ES2319009A1 - Metodo de identificacion de especies de la superfamilia penaeoidea mediante analisis de adn. - Google Patents
Metodo de identificacion de especies de la superfamilia penaeoidea mediante analisis de adn. Download PDFInfo
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Abstract
Método de identificación de especies de la
superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.
La presente invención se refiere a un método de
identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea
mediante análisis de ADN que comprende:
A. Extracción y aislamiento del ADN a partir de
una muestra biológica o alimentaria.
B. La posterior amplificación mediante el uso de
cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su
complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada
por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos
un 90% de identidad con SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2.
C. Digestión de la secuencia nucleotídica
amplificada mediante los enzimas de restricción Alul, Taql o
Hinfl.
D. Detección de los fragmentos obtenidos en el
paso anterior.
E. Identificación de las especies por
comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el
patrón de fragmentos característico de cada especie.
Description
Método de identificación de especies de la
superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.
La presente invención se refiere a un método de
identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea
mediante análisis de ADN.
Diversos países, entre ellos los países
integrantes de la Unión Europea, destacan entre sus objetivos
prioritarios lograr la transparencia en los mercados pesqueros y
ofrecer al consumidor información fiable sobre los productos que va
a consumir. Este hecho resulta fundamental en un mercado cada vez
más globalizado donde se pueden encontrar varias especies distintas
bajo una misma denominación. Este es el caso concreto de las
especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea. La
incorrecta catalogación, debida a que, entre otras cosas, especies
de origen y características muy diversas no son adecuadamente
identificadas, puede ocasionar problemas de sustituciones que
afectarían tanto al etiquetado como a la actividad comercial del
sector y al propio consumidor.
En el mercado existe una notable heterogeneidad
de las especies y géneros que constituyen los principales
"nombres comerciales" de langostinos peneidos. Cabe destacar
que bajo los términos "langostino banana", "langostino
blanco" o "langostino tigre" se encuadran distintas
especies de peneidos e incluso distintos géneros. Otro ejemplo es la
cada vez más frecuente comercialización de gamba pelada donde se
engloban diversas especies de langostinos cuya diferenciación en
base a criterios morfológicos es complicada.
Estos ejemplos ilustran la importancia de la
correcta identificación de estas especies marinas tanto de origen
pesquero como procedentes de la acuicultura.
Sin embargo, la situación actual es de carencia
de métodos fiables de identificación de especies de crustáceos
pertenecientes al Orden Decapoda, que engloba a las
principales especies de langostinos y gambones.
Se han realizado con anterioridad estudios
filogenéticos con el objetivo de relacionar distintas especies
dentro de la superfamilia Penaeoidea, en los que se ha
trabajado con la clonación, secuenciación y comparación de
secuencias nucleotídicas del ADN. En concreto, en el artículo de
nombre "Sequence and Conservation of a RNA and tRNA^{Val}
Mitocondrial Gene Fragment from Penaeus californiensis and
Comparison with Penaus vannamei and Penaeus
stylirostris " de Luis Enrique
Gutiérrez-Millán et al (Marine Biotechnology
4, 392-398, 2002) se realizó un estudio donde se
utilizaba una secuencia nucleotídica de 1.38 Kb que abarcaba un
fragmento de los genes mitocondriales 16S rRNA y 12S rRNA y la
secuencia completa del gen mitocondrial tRNA^{Val} para el estudio
de las relaciones filogenéticas entre las especies Penaeus
californiensis, Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris.
Sin embargo, este estudio no aporta un método para la
identificación de las citadas especies.
En el artículo "Species identification of
Five Penaeid Shrimps using PCR-RFLP and SSCP
analyses of 16S Ribosomal DNA" de Bavornlak Khamnamtong
et al, (Journal of Biochemistry and Molecular Biology Vol 38
No. 4 July 2005, pp 491-499) se cita un método para
la identificación de especies de peneideos en base al polimorfismo
del gen 16S rRNA en el cual abarcaban únicamente las especies P.
monodon, P. semisulcatus, Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus
merguiensis y Marsupenaeus japonicus. En dicho método se
describe el proceso de obtención de nuevos cebadores específicos
por amplificación de las regiones del ADN correspondientes a los
genes COI - COII y 16S rRNA mediante PCR utilizando cebadores
universales y el posterior alineamiento de las secuencias
obtenidas, con el fin de encontrar secuencias conservadas en las
distintas especies de peneidos que pudieran servir como
cebadores.
cebadores.
Con los nuevos cebadores obtenidos, 16S 312
Forward y 16S 312 Reverse, amplificaron una secuencia de 312 pb del
16S rDNA. Los productos amplificados fueron sometidos a digestión
por separado con los enzimas de restricción AluI,
SspI y VspI y posteriormente a electroforesis. Se
obtuvieron patrones de bandas para la identificación de las especies
P. monodon, P. semisulcatus, L. vannamei, F. merguiensis y
M. japonicus. Sin embargo, en el caso de algunas de estas
especies (P. semisulcatus, M. japonicus y L.
vannamei), no lograron dilucidar de qué especie se trataba ya
que presentaban los mismos patrones de corte.
A la vista de los intentos anteriormente
realizados, podemos observar cómo aún persiste la necesidad de
encontrar un sistema que proporcione soluciones a los problemas
planteados a la hora de realizar una correcta identificación de
especies pertenecientes a la superfamilia Peneaoidea.
De acuerdo con la presente invención, los
autores proporcionan un método de identificación de langostinos
capaz de identificar al menos 24 especies pertenecientes a la
superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN previamente
aislado.
En la presente invención se logra la correcta
identificación de especies comerciales por medio de un método
fiable, que cumple con una serie de requisitos entre los que cabe
destacar los siguientes: que permite la identificación de un gran
número de especies dentro de la misma familia, resulta fiable, se
minimiza el margen de confusión, siendo a la vez sencillo y
reproducible. Por otro lado, este método utiliza marcadores
susceptibles de ser seguidos durante toda la vida útil del
producto, con el fin de garantizar su trazabilidad.
En la presente invención se identifican las
secuencias nucleotídicas que van a ser utilizadas en los ensayos de
identificación de especies pertenecientes a la superfamilia
Penaeoidea y se desarrollan los cebadores que resultan
necesarios para la implantación de sistemas de trazabilidad.
La presente invención versa sobre un método de
identificación de especies pertenecientes a la superfamilia
Penaeoidea cuyos aspectos fundamentales son:
- \bullet
- La extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria,
- \bullet
- La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2
- \bullet
- La digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI
- \bullet
- La detección de los fragmentos de restricción obtenidos en el paso anterior
- \bullet
- La identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos de restricción característico de cada especie.
En una realización preferida la secuencia
amplificada en la presente invención está comprendida entre SEQ ID
N° 1 y SEQ ID N° 2.
De aquí en adelante nos referiremos a las
secuencias nucleotídicas aisladas susceptibles de ser amplificadas
mediante el uso de cebadores y que se encuentran comprendidas entre
las SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2 o entre secuencias con un grado de
identidad de al menos el 90% con SEQ ID n° 1 y SEQ ID N° 2, y a sus
secuencias complementarias, como secuencias nucleotídicas de la
invención.
En una realización preferida, los cebadores
utilizados para la amplificación de las secuencias nucleotídicas de
la invención son un cebador directo que comprende la SEQ ID N° 3
(16S CRUC3), y un cebador reverso que comprende la SEQ ID N° 4 (16S
CRUC4).
Estos cebadores permiten la amplificación de
todas las especies que habitualmente se pueden encontrar en el
mercado y de aquí en adelante nos referiremos a ellos como
cebadores de la invención.
En otra realización preferida las secuencias
nucleotídicas amplificadas se seleccionan de cualquiera de las
secuencias SEQ ID N° 7 a SEQ ID N° 33.
Otra realización preferida de la invención es la
amplificación de las secuencias nucleotídicas de la invención
mediante PCR. En la PCR, la temperatura de anillamiento varía entre
51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que presentan
las secuencias manejadas para los distintos langostinos.
En otra realización preferida la detección e
identificación de los fragmentos se realiza mediante
electroforesis.
En otra realización preferida de la invención la
identificación de las especies se realiza por comparación de los
patrones de tamaño de fragmentos de restricción obtenidos, con los
reflejados en la tabla 1.
En una realización preferida de la invención el
presente método permite identificar al menos cualquiera de las
especies de la siguiente lista: Penaeus monodon, Penaeus
semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus
stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus
brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus,
Farfantepenaeus californiensis, Fenneropenaeus indicus,
Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29,
Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus
sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21,
Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera
sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y
Aristeomorpha foliacea.
Otras especies pertenecientes a la superfamilia
Penaeoidea susceptibles de ser identificadas mediante el
método de la presente invención quedarían dentro de las
realizaciones de la presente invención.
La enzima de restricción AluI, mediante
la digestión de las secuencias nucleotídicas de la invención,
genera patrones de bandas que permiten diferenciar al menos
cualquiera de las especies citadas a continuación: Penaeus
monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus
stylirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus
notialis, Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus,
Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus
sp. 21, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15,
Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y
Aristeomorpha foliacea.
Por otro lado, para los casos en los que,
mediante los ensayos realizados según el método de la presente
invención utilizando como enzima de restricción AluI,
persistan dudas sobre la correcta identificación, existen ensayos
complementarios mediante la utilización de los enzimas de
restricción TaqI o de HinfI, que permiten confirmar la
especie a la que pertenece la muestra biológica o alimentaria a
evaluar.
En concreto,
- \bullet
- la utilización de la enzima de restricción TaqI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus aztecus y Farfantepenaeus californiensis.
- \bullet
- la utilización de las enzimas de restricción TaqI y HinfI mediante ensayos independientes realizados según el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Litopenaus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis y Fenneropenaeus sp. 29, las cuales son claramente diferenciables.
- \bullet
- la utilización de la enzima de restricción HinfI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Metapenaeus sp. 9 y Parapenaeus longirostris.
Los enzimas de restricción utilizados en la
presente invención evitan zonas de corte que presentan variabilidad
intraespecífica, lo cual contribuye a minimizar el margen de
confusión entre distintas especies.
Las secuencias nucleotídicas de la invención
están caracterizadas por presentar tamaños variables en especies
muy próximas. El tamaño que dichas secuencias amplificadas
presentan, por un lado facilita su amplificación y por otro lado
permite el análisis e identificación en productos procesados donde
el ADN se encuentra parcialmente degradado. Preferiblemente este
tamaño se encuentra entre 515 y 535 pb aproximadamente.
En este documento se entiende por "secuencia
nucleotídica" cualquier polímero de nucleótidos compuesto por
dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, unidos entre sí por puentes fosfodiéster. Las
"secuencias nucleotídicas" incluyen ácido desoxirribonucleico
(ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, y fragmentos
generados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o por
otros métodos que incluyen pero no se limita a ligamiento, escisión,
acción de endonucleasas y acción de exonucleasas.
Por "nucleótido" se entiende una unidad
monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa),
un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases
del ADN son adenina ("A"), guanina ("G"), citosina
("C") y timina ("T"). Las cuatro bases del ARN son A, G, C
y uracilo ("U").
Por "secuencia nucleotídica aislada" se
entiende una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el
ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico
puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse
usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación
por PCR, clonación, etc.), o puede sintetizarse químicamente. La
molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente
natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un
híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede
ser monocatenaria o bicatenaria.
Por "enzimas de restricción" se entiende
enzimas endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del
material genético a partir de una secuencia que reconocen (diana de
restricción). Las dianas de restricción cuentan con entre 4 y 12
pares de bases y son palindrómicas. Estas enzimas permiten cortar
ADN bicatenario rompiendo 2 enlaces fosfodiéster en la doble cadena
y dando lugar a dos extremos del ADN, que pueden ser Romos o
Cohesivos/
escalonados.
escalonados.
Por "PCR", Reacción en Cadena de la
Polimerasa, se entiende una técnica de biología molecular que
permite amplificar un fragmento de ADN, gracias a la acción de las
ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea
ciclos de altas y bajas temperaturas alternados, para separar las
hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de
replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a
polimerasas para que vuelvan a
duplicarlas.
duplicarlas.
En este documento se entiende por
"electroforesis" una técnica para la separación de moléculas
(proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño
molecular, conformación, el tamaño de los poros del gel o la
magnitud de la carga neta de la molécula y carga eléctrica. Para la
separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida. Las moléculas
cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo
de corriente eléctrica. Al exponer la mezcla de moléculas a un
campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando a través del
gel, por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente.
Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán
cerca del lugar de partida.
Los fragmentos generados a partir de una
molécula de ADN por corte con enzimas de restricción pueden ser
separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis.
Los fragmentos de ADN migrarán de un modo inversamente proporcional
al logaritmo de su tamaño o peso molecular.
El movimiento de los fragmentos de ADN genera un
"patrón de bandas", donde cada banda corresponde a un
fragmento de un tamaño particular. El tamaño de cada fragmento
puede ser determinado utilizando un marcador de ADN cuyos
fragmentos tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve
de control y migrará paralelo a las bandas de ADN que deseamos
analizar.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto la efectividad del método de detección anteriormente
descrito.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El ADN de los langostinos fue extraído a partir
de porciones de 250 mg de músculo esquelético de cada una de las
muestras investigadas, mediante el método comercial (DNeasy Tissue
Isolation kit, QIAGEN, Darmstadt, Germany), que consta de dos
fases:
\vskip1.000000\baselineskip
- Se cortó el músculo en pequeños pedazos para que la tisis fuera más eficiente. Se pesaron 250 mg. de muestra en un tubo microcentrífuga de 1,5 ml y se le añadieron 180 \mul de buffer ATL y 20 \mul de proteinasa K. Se agitó vigorosamente el tubo de microcentrífuga (Mixtub Raypa) y se incubó en el termomezclador (Thermomixer Comfort, Eppendorf) a 55°C durante 1-3 horas o bien toda la noche para que la tisis fuera eficiente. En algunos casos se añadieron 4 \mul de RNasa (100 mg/ml) y se agitó vigorosamente.
- Después se mantuvieron las muestras durante 2 minutos a temperatura ambiente (18-20°C), se agitaron durante 15 segundos y se les añadió 200 \mul de buffer AL a cada muestra. Se agitó cuidadosamente y se incubó a 70°C durante 10 minutos. A continuación se añadieron 200 \mul de etanol (96-100%) en la muestra y se agitó suavemente.
\vskip1.000000\baselineskip
- Se transfirieron las muestras que habían completado la tisis a una membrana (DNasy Mini Spin column) en un tubo colector de 2 ml. La muestra se centrifugó en microcentrífuga (modelo 5415 D, Eppendorf) a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se transfirió el DNasy Mini Spin column a otro tubo de colector de 2 ml, y se añadieron 500 \mul de buffer AW1. Se sometió a centrifugación a 8.000 rpm durante 1 minuto y se descartaron el tubo colector y su contenido. Se repitió el paso anterior añadiendo 500 \mul de buffer AW2 y se centrifugó a 13.000 rpm durante 3 minutos.
- Finalmente, el DNeasy Mini Spin Column fue transferido a un tubo colector de 1,5-2 ml, y se añadieron 100-200 \mul de buffer AE directamente sobre la membrana DNeasy. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto y después se centrifugó a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se descartó el DNeasy Mini Spin column y se recuperó el extracto del ADN purificado obtenido.
El ADN extraído fue cuantificado mediante
fluorimetría utilizando el método de Downs y Wilfinger (Downs y
Wilfinger, 1983) y un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer- fluorometer,
Applied Biosystems, Foster City, CA) mediante la determinación de
la fluorescencia obtenida al mezclar un volumen conocido del
extracto del ADN con el reactivo Hoechst 33258 (The Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), compuesto por 1 bis-benzimida,
la cual se intercala entre las moléculas de ADN. La longitud de
onda de excitación de esta molécula está en el ultravioleta próximo
(350 nm) mientras que la longitud de onda de emisión se encuentra
en la región azul (450 nm). La sensibilidad del ensayo con el
Hoechst 33258 (Sigma) es de 5 ng/ml aproximadamente. Las medidas se
llevaron a cabo en un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer).
\newpage
Para llevar a cabo la medida de la fluorescencia
se preparó cada vez 100 ml de disolución fresca de Hoechst de la
siguiente manera:
- \bullet
- 10 ml de TNE 10X
- \bullet
- 10 \mul de Hoechst (1 mg/ml)
- \bullet
- 90 ml de agua Milli-Q
\vskip1.000000\baselineskip
La composición del TNE 10X es la siguiente:
- \bullet
- 12.11 g de Tris; (hidroximetil) aminometano (Merck)
- \bullet
- 3.72 g de EDTA (Calbiochem)
- \bullet
- 116.89 g de cloruro sódico (Merck)
- \bullet
- Hasta 800 ml de agua Milli-Q
- \bullet
- pH=7.4; ajustar con HCI (Merck) concentrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon soluciones control y estándar.
Como solución control, dependiendo de la concentración final que
estimamos obtener en las muestras, se prepararon dos tipos de
soluciones de ADN de calf-thymus (Sigma), una de
bajo rango, con rangos de concentración entre 10 y 150 ng/ml y otra
de rango más elevado, con unas concentraciones entre 100 y 1000
ng/ml.
Para calcular la concentración de ADN de cada
muestra, se tomaron 4 \mul de cada muestra de ADN extraído, se
añadió el tampón TNE Hoechst 33258 (NaCl 0.2 M,
Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) para un volumen
total de 2000 \mul en la cubeta. Se mezclaron la disolución de
Hoechst-TNE y el ADN a fin de medir la intensidad
de cada muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En el presente ejemplo se describe cómo se
procedió al diseño de cebadores en una zona conservada del gen 16S
rRNA.
Se estudiaron 70 secuencias de ADN del gen 16S
rRNA y tRNA^{Val} del ADN mitocondrial, que comprenden 20
especies de la superfamilia Penaeoidea de interés comercial
en el sector alimentario, dentro de las cuales se encuentran las
siguientes especies: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus,
Litopenaeus vannamei, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus
brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus,
Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29,
Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus
sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21,
Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera
sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y
Aristeomorpha foliacea. Todas estas especies pertenecen a la
superfamilia Penaeoidea, que a su vez pertenece al Orden
Decapoda.
Una vez purificado el ADN según se expone en el
ejemplo 1, se procedió a amplificar la zona del ADN mitocondrial de
interés. Para ello se buscaron oligonucleotidos en las regiones 16S
rRNA, tRNA^{Val} y 12S rRNA.
Los cebadores fueron diseñados en base a los
alineamientos de secuencias completas publicadas del orden
Decapoda, buscando zonas conservadas del gen 16S rRNA.
Las secuencias que se alinearon para el diseño
de los cebadores se mencionan a continuación, y están depositadas
en la base de datos del GenBank: Penaeus monodon
(NC_002184), Penaeus monodon (AF217843), Marsupenaeus
japonicus (AP006346), Marsupenaeus japonicus
mitochondrion (NC_007010), Callinectes sapidus
(NC_006281), Callinectes sapidus (AY363392), Panulirus
japonicus (NC_004251), Panulirus japonicus (AB071201),
Portunus trituberculatus (NC_005037) Portunus
trituberculatus (AB093006), Pagurus longicarpus
(NC_003058), Pagurus longicarpus (AF150756).
Se seleccionaron los oligonucleotidos 16S CRUF
(SEQ ID N° 5) y 16S CRUR (SEQ ID N° 6) como cebadores, que caían en
las regiones 16S rRNA y tRNA^{Val}, respectivamente. Los
cebadores fueron diseñados en base a estos oligonucleótidos
mediante el programa PrimerExpress de Applied Biosystems.
\newpage
Para la amplificación mediante PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) de las secuencias de ADN reconocidas por
los cebadores 16S CRUF y 16S CRUR, que amplifican un fragmento de
966 bp, las condiciones seleccionadas fueron:
- \bullet
- se suplementó la mezcla de reacción con MgCl_{2} a una concentración final de 2.0 mM.
- \bullet
- la desnaturalización inicial se realizó a 94°C durante 90 segundos
- \bullet
- se sometió a 35 ciclos (94°C durante 20 segundos, 51-55°C durante 20 s, 72°C durante 30 segundos)
- \bullet
- la extensión final se realizó a 72°C durante 15 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La temperatura de anillamiento varió entre 51°C
y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las
secuencias manejadas para los distintos langostinos.
Los productos obtenidos en la PCR se procesaron,
con vista a detectar la presencia de ADN, mediante electroforesis
horizontal en gel de agarosa al 2,5% en tampón TAE 1X
(Tris-acetate-EDTA) con 0.5
\mug/ml del bromuro de etidio (Merck, Darmstadt, Germany).
Se cargaron en el gel 5 \muL de cada muestra mezclados con
3-4 \mul de tampón de carga. Las condiciones de
electroforesis fueron: 1 hora a 100 V. La visualización de los
fragmentos amplificados, o amplicones, se realizó en un
transiluminador de luz ultravioleta (254 nm).
La determinación del tamaño de los productos de
amplificación producidos mediante la PCR se llevó a cabo en el
mismo gel, mediante la comparación con el marcador de peso EZ
Load 100 bp Molecular Ruler (Sigma), analizado en paralelo con
las muestras. Este patrón de peso presenta 10 fragmentos de ADN con
los siguientes tamaños: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300,
200 y 100 pb.
Por otro lado, los productos de PCR amplificados
fueron purificados mediante el kit ExoSAP-IT
(GE Healthcare - Amersham Biosciences) con el fin de
eliminar componentes de la reacción (primers, dNTPs, sales, etc)
que pudieran interferir en la reacción de secuenciación.
La secuenciación directa de los amplicones
purificados se realizó mediante el método comercial BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems). Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación,
se emplearon los mismos cebadores de la PCR, realizándose la
secuenciación en ambos sentidos de las hebras de ADN con el fin de
poder comparar ambas hebras y poder así tener mayor información
acerca de las secuencias de las muestras de langostinos. Una vez
finalizada la secuenciación se añadieron 4 \muL de
formamida/EDTA-dextran blue (5/1) y las muestras se
desnaturalizaron 2 min a 90°C. Las reacciones de secuenciación se
analizaron en un secuenciador capilar ABI 3730XL DNA
Analyzer (Applied Biosystems).
Las secuencias obtenidas fueron analizadas por
medio de cromatografía. Los cromatogramas de las muestras
secuenciadas se visualizaron mediante el programa bioinformático
CHROMAS Versión 1.45 (Technelysium Pty, Tewantin,
Australia), que permite editar las secuencias nucleotídicas y
copiarlas en formato FASTA. En el estudio filogenético se
incluyeron las siguientes secuencias del gen 16S rRNA depositadas en
las bases de datos publicas (Genbank): Penaeus monodon
(AF217843), Marsupenaeus japonicus (NC_007010),
Marsupenaeus japonicus (AP006346), Litopenaeus
stylirostris (AY046913), Penaeus stylirostris
(AJ297970), Penaeus vannamei (AJ132780), Litopenaeus
vannamei (AY046914), Penaeus setiferus (AJ297971),
Farfantepenaeus californiensis (AY046912) y Penaeus
notialis (X84350).
Las secuencias en formato FASTA se alinearon con
el programa ClustalX 1.83 (Thompson y col., 1997). Posteriormente
se realizó el análisis filogenético de las secuencias alineadas.
Los árboles filogenéticos se obtuvieron empleando el algoritmo de
Neighbor-Joining aplicando el modelo de dos
parámetros de Kimura en el programa MEGA 3.1 (Kumar y col., 2004).
Para evaluar el soporte estadístico de la topología obtenida se
realizó un Bootstrap resampling test con 1.000
replicaciones.
La asignación de genotipos se basó en la
relación filogenética con respecto a muestras utilizadas como
referencia, cuyos fenotipos fueron previamente determinados
mediante análisis morfológico de los caracteres externos.
Basándose en el alineamiento de todas las
secuencias obtenidas mediante la amplificación con los cebadores
que amplifican un fragmento de 966 bp, se llevó a cabo el diseño de
unos nuevos cebadores con el fin de obtener unos cebadores en una
zona conservada, y que amplificasen un fragmento de ADN más corto.
Este fragmento más corto es de gran utilidad para la identificación
de los productos procesados, ya que al estar sometidos a altas
temperaturas, el ADN está parcialmente degradado.
Con los nuevos cebadores diseñados, 16S CRUC3
(SEQ ID N° 3) y 16S CRUC4 (SEQ ID N° 4) se consiguió amplificar el
ADN extraído de la totalidad de las muestras utilizadas para este
estudio. Con estas amplificaciones se llevó a cabo la posterior
digestión con las enzimas de restricción utilizadas en esta
invención.
\newpage
Los nuevos cebadores específicos para
langostinos de la superfamilia Penaeoidea (langostinos
peneidos) amplifican un fragmento de aproximadamente entre 515 bp y
535 bp del gen 16S rRNA y parte del tRNA^{Val}, ambos
pertenecientes al ADN mitocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una vez purificado el ADN según se expone en el
ejemplo 1, se procedió a amplificar con los nuevos cebadores
específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4, la zona del ADN mitocondrial de
interés.
Utilizando los cebadores específicos 16S CRUC3 y
16S CRUC4 se amplificó mediante PCR el ADN de Penaeus monodon,
Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus Litopenaeus vannamei,
Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris,
Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis,
Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis,
Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis,
Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus
latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris,
Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera
agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18,
Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.
Para realizar la amplificación se suplementó la
mezcla de reacción con MgCl_{2} a una concentración final de 2.0
mM, se desnaturalizó a 94°C durante 90 segundos, y se sometió a 35
ciclos (94°C durante 20 segundos, 51-55°C durante
20 s, 72°C durante 30 segundos), con una extensión final a 72°C
durante 15 minutos.
La temperatura de anillamiento varió entre 51°C
y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las
secuencias manejadas para los langostinos peneidos.
La selección de los enzimas de restricción se
llevó a cabo mediante la búsqueda de lugares de restricción en las
secuencias de ADN que habían sido alineadas y editadas en formato
FASTA. Mediante el programa bioinformático Restrictionmapper
versión 3 se seleccionaron las enzimas que permitían la
diferenciación de las especies comerciales de langostinos. Las
enzimas de restricción seleccionadas fueron AluI, TaqI
y HinfI.
Los fragmentos amplificados se sometieron a
digestión por separado con cada uno de los enzimas de restricción
AluI, TaqI y HinfI. Las condiciones de las
reacciones fueron:
- 1.
- 2 \mul de la enzima de restricción
- 2.
- 2 \mul de buffer especifico de la enzima
- 3.
- 8 \mul de amplicón (producto de PCR) y
- 4.
- 8 \mul de agua de PCR, para un volumen total de 20 \mul.
Las muestras se agitaron y centrifugaron unos
segundos y se incubaron durante 1-2 horas a
37°C.
La visualización de los fragmentos de
restricción se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de
agarosa al 2.5% o bien mediante electroforesis en geles analíticos
de poliacrilamida (15% ExcelGel Homogeneous
SDS-PAGE, Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden), siguiendo el protocolo que indica el método. Los geles
fueron procesados a 15°C en una cubeta de electroforesis Multiphor
II equipado con un criostato MultiTemp III, utilizando los ánodos y
cátodos comerciales (ExcelGel Buffer Strips, Amersham Biosciences).
Las condiciones en que se llevó a cabo la electroforesis fueron de
600 V/30 mA/30 W durante 140 min. Los fragmentos fueron
visualizados según el protocolo de tinción de plata (Amersham
Biosciences).
Los resultados obtenidos quedan reflejados en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Universidade de Santiago de
Compostela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de identificación de
diferentes especies de la superfamilia Penaeoidea mediante
análisis de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES11596.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Superfamilia Penaeoidea
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia reconocida por SEQ ID N°
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Superfamilia Penaeoidea
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia reconocida por SEQ ID N°
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo 16SCRUC3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso 16SCRUC4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 16S CRUF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 16s CRUR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Litopenaeus vannamei genotipo
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por los
cebadores SEQ ID N° 3 y SEQ N° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Litopenaeus vannamei genotipo
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia amplificada por los
cebadores SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Litopenaeus stylirostris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID n° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus notialis
genotipo 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus notialis
genotipo 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus setiferus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID Na
3 y SEQ ID N° 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus
brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N°4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus
brevirostris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus aztecus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Farfantepenaeus
californiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fenneropenaeus indicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fenneropenaeus
merguiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fenneropenaeus sp. 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus monodon
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus semisulcatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Marsupenaeus japonicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Melicertus latisulcatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Melicertus sp.30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 515
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aristeomorpha foliacea
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solenocera sp.15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID n°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solenocera agasizzi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pleoticus mulleri genotipo
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Scuencia amplificada por SEQ ID N° 3
y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pleoticus mulleri genotipo
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solenocera sp.18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Metapenaeus sp.9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Metapenaeus sp.21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Parapenaeus longirostris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia amplificada por SEQ ID N°
3 y SEQ ID N° 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
Claims (12)
1. Método de identificación de especies
pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea que
comprende:
- A.
- Extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria.
- B.
- La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2.
- C.
- Digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI.
- D.
- Detección de los fragmentos obtenidos en el paso anterior.
- E.
- Identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos característico de cada especie.
2. Método según la reivindicación anterior donde
la secuencia amplificada en el paso B está comprendida entre SEQ ID
N° 1 y SEQ ID N° 2.
3. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde la amplificación se realiza
utilizando un cebador directo que comprende la SEQ ID N° 3 (16S
CRUC3), y un cebador reverso que comprende la SEQ ID N° 4 (16S
CRUC4).
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la secuencia amplificada se
selecciona de cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 7 a SEQ ID N°
33.
5. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores donde la amplificación se realiza
mediante PCR.
6. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde la detección e
identificación de los fragmentos se realiza mediante
electroforesis.
7. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde la identificación de las
especies se realiza por comparación del patrón de fragmentos
obtenidos con los reflejados en la tabla 1.
8. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores donde las especies identificadas se
seleccionan de la lista que comprende: Penaeus monodon, Penaeus
semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus
stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus
brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus,
Farfantepenaeus callforniensis, Fenneropennaeus indicus,
Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29,
Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus
sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21,
Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera
sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y
Aristeomorpha foliacea.
9. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas
utilizando AluI como enzima de restricción son seleccionadas
de una lista que comprende Penaeus monodon, Penaeus
semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus stylirostris,
Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis,
Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus, Melicertus
latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus sp. 21,
Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera
sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha
foliacea.
10. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas
utilizando TaqI como enzima de restricción son seleccionadas
de una lista que comprende Farfantepenaeus brevirostris,
Farfantepenaeus aztecus o Farfantepenaeus
californiensis.
11. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas
utilizando HinfI como enzima de restricción son
seleccionadas de una lista que comprende Metapenaeus sp. 9 o
Parapenaeus longirostris.
12. Método de identificación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, donde las especies identificadas
mediante ensayos independientes con TaqI y HinfI son
seleccionadas de una lista que comprende Litopenaus vannamei,
Fenneropenaeus merguiensis o Fenneropenaeus sp. 29.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200603211A ES2319009B2 (es) | 2006-12-18 | 2006-12-18 | Metodo de identificacion de especies de la superfamilia penaeoidea mediante analisis de adn. |
| PCT/ES2007/070212 WO2008074909A1 (es) | 2006-12-18 | 2007-12-14 | Método de identificación de especies de la superfamilia penaeoidea mediante análisis de adn |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200603211A ES2319009B2 (es) | 2006-12-18 | 2006-12-18 | Metodo de identificacion de especies de la superfamilia penaeoidea mediante analisis de adn. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2319009A1 true ES2319009A1 (es) | 2009-05-01 |
| ES2319009B2 ES2319009B2 (es) | 2009-10-15 |
Family
ID=39536023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200603211A Active ES2319009B2 (es) | 2006-12-18 | 2006-12-18 | Metodo de identificacion de especies de la superfamilia penaeoidea mediante analisis de adn. |
Country Status (2)
| Country | Link |
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Families Citing this family (2)
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| CN108220455A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-06-29 | 厦门大学 | 基于dna条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法 |
-
2006
- 2006-12-18 ES ES200603211A patent/ES2319009B2/es active Active
-
2007
- 2007-12-14 WO PCT/ES2007/070212 patent/WO2008074909A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GUTIÉRREZ-MILLÁN, L. E., PEREGRINO-URIARTE, A. B., SOTELO-MUNDO, R. et al. Sequence and conservation of a rRNA and tRNAval mitochondrial gene fragment from Penaeus californiensis and comparison with Penaeus vannamei and Penaeus stylirostris. Marine Biotechnology. Septiembre 2002, Vol. 4, Nº 4, páginas 392-398. ISSN 1436-2228. * |
| KHAMNAMTONG, B., KLINBUNGA, S., MENASVETA, P. Species identification of five penaeid shrimps using PCR-RFLP and SSCP analyses of 16S ribosomal DNA. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. Julio 2005, Vol. 38, Nº 4, páginas 491-499. ISSN 1225-8687. * |
| LAVERY, S., CHAN, T. Y., TAM, Y, K., CHU, K. H. Phylogenetic relationships and evolutionary history of the shrimp genus Penaeus s. l. derived from mitochondrial DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution. Abril 2004, Vol. 31, Nº 1, páginas 39-49. ISSN 1055-7903. * |
| QUAN, J., ZHUANG, Z., DENG, J. et al. Phylogenetic relationship of 12 Penaeoidea shrimp species deduced from mitochondrial DNA sequences. Biochemical Genetics. Octubre 2004, Vol. 42, Nº 9-10, páginas 331-345. ISSN 0006-2928. * |
| VOLOCH, C. M., FREIRE, P. R., RUSSO, C. A. M. Molecular phylogeny of penaeid shrimps inferred from two mitochondrial markers. Genetics and Molecular Research. 2005, Vol. 4, Nº 4, páginas 668-674. ISSN 1676-5680. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008074909A1 (es) | 2008-06-26 |
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