JP6312141B2 - 前立腺がん検査用尿中バイオマーカー - Google Patents
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Description
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(1) 質量分析によるm/zが2332±4であるペプチド
(1) 質量分析によるm/zが2332±4であるペプチド
インフォームド・コンセントを取得した男性から、尿(主に前立腺マッサージ後尿)を採取し、9M尿素溶液を用いて変性させた後、弱陽イオン交換樹脂 (Carboxy methyl [CM-] Sepharose Fast Flow [GE Healthcare, Freiburg, Germany])を用いて濃縮・脱塩を行い、溶出されたサンプルのマス・プロファイルから、前立腺がんに特異的なピークを検出し、その同定を行った。
インフォームド・コンセントを取得した男性から尿を採取し、50mL遠心管に100μm Nylon cell strainer (BD Falcon, REF352360)を載せ、採尿した尿をcell strainerに通して回収した。回収した尿は、20℃で10分間、2,000 x g で遠心分離を行った(採尿から遠心分離までを30分以内に完了することが望ましい)。遠心分離後、その上清を、再度、100μm Nylon cell strainerを通して収集し、尿検体とした。解析用サンプルは1.5mLのマイクロチューブに、それぞれ1.0mLずつ分取して、分析まで-80℃で保存した。
1. MALDI-TOF/MSnを用いた尿中ペプチド・タンパク質断片のマス・プロファイル
図1に、健常者、前立腺肥大症患者および前立腺がん患者の尿検体(前立腺マッサージ後尿)の質量分析結果のデータの代表例を示す。横軸に質量(m/z値)、縦軸にその質量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークで示した。図1から明らかなように、前立腺がんと前立腺肥大症の患者尿検体を比較すると、前立腺がんでは、m/z2332が有意に増加していた。健常者では、前立腺がんで顕著に認められるm/z2332ピークは殆ど検出されなかった。
島津製作所製のMALDI-TOF/MSnを用いて尿中ペプチド・タンパク質断片の同定を行った。解析はMS1でprecursorイオンを選択し、MS2解析により得られたMS2イオンデータをMascot(商標) MS2 Ion Search (Matrix Science, Inc., 米国マサチューセッツ州Boston) 検索を実施し、同定を行った。
m/z2332をprecursorイオンとしてアミノ酸配列を同定した結果を図2に示す。Mascot(商標) MS2 Ion Searchの結果、m/z2332は分子量2331DaのPSAのC端部断片であることが明らかとなった。さらに、Mascot(商標) MS2 Ion Searchで推定されたPSAのC端部のアミノ酸配列(YTKVVHYRKWIKDTIVANP、配列番号1)を合成(Medical & Biological Laboratories Co. Ltd [MBL], 日本国名古屋)してvalidation試験を行った。推定されたアミノ酸配列を有する合成ペプチドのMS2マス・プロファイルは、前立腺がん患者尿で検出されたm/z2332のMS2マス・プロファイルと一致した。本解析の結果、前立腺がん患者尿中のm/z2332はPSAのC端部のアミノ酸構造と同一であることが立証された。また、分子量2331DaのPSAのC端部断片の由来に関して、前立腺がん患者の前立腺マッサージ後尿と随時尿の比較を行ったところ、前立腺マッサージ後尿で顕著なm/z2332ピークを検出した。このピークは、前立腺肥大症患者の前立腺マッサージ後尿でも検出されるが、そのピークは有意に低値である。以上の結果から、m/z2332ピークは、前立腺がん患者の前立腺マッサージによって前立腺より顕著に分泌促進されたPSAのC端部断片であることが明らかとなった。
m/z1243をprecursorイオンとして同定した結果を図3に示す。Mascot(商標) MS2 Ion Searchの結果、m/z1243は分子量1242DaのPSAの断片(LRLSEPAELTD、配列番号2)であることが明らかとなった。
m/z1314をprecursorイオンとして同定した結果を図4に示す。Mascot(商標) MS2 Ion Searchの結果、m/z1314 は分子量1313DaのPSAの断片(LRLSEPAELTDA、配列番号3)であることが明らかとなった。
m/z2444をprecursorイオンとして同定した結果を図5に示す。Mascot(商標) MS2 Ion Searchの結果、m/z2444は分子量2443Daのβ2ミクログロブリン(β2M)の断片(LLKNGERIEKVEHSDLSFSKD、配列番号4)であることが明らかとなった。
健常者尿1例、前立腺肥大症患者尿4例、前立腺がん患者尿10例について、MALDI-TOF/MSnを用いた尿中ペプチド・タンパク質断片のマス・プロファイルから各ピークの相対定量値を算出した。すなわち、m/z 1200〜5000の範囲の全イオン電流値(Total Ion Current: TIC)でノーマライズし、各ピーク占める電流値の割合[%]で表示した。結果を表2に示す。「がん」は前立腺がん患者群、「非がん」は健常者と前立腺肥大症の患者群を示す。
PSAのC末端領域からなるm/z 2332のPSA断片1について、症例数を増やしてより詳細な統計学的解析を行った。表3に示した各症例について、上記と同様に、前立腺マッサージ後尿を採取してMALDI-TOF/MSnを行い、PSA断片1のマス・プロファイルから各ピークの相対定量値を算出した。群間の比較はマンホイットニーU検定により行った。比較例として、各症例について、血清中PSA量を測定する従来法のPSA検査も行った。
Claims (21)
- 下記のペプチドからなる前立腺疾患検査用尿中バイオマーカー。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド - 下記のペプチドからなる前立腺がん検査用尿中バイオマーカー。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド - 下記(b)〜(d)から選択される少なくとも1種のペプチドからなる前立腺疾患検査用尿中バイオマーカーと組み合わせて用いられる、請求項1記載の尿中バイオマーカー。
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(d) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるペプチド - 下記(b)〜(d)から選択される少なくとも1種のペプチドからなる前立腺がん検査用尿中バイオマーカーと組み合わせて用いられる、請求項2記載の尿中バイオマーカー。
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなるペプチド
(d) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるペプチド - 前記全てのペプチドは、前立腺がん患者において高値で検出されるペプチドである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の尿中バイオマーカー。
- 前記全てのペプチドは、前立腺がん患者において、既知の非前立腺がん患者集団における尿中ペプチド量の平均値の2倍以上の値を示すペプチドである請求項5記載の尿中バイオマーカー。
- 下記のペプチドからなる前立腺疾患検査用尿中バイオマーカー。
(1) 質量分析によるm/zが2332±4であるペプチド - 下記のペプチドからなる前立腺がん検査用尿中バイオマーカー。
(1) 質量分析によるm/zが2332±4であるペプチド - 下記(2)〜(4)から選択される少なくとも1種のペプチドからなる前立腺疾患検査用尿中バイオマーカーと組み合わせて用いられる、請求項7記載の尿中バイオマーカー。
(2) 質量分析によるm/zが1243±3であるペプチド
(3) 質量分析によるm/zが1314±3であるペプチド
(4) 質量分析によるm/zが2444±4であるペプチド - 下記(2)〜(4)から選択される少なくとも1種のペプチドからなる前立腺がん検査用尿中バイオマーカーと組み合わせて用いられる、請求項8記載の尿中バイオマーカー。
(2) 質量分析によるm/zが1243±3であるペプチド
(3) 質量分析によるm/zが1314±3であるペプチド
(4) 質量分析によるm/zが2444±4であるペプチド - 前記全てのペプチドは、前立腺がん患者において高値で検出されるペプチドである請求項7ないし10のいずれか1項に記載の尿中バイオマーカー。
- 前記全てのペプチドは、前立腺がん患者において、既知の非前立腺がん患者集団における尿中ペプチド量の平均値の2倍以上の値を示すペプチドである請求項11記載の尿中バイオマーカー。
- 被検者から採取された尿検体を分析し、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の尿中バイオマーカーの存否又は存在量を調べることを含む、前立腺疾患の検査のための方法。
- 被検者から採取された尿検体を分析し、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の尿中バイオマーカーの存否又は存在量を調べることを含む、前立腺がんの検査のための方法。
- 尿検体の分析が、質量分析法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、イムノアッセイ法、マイクロアレイ法又はこれらのうちのいずれかの組み合わせにより行なわれる請求項13又は14記載の方法。
- 尿検体を前処理した後に分析が行なわれる請求項13ないし15のいずれか1項に記載の方法。
- 尿検体をイオン交換処理した後に質量分析法による分析が行なわれる請求項15記載の方法。
- 前記尿検体が、被検者に対し前立腺マッサージを実施した後に採取された尿検体である請求項13ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被検者が前立腺がんの疑いのある被検者であり、前記尿中バイオマーカーを指標として前立腺がんと前立腺肥大症との判別を補助する、請求項13ないし18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被検者が前立腺がん治療中又は治療後の患者であり、前記尿中バイオマーカーを指標として前立腺がんの治療効果のモニタリングを補助する、請求項13ないし18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被検者が前立腺がん治療後の患者であり、前記尿中バイオマーカーを指標として前立腺がんの再発のモニタリングを補助する、請求項13ないし18のいずれか1項に記載の方法。
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