ES2319349T3

ES2319349T3 - Relleno cromatografico que tiene un metodo caracteristico para separar una sustancia y utilizacion del mismo.

Info

Publication number: ES2319349T3
Application number: ES99921232T
Authority: ES
Inventors: Teruo Okano; Akihiko Kikuchi; Yasuhisa Sakurai; Hideko Kanazawa; Yoshikazu Matsushima
Original assignee: Cellseed Inc
Current assignee: Cellseed Inc
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2019-05-24
Also published as: EP1081492A1; JP4532736B2; EP1081492A4; US6706187B1; ATE420722T1; EP1081492B1; DE69940310D1; WO1999061904A1

Abstract

Un método para separar sustancias separando cromatográficamente dichas sustancias con el uso de un relleno que contiene un polímero y una fase móvil acuosa caracterizado porque dicho copolímero tiene grupos de intercambio iónico cargados, cambiándose la densidad de carga efectiva al cambiar la temperatura o el pH en el método, siendo dicho copolímero un copolímero de polialquilacrilamida que tiene grupos amino, carboxilo o sulfonato en las cadenas laterales o en los extremos.

Description

Relleno cromatográfico que tiene un método característico para separar una sustancia y utilización del mismo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un relleno que contiene un copolímero cargado, y a un nuevo método de separación a través del cual se separaran cromatográficamente sustancias como elementos de metal, fármacos o componentes biológicos. En el método, se cambia la densidad de carga efectiva en la superficie del relleno cambiando la temperatura o el pH.

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Antecedentes de la invención

Existe una gran variedad de técnicas de cromatografía de líquidos dependiendo de la combinación de la fase estacionaria con la fase móvil y los sistemas de interacción empleados para la separación. La cromatografía de líquidos es una técnica muy importante para separar elementos metálicos, aislar y purificar fármacos y separar péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc, en el campo de la bioquímica. En los últimos años, además, se han realizado algunas tentativas para aplicar proteínas recombinantes, etc, producidas a través de procedimientos de bioingeniería, con lo se ha conseguido un notable avance en medicinas. En estas circunstancias, existe una creciente necesidad de contar con métodos de separación eficientes para separar y purificar estos productos. Las técnicas cromatográficas que se emplean comúnmente en el momento actual implican cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase
inversa, etc.

En la cromatografía de intercambio iónico, se lleva a cabo la separación utilizando, como fase estacionaria, un electrolito en la superficie de un soporte insoluble y absorbiendo irreversiblemente los contra iones contenidos en la fase móvil. Como soporte, está extendido el uso de sílice, celulosa, dextrano, copolímero de estireno/divinil benceno, etc. Los soportes que tienen grupos de intercambio iónico (por ejemplo, sulfonato, amonio cuaternario) introducidos en ellos están disponibles en el comercio como agentes de intercambio de iones. El soluto se disocia en cationes, aniones e iones anfóteros dependiendo de la concentración de ión hidrógeno de la solución. Cuando se pasa esta solución a través de una columna de intercambio iónico, cada ión se une al grupo de intercambio de carga opuesta en la superficie del soporte de forma competitiva con los iones de disolvente, causando así la distribución entre la solución y la superficie del agente de intercambio iónico en determinada relación. La velocidad de desplazamiento a través de la columna varían dependiendo de la resistencia de unión y la separación se completa utilizando esta diferencia de la velocidad de desplazamiento. La distribución se puede modificar a través de algunos métodos. Por ejemplo, se puede cambiar controlando la concentración de la especie de ión competitivo en la fase móvil. Alternativamente, se puede variar el grado de ionización del grupo de intercambio iónico en la superficie del soporte cambiando la concentración de ión hidrógeno en la solución. Es decir, según la práctica de la cromatografía de intercambio de iones se separan los solutos entre sí controlando la concentración iónica o la concentración del ión hidrógeno en la fase móvil cambiando así el orden de elución de los solutos.

La cromatografía de fase inversa implica el uso de una combinación de fase estacionaria hidrófoba con una fase móvil polar. Se distribuyen los solutos entre la fase móvil y la fase estacionaria dependiendo del grado de hidrofobia. En este caso, se eluyen también los solutos cambiando el grado de hidrofobia del disolvente en la fase móvil para cambiar así la distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria. Dado que se emplea un disolvente orgánico como disolvente en la fase móvil, existe el temor de que se puedan deteriorar con ello las actividades de los componentes biológicos que se van a separar.

Brevemente, se eluyen los solutos y se separan uno de otro fundamentalmente variando el disolvente en la fase móvil tanto en la cromatografía de intercambio iónico como en la cromatografía de fase inversa. Por consiguiente, existe el riesgo de que se pueda dañar la actividad de la muestra objetivo a través del ácido o el disolvente orgánico empleado en la elución.

Cuando se pretende separar sustancias entre sí a través de dos o más cromatografías, se deberá llevar a cabo cada una de las cromatografías independientemente, ya que el modo cromatográfico varía según el soporte. Si es posible llevar a cabo la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía en fase inversa utilizando un solo soporte y un solo estímulo físico, la separación se podría completar con una eficacia elevada en el plazo de un breve período de tiempo. Por otra parte, se pueden separar así las sustancias que no se pueden separar entre sí a través de las técnicas convencionales.

Existe una gran variedad de componentes biológicos incluyendo los que llevan carga y los que no llevan carga. En general, un compuesto con la capacidad de ser ionizado se retiene, en un estado no ionizado, en un relleno hidrófobo gracias a la interacción hidrófoba. Sin embargo, cuando se ioniza, la interacción hidrófoba con el relleno hidrófobo se debilita. Los compuestos que se pueden disociar iónicamente que difieren en la constante de disociación se pueden separar fácilmente uno de otro gracias a la interacción ión a ión con el uso de un agente de intercambio
iónico.

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Se sabe de manera general que las resinas de intercambio iónico débilmente ácidas y las resinas de intercambio iónico débilmente básicas son adecuadas para separar proteínas básicas y ácidas, respectivamente. Por lo tanto, es de esperar que al introducir sustituyentes de intercambio iónico, la cromatografía de intercambio iónico basada en las interacciones ión a ión sea útil para separar diversas sustancias que son similares entre sí en cuanto a la hidrofobia o el peso molecular y que, por tanto, no se pueden separar exclusivamente a través de interacciones hidrofóbicas, así como moléculas biológicas como proteínas y oligómeros de ácido nucleico.

Sin embargo, hasta el momento no se conoce ningún soporte que se pueda utilizar tanto en cromatografía de intercambio iónico como en cromatografía de fase inversa cuando se emplean en solitario bajo un estímulo físico, ni tampoco ningún soporte que se pueda utilizar para separar eficientemente varias sustancias, que son similares entre sí en cuanto a la hidrofobia o el peso molecular y que, por lo tanto, no se pueden separar exclusivamente a través de interacciones hidrófobas, así como moléculas biológicas, como proteínas y oligómeros de ácido nucleico.

EP-A-0.534.016 se refiere a una matriz para cromatografía de líquidos que comprende un compuesto polimérico sensible a la temperatura insolubilizado en agua que tiene una temperatura de solución crítica inferior. El compuesto polimérico puede ser un derivado de acrilamida poli-N-sustituido, un derivado de metacrilamida poli-N-sustituido, sus copolímeros, poliéter de vinil metilo o polialcohol vinílico parcialmente acetilado. Por otra parte, la solicitud de patente se refiere a un proceso para cromatografía de líquidos en una columna con el uso del compuesto polimérico mencionado y variando la temperatura de la columna a una temperatura comprendida entre una temperatura por encima de la temperatura de solución crítica inferior y por debajo de dicha temperatura.

En JP-A-07318551 se refiere a una carga y a un método cromatográfico en el que se emplea. La carga puede tener grupos amino, carboxilo o hidroxi en la superficie y se puede modificar químicamente con una polialquil acril amida que tiene un grupo amino terminal o un copolímero del mismo. Según se afirma, la carga permite que se pueda variar el equilibrio entre la hidrofilia y la hidrofobia en la superficie de la fase fija con una señal externa, v.g., la variación de la temperatura.

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Descripción de la invención

Para resolver los problemas que se han mencionado, los autores de la presente invención han realizado estudios y desarrollos desde diferentes puntos de vista. Como resultado de ello, han logrado preparar un nuevo relleno que tiene la función de intercambio iónico a través de la copolimerización de poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) con dimetilaminopropilacrilamida de carga positiva (DMAPAAm) y se ha observado que este relleno es adecuado tanto en la cromatografía en fase inversa como en cromatografía de intercambio iónico, cuando se controla de forma apropiada la temperatura. Los autores de la invención han observado asimismo que el uso del copolímero cargado hace posible controlar la LCST del polímero regulando el valor del pH. La presente invención ha sido completada en función de estas conclusiones.

La presente invención se refiere a un método para separar sustancias por separación cromatográfica de dichas sustancias con el uso de un relleno que contiene un copolímero y una fase móvil acuosa, caracterizándose dicho método de separación por los rasgos que se recitan en la reivindicación 1.

La presente invención se refiere asimismo a un relleno cromatográfico que contiene un copolímero de N-isopropilacrilamida y N,N-dimetilamino propil acrilamida.

En el relleno cromatográfico de la presente invención, se puede controlar reversiblemente el estado de carga de los grupos de intercambio iónico en la superficie del soporte cambiando la estructura superficial de la fase estacionaria a través de un estímulo físico externo como puede ser un cambio de temperatura. El relleno cromatográfico según la presente invención proporciona una fase estacionaria que hace posible llevar a cabo dos modos cromatográficos, es decir, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de fase inversa, al mismo tiempo con el uso de una fase móvil que es un disolvente acuoso único (fase móvil acuosa). El término "disolvente acuoso", tal como se utiliza aquí, significa agua en solitario o soluciones acuosas que contienen sales inorgánicas, pero que están libres de disolventes orgánicos.

El relleno cromatográfico según la presente invención proporciona un soporte para la separación y purificación que se caracteriza porque la separación se lleva a cabo en una fase móvil acuosa controlando la carga de los grupos de intercambio iónico de la superficie de la fase estacionaria regulando las propiedades físicas o la estructura en torno a los grupos de intercambio iónico en la superficie del soporte cambiando la temperatura o el pH. De acuerdo con la presente invención, cuando la temperatura externa está por debajo de la temperatura crítica, los grupos de intercambio iónico aparecen en la superficie del soporte. A continuación, los componentes biológicos que se van a separar experimentan una interacción con los grupos de intercambio iónico, lo que va seguido de la separación a través del modo de cromatografía de intercambio iónico. Cuando la temperatura externa es superior a la temperatura crítica, por otra parte, se debilita la carga superficial y se hace más hidrófobo el soporte. Entonces, se pueden separar los componentes biológicos según el modo de cromatografía de fase inversa. Es decir, se puede cambiar reversiblemente y arbitrariamente el equilibrio hidrófilo/hidrófobo en la superficie del soporte controlando la temperatura
externa.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 proporciona gráficos en los que se muestra la relación entre la temperatura y el tiempo de retención en la separación de aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico con el uso de dos rellenos como los descritos en el ejemplo 3.

La figura 2 proporciona gráficos que muestran la relación entre la temperatura y el tiempo de retención en la separación de aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico al mismo tiempo que se cambia el valor del pH en el ejemplo 4.

La figura 3 proporciona gráficos en los que se muestra la relación entre la temperatura y el tiempo de retención en la separación de aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico al mismo tiempo que se cambia la concentración iónica en el ejemplo 5.

La figura 4 proporciona gráficos en los que se muestra la relación entre la temperatura y el tiempo de retención en la separación de aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico al mismo tiempo que se cambia la relación de polimerización de IPAAm a DMAPAAm en el ejemplo 6.

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Mejor modo de realización de la invención

Entre los ejemplos de la señal física externa que se utiliza en el método de la presente invención se puede mencionar un cambio de temperatura.

Para alterar las propiedades físicas o la estructura en torno a los grupos de intercambio iónico de la superficie del relleno cambiando la temperatura, se puede introducir, por ejemplo, un polímero sensible a la temperatura en la superficie del soporte. Entre los ejemplos de rellenos de este tipo se incluyen rellenos cromatográficos químicamente modificados en la superficie del soporte con copolímeros de alquil acrilamida que tienen grupos amino o carboxilo, etc. en las cadenas laterales o en los extremos. Entre los ejemplos de rellenos químicamente modificados se incluyen soportes de sílice modificados con los polímeros o copolímeros de alquilacrilamida que se han mencionado. Para introducir grupos de intercambio iónico, se modifican los soportes químicamente mediante copolímeros de las alquil acrilamidas que se han mencionado con comonómeros que tienen grupos amino, carboxi o sulfonato.

Entre los ejemplos de unidades constitucionales de polímeros que contienen amino se incluyen dialquil aminoalquil (met)acrilamida, (met)acrilato de dialquilaminoalquilo, (met)acrilato de aminoalquilo, aminoestireno, aminoalquilestireno, amino alquil (met)carilamida, sales de alquiloxialquiltrimetilamonio y sales de (met)acrilamido-alquiltrimetilamonio. Entre los ejemplos de unidades constitucionales de polímeros con contenido en carboxilo se incluyen ácido acrílico y ácido metacrílico, al tiempo que entre los ejemplos de unidades constitucionales de los polímeros con contenido en sulfonato se incluye ácido (met)acrilamido-alquilsulfónico.

Es preferible que la polialquilacrilamida que se utilice en la presente invención se seleccione entre poli(N-isopropilacrilamida), polidietilacrilamida, poli(N-propilacrilamida) y poliacriloílpirrolidina y copolímeros de las unidades constitucionales de estos polímeros con (met)acrilato de alquilo, tal como se muestra con las siguientes fórmu-
las.

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Dado que poli(N-isopropilacrilamida) tiene un límite inferior de temperatura crítica de 32ºC, un soporte qúimicamente modificado con él experimenta un gran cambio en las propiedades superficiales hidrófilas/hidrófobas a esta temperatura crítica. Cuando se injerta o se recubre la superficie de un relleno cromatográfico con este polímero, varía el poder de retención de una muestra dependiendo de la temperatura. Por consiguiente el comportamiento de retención puede regularse controlando la temperatura sin cambiar la composición del eluato. Se puede conseguir un límite de temperatura crítica inferior de 32ºC o superior copolimerizando la N-isopropilacrilamida con comonómeros que son más hidrófilos que isopropilacrilamida, como por ejemplo acrilamida, ácido metacrílico, ácido acrílico, dimetilacrilamida y vinil pirrolidona. Por otra parte, se puede conseguir un límite inferior de temperatura crítica, por debajo de 32ºC, por copolimerización de la N-isopropilacrilamida con comonómeros hidrófobos, como por ejemplo estireno, metacrilato de alquilo y acrilato de alquilo.

El límite inferior de temperatura crítica de polidietilacrilamida es de aproximadamente 30 a 32ºC. A esta temperatura, dicho polímero experimenta un cambio en la naturaleza de la superficie hidrófila/hidrófoba. De manera similar al caso de poli(N-isopropilacrilamida) que se ha mencionado, se puede regular así el poder de retención de la muestra controlando la temperatura. El nuevo soporte cromatográfico que se utiliza en la presente invención se prepara por modificación química o recubrimiento del soporte con un polímero. La modificación química se puede llevar a cabo a través de dos métodos, es decir, injerto superficial y polimerización de radicales. En el caso del recubrimiento, por otra parte, se insolubiliza el polímero dentro del intervalo de temperatura de aplicación y después se emplea el producto insolubilizado en el recubrimiento.

Tal como se ha descrito anteriormente, se puede recurrir a el injerto superficial y la polimerización de radicales como medios de modificación química a través de los cuales se introduce en un soporte un polímero sensible a la temperatura. En el método de injerto superficial, se sintetiza en primer lugar un polímero sensible a la temperatura de un apresto definitivo y después se injerta en el soporte. En el método de polimerización de radicales, en contraposición, se polimeriza(n) monómero(s) en la superficie del soporte para dar un polímero. En comparación con el método de injerto superficial, el método de polimerización de radicales hace posible introducir el polímero sensible a la temperatura en la superficie del soporte a una alta densidad. De este modo, se puede elevar la hidrofobia de la superficie del soporte y se puede controlar fácilmente el tiempo de retención. En este caso, además, se puede evitar fácilmente la absorción no específica en la superficie del soporte como consecuencia de la interacción con el gel de sílice.

Entre las sustancias que se pueden separar a través del método de la invención se incluyen elementos metálicos (Cu^{2+}, Mn^{2+}, etc.), fármacos (esteroides, antipiréticos, agentes analgésicos, etc.) y componentes biológicos (péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). El método de la presente invención es particularmente útil para la separación de diversos componentes biológicos que no se pueden separar a través del uso de cromatografía de intercambio iónico o cromatografía en fase inversa en solitario.

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Ejemplos

Para ilustrar con mayor detalle la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos que no deben interpretarse en ningún modo como una limitación.

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Ejemplo 1

1. Síntesis de polímero 1-1) Poli(IPAAm-DMAPAAm) (DMAPAAm: N,N-dimetilaminopropilacrilamida) 1-1-a) Preparación de copolímero IPAAm con un extremo carboxilo

Se sintetizó un copolímero IPAAm que tenía un extremo carboxilo de un modo adecuado para proporcionar un peso molecular de 4.000 como patrón. Se puede designar el peso molecular del polímero controlando la cantidad de ácido 3-mercaptopropiónico (MPA) empleado como agente de transferencia de cadena. Para preparar un copolímero que tiene peso molecular de 4.000, se reguló la cantidad de MPA para dar una relación molar MPA/(IPAAm + DMAPPam) de 0,028.

Monómero IPAAM purificado:: 25,0 g

Monómero catiónico (5% en moles de DMAPPAm en función de IPAAm):: 1,72 g

Iniciador de polimerización de radicales {2,2'-azobis(isobutironitrilo) (AIBN):: 0,145 g

Agente de transfernecia de cadena (ácido 3-mercaptopropiónico):: 0,691 g

DMF (N,N-dimetilformamida):: 50 ml

Se introdujeron los componentes indicados en un tubo de polimerización y se fijaron con un anillo de caucho provisto de una llave de tres pasos. Se introdujo el tubo de polimerización en nitrógeno líquido, al mismo tiempo que se cerraba la llave, y se congeló completamente. A continuación, se abrió la llave y se desgasificó el contenido del tubo utilizando una bomba de vacío. Después de cerrar de nuevo la llave, se introdujo el tubo de polimerización en metanol y se disolvió completamente la muestra de tubo. Se repitió este procedimiento tres veces (método de desgasificación congelado/descongelado). A continuación, se introdujo el tubo de polimerización que contenía la muestra completamente desgasificada a presión reducida en un termostato con agitación a 70ºC y se llevó a cabo la polimerización de radicales durante 2 horas para sintetizar así un copolímero que tenía un grupo carboxilo en uno de los extremos. Una vez completada la reacción, se enfrió al mezcla de reacción a temperatura ambiente dejándolo en reposo. A continuación, se concentró el disolvente (DMF) por destilación a 40ºC a presión reducida y se hizo gotear el residuo en éter dietílico enfriado con hielo para dar así un polímero. Se extrajo el polímero así obtenido por filtración y se secó a la temperatura ordinaria a presión reducida durante toda la noche. Se disolvió el producto seco en acetona y se volvió a purificar con éter dietílico. Se extrajo el polímero así obtenido de nuevo por filtración y se secó a la temperatura ordinaria a presión reducida durante toda la noche. A continuación, se disolvió el polímero obtenido en agua purificada para dar una solución al 5% (peso/v). Se transfirió la solución resultante a una membrana de diálisis de un peso molecular fraccionado de 500 y se dializó durante 3 días. De esta forma, se pudo obtener un copolímero de alta pureza que tenía un peso molecular uniforme.

1-1-b) Introducción de copolímero IPAAm en el soporte (a) Método de esterificación activa (succinilación)

Para succinilar el copolímero antes sintetizado, se ajustó la relación molar del copolímero: N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC): N-hidroxisuccinimida a 1:2,5:2.

Se introdujo el copolímero en un matraz de fondo redondo y se disolvió en una cantidad media (25 a 30 mL) de acetato de etilo. A continuación, se añadió N-hidroxisuccinimida y DCC al mismo seguido de la disolución en el acetato de etilo residual. Se sumergió la mezcla obtenida en agua con hielo a 4ºC y se agitó con un mecanismo de agitación durante 2 horas. A continuación, se introdujo en un termostato a 25ºC y se agitó durante toda la noche. Se filtró la solución y, de esta manera, se formó diciclohexil urea como un subproducto. Tras la concentración a presión reducida, se purificó el residuo con éter dietílico. Se extrajo el producto así obtenido por filtración y se secó a presión reducida. Se almacenó el copolímero succinilado así obtenido en un congelador.

1-1-c) Introducción en el soporte (gel de sílice)

Se hizo reaccionar el copolímero succinilado en tres porciones con gel de sílice de aminopropilo con el uso de 1,4-dioxano como disolvente. Se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente (25ºC). En primer lugar, se disolvió el polímero succinilado (1,0 g) en 1,4-dioxano (50 mL) y se hizo reaccionar con gel de sílice de aminopropilo (3 g) en un termostato con agitación durante toda la noche. A continuación, se filtró la mezcla de reacción líquida y se disolvieron el precipitado así obtenido y copolímero nuevo (1,0 g) en 1,4-dioxano (50 mL) de nuevo y se dejó reaccionando toda la noche. Después de repetir este procedimiento una vez más, se lavó suficientemente el producto que se extrajo finalmente por filtración con metanol (500 mL) y agua destilada (2 mL), se secó a presión reducida y después se almacenó en un desecador como un relleno.

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Ejemplo 2

1-2) Preparación de la superficie de hidrogel de PIPAAm 1-2-a) Formación de una capa de gel en superficie de gel de sílice de aminopropilo

Para introducir el iniciador de polimerización en el gel de sílice de aminopropilo, se utilizaron los siguientes compuestos:

Gel de sílice de aminopropilo:: 5 g

V-501:: 3,5 g (12,5 mmoles)

EEDQ:: 6,18 g (25,0 mmoles)

DMF:: 50 ml

Se utilizó V-501 [4,4'-azobis(ácido 4-cianovalérico) (peso molecular: 280,28)] como iniciador de polimerización y EEDQ [N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinoleína, peso molecular: 247,30] como agente de condensación en la cantidad que se ha especificado antes. Se hicieron reaccionar estos compuestos con gel de sílice de aminopropilo en DMF. Después de la introducción de burbujas de gas N_{2} dentro, en la oscuridad, durante 30 minutos, se cargó completamente el recipiente de reacción con N_{2} y se llevó a cabo la reacción utilizando un balón de N_{2} a temperatura ambiente durante 6 horas. Una vez completada la reacción, se filtró la mezcla y se lavó con DMF. De esta manera, se introdujo el iniciador de polimerización en la superficie del gel de sílice de aminopropilo.

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1-2-b) Formación de la capa de gel superficial

Gel de sílice que tenía V-501 unido a él preparado en el punto 1-2-a) anterior:: \\[2.1mm]{}\hskip0.9cm 4 g

IPAAm: 10 g

BIS: 0,27 g

EtOH: 200 ml

DMAPAAm: cantidad suficiente para dar una relación molar con IPAAm de 8:1 ó 9:1

Se disolvieron gel de sílice, IPAAm, DMAPAA y BIS [N,N'-metilen-bis(acrilamida), peso molecular: 154,17] en etanol. Después de introducir burbujas de gas N_{2}, en la oscuridad, durante 1 hora, se cargó completamente el recipiente de reacción con N_{2} y se llevó a cabo la reacción en un baño de aceite a 70ºC utilizando un balón de N_{2} durante 5 horas, formando de este modo una capa de gel sobre la superficie de PIPAAm. Una vez completada la reacción, se filtró la mezcla y se lavó con metanol y agua. Se secó el producto obtenido a presión reducida y se almacenó en un desecador como relleno. Se rellenó con ello una columna de acero inoxidable y se empleó en análisis.

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Ejemplo 3

Se separaron aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico en las siguientes condiciones utilizando columnas rellenas con gas cargado positivamente (IPAAm: DMAPAAm = 8:2) e hidrogel IPAAm.

Condiciones de separación

Columna:: (1) rellena con sílice modificado con hidrogel poli(IPAAm)

\quad: (2) rellena con sílice modificada con hidrogel poli(IPAAm-co-DMPAAm) (8:2)

Tampón: Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3}.

pH = 9,0

Concentración iónica = 0,1 M

En la figura 1 se muestran los resultados. No se pudo separar la aspirina de ácido benzoico utilizando la columna rellena con hidrógel IPAAm. En contraposición, se pudieron separar estos compuestos uno de otro utilizando la columna rellena con gel cargado positivamente (IPPAm : DMAPPAAm = 8:2). A 10ºC, en particular, los cuatro compuestos, incluyendo los cargados y los que no tenían carga, se pudieron separar unos de otros en el plazo de un corto período de tiempo, de aproximadamente 20 minutos. El orden de separación dependió de los grados de hidrofobia de estos compuestos. En los casos de ácido salicílico y ácido benzoico, los tiempos de retención se acortaron cuando se elevó la temperatura. Esto se produce aparentemente porque al elevar la temperatura, se cambiaron la estructura y las propiedades físicas del polímero sensible a la temperatura y se redujo de este modo la carga en la superficie del soporte para reducir la interacción entre la superficie y los solutos. Por el contrario, salicilato de metilo (es decir el compuesto sin carga) presentó un tiempo de retención prolongado cuando se elevó la temperatura. Aparente, esto se debe a que el polímero sensible a la temperatura se hizo hidrófobo debido al aumento de la temperatura.

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Ejemplo 4

Efectos del cambio de pH

Se separaron aspirina, ácido silícico, salicilato de metilo y ácido benzoico según el mismo método que el del ejemplo 3 pero utilizando la columna rellena con sílice modificado con hidrogel de poli(IPAAm-co-dMAPAAm) (8:2) del ejemplo 3 y NaHPO_{4}/H_{3}C_{6}H_{5}=7 [ácido cítrico H_{2}O (monohidrato)] como tampón a pH 7,0. En la figura 2 se muestran los resultados.

En la figura 2 se indica que los tiempos de retención de todas las sustancias se prolongaron a un pH de 7,0, en comparación con un pH de 9,0. Esto se debe aparentemente a que los compuestos aniónicos hayan sufrido interacciones más fuertes con la superficie de soporte de carga positiva a un pH 7,0. Estos resultados sugieren que los tiempos de retención de las sustancias que se separen se puedan controlar regulando el valor del pH.

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Ejemplo 5

Efecto de la concentración iónica

Se separaron aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico utilizando una columna rellena con la sílice modificada con hidrogel de poli(IPAAm-co-DMAPAAm) (8:2) del ejemplo 3 en las siguientes condiciones de separación.

Condiciones de separación

Tampón: NaHPO_{4}/H_{3}C_{6}H_{5}O_{7}

pH = 7,0

Resistencia iónica = 1,0 M y 0,1 M.

En la figura 3 se muestran los resultados. Cuando se elevó la concentración iónica (0,1 M a 1,0 M), se acortaron todos los tiempos de retención de todos los compuestos, a excepción del salicilato de metilo sin cargar, al mismo tiempo que se prolongó el tiempo de retención del salicilato de metilo. Esto se debe aparentemente a que cuando se elevó la concentración iónica, se suprimió la protonación de los grupos amino de la superficie del soporte y se redujo la carga positiva, lo que debilitó las interacciones de la superficie del soporte con los compuestos aniónicos. En el caso del salicilato de metilo, se elevó la hidrofobia con un aumento de la concentración iónica y, a su vez, aparentemente se reforzó la interacción hidrófoba.

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Ejemplo 6

Efecto de la relación de polimerización de IPAAm a DMAPAAm

Se separaron aspirina, ácido salicílico, salicilato de metilo y ácido benzoico en las siguientes condiciones.

Condiciones de separación

Columna:: (1) rellena con sílice modificado con hidrogel poli(IPAAm-co-DMAPAAm) (9:1)

Tampón: NaHPO_{4}/H_{3}C_{6}H_{5}O_{7}.

pH = 9,0

Concentración iónica = 0,1 M

En la figura 4 se muestran los resultados. Se prolongaron los tiempos de retención con un aumento de la relación de polímero de carga positiva, lo que indica que se puede controlar el tiempo de retención regulando la relación de polimerización.

Aplicación industrial

La presente invención presenta las siguientes ventajas.

1) La carga de un agente de intercambio iónico expuesto en la superficie de un soporte se puede controlar arbitrariamente regulando la temperatura. Se puede llevar a cabo la separación en una sola fase móvil acuosa sin cambiar el disolvente de la fase móvil.

2) Debido a las diferencias de la hidrofobia y las propiedades iónicas, se puede llevar a cabo la separación a través de una sola operación. En comparación con los métodos convencionales, en los que se necesitan dos operaciones de separación, por tanto, el método de la presente invención es altamente eficaz y proporciona un alto rendimiento.

3) El método de la presente invención hace posible separar componentes biológicos que no se pueden separar por cromatografía de intercambio aniónico o por cromatografía en fase inversa en solitario.

4) Dado que no se utiliza ni ácido ni disolvente orgánico en el método de la presente invención, se pueden separar los componentes biológicos sin deteriorar sus actividades.

5) En comparación con los agentes de intercambio iónico convencionales, el relleno de la presente invención se puede regenerar rápidamente.

Claims

1. Un método para separar sustancias separando cromatográficamente dichas sustancias con el uso de un relleno que contiene un polímero y una fase móvil acuosa caracterizado porque dicho copolímero tiene grupos de intercambio iónico cargados, cambiándose la densidad de carga efectiva al cambiar la temperatura o el pH en el método, siendo dicho copolímero un copolímero de polialquilacrilamida que tiene grupos amino, carboxilo o sulfonato en las cadenas laterales o en los extremos.

2. El método para separar las sustancias tal como se ha señalado en la reivindicación 1, en el que el copolímero es un copolímero de monómeros de alquilacrilamida con monómeros seleccionados del grupo que consiste en dialquilaminoalquil (met)acrilamida, (met)acrilato de dialquilaminoalquilo, (met)acrilato de aminoalquilo, aminoestireno, aminoalquil estireno, aminoalquil (met)acrilamida, sales de (met)acrilamido-alquiltrimetilamonio, ácido acrílico, ácido metacrílico y ácido (met)acrilamido-alquilsulfónico.

3. El método para separar las sustancias tal como se ha señalado en la reivindicación 2, seleccionándose dichos monómeros de alquilacrilamida del grupo que consiste en N-isopropilacrilamida, N-n-propilacrilamida, N,N-dietilacrilamida y acriloílprirrolidina.

4. El método para separar las sustancias tal como se ha señalado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, seleccionándose las sustancias entre elementos metálicos, fármacos y componente biológicos.

5. Un relleno cromatográfico que contiene un copolímero de N-isopropilacrilamida y N,N-dimetilaminopropilacrilamida.