición de las formas de una cadena intactas (es decir, las formas maduras y zimógenas) presentes como formas de PSA tanto libres como complejadas. Esto se alcanza utilizando anticuerpos que reconocen selectivamente la forma o formas de una cadena maduras intactas (es decir, internamente no escindidas). Estos anticuerpos se combinan con anticuerpos de enlazamiento independiente que reconocen las formas libre y complejada de PSA con igual afinidad (SCINT PSA). Este ensayo es aplicable a muestras de suero, plasma o sangre entera, así como a otros fluidos biológicos.

5. Diseño de un inmunoensayo de dos lugares altamente sensible que mide selectivamente formas de PSA internamente escindidas, independientemente de si se encuentran en forma libre o complejada de PSA (es decir, PSA cortado o PSA-N). Este diseño de ensayo utiliza primero un gran exceso de anticuerpos que reconocen selectivamente la forma o formas de una cadena maduras intactas (es decir, internamente no escindidas). Esto se lleva a cabo a efectos de inhibir o bloquear el enlazamiento del PSA de una cadena intacto por parte de otro anticuerpo que se enlace al PSA en un epítope que se superpone con el definido por el primer anticuerpo bloqueante. Tras la adición de un anticuerpo superpuesto de este tipo (utilizado para la detección o captura), se añade un tercer anticuerpo de enlace independiente adecuado como pareja de disposición en sándwich con el segundo anticuerpo, a efectos de completar la inmunorreacción. Debido al diseño del ensayo, únicamente se medirá el PSA que está internamente escindido en Lys145-Lys146, independientemente de si se encuentra en forma libre o complejada.

La presente invención se refiere al desarrollo de inmunorreactivos de alta afinidad específicos para SCINT PSA. Utilizando dichos anticuerpos de alta afinidad, la presente invención también se refiere al establecimiento de inmunoensayos muy sensibles, altamente específicos para las mediciones de la concentración de SCINT PSA libre y SCINT PSA que se debe utilizar a efectos de discriminar los hombres con cáncer de próstata de los hombres sanos asintomáticos o de los que presentan condiciones prostáticas benignas. La presente invención puede ser utilizada para la detección de PCa tanto en el análisis de individuos asintomáticos como a la hora de distinguir el cáncer de otras condiciones benignas en hombres que presentan síntomas clínicos (por ejemplo, síntomas del tracto urinario inferior, LUTS). Además, la presente invención se puede utilizar para mejorar la división en etapas y la clasificación del cáncer de próstata, así como para proporcionar medios mejorados para detectar la recurrencia del cáncer en una etapa temprana y para proporcionar medios mejorados para controlar la respuesta terapéutica en diversas etapas de la enfermedad.

Según la presente invención, se pueden desarrollar anticuerpos monoclonales específicos que detecten la forma o formas de una cadena maduras intactas (es decir, internamente no escindidas) y/o zimógenas de PSA con una elevada afinidad. Un análisis más detallado de dichos anticuerpos muestra que son incapaces de reconocer una forma de dos cadenas de PSA que presenta una escisión interna entre Lys145 y Lys146. Esta forma constituye una forma cortada (es decir, internamente escindida) común de PSA en plasma seminal, así como en la circulación.

Según la presente invención, se pueden llevar a cabo inmunoensayos que detectan específicamente el SCINT PSA libre en muestras de suero, plasma y sangre entera, así como en otros fluidos biológicos, tales como orina o plasma seminal, obtenidos de los individuos investigados. Además, la diferencia calculada entre SCINT PSA libre y PSA-F proporcionará otro parámetro importante sobre el PSA cortado (PSA-N).

Tal como se ha mencionado anteriormente, el acceso a los anticuerpos monoclonales específicos para SCINT PSA también proporciona una oportunidad, descrita en la presente invención, para diseñar un inmunoensayo en el que el PSA cortado se puede cuantificar específicamente bloqueando completamente el SCINT PSA con ayuda de los anticuerpos específicos para SCINT PSA reivindicados en la presente invención, y a continuación proseguir con la detección de las formas de PSA cortado mediante la utilización de anticuerpos de PSA que ya no reaccionan con las formas de PSA intactas libres o intactas complejadas. Un diseño de este tipo permite que el PSA cortado (ya sea libre o complejado) se mida sin la utilización de anticuerpos de PSA libre.

Según los descubrimientos esenciales de la presente invención, la utilización del inmunoensayo específico para SCINT PSA libre como eficiente marcador tumoral se puede llevar a cabo utilizando SCINT PSA libre o únicamente el PSA-N calculado, o utilizando cualquiera de estos parámetros en combinación con cualquiera de las diferentes formas de PSA libre, complejado y total, y/o de hK2 (por ejemplo, PSA total o hK2 total, PSA complejado o hK2 complejada, cualquier inhibidor específico de proteasa en complejo con PSA o cualquier inhibidor específico de proteasa en complejo con hK2, concentraciones totales de PSA libre [es decir, formas de una cadena maduras intactas y zimógenas + diversas formas de dos cadenas o multicadena internamente escindidas] o concentración total de hK2 libre, y/o diversas formas de dos cadenas o multicadena internamente escindidas de PSA libre, o diversas formas de dos cadenas o multicadena internamente escindidas de hK2 libre).

Según otro aspecto de la presente invención, la combinación de SCINT PSA libre, SCINT PSA o PSA-N con otras formas medidas de PSA se puede llevar a cabo formando diversos cocientes o algoritmos de los parámetros medidos, tales como:

el cociente entre SCINT PSA libre o PSA-N y PSA libre total;

el cociente entre SCINT PSA libre o PSA-N y PSA total;

el cociente entre SCINT PSA libre dividido por la concentración total de PSA libre multiplicado por el cociente de PSA total dividido por la concentración total de PSA libre;

el cociente entre SCINT PSA libre dividido por la concentración total de PSA libre multiplicado por el PSA total;

o alternativamente mediante:

la utilización de análisis de regresión logística de los diversos parámetros medidos en análisis de características operativas del receptor (ROC);

la utilización de diversos enfoques de inteligencia artificial, tal como redes neuronales artificiales.

Según otro aspecto de la presente invención, la misma se aplica preferentemente a un subconjunto de muestras de pacientes caracterizados principalmente por niveles moderadamente elevados de PSA total o complejado, es decir concentraciones de PSA en las que la discriminación diagnóstica de las condiciones cancerígena y no cancerígena únicamente a través del PSA total o complejado es menos fiable, y en las que los cánceres detectados son con mayor probabilidad confinados a órganos y seleccionables para tratamientos curativos. Este área se define frecuentemente como intervalos de PSA totales de 3 ó 4 a 20 \mug/l, pero se puede definir diferentemente tanto por lo que respecta al límite inferior (que puede ser incluso menor, por ejemplo de 2,0 ó 2,5 \mug/l) como al límite superior (que puede ser incluso mayor o menor, por ejemplo de 8,0, 10, 12 ó 15 \mug/l).

Según otro aspecto de la presente invención, las concentraciones de SCINT PSA o PSA-N individuales o en combinación con otros parámetros medidos, por ejemplo utilizando diversos cocientes, análisis por regresión logística o inteligencia artificial, también se pueden utilizar para identificar subgrupos de los pacientes de cáncer de próstata identificados, más específicamente para diferenciar los cánceres de próstata con una elevada probabilidad de permanecer indolentes o de progresar lentamente de aquellos cánceres con una elevada probabilidad de progresar más agresivamente. Otras aplicaciones clínicas de la presente invención se pueden referir a la discriminación entre una enfermedad patológicamente confinada a órgano y etapas de la enfermedad con extensión extraprostática, ya sea enfermedad localmente avanzada o metastásica. Aún otra aplicación clínica de la presente invención se puede referir a la detección de una recurrencia temprana del cáncer tras los procedimientos de tratamiento curativo, o para proporcionar medios mejorados para controlar la respuesta terapéutica en diversas etapas de la
enfermedad.

Se utilizaron diferentes estructuras inmunogénicas para desarrollar anticuerpos monoclonales contra diferentes formas de PSA libre; (i) PSA purificado por afinidad de células LNCaP en las que la mitad de la proteína fue recuperada en forma madura de una sola cadena, y la otra mitad fue recuperada en la forma zimógena -5 ó -7. La segunda estructura inmunogénica consistía en un péptido sintético de 14 aminoácidos que incluía la prosecuencia de PSA y los siete primeros aminoácidos amino terminales (APLILSRIVGGWEC) conjugado con KLH Y BSA. Se utilizaron diversos procedimientos de barrido a efectos de identificar anticuerpos que detectan el PSA aislado de células LNCaP con una intensidad de señal distinta del PSA procedente de plasma seminal.

La caracterización de los grupos de epítopes de PSA en una estructura de modelo 3-D utilizando anticuerpos que se enlazan a secuencias de péptidos lineales mostró que el nuevo Mab 5H6 se mapeaba a la secuencia peptídica aa 225-237, que es muy similar al epítope de Mab E73 previamente caracterizado. Los MAb 4D4 y 5C3 se enlazaron a la secuencia peptídica 136-144. Este es un epítope antigénico previamente no reconocido sobre PSA que es adyacente al lugar de escisión interno entre Lys145 y Lys146, así como al lugar catalíticamente activo cercano a los epítopes de Mab 4D4 y Mab 5C3. Los MAb 4D4, 5C3, y 5H6 reconocían el PSA libre y el complejo PSA-ACT con una afinidad similar, pero no reconocían la hK2.

Los MAb 4D4 y 5C3 tenían constantes de afinidad de 2,5 x 10^{9} 1/M y 2,7 x 10^{9} 1/M, respectivamente, para proPSA y para formas intactas de PSA. Reconocieron un PSA en plasma seminal significativamente menor que proPSA, y la cantidad de MAb 4D4, 5C3 enlazados a fracciones que contienen principalmente (95%) PSA escindido internamente en Lys145-Lys146 fue únicamente del 5% en comparación con la cantidad de anticuerpo enlazado a los grupos que contenían únicamente PSA intacto.

A continuación, la presente invención se describe con mayor detalle mediante la siguiente sección experimental.

\vskip1.000000\baselineskip

Sección experimental Procedimientos y materiales Reactivos e instrumentación

Se obtuvieron adyuvantes completos e incompletos de Freund a través de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se obtuvieron placas de 96 pocillos de cultivo celular a través de Nunc (Dinamarca), botellas de cultivo rotatorias a través de Corning (NY) y biorreactores Celline a través de Integra (Alemania). Optimem 1 con Glutamax-1 y suplemento HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) son productos de Life Technologies (Gibco BRL, Escocia). El suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor era de Hyclone (Logan, UT). Las células de mieloma de ratón Sp 2/0 se obtuvieron a través de ATCC (Rockville, MD). El péptido sintético de proPSA -7 a +7 era del Dr. Hans Lilja (Universidad de Lund, Malmö, Suecia). El fluorómetro 1234 Delfia Plate, el kit Delfia Eu-labelling, las placas de microtitulación recubiertas con IgG anti-ratón de conejo, Mab H117 anti-PSA, Mab 2E9 anti-PSA o estreptavidina, el tampón de Delfia Assay, la solución de lavado y la solución de refuerzo eran de PerkinElmer Life Sciences (Turku, Finlandia). La columna de afinidad HiTrap Protein G, la columna Superose 12 HR 10/30 FPLC para filtración en gel, el intercambiador PBE 94 Polybuffer y Polybuffer 96 para la cromatofocalización eran de Amersham Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Suecia). Los análisis de secuencia amino terminal se llevaron a cabo con un secuenciador líquido de pulsos Applied Biosystems modelo 477A conectado con un analizador de aminoácidos de feniltioidantoina on line Applied Biosystems modelo 120A (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Los anticuerpos monoclonales 5A10, 2E9, 2H11, 3C1, 4H5 y 2C1 han sido caracterizados previamente. Los MAb 66 y 10 fueron donados amablemente por el Dr. O. Nilsson (CanAg Diagnostics, Göteborg, Suecia). Los MAb H117, H179, H164 y H50 se obtuvieron a través de Abbott (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). El anticuerpo E73 fue donado amablemente por la Dra. Elisabeth Paus (The Radium Hospital, Oslo, Noruega).

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunogenes

Se utilizaron tres estructuras inmunogénicas diferentes a efectos de desarrollar anticuerpos contra las formas libres de PSA. Previamente, el PSA de LNCaP había sido purificado mediante cromatografía de afinidad a partir de medio de cultivo celular utilizado. Aproximadamente la mitad de la proteína se encontraba en forma de PSA madura de una sola cadena, y la otra mitad se encontraba en la forma zimógena -5 ó -7. La segunda estructura inmunogénica consistía en un péptido sintético de 14 aminoácidos que incluía la prosecuencia de PSA y los siete primeros aminoácidos de la secuencia amino terminal (APLILSRIVGGWEC). Este péptido se acopló a KLH y BSA utilizando el kit de conjugación Imject Immunogen EDC (Pierce, IL). Un tercer inmunogen utilizado se mutó a partir de hK2 (fXahK2) en el que se modificaron dos aminoácidos de la prosecuencia. Las mutaciones puntuales en la prosecuencia hacen a la hK2 incapaz de autoactivarse y de escindir la prosecuencia. Se utilizaron una segunda y una tercera estructuras inmunogénicas en inmunizaciones a efectos de generar anticuerpos anti-proPSA. Las inmunizaciones y fusiones con el péptido y la hK2 se llevaron a cabo esencialmente tal como se describe a continuación para PSA de
LNCaP.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunizaciones

La tabla 1 indica las inmunizaciones realizadas. Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección intraperitoneal con cantidades variables del inmunogen emulsionado con adyuvante completo de Freund (Sigma). Se administraron dosis de recuerdo en intervalos de 3-4 semanas. El tiempo total de inmunización varió de 2 a 10 meses. Se administró una dosis de recuerdo final tres días antes de sacrificar los ratones. Las células linfoides esplénicas se fusionaron con células de mieloma Sp2/0 en una relación 1:1, tal como se ha descrito anteriormente. Las células fusionadas se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo celular en Optimem que contenía 20% de suero bovino fetal y suplemento HAT.

TABLA 1 Resumen de inmunizaciones y resultados de fusiones

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimientos de barrido

Se utilizaron diversos procedimientos de barrido diferentes. Una circunstancia común a todos los procedimientos era que los mismos se diseñaron para reconocer anticuerpos que detectan el PSA producido por células LNCaP de forma diferente en algún aspecto al PSA obtenido de plasma seminal. En las figuras 1a-1d se presentan cuatro procedimientos de barrido. En todos los procedimientos, se incubaron sobrenadantes de hibridoma durante una noche a +4ºC, en pocillos de microtitulación recubiertos con anticuerpo anti-ratón de conejo (procedimientos 1, 2 y 4) o en pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina y péptido sintético biotinilado (procedimiento 3). Tras la incubación, las placas se lavaron cuatro veces. La detección del anticuerpo enlazado se lleva a cabo tal como se describe en las figuras 1a-d. Para el desarrollo de señal, se utilizaron 200 \mul/pocillo de solución de refuerzo Delfia. Las señales se midieron con un fluorómetro 1234 Delfia.

\vskip1.000000\baselineskip

Caracterización de anticuerpos

Proteínas purificadas. El PSA de LNCaP se preparó y purificó tal como describen Väisänen et al. Las formas proPSA y PSA maduro de LNCaP se separaron utilizando cromatofocalización, que separa estas dos formas en base a sus distintos valores de pI. El gradiente de pH fue de 8,5 a 6, y los tampones utilizados fueron etanolamina-CH_{3}COOH 0,025 M, pH 8,5, y Polybuffer pH 6 (dilución 1:10). La cromatofocalización se lleva a cabo utilizando 30 ml de gel intercambiador Polybuffer empaquetado en una columna C 10/40 y un sistema ÄKTAexplorer 100 (Amersham Pharmacia Biotech AB Uppsala, Suecia). La velocidad de flujo fue de 0,3 ml/min y se recogieron 3,6 ml de fracciones. Antes de recoger la fracción, se añadió 1/10 de volumen de Tris-HCl 2 M de pH 8 a cada tubo de fracción. En cada fracción se midió la concentración de PSA utilizando el kit Prostatus de PSA libre/total (PerkinElmer Life Sciences, Turku, Finlandia). Las fracciones que contenían PSA de un área de pico se agruparon y se sometieron a secuenciación amino terminal.

Los grupos separados de PSA de plasma seminal purificado fueron donados generosamente por el Dr. U-H Stenman. Los grupos A, B, C, D y E contienen diferentes cantidades de PSA escindido internamente, tal como describen Zhang et al. Los grupos A y B contienen únicamente PSA intacto. Los grupos C y D contienen una forma intacta de PSA y formas de PSA que se han escindido internamente en Arg85-Phe86 y Lys145-Lys146. Así, el grupo D contenía una parte menor de PSA escindido entre Lys182-Ser183. El grupo E contenía principalmente una forma escindida internamente en Lys145-Lys146. Las intensidades de tinción en SDS-PAGE sugerían que la cantidad de PSA intacto en los grupos C, D y E fue de aproximadamente 20%, 10% y menos del 5%, respectivamente.

La hK2 fue producida con el sistema de expresión de baculovirus y se purificó tal como describen Lövgren et al. La preparación y purificación de PSA-ACT in vitro han sido descritas anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Mapeo de epítopes

Los MAb caracterizados anteriormente se utilizaron en ensayos de sándwich en todas las combinaciones posibles con los MAb investigados a efectos de determinar los lugares de enlace sobre la molécula de PSA.

\vskip1.000000\baselineskip

Mapeo de péptidos

Se utilizaron péptidos sintéticos de 15 mer que se superponían a la secuencia completa de PSA para la determinación de los lugares de enlace específicos de los anticuerpos que reconocen epítopes continuos. Se incubaron MAb marcados con europio con péptidos biotinilados enlazados a placas de estreptavidina, tal como describen Piironen et al.

\vskip1.000000\baselineskip

Especificidad y enlace a diversas formas de PSA

Utilizando un anticuerpo pareja adecuado, se determinó la especificidad de los nuevos MAb utilizando complejo de PSA, hK2 y PSA-ACT. Además, el enlace de diversas formas de PSA se determinó utilizando los grupos A, B, C, D y E de PSA purificado a partir de plasma seminal, tal como describen Zhang et al, y utilizando proPSA purificado a partir de PSA de LNCaP, tal como describen Väisänen et al.

\vskip1.000000\baselineskip

Afinidad de los MAb

Las constantes de afinidad de los MAb marcados con Eu se determinaron tal como se ha descrito anteriormente, utilizando 2E9 o H117 como anticuerpos capturadores y PSA purificado a partir de plasma seminal o hK2 purificada. Las afinidades se calcularon utilizando el procedimiento Scatchard.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunoensayos

Se desarrolló un protocolo de inmunoensayo de dos lugares para la determinación específica de SCINT-PSA libre. El diseño utilizaba (i) Mab 5C3 que se mapeaba en un epítope que contenía la secuencia peptídica aa 136-144 en PSA, que (ii) se combinó con un Mab específico libre previamente caracterizado (5A10) que se mapeó en un epítope que contenía la secuencia peptídica aa 84-91. Se inmovilizaron preparaciones biotiniladas de Mab 5C3 en placas recubiertas con estreptavidina utilizando 200 ng de Mab en 200 \mul de tampón de ensayo en una incubación de 60 min a temperatura ambiente. Tras una etapa de lavado para eliminar el Mab biotinilado no enlazado, se añadieron 50 \mul de estándar o de muestra por pocillo, seguidos de 100 \mul de tampón Delfia, y se incubó a temperatura ambiente durante 60 min con agitación continua. Tras lavar dos veces, se añadieron 100 \mul de tampón de ensayo Delfia que contenían 100 ng de Mab 5A10 marcado con Eu por pocillo y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con agitación continua. Tras un lavado final (6x), se añadieron 200 \mul de solución de refuerzo Delfia por pocillo. Tras agitar durante 5 min, se midió la señal en un fluorómetro 1232 Delfia Plate. Las concentraciones de las muestras desconocidas se calcularon a partir de un conjunto de estándares (0,05 a 200 \mug/l de PSA) de proPSA producido por baculovirus recombinante.

Otros inmunoensayos utilizados fueron: Delfia ProStatus F/T PSA (de Perkin-Elmer, Wallac, Turku, Finlandia), y un ensayo de investigación para hK2 [Becker et al, Clin Chem 2000;46:198-206].

\vskip1.000000\baselineskip

Población de estudio clínico

La población de estudio consistía en doscientos noventa y un (291) hombres, con una edad de 51-66 años, que participaron en un estudio de barrido de cáncer de próstata basado en la población en la zona de Goteborg, Suecia, y que presentaban inicialmente una concentración de PSA total > 3 \mug/l [Becker et al, Urology 2000; 55:694-699]. Antes de llevar a cabo DRE, TRUS y una biopsia sextante guiada por TRUS, se obtuvieron muestras adicionales de suero y de plasma EDTA. Tras la coagulación (suero) y la centrifugación llevadas a cabo dentro de las 3 horas posteriores a la venipunción, las muestras se congelaron a 70ºC. Para este estudio, se utiliza la muestra de plasma EDTA, que se descongeló inmediatamente antes de llevar a cabo los inmunoensayos. Las biopsias sextantes revelaron la existencia de cáncer de próstata en 79 hombres de los 291 estudiados.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis estadísticos

las estadísticas descriptivas se dieron como medianas, cuartiles superiores y cuartiles inferiores (percentiles 25 y 75). Se llevaron a cabo ensayos no paramétricos de Mann-Whitney a efectos de analizar si existía diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) en PSA-T, PSA-F, SCINT-PSA libre, PSA-N, hK2, hK2/PSA-F, PSA-F/PSA-T, SCINT-PSA libre/PSA-F, SCINT-PSA libre/PSA-T, PSA-N/PSA-T, (SCINT-PSA libre/PSA-F) x PSA-T, (SCINT-PSA libre/PSA-F) x PSA-T x hK2, (SCINT-PSA libre/PSA-F)/(PSA-F/PSA-T) entre los dos grupos de pacientes (afectados y no afectados por cáncer). Este análisis se llevó a cabo tanto en el material total de pacientes como para diversos subgrupos seleccionados según el intervalo de PSA-T.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip0.900000\baselineskip

Resultados Inmunizaciones y barridos

El objetivo era encontrar nuevos anticuerpos que reconocieran diversas formas moleculares de PSA específicamente presentes en el cáncer. Los anticuerpos que dieron una señal positiva muy elevada o reconocieron las formas ensayadas de PSA procedentes de LNCaP diferentemente al PSA procedente del fluido seminal fueron producidos y caracterizados adicionalmente. La tabla 1 indica las inmunizaciones llevadas a cabo, el número de líneas celulares positivas a PSA y los MAb que se caracterizaron adicionalmente de cada fusión. Todos los MAb caracterizados finalmente procedían de fusiones en las que el PSA de LNCaP se utilizó como inmunógeno. Algunas líneas celulares procedentes de fusiones peptídicas fueron positivas para el péptido sintético, pero el análisis posterior mostró que los anticuerpos no reconocían la molécula entera de PSA. También se obtuvieron líneas celulares positivas a anti-PSA a partir de fusiones fXahK2, pero dichos anticuerpos no pudieron distinguir el PSA de LNCaP del PSA de plasma seminal, y en consecuencia no se caracterizaron adicionalmente.

Características de los anticuerpos

Mapeo de epítopes. Los nuevos MAb se analizaron con diversas combinaciones de anticuerpos a efectos de definir su lugar de enlazamiento sobre la molécula de PSA. En base a los resultados, se construyó un mapa de epítopes en 2-D (figura 2). Los lugares de enlazamiento de los nuevos MAb de anti-PSA se presentan en relación con los MAb previamente caracterizados.

Diversas regiones de enlazamiento de 83 anticuerpos monoclonales anti-PSA han sido descritas por Paus et al en el estudio ISOBM, en el que las regiones de enlazamiento de 1 a 6 se mapean en un modelo 2-D y 3-D. Las regiones de enlazamiento de los nuevos anticuerpos anti-PSA se compararon con los lugares de enlazamiento de los MAb previamente caracterizados.

5F12 se mapeó en anticuerpos específicos de PSA libre del grupo I que se enlazaban al mismo epítope que el Mab 5A10 (#25) previamente caracterizado en el estudio ISOBM. Interesantemente, 5F12 también bloqueó el enlazamiento Mab PSA10 (#72), que pertenece al grupo de anticuerpos 3a. 7G1 se enlazó a un epítope cercano a H50 (#57) y PSA10 en el grupo de anticuerpos 3a. Además, 7G1 también se vio ligeramente inhibido por el anticuerpo 2H11 (#41), que pertenece al grupo de anticuerpos 5b. También 5F7 y 5H6 se enlazaron a una zona superpuesta con los lugares de enlazamiento de los MAb H50 y PSA10. Además, 7C4, 4D4 y 5C3 se enlazaron a una zona cercana al lugar o lugares de enlazamiento de los MAb H164, H50 y 2H11, situada cerca del grupo de anticuerpos 5b.

Mapeo de péptidos. Tres de siete MAb analizados se enlazaron a péptidos lineales biotinilados de 15 mer que se superponían con la secuencia entera de PSA (tabla 1).

Los anticuerpos 4D4 y 5C3 se enlazaron a las secuencias peptídicas de 15 mer 130 ASGWGSIEPEEFLTP 144 y 136 SIEPEEFTLTPKKLQC 149. La secuencia de aminoácidos común para estos dos péptidos superpuestos de 15 mer es la secuencia 136 SIEPEEFLTP 144. Un lugar de escisión de PSA interno común está situado entre los aminoácidos Lys145 y Lys146, cosa que vuelve inactivo el PSA.

5H6 se enlazó al péptido C-terminal de PSA (225 YRKWIKDTIVANP 237). Se ha caracterizado otro anticuerpo (E73) que se enlaza cerca de la parte C-terminal de la molécula de PSA (datos no mostrados). El Mab E73 se enlazó al péptido de 15 mer (215 RPSLYTKVVHYRKWI 229), que se superpone parcialmente con el reconocido por 5H6.

Los resultados de los estudios de enlazamiento peptídico se combinaron con los datos presentados por Piironen et al a efectos de generar un mapa de epítopes en 3-D que muestra siete dominios antigénicos independientes sobre el resto de PSA (figura 3).

Especificidad de los MAb. 5F12 era un anticuerpo específico de PSA libre. 7C4, 4D4, y 5C3 reconocieron el PSA libre y el complejo PSA-ACT con una afinidad similar, pero no reconocían la hK2. 7G1 reconocieron el PSA libre, el PSA complejado con ACT y la hK2 con una afinidad similar.

Enlace a diversas formas de PSA. El enlazamiento de nuevos MAb a diferentes formas de PSA se analizó utilizando formatos de ensayo sándwich con diferentes anticuerpos capturadores previamente caracterizados y nuevos MAb como marcadores. El enlazamiento se estudió a PSA maduro intacto, en comparación con las formas maduras de PSA internamente escindidas y con proPSA. Solo se encontraron diferencias significativas en el enlazamiento a diversas isoformas de PSA para los MAb 4D4 y 5C3.

Los clones 4D4 y 5C3 reconocieron PSA de plasma seminal con una intensidad de señal menor que proPSA utilizando el procedimiento de barrido 4. Estos anticuerpos se analizaron adicionalmente con diferentes grupos de PSA aislado a partir de plasma seminal que contenían diversas cantidades de PSA internamente escindido, es decir formas de dos o múltiples cadenas. Únicamente un 5% del anticuerpo (4D4, 5C3) está unido a un grupo E que contiene predominantemente (\approx95%) PSA que está escindido internamente entre Lys145-Lys146 en comparación con la cantidad de anticuerpo (ajustada a 100%) enlazado a los grupos A y B, que contenía únicamente PSA de una sola cadena intacto. En consecuencia, estos anticuerpos solo pueden reconocer formas de PSA en las que no exista escisión interna en Lys145-Lys146, tal como en el PSA de LNCaP, que se utilizó como inmunogen. Las figuras 4a-4c ilustran la reactividad de diferentes anticuerpos con los grupos A-E de PSA de plasma seminal. se analizaron los anticuerpos en formato de ensayo sándwich que utilizaba placas recubiertas con H117 o placas de estreptavidina recubiertas con 5A10 biotinilado como capturador. Los anticuerpos se designan de acuerdo con las diferentes regiones enlace ilustradas en el estudio ISOBM.

Afinidad de los MAb. Las constantes de afinidad de los MAb se indican en la tabla 2. Todos los MAb caracterizados mostraron una alta afinidad para el PSA de plasma seminal (Ka >1 x 10^{9} 1/M). 7G1 tenía una muy alta afinidad para PSA y hK2 (Ka= 2 x 10^{10 }1/M). 4D4 y 5C3 tenían constantes de afinidad de 2,5 x 10^{9} 1/M y 2,7 x 10^{9} 1/M, respectivamente, para proPSA y formas intactas de PSA. Además, en 4D4 y 5C3 se analizó la afinidad para los grupos de PSA de plasma seminal que contienen formas internamente escindidas (grupos C, D y E). Las constantes de afinidad de estos dos MAb disminuían para cantidades crecientes de formas de PSA internamente escindidas. La afinidad de 4D4 y 5C3 por el PSA del grupo E no se pudo determinar utilizando el procedimiento Scatchard debido a una afinidad muy baja (datos no mostrados).

TABLA 2 Resumen de características de los anticuerpos

2

Rendimiento de inmunoensayo de SCINT-PSA

En la figura 5 se muestra una curva estándar típica. El límite de detección analítico (fondo + 2 SD) fue de \leq 0,05 \mug/l y la curva estándar fue lineal hasta el punto estándar más alto utilizado (50 \mug/l). Dentro de cada ensayo y entre los mismos, la variación fue menor de 6 y 8 por ciento respectivamente a lo largo del intervalo de concentraciones de 0,2 a 50 \mug/l.

\vskip1.000000\baselineskip

Medición de SCINT-PSA libre, PSA-F, PSA-T y hK2 en los sueros de la población estudiada

Las concentraciones medianas (y los percentiles 25 y 75) de los diferentes parámetros medidos SCINT-PSA libre, PSA-F, PSA-T y hK2, así como combinaciones de los mismos en diversos cocientes o algoritmos, se indican en las tablas 1 a 3 para toda la población de estudio, para los pacientes con PSA-T \leq 10 y para PSA-T \leq 5. Se llevaron a cabo análisis estadísticos entre cánceres y no cánceres utilizando el ensayo no paramétrico Mann-Whitney-U.

\global\parskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Discriminación de cánceres (N=197) y no cánceres (N=79) utilizando parámetros individuales o combinados sin restricciones en cuanto a las concentraciones de PSA-T. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo no paramétrico Mann- Whitney-U. La significancia estadística (p < 0,05) se muestra en negrita, y la significancia estadística límite (p 0,05-0,1) en cursiva

4

TABLA 4 Discriminación de cánceres (N=54) y no cánceres (N=187) utilizando parámetros individuales o combinados en el intervalo de PSA-T menor o igual a 10 \mug/l. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo no paramétrico Mann- Whitney-U. La significancia estadística (p < 0,05) se muestra en negrita, y la significancia estadística límite (p 0,05-0,1) en cursiva

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Discriminación de cánceres (N=38) y no cánceres (N=128) utilizando parámetros individuales o combinados en el intervalo de PSA-T menor o igual a 5 \mug/l. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ensayo no paramétrico Mann- Whitney-U La significancia estadística (p < 0,05) se muestra en negrita, y la significancia estadística límite (p 0,05-0,1) en cursiva

6

El análisis estadístico de las mediciones de inmunoensayo de todo el material de estudio clínico (es decir, sin restricciones para PSA-T tal como se muestran en la tabla 3), revela que los niveles de PSA-T (p < 0,0001), SCINT PSA libre (p = 0,0063) y de hK2 (p = 0,018), así como el parámetro individual de PSA-N (p = 0,0271) fueron significativamente diferentes para el grupo con cáncer en comparación con el grupo sin cáncer, mientras que el PSA-F (p = 0,435) no podía diferenciar entre los dos grupos. Todos los cocientes entre dos parámetros, destacando PSA-F/PSA-T, SCINT-PSA libre/PSA-F y PSA-N/PSA-T (en todos ellos p < 0,0001), discriminaban bien entre los dos grupos. La proporción (medianas) de SCINT PSA libre en relación con PSA-F fue del 47 por ciento en los no cánceres, en comparación con el 59 por ciento en cánceres (p < 0,0001). Los algoritmos de tres o cuatro parámetros también separaban los cánceres y los no cánceres con una significancia estadística elevada.

En el intervalo de PSA-T \leq 10 \mug/l (tabla 4) de los parámetros individuales, únicamente SCINT PSA libre y PSA-N discriminaron entre cánceres y no cánceres. Es especialmente notable el hecho de que la concentración mediana de PSA-N fue de 0,39 \mug/l en los no cánceres y de 0,27 \mug/l en los cánceres (p = 0,0043). De los cocientes de dos parámetros, PSA-F/PSA-T (p = 0,0002), PSA-N/PSAT (p = 0,0002), SCINT-PSA libre/PSA-F (p = 0,0018) discriminaron bien entre los dos grupos clínicos, igual como lo hicieron todos los algoritmos de tres y cuatro parámetros. La proporción (medianas) de SCINT PSA libre en relación con PSA-F fue del 47 por ciento en los no cánceres, en comparación con el 58 por ciento en cánceres (p < 0,0018).

En el intervalo de PSA-T \leq 5 \mug/l (tabla 5) de los parámetros individuales, únicamente PSA-N discriminó entre cánceres y no cánceres. La concentración mediana de PSA-N fue de 0,32 \mug/l en los no cánceres y de 0,20 \mug/l en los cánceres (p = 0,0055). De los cocientes de dos parámetros, PSA-F/PSA-T (p < 0,0001), PSA-N/PSAT (p = 0,0001), SCINT-PSA libre/PSA-F (p = 0,0012) discriminaron bien entre los dos grupos clínicos, igual como lo hicieron todos los algoritmos de tres y cuatro parámetros. También en este intervalo de PSA-T, la proporción (medianas) de SCINT PSA libre en relación con PSA-F fue muy similar a la de todo el material de estudio, es decir 49 por ciento en los no cánceres en comparación con 59 por ciento en los cánceres.

\vskip1.000000\baselineskip

Discusión y conclusiones

Un objetivo del presente estudio consistía en preparar anticuerpos anti-PSA contra las formas de PSA producidas por la línea celular de cáncer metastásico, LNCaP, y comparar dichos anticuerpos con un gran conjunto de anticuerpos caracterizados previamente obtenidos a través de inmunizaciones con PSA de plasma seminal. Se quería obtener nuevos anticuerpos anti-PSA contra diferentes isoformas del PSA libre a efectos de desarrollar inmunoensayos específicos para su detección. Un objetivo consistía en desarrollar anticuerpos anti-proPSA. Además de las inmunizaciones que utilizaban PSA de LNCaP como inmunogen, se conjugó un péptido sintético consistente en aminoácidos -7 a +7 con una proteína portadora y se utilizó en inmunizaciones. También se utilizó una forma mutada de hK2, la fXahK2, en las inmunizaciones. Dicha forma contiene un propéptido mutado que impide la autoactivación del zimógeno-proteína que resulta de la pérdida del propéptido. Dado que hK2 y PSA presentan un 79% de identidad de aminoácidos, se esperaba generar anticuerpos específicos anti-PSA a partir de fusiones fXahK2.

Aproximadamente el 50 por ciento del PSA de LNCaP purificado consistía en una forma madura de una sola cadena y aproximadamente el 50 por ciento en una forma zimógena. Ocho fusiones de PSA de LNCaP generaron más de mil pocillos positivos para PSA. Se seleccionaron 125 líneas celulares, se cultivaron y se sometieron a ensayo con diferentes procedimientos. La mayoría de las características de los anticuerpos fueron muy similares a las de los anticuerpos anti-PSA caracterizados previamente. Sin embargo, se obtuvieron tres nuevos anticuerpos con características de epítopes desconocidas previamente. Dos nuevos anticuerpos (4D4 y 5C3) se enlazaron a un epítope adyacente al lugar de escisión interna del péptido más común en el PSA (Lys_{145}-Lys_{146}) y un anticuerpo (5H6) se enlazó al péptido C-terminal de la proteína. Las fusiones de péptido sintético y las fusiones de fXahK2 no produjeron ningún anticuerpo anti-PSA nuevo.

4D4 y 5C3 se enlazaron a la secuencia peptídica lineal adyacente al lugar de escisión Lys145-Lys146. Estos anticuerpos fueron muy similares en su especificidad y afinidad por la isoforma de PSA, a pesar de que procedían de diferentes clones. No reconocieron la hK2. 4D4 y 5C3 inhibieron la actividad del PSA hacia el substrato peptídico cromogénico (datos no mostrados), lo que ya se esperaba, dado que el lugar catalíticamente activo del PSA se ha mapeado adyacente al lugar de escisión interna Lys145-Lys146 (figura 3). Cuando estos anticuerpos se analizaron con grupos de PSA de plasma seminal que contenían diferentes cantidades de formas de PSA internamente escindidas, se pudo observar que dichos anticuerpos no reconocían el PSA que estaba internamente escindido entre Lys145 y Lys146. La escisión interna del PSA en Lys145-Lys146 provoca la pérdida de la actividad enzimática. De este modo, 4D4 y 5C3 no reconocen el PSA que es inactivo debido a la escisión interna en Lys145-Lys146.

5H6, otro nuevo anticuerpo, se enlazó al péptido C-terminal de los últimos 15 aminoácidos de la molécula de PSA. Este péptido es helicoidal en forma nativa y está situado en la superficie de la molécula. El aminoácido 234 en la molécula de PSA es la valina, pero en la hK2 es la alanina. Debido a esta diferencia en un aminoácido, este anticuerpo no reconoce la hK2. Otro anticuerpo, el E73 del Dr. E. Paus, también fue mapeado en la parte C-terminal del PSA, pero la secuencia peptídica solo se superpone parcialmente con el lugar de enlace del 5H6.

Se diseñó un inmunoensayo que utilizaba el 5H6 como anticuerpo marcador. La idea de este ensayo fue estudiar los cambios en la parte C-terminal del PSA. Dado que el 5H6 se enlaza al péptido C-terminal del PSA, se pensó que la escisión de aminoácidos en el terminal C podría hacer disminuir el enlazamiento del 5H6 al PSA. Väisänen et al han documentado el hecho de que el PSA de LNCaP cultivado con suero es inactivo por una razón desconocida. También Corey et al han documentado resultados similares, mostrando que parte de la fracción inactiva del PSA se podía activar con tripsina, pero otras partes permanecían en forma inactiva. La escisión de aminoácidos en el terminal C del PSA podría modificar la conformación de la proteína y posiblemente hacer que el PSA se vuelva activo. Se separaron formas de PSA de LNCaP a partir de medio de cultivo celular utilizado de células LNCaP cultivadas con suero o sin suero tras la purificación por afinidad, utilizando cromatofocalización, en proforma y forma madura de la proteína. Se analizaron diferentes formas de PSA de LNCaP con un inmunoensayo que utilizaba H117 como anticuerpo de captura y 5H6 como anticuerpo marcador. Se quería comprobar si estas diferentes formas de PSA de LNCaP difieren en su secuencia C-terminal de aminoácidos. El inmunoensayo con 5H6 no reveló ninguna diferencia entre estas diferentes formas de PSA (datos no mostrados).

La concentración elevada de PSA en suero puede estar provocada por diversos problemas urológicos distintos del cáncer de próstata, de tal modo que el PSA no es específico del cáncer. Sin embargo, se ha demostrado que la proporción de PSA-F con respecto a complejo PSA-ACT en suero es significativamente mayor en la BPH que en el cáncer de próstata [Stenman et al, Cancer Res 1991; 51: 222-226, Christensson et al, J Urol 1993;150: 100-5]. Se desconocen los mecanismos que provocan la fracción aumentada de PSA libre en suero en la BPH. Björk et al, [Björk et al, Urology 1994;43: 427-34] han documentado falta de producción de ACT en los nódulos de BPH que contienen PSA en contraste con los tejidos cancerosos, en los que se pudo detectar la producción tanto de PSA como de ACT. Esto podría comportar una mayor formación del complejo PSA-ACT en el cáncer, lo que explicaría la diferencia en la cantidad de PSA libre en la BPH y el cáncer de próstata. Sin embargo, Jung et al, [Jung et al, Clin Chem 2000; 46:47-54] han demostrado que las cantidades de diferentes formas de PSA en el tejido prostático no se correlacionan con las cantidades o cocientes de diferentes formas de PSA en el suero. De este modo, los patrones de isoforma observados en el suero pueden no ser un simple reflejo de los patrones de isoforma de PSA en tejido. En lugar de ello, la liberación de diferentes proporciones de formas enzimáticamente activas o inactivas de PSA libre a partir de células neoplásicas y benignas pueden provocar la diferencia en la relación PSA libre-total en el PCa y la BPH.

Existen referencias contradictorias sobre la naturaleza del PSA libre en suero. La forma zimógena de PSA que empieza en el aminoácido -4 en el suero de los pacientes de cáncer de próstata fue documentado por Mikolajczyk et al, [Mikolajczyk et al, Urology 1997; 50: 710-4]. Se ha puesto de manifiesto que las células LNCaP producen proformas de PSA que empiezan en el aminoácido -7 ó -5. Estas proformas presentan valores elevados de pI isoeléctrico que, según Väisänen et al, desaparecieron tras la incubación con hK2. Estos puntos elevados de pI también han sido detectados en el suero de pacientes con cáncer de próstata avanzado, pero no en los pacientes con BPH [Huber et al, Prostate 1995;27: 212-9]. Sin embargo, Noldus et al, [Noldus et al, J Urol 1997;158: 1606-9] no detectaron ninguna forma zimógena en el suero de pacientes de cáncer de próstata de grado elevado. Sus procedimientos de purificación no excluyeron la hK2, que podría escindir el proPSA en la forma madura durante las etapas de
purificación.

Las respuestas a las diferentes formas de PSA libre podrían añadir nueva información discriminatoria al diagnóstico del cáncer de próstata. Un anticuerpo anti-proPSA podría permitir una medición específica y sensible de las formas zimógenas de la proteína. A pesar de la elevada naturaleza inmunogénica del PSA de LNCaP, no pudimos encontrar anticuerpos específicos, ni siquiera con una mayor preferencia, por la forma zimógena del PSA.

Podrían existir diversas razones para esta no obtención de anticuerpos anti-proPSA. Se ha puesto de manifiesto que la prosecuencia de PSA de kallicreínas de ratón es similar a las prosecuencias de kallicreína en el humano [Fukushima et al, Biochemistry 1985; 24: 8037-43]. Esto podría significar que el propéptido no es inmunogénico en el ratón. Además, debido a la homología, las kallicreínas de ratón podrían ser capaces de escindir la proPSA humana en PSA maduro, lo que provocaría la pérdida de la prosecuencia. Adicionalmente, no se conoce la orientación de la prosecuencia en la molécula de PSA y podría estar parcialmente enterrada.

La caracterización de diversas formas de PSA libre procedente de plasma seminal y tejido prostático ha sido un enfoque en la comprensión de las diferentes formas moleculares de PSA libre y de su importancia en diferentes enfermedades prostáticas. Una explicación para las formas de PSA libre inactivo son las formas de PSA internamente escindidas. Se ha puesto de manifiesto que el PSA de plasma seminal contiene \sim30% de PSA internamente escindido, encontrándose el lugar de escisión interna más común en Lys145-Lys146 [Christensson et al, Eur J Biochem 1990;194:755-63]. Noldus et al [Noldus et al, J Urol 1997;158: 1606-9] han detectado esta forma de PSA internamente escindida en el suero de pacientes de cáncer de próstata de grado elevado. Charrier et al, [Charrier et al, Electrophoresis 1999; 20:1075-81] han utilizado electroforesis bidimensional para comparar patrones de formas de PSA en suero de BPH y PCa. Han demostrado que el suero de BPH contiene más formas escindidas de PSA libre que el suero de PCa. También se han identificado lugares de escisión interna entre Arg85-Phe86 y Lys182-Ser183 [Zhang et al, Clin Chem 1995;41:1567-73, Watt et al, Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 3166-70]. Una nueva forma de PSA recientemente caracterizada, la "B-PSA", que se aisló a partir de tejido benigno de zona de transición de pacientes de BPH contiene el lugar de escisión interna en Lys182-Ser183 [Mikolajzcyk et al, Urology 2000; 55: 41-5]. En los fluidos nodulares de BPH, Chen et al, [Chen et al, J Urol 1997;157:2166-70] han documentado formas de PSA con lugares de escisión interna en His54-Ser55, Phe57-His58, Lys145-Lys146 y Lys146-Leu147. Se desconoce si las escisiones en estos sitios distintos de Lys145-Lys146 inactivan el PSA.

Zhang et al, [Zhang et al, Clin Chem 1995; 41:1567-73] han documentado una forma madura inactiva no cortada de PSA en el fluido seminal que no pudo formar complejo con ACT. Esta forma intacta e inactiva de PSA también ha sido encontrada en suero [Mikolajczyk et al, Urology 1997;50:710-4, Noldus et al, J Urol 1997:158-1606-9, Qian et al, Clin Chem 1997; 43:352-9] y en medio utilizado de células LNCaP [Väisänen et al, Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999; 6:1-7, Corey et al, Prostate 1998; 35:135-43]. Actualmente no se dispone de ninguna explicación para esta forma inactiva de PSA.

Existen zonas antigénicas separadas en la molécula de PSA (figura 3). La presencia de estas zonas puede hacer disminuir la posibilidad de obtener anticuerpos contra zonas menos inmunogénicas. Sin embargo, en el presente estudio se encontraron anticuerpos contra dos nuevos epítopes previamente no reconocidos.

Utilizando los nuevos y únicos Mab 5C3 o 4D4 de alta afinidad descritos, fuimos capaces de construir un ensayo sencillo y muy sensible para el SCINT PSA libre. Estos fueron utilizados principalmente como anticuerpos detectores con el Mab 5A10 capturador específico de PSA libre. Dado que los dos MAb marcadores de que se disponía se comportaban de forma similar, proseguimos con uno solo de ellos, el Mab 5C3. Como resulta evidente a partir del mapa de epítopes (figura 2), los MAb 5C3 y 4D4 se pueden combinar fácilmente con otros anticuerpos específicos de PSA total, proporcionándose de este modo ensayos para formas complejadas y libres de SCINT PSA.

Dado que el SCINT PSA, según nuestra definición, constituye una subfracción de PSA-F, pudimos obtener fácilmente la concentración de PSA cortado libre (PSA-N) sustrayendo el nivel de SCINT PSA libre al medido mediante un ensayo de PSA libre. Se puso de manifiesto que este parámetro calculado es un parámetro valioso, especialmente para formar el cociente PSA-N/PSA-T (o viceversa) a efectos de discriminar los cánceres de los no cánceres. Resulta evidente a partir del mapa de epítopes en 2-D (figura 2) que se puede construir una medición directa del PSA cortado utilizando una etapa de prebloqueo, por ejemplo mediante Mab 5C3 y/o 4D4, impidiéndose, es decir bloqueándose, que el PSA intacto, es decir el SCINT PSA, participe posteriormente en la detección. De los pares de anticuerpos formadores de sándwich seleccionados, un anticuerpo (por ejemplo, 2C1) se basaría en el reconocimiento un epítope que se superpone al epítope específico de 5C3 y 4D4, y el otro sería cualquier otro anticuerpo de PSA capaz de dar lugar a una buena formación de sándwich.

Tal como se ha observado analizando las muestras clínicas, un barrido de grupo de edad, tanto el SCINT PSA libre como el PSA-N eran capaces, individualmente o en diversas combinaciones diferentes, de discriminar de un modo muy significativo entre cánceres y no cánceres, tanto para todo el grupo de edad como también en la llamada zona gris de difícil diagnóstico, con concentraciones bajas (\leq5 \mug/l) o intermedias (\leq10 \mug/l) de PSA-T.

Naturalmente, la combinación de SCINT PSA libre y PSA-N con la medición de otras formas de PSA o hK2 también se puede llevar a cabo de otras maneras que formando cocientes u otros algoritmos matemáticos, pero también por combinación mediante regresión logística. A menudo, las combinaciones por regresión logística proporcionan una discriminación incluso mejor que los cocientes calculados a partir de las mediciones individuales de cada paciente. Dado que la combinación mediante regresión logística, a diferencia de la combinación obtenida mediante la formación de cocientes, no proporciona una variable continúa, no es posible definir los límites de corte en estos casos. El análisis por regresión logística resulta útil para proporcionar la base para diversos "sistemas de análisis de riesgo que pueden proporcionar apoyo a la decisión médica". Otros ejemplos de dichos sistemas de manejo de datos son: redes neuronales artificiales (ANN), redes neuronales difusas (NFN), perceptrón multicapa (MLP), cuantificación de vector de aprendizaje (LVQ) [Freeman JA et al, en: Neural Networks: Algorithms, Applications and Programming Techniques, Addison-Wesley Publishing Company 1991; Zadeh LA Information and Control, 1965, 8: 338-353; Zadeh LA, IEEE Trans. on Systems, Man and Cybernetics 1973, 3: 28-44; Gersho A et al, en: Vector Quantization and Signal Compression, Kluywer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, Londres 1992; Hassoun M. H., Fundamentals of Artificial Neural Networks, The MIT Press, Cambridge, Massachusetts, Londres 1995].

Claims

1. Anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se enlaza con afinidad elevada a formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no escindidas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA), caracterizado porque dicho anticuerpo, que se puede obtener por inmunización con una forma no disociada de PSA y que se selecciona por su reactividad diferencial con las formas intactas y escindidas interiormente, no se enlaza a un PSA cortado (PSA-N) escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, en el que dicho PSA-N se ha formado mediante escisión o escisiones de enlaces peptídicos internos de SCINT PSA, dando lugar a PSA de doble cadena o multicadena.

2. Inmunoensayo para la determinación cuantitativa en una muestra de formas maduras y/o zimógenas humanas de cadena simple intactas, es decir no disociadas interiormente, del antígeno específico de la próstata (SCINT PSA), o alternativamente formas cortadas de PSA (PSA-N) escindidas entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, en el que dicho PSA-N se ha formado mediante escisión o escisiones de enlaces peptídicos internos del SCINT PSA, dando lugar a formas de antígeno específico de la próstata (PSA) de doble cadena o multicadena, pudiendo darse el SCINT PSA o el PSA-N en forma libre y/o complejada, y estando caracterizado dicho inmunoensayo en que se utiliza un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se enlaza con una elevada afinidad ha dicho SCINT PSA, pero no se enlaza a dicho PSA-N escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146.

3. Inmunoensayo según la reivindicación 2 para la determinación de PSA-N escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, caracterizado porque

a): dicho anticuerpo, es decir un primer anticuerpo, se enlaza con afinidad elevada al SCINT PSA presente en la muestra; y

b): un anticuerpo adicional, es decir un segundo anticuerpo; en el que dicho segundo anticuerpo se enlaza con afinidad elevada a formas maduras y/o zimógenas del antígeno específico de la próstata (PSA) humano y también se enlaza al PSA-N escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, pero es incapaz de enlazarse al PSA ya enlazado a dicho primer anticuerpo; con lo que el segundo anticuerpo se enlaza únicamente a las formas de PSA no bloqueadas por el primer anticuerpo, es decir el PSA-N escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146;

permitiendo la determinación del PSA-N escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, que se ha formado mediante escisión o escisiones internas, dando lugar a formas de PSA de doble cadena o multicadena.

4. Inmunoensayo según la reivindicación 2 para determinar el SCINT PSA, caracterizado porque dicho inmunoensayo es un inmunoensayo de sándwich que incluye adicionalmente la utilización de un anticuerpo específico para antígeno específico de la próstata libre (PSA-F), es decir no complejado, para permitir la determinación específica de SCINT PSA libre, es decir no complejado.

5. Procedimiento para obtener un valor de marcación útil para diferenciar pacientes con cáncer de próstata (PCa) de pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH) y/o sujetos masculinos sanos sin PCa, caracterizado porque dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a): determinar el antígeno específico de la próstata (SCINT PSA) humano de una cadena intacto, es decir no escindido internamente, libre y/o complejado, utilizando un anticuerpo según la reivindicación 1, y

b): establecer un valor de marcación que es una función del SCINT PSA determinado.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa a) comprende la determinación del SCINT PSA según la reivindicación 2.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa a) comprende la determinación del SCINT PSA libre, es decir no complejado, según la reivindicación 4.

8. Procedimiento para obtener un valor de marcación útil para diferenciar pacientes con cáncer de próstata (PCa) de pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH) y/o sujetos masculinos sanos sin PCa, caracterizado porque dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a): determinar el PSA cortado (PSA-N), escindido entre los aminoácidos de lisina 145 y lisina 146, libre y/o complejado, utilizando un anticuerpo según la reivindicación 1, y

b): establecer un valor de marcación que es una función del PSA-N determinado.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa a) comprende la determinación del PSA-N según la reivindicación 3.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque la función de dicho valor de marcación también es una función de otras formas de PSA y/o kallicreína glandular humana 2 (hK2).

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque dichas otras formas de PSA y/o hK2 se seleccionan de entre el grupo constituido por:

PSA total (PSA-T),

PSA no complejado, es decir libre (PSA-F),

PSA cortado (PSA-N) y

kallicreína glandular humana 2 (hK2).

12. Procedimiento según las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque dicha función para establecer el valor de marcación es una concentración como tal; cocientes, productos y combinaciones de una concentración o concentraciones; combinaciones de diversos parámetros utilizando regresión logística; o combinaciones de diversos parámetros utilizando inteligencia artificial, tal como redes neuronales.