ES2317261T3 - Bioensayo de arn. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para caracterizar el estado patológico del riñón de un sujeto, que comprende medir la cantidad de un marcador de ARN de riñón en una muestra de orina obtenida de un sujeto mamífero, en el que el mencionado marcador de ARN de riñón es ARN que tiene una secuencia específica que está transcrita de ADN de la proteína regulada por andrógenos específicos del riñón (KAP).
Description
Bioensayo de ARN.
La presente invención se refiere a
procedimientos para caracterizar el estado patógeno del riñón,
procedimientos para caracterizar un agente, procedimientos para
evaluar características protectoras y terapéuticas de un agente y
procedimientos para controlar el efecto de un agente farmacéutico
sobre el riñón de un sujeto, relacionados con la medida de un
marcador de ARN renal en la orina de un sujeto.
En el campo farmacéutico se han hechos grandes
esfuerzos para minimizar el potencial toxicológico de agentes
farmacéuticos. Entre los riesgos asociados con la exposición a
agentes tóxicos está la posibilidad de causar lesiones o la muerte
a células del cuerpo, lo que puede dar por resultado daños a órganos
vitales.
Mandel y Metais (1948) han dado cuenta del
descubrimiento de ácidos nucleicos extracelulares en plasma
humano.
Lo, K.W. y otros (1999) y Kopreski, M. y otros
(1999) han dado cuenta de la detección de ARN derivado de un tumor
en el plasma de pacientes de cáncer.
Chen, X.Q. y otros (2000) han propuesto el uso
de ARN de telomerasa como marcador de detección en el suero de
pacientes con cáncer de mama.
Poon, L.L. y otros (2000) han dado cuenta de la
presencia de ARN fetal en plasma materno.
La patente U.S. nº. 6.329.179 describe el uso de
ARN extracelular asociado con un tumor o derivado de un tumor
encontrado en circulación en el plasma o fracción de suero sanguíneo
para la detección, control o evaluación de cáncer o afecciones
premalignas.
La patente U.S. nº. 6.156.504 describe la
detección, identificación o control del estado clínico de neoplasias
benignas, premalignas o malignas en seres humanos o animales que
contienen una mutación asociada con la neoplasia mediante detección
del ácido nucleico mutado de la neoplasia en plasma o fracciones de
suero.
La patente U.S. nº. 6.020.124 describe la
detección de ADN soluble para genes mutados y oncogenes en fluidos
biológicos.
Dado que se considera que el ARN es lábil, los
investigadores han examinado posibles mecanismos por los que el ARN
está protegido de la degradación en plasma humano. Hasselmann, D.O.
y otros (2001) han dado cuenta de que, en un modelo in
vitro, el ARNm liberado dentro de cuerpos apópticos por células
de melanoma estaba protegido de la degradación cuando se incubó en
suero humano.
Ng, E.K.O. y otros (2002) han dado cuenta de que
una porción sustancial de ARNm de plasma está asociado a
partículas.
La solicitud de patente U.S. nº. 10/745823,
cedida como es habitual, describe procedimientos para evaluar el
potencial de daño celular de un agente determinando la capacidad del
agente de incrementar la liberación de ARN mensajero en
células.
Entre los procedimientos convencionales
disponibles para determinar si un agente causa lesiones del tejido
y celulares en el riñón están incluidas la medida de las
características físicas y químicas de la orina (por ejemplo, color,
transparencia, olor, volumen, osmolalidad, peso específico, pH y
presencia de sedimentos, proteína, glucosa, bilirrubina, sangre,
urobilinógeno, nitrito y enzimas), la realización de un ensayo de
la función renal, la medida de nitrógeno ureico en sangre y la
medida de creatinina en suero. Sin embargo, la capacidad de usar
tales indicadores para la detección precoz depende de varios
factores, incluida la rapidez de la liberación de enzimas y la
sensibilidad de detección. Por tanto, existe un interés creciente en
descubrir indicadores precoces adicionales o biomarcadores de
toxicidad que tengan una especifidad y una sensibilidad
comparativamente mayores que las de los procedimientos tradicionales
para detectar toxicidad.
La proteína regulada por andrógenos específicos
del riñón (KAP) se expresa en las células epiteliales de los
túbulos convolutados proximales renales. Toole y otros (1979);
Meseguer y Catterall (1987). La molécula-1 de
lesión renal (KIM-1), una proteína de membrana
expresada en las células epiteliales de túbulo proximal, está
regulada por hiperproducción después de lesión isquémica así como
después de tratamiento con los nefrotóxicos,
S-(1,1,2,2-tetrafluoroetil)-L-cisteína
(TFEC), ácido fólico y cisplatino. Ichimura y otros (1998): Ichimura
y otros (2004). La expresión del factor de crecimiento epidérmico
de unión a heparina (HB-EGF) es inducida en el
riñón después de una lesión isquémica y después de tratamiento con
el nefrotóxico cloruro mercúrico. Homma y otros (1995). El
factor-1 de crecimiento de fibroblastos
(FGF-1) y el factor de crecimiento de queratinocitos
(FGF-7), miembros de la familia de factores de
crecimiento de fibroblastos de proteínas y el receptor de
FGF-7, FGFR2 IIIb, son inducidos en el riñón
después de tratamiento con TFEC. Ichimura y otros (1995): Ichimura y
otros (1996). Las proteínas del canal de agua, aquaporina 1, 2 y 3,
se expresan mucho en el riñón. Agre y otros (1993); Fushimi y otros
(1993); e Ishibashi y otros (1994). La glicoproteína de
Tamm-Horsfall se expresa en células epiteliales de
riñón y se localiza en los limbos gruesos ascendentes de los bucles
de Henle y los túbulos contorneados distales del hígado. Sikri y
otros (1981); y Zhu, X. y otros (2002). La expresión del gen de
respuesta del crecimiento precoz, Egr-1, el
protooncogén, c-fos, y el gen de respuesta a
tensión, hsp 70, se activan después de una lesión isquémica del
riñón. Ouellette y otros (1990): Bardella y Comoli (1994).
La presente invención se refiere en parte a
procedimientos para caracterizar el estado patológico del riñón de
un sujeto, que comprenden: medir la cantidad de un marcador de ARN
de riñón en una muestra de orina obtenida de un sujeto mamífero,
preferiblemente un sujeto humano, en los que el mencionado marcador
de ARN de riñón es proteína regulada por andrógenos específicos del
riñón (KAP). En una realización preferente, el mencionado
procedimiento comprende además caracterizar el mencionado sujeto
como que tiene un estado patológico del riñón en el supuesto de que
la mencionada muestra de orina contenga como mínimo una cantidad dos
veces mayor del mencionado marcador de ARN que el medido en un
sujeto de control que no tiene un estado patológico del riñón.
Un aspecto adicional de esta invención
proporciona procedimientos de caracterización de un agente, que
comprenden: tratar un sujeto mamífero no humano con un agente y
medir el efecto del mencionado agente sobre la cantidad de un
marcador de ARN liberado en la orina del mencionado sujeto, en el
que el mencionado marcador de ANR de riñón es KAP.
Otro aspecto de esta invención se refiere a
procedimientos para evaluar las características protectoras del
riñón de un agente, que comprende: tratar un sujeto mamífero no
humano con un primer agente, caracterizándose el mencionado primer
agente por aumentar la cantidad de un marcador de ARN de riñón
liberado en la orina del mencionado sujeto; tratar el mencionado
sujeto con un segundo agente, y medir el efecto del mencionado
segundo agente sobre la reducción de la cantidad del mencionado
marcador de ARN de riñón liberado en la orina del mencionado sujeto
causada por el mencionado primer agente, siendo KAP el mencionado
marcador de ARN.
Otro aspecto de esta invención proporciona
procedimientos para controlar el efecto de un agente farmacéutico
sobre el riñón de un sujeto tratado con un agente farmacéutico, y
medir el efecto del mencionado agente sobre la cantidad de un
marcador de ARN renal liberado en la orina del mencionado sujeto,
siendo KAP el mencionado marcador de ARN.
Los términos usados en esta memoria tienen su
significado usual en la técnica. Sin embargo, para clarificar
incluso más la presente invención y por razones de conveniencia, se
proporciona seguidamente el significado de ciertos términos y
frases de la memoria, incluidos los ejemplos y las
reivindicaciones.
"Agente" significa un medio químico,
biológico o físico para producir un efecto. Un agente puede ser uno
o una combinación de dos o más sustancias bioquímicas, patógenos
biológicos o perturbaciones físicas.
"Secuencia de nucleótidos" y
"polinucleótidos" significa ADN o ARN, sea en forma de cadena
simple o de cadena doble. El término "secuencia complementaria de
nucleótidos" significa una secuencia de nucleótido que se híbrida
(se une) a otra secuencia de nucleótido de acuerdo con el
emparejamiento de un nucleótido de guanidina (G) con un nucleótido
de histidina (C) y un nucleótido de adenosina (A) con un nucleótido
de timidina (T), excepto en ARN en el que T está reemplazado con un
nucleótido de uridina (U) de manera que U se une con A.
"Estado patológico" significa un estado de
anormalidad biológica e incluye estados anormales de un órgano,
tipo de tejido o tipo de célula. El término incluye anormalidad
independientemente de la causa, y puede incluir enfermedades que
derivan de, por ejemplo, anormalidades fisiológicas, anormalidades
genéticas o agentes patógenos, lesiones físicas o toxicidades
causadas por agentes xenobióticos.
"Marcador de ARN" significa un
polinucleótido de ARN, o un fragmento de él, que tiene una secuencia
específica que está transcrita de la información genética de una
célula. El término marcador de ARN incluye polinucleótidos de ARNm,
o fragmentos de él, que han sido procesados por una célula, por
ejemplo, por remate de 5', reparación de ARN y
3'-poliadenilación, después de copiar de la
correspondiente secuencia de ADN. Cuando al "marcador de ARN"
sigue el nombre de un órgano, de tipo de tejido o de tipo de célula
(por ejemplo, "marcador de ARN de riñón"), el término
significa que el marcador de ARN está transcrito en ese órgano, de
tipo de tejido o de tipo de célula. A los fines de esta invención,
este uso del término se referiría preferiblemente a marcadores de
ARN que se transcriben sólo en el órgano designado, de tipo tejido o
de tipo célula. Sin embargo, el término incluye también un marcador
de ARN que se puede usar para identificar el órgano particular, de
tipo tejido o de tipo célula, de interés en el contexto de la
invención. Por ejemplo, en los procedimientos de esta invención que
implican la caracterización de un estado patológico del riñón
midiendo un marcador de ARN renal en la orina, el marcador de ARN
particular no ha de ser uno expresado exclusivamente en el riñón,
con tal que cualquier expresión, por ejemplo en un segundo tejido u
órgano, sea improbable de detectar en la orina como resultado de la
patología de ese segundo órgano o tejido.
Las abreviaturas usadas en esta memoria tienen
su significado usual en la técnica. Sin embargo, para clarificar
más la presente invención y por razones de conveniencia, se
proporciona seguidamente el significado de ciertas abreviaturas.
"C" significa grados centígrados; "ADNc" significa ADN
complementario; "CT" significa número de ciclos de
amplificación; "dl" significa decilitro(s); "ADN"
significa ácido desoxirribonucleico; "EDTA" significa ácido
etilendiamina-tetraacetico; "g" significa
gramo; "kg" significa kilogramo; "NaOH" significa
hidróxido sódico; "ARNm" significa ARN mensajero; "mg"
significa miligramo; "ml" significa mililitro; "ng"
significa nanogramo; "PCR" significa reacción en cadena de
polimerasa; "PBS" significa solución salina tamponada con
fosfato; "ARN" significa ácido ribonucleico; "rpm"
significa revoluciones por minutos y "RT-PCR"
significa reacción en cadena de polimerasa transcriptasa
inversa.
La Figura 1 muestra las secuencias de cebadores
de PCR y sondas de PCR que se pueden usar para amplificar y
detectar KIM-1 y KAP de rata.
Durante el proceso tumoral normal, las células
mamíferas liberan ARN que es detectable en el plasma. Esta
invención está basada en parte en el descubrimiento de que la
liberación de ARN por las células del riñón sólo se exacerba por
lesión celular causada por agentes químicos, que este efecto es
detectable en la orina de un mamífero y que es un indicador útil de
lesión renal. Un aspecto de esta invención hace uso de la naturaleza
específica para el tipo de tejido y específica para el tipo de
célula de la transcripción de genes (esto es, para un tipo
particular de tejido o célula, que algunos genes se pueden
transcribir y otros no) y la disposición de reparación del tipo de
tejido y del tipo de célula de ciertos transcritos génicos. Los ARN
que son distintivos de un tipo particular de tejido o un tipo
particular de célula se pueden usar como biomarcadores de lesión
biológica, fisiológica o toxicológica para tipos específicos de
órganos, tejidos o células particulares.
La invención proporciona procedimientos de
ensayo de agentes potencialmente tóxicos, identificación de agentes
terapéuticos, ensayo de la eficacia de agentes terapéuticos y
caracterización del estado patológico del riñón sobre la base de la
liberación de ARN por células renales en la orina como indicador de
lesión renal o muerte celular. En la práctica de esta invención son
útiles las técnicas de detección de ANR conocidas por los expertos
o que se identificarán sobre la base de esta descripción.
Una realización proporciona procedimientos no
invasivos in vivo para la detección precoz de la
nefrotoxicidad de un agente. De acuerdo con tales procedimientos,
se ensaya la orina de un sujeto para determinar el nivel de ARN de
un marcador de ARN de riñón específico, esto es, KAP (según se
describe, por ejemplo, por Toole y otros (1979) y Meseguer y
Catterall (1987)). La toxicidad del agente se evalúa sobre la base
de su capacidad de causar la liberación celular de ARN medida en la
orina del sujeto de ensayo. Tales procedimientos serían útiles como
ensayos in vivo para la evaluación de la nefrotoxicidad de
los agentes de ensayo usando, por ejemplo, animales de ensayo. Los
procedimientos se pueden usar también clínicamente para controlar
pacientes no invasivamente después de un tratamiento con fármacos
como un aviso precoz de posible nefrotoxicidad.
En otra realización, la presente invención
proporciona procedimientos no invasivos para evaluar las
características protectoras o terapéuticas del riñón de un agente
de ensayo. De acuerdo con tales procedimientos, una reducción de la
cantidad de un marcador de ARN renal (específicamente KAP) liberada,
por ejemplo, de células del riñón tratadas con un agente que es
sabido que aumenta la liberación de KAP, indicará que el agente de
ensayo tiene un efecto protector o terapéutico deseado sobre el
riñón.
En la práctica de los procedimientos de esta
invención, se recoge orina de un sujeto en un tubo o vial colector
estéril. Preferiblemente, la totalidad del equipo colector y los
recipientes está exenta de ARN foráneo. Preferiblemente, la orina
se congela súbitamente y se almacena a 80ºC.
Generalmente, en la práctica de los
procedimientos de la presente invención, la detección de ARN supone
un procedimiento de multietapas: (1) extracción de ARN; (2)
amplificación, que puede implicar transcripción inversa de ARN en
su ADNc, y (3) detección. Si bien no se pretende con ello tener
compromiso alguno con una teoría o mecanismo particular, se cree
que el ARN extracelular está presente extracelularmente como
complejos de proteína-ARN,
lipoproteína-ARN, complejo de
lípido-ARN o de ADN-ARN y que tal
formación de complejos puede interferir con la amplificación y
detección de los niveles de ARN. Por tanto, de acuerdo con esta
teoría, es preferible usar una etapa de extracción con el fin de
disociar el ARN de sus complejos asociados antes de la
amplificación y detección.
En la práctica de la presente invención se puede
usar cualquiera de los diversos procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica. Aunque muchos de los procedimientos
publicados están diseñados para la extracción de ARN intracelular,
se pueden usar como se describe en la bibliografía o con
modificaciones que identificarán los expertos en la técnica sobre
la base de la presente invención. Por ejemplo, se puede extraer ARN
extracelular usando partículas de sílice, perlas de vidrio o
diatomeas, como en los procedimientos descritos por Boom y otros
(1990) o Cheung y otros (1994).
En un procedimiento ejemplar para extraer ARN de
medios de crecimiento de células para los procedimientos in
vitro de la invención, el medio que se ha separado de las
células por procedimientos bien conocidos en la técnica (por
ejemplo, por centrifugación o filtración) se trata con agentes
estabilizadores de ARN tales como una sustancia caotrópica, por
ejemplo, (iso)tiocianato de guanidinio según se describe en
la patente U.S. nº. 5.234.809. El ARN se une luego a un agente
sólido de unión, tal como partículas de sílice. La fase de
ARN-sólido se separa de la fase líquida por
filtración. El ARN se puede eluir luego de las partículas de sílice
usando una solución tampón constituida por Tris-HCl
10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).
En un procedimiento ejemplar de extracción de
orina, se mezclan de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 1,0
ml de orina con 40 \mul de una suspensión acuosa de sílice,
preparada como se describe más adelante, y aproximadamente 900
\mul de tampón de lisis, preparada como se describe más adelante,
y se mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 10
minutos. Luego se centrífuga la mezcla a 12.000x g durante 1 minuto
y se elimina el material sobrenadante. El sedimento resultante de
sílice-ARN se lava luego dos veces con
aproximadamente 450 \mul de un tampón de lavado, preparada como
se describe más adelante, y seguidamente con aproximadamente 1 ml
de etanol al 70% (vol/vol). Finalmente, el sedimento se lava con 1
ml de acetona y se seca a aproximadamente 65ºC durante
aproximadamente 10 min. Luego se eluye el ARN del sedimento
poniéndolo en suspensión en aproximadamente 20-50
\mul de agua tratada con procarbonato de dietilo a 56ºC durante
aproximadamente 10 min y centrifugando seguidamente a
aproximadamente 12.000 veces la gravedad durante aproximadamente 3
min. Alternativamente, el ARN se puede eluir usando un tampón
constituido por Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0) y
un inhibidor de ARNasa (por ejemplo, RNAsin®, Promega, Madison WI)
con o sin una proteinasa, tal como proteinasa K, de acuerdo con lo
descrito por
Boom y otros (1991). El material sobrenadante resultante que contiene ARN se recupera por amplificación y detección.
Boom y otros (1991). El material sobrenadante resultante que contiene ARN se recupera por amplificación y detección.
La suspensión acuosa de sílice descrita antes se
puede preparar poniendo en suspensión 60 g de dióxido de silicio
(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) en 500 ml de
agua estéril desmineralizada destilada dos veces. La suspensión se
deja luego en reposo durante 24 horas a temperatura ambiente. Se
elimina el material sobrenadante y las partículas se vuelven a
poner en suspensión en agua estéril desmineralizada destilada dos
veces, añadida a un volumen igual de 500 ml. Una vez que ha
sedimentado la suspensión, se separan 440 ml del material
sobrenadante y se ajusta el pH de la suspensión a aproximadamente 2
usando ácido clorhídrico.
Se prepara el tampón de lisis descrito antes
disolviendo 120 g de tiocianato de guinidina en 100 ml de
Tris-hidrocloruro (tris-HCl) (pH
6,4) y 22 ml de EDTA 0,2 M, de pH ajustado a 8,0 con NaOH, y 2,6 g
de Triton X-100 (Sigma-Aldrich
Corp.).
El tampón de lavado descrito antes se prepara
disolviendo 120 g de tiocianato de guinidina en 100 ml de
Tris-HCl 0,1 M (pH 6,4).
Para extraer ARN se pueden usar procedimientos
alternativos, incluidos, no limitativamente, el de centrifugación a
través de un gradiente de cloruro de cesio, por ejemplo, como
describen Chirgwin y otros (1979) y la coprecipitación de ARN
extracelular de plasma o suero con gelatina, por ejemplo, como
describen en general Foumie y otros (1986). Los expertos en la
técnica, basándose en la presente descripción, identificarán otros
procedimientos para la extracción de ARN.
Entre los procedimientos de extracción de ARN
preferidos está incluido el uso de un kit RNeasy^{MC} (nº. de
catál. 74124, Quiagen Inc., Valencia, CA) o un kit QIAamp Viral RNA
(Qiagen Inc.).
Antes de la amplificación y detección puede ser
deseable purificar más el ARN eliminando rastros de ADN. La
purificación se puede realizar usando ADNasa de acuerdo con
procedimientos descritos por Rashtchian, A. (1994).
El ARN que se ha extraído y, si se quiere,
purificado, como se ha descrito antes, se puede amplificar usando
un ensayo de amplificación de ácido nucleico para el marcador de ARN
de riñón deseado, esto es, KAP.
En la práctica de la invención se puede usar
cualquier ensayo de amplificación capaz de permitir la detección de
números pequeños de moléculas de ARN. Entre los ensayos aplicables
están incluidos, no limitativamente, la reacción en cadena de
polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR), la
reacción en cadena de ligasa (véase, por ejemplo, Abravaya, K. y
otros (1995), amplificación de señal de ADN ramificada (véase, por
ejemplo, Jrdea, M.S. y otros (1993)), amplificación isotérmica
basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) (véase, por ejemplo,
Kievits, T. y otros (1991)) y otros ensayos de replicación de
secuencias autosostenida.
La realización preferida para la amplificación
de ARN de esta invención es mediante el uso de
RT-PCR. Los procedimientos para amplificar ARN
usando RT-PCR son bien conocidos por los expertos en
la técnica y están descritos en la bibliografía (véase, por
ejemplo, Ausubel y otros (1994) e Innis y otros (1990)).
Como los expertos en la técnica lo apreciarán
sobre la base de la presente descripción, la elección de los
cebadores que se han de usar para la amplificación y las sondas para
la detección del producto amplificado, por ejemplo, por
RT-PCR, dependerá de los tipos de células que se
evalúan por los procedimientos de la invención. Para los
procedimientos in vitro de esta invención, tal evaluación
implica el uso de cultivos de células que comprenden uno o varios
tipos de células.
Consecuentemente, los conjuntos de sondas y
cebadores han de apuntar a uno o más genes transcritos de tales
células de manera que se pueda usar su transcripción para
identificar esas células. Preferiblemente, tales sondas y cebadores
apuntarán ARN que son singulares al tipo particular de células.
También es preferible que tales genes sean transcritos a un nivel
relativamente alto y, preferiblemente, continuamente,
independientemente del estado de la célula o las condiciones que
afectan a la célula.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y
cebadores son bien conocidos en la técnica y los describen, por
ejemplo, Sambrook y otros (1989), Ausubel y otros (1994) e Innis y
otros (1990). Los pares de cebadores de PCR pueden derivarse de
secuencias conocidas, por ejemplo, usando programas de ordenador
diseñados para ese fin, tales como Primer (versión 0,5, 1991,
Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Los oligonucleótidos para uso como cebadores se
seleccionan usando software conocido en la técnica para esa
aplicación. Por ejemplo, el software OLIGO® versión 6 (Molecular
Biology Insights, Inc., Cascade CO, www oligo.net) es útil para la
selección de pares de cebadores de PCR de hasta 100 nucleótidos cada
uno y para el análisis de oligonucleótidos y polinucleótidos
mayores de hasta 5.000 nucleótidos de una secuencia de
polinucleótidos de hasta 32 kilobases. Programas similares de
selección de cebadores han incorporado características adicionales
para las capacidades expandidas. Por ejemplo, el programa de
selección de cebadores PrimOU (asequible para el público del Genome
Center, de la Universidad de Texas, South West Medical Center,
Dallas TX, ftp://ftp.genome.ou.edu/pub/programs/primou
src.tar) es capaz de escoger cebadores específicos de secuencias
de megabase y es así útil para diseñar cebadores en un ámbito de la
amplitud de genoma. El Primer 3, versión 0,9, programa de selección
de cebadores (asequible para el público del Whitehead Institute/MIT
Center for Genome Research, Cambridge MA,
http://www-genome.wi.mit.edu/genome
software/other/primer3.html) permite al usuario incorporar una
"biblioteca de cebado erróneo" en el que están especificadas
secuencias a evitar como sitios de cebado. El Primer 3 es útil, en
particular, para la selección de oligonucleótidos para
micromatrices. (El código de la fuente para los programas de
selección de los dos últimos cebadores también se puede obtener de
sus fuentes respectivas y modificarse para satisfacer las
necesidades específicas del usuario). El programa PrimeGen
(asequible al público del UK Human Genome Mapping Project Resource
Centre, Cambridge UK,
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/registered/option/primegen.html)
diseña cebadores basados en alineamientos de múltiples secuencias,
lo que permite la selección de cebadores que se hibridizan a las
regiones muy conservadas o menos conservadas de secuencias alineadas
de ácidos nucleicos. Por tanto, este programa es útil para
identificar oligonucleótidos y fragmentos de polinucleótidos
singulares y conservados. Los expertos en la técnica, basándose en
la presente descripción, podrán identificar otros procedimientos de
selección de oligonucleótidos.
El ARN que ha sido extraído y/o amplificado como
se ha descrito antes se puede detectar usando un procedimiento de
detección. Los procedimientos de detección de ARN son bien conocidos
por los expertos en la técnica y los describen, por ejemplo,
Sambrook y otros (1989), Ausubel y otros (1994) e Innis y otros
(1990).
Un sistema de detección preferido usa la
detección en tiempo real de ARN durante ciclos de PCR usando un
ciclador térmico, una fuente luminosa que induce fluorescencia y un
detector. Un ejemplo de instrumento para realizar tal detección es
el ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems,
Foster City, CA).
Los expertos en la técnica, sobre la base de la
presente descripción, identificarán procedimientos alternativos
para la detección de ARN. Tales procedimientos pueden incluir, por
ejemplo, electroforesis en gel seguida de análisis por
transferencia Southern (véase, por ejemplo, Nguyen, T.D. (1989),
procedimientos de detección por ELISA (véase, por ejemplo,
Landgraf, A. y otros (1991), Coutlee, F. y otros (1989), y Bobo, L.
y otros (1990)) y procedimientos en los que se usa la detección por
electroquimioluminscencia (véase, por ejemplo, Blackburn, G.F.
(1991) y DiCesare, J. y otros (1993)). Los procedimientos de
detección por electroforesis pueden implicar una comparación de
bandas de dos o más poblaciones de ARN. Las bandas presentes en una
autorradiografía de un gel de una población de ARN y no presentes
en la otra corresponden a la presencia de un ARN particular en una
población y no en la otra e indican así un gen que probablemente se
expresa diferencialmente (véase, por ejemplo, Williams, J.G.
(1990), Welsh, J. y otros (1990), Woodward, S. R. (1992), Nadeau, J.
H. (1992), Liang, P. y otros (1992), Welsh y otros (1992) y Liang y
otros (1993)).
Finalmente, los procedimientos de detección para
la presente invención pueden implicar el uso de matrices o
micromatrices. Las matrices y micromatrices son series de distintos
polinucleótidos u oligonucleótidos sintetizados sobre un sustrato
tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, laminilla,
lámina de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En una
realización preferente, las matrices y micromatrices se pueden
preparar y usar de acuerdo con los procedimientos descritos en la
patente U.S. nº. 5.837.832, la publicación de solicitud de patente
PCT nº. WO 95/11995, por Lockhart y otros (1996) y por Schena, M. y
otros (1996). En otras realizaciones, tales matrices se producen
por los procedimientos descritos en la patente U.S. nº.
5.807.522.
Se cree que un experto en la técnica, usando la
presente descripción, incluidos los ejemplos, dibujos, listados de
secuencias y reivindicaciones anexas, puede utilizar la presente
invención en su total extensión. Los Ejemplos siguientes se han de
interpretar como meramente ilustrativos de la práctica de la
invención y de ninguna manera como limitativos del resto de la
descripción.
Los días 0 y 1 se recogió orina de 4 ratas macho
Sprague-Dawley (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA), una vez por la mañana y una vez al anochecer. La
evacuación se hizo estimulando manualmente el abdomen y el tórax de
cada rata mientras que se la mantenía sobre aceite de aluminio
exento de ARN. Se combinó para cada período de tiempo la orina de
todas las ratas, se congeló súbitamente, y se almacenó a 80ºC. Al
comienzo del 2º día, a cada rata se administró cisplatino por
inyección intravenosa a una dosis de 10 mg/kg. Los días 2 y 3 se
recogió nuevamente la orina evacuada, una vez por la mañana y una
vez al anochecer, se combinó y se congeló súbitamente. El día 4 se
recogió la orina evacuada por la mañana, se combinó y se congeló
súbitamente. Luego se sacrificaron las ratas con eutanasia y se
recogieron los riñones por necropsia. El tejido renal se fijó en
formalina neutra al 10% y se procesó para histopatología por
selección, deshidratación, embutido en parafina, corte, montaje
sobre portaobjetos de vidrio y tinción con hematoxilina y manchas de
eosina. Todos los animales presentaron una necrosis suave de las
células epiteliales tubulares caracterizada por necrosis celular
individual asociada con zonas de regeneración de células epiteliales
tubulares.
Una porción (650 \mul) de la orina evacuada en
cada período de tiempo se usó para la extracción de ARN usando el
minikit RNeasy^{MC} (Qiagen Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La orina se analizó por
RT-PCR en cuanto a la presencia de marcadores de
ARN, KIM-1 y KAP.
Para KIM-1 se usó
1,5'-AAACTCCATCATATACTCCTGCAGACT-3'
como cebador directo, 5'-ATTCTTACAG
TGTGATTATTCCAGGCCTCCTCTGAG-3 como cebador inverso y 5'-TTCTCTGCGGCTTCCTCAAA-3' como sonda.
TGTGATTATTCCAGGCCTCCTCTGAG-3 como cebador inverso y 5'-TTCTCTGCGGCTTCCTCAAA-3' como sonda.
Para KAP, se usó
5'-GTGCTGACTGTGGCTTTCC-3' como
cebador directo, 5'-TCAAAGATTGAATCCTG
TAGTTCTTCATTGAT-3' como cebador inverso y 5'-CCAGTTTGGACATAGATTC-3' como sonda. La RT-PCR se realizó en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® Applied Biosystem).
TAGTTCTTCATTGAT-3' como cebador inverso y 5'-CCAGTTTGGACATAGATTC-3' como sonda. La RT-PCR se realizó en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® Applied Biosystem).
Los resultados del Ejemplo 1 se dan en las
siguientes Tablas 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* El cambio de pliegue se calcula como 2^{N},
siendo N igual a la dosificación de CT medio menos el CT medio del
día de dosificación.
El Ejemplo 1 ilustra los procedimientos de esta
invención relacionados con la medida de un marcador de ARN de riñón
en la orina de un sujeto.
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Rattus rattus
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<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
Claims (6)
1. Un procedimiento para caracterizar el
estado patológico del riñón de un sujeto, que comprende medir la
cantidad de un marcador de ARN de riñón en una muestra de orina
obtenida de un sujeto mamífero, en el que el mencionado marcador de
ARN de riñón es ARN que tiene una secuencia específica que está
transcrita de ADN de la proteína regulada por andrógenos
específicos del riñón (KAP).
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende caracterizar el
mencionado sujeto como que tiene un estado patológico del riñón en
el supuesto de que la mencionada muestra de orina contenga como
mínimo una cantidad dos veces mayor del mencionado marcador de ARN
que la medida en un sujeto de control que no tiene estado
patológico alguno del riñón.
3. Un procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el mencionado sujeto es un ser
humano.
4. Un procedimiento para caracterizar un
agente, que comprende:
tratar un sujeto mamífero no humano con un
agente y
medir el efecto del mencionado agente sobre la
cantidad de un marcador de ARN de riñón liberada en la orina del
mencionado sujeto, siendo el mencionado marcador de ARN la
KAP.
5. Un procedimiento para evaluar las
características protectoras o terapéuticas de un agente, que
comprende:
tratar un sujeto mamífero no humano con un
primer agente, estando caracterizado el mencionado primer
agente por aumentar la cantidad de marcador de ARN de riñón
liberada en la orina del mencionado sujeto,
tratar el mencionado sujeto con un segundo
agente, y
medir el efecto del mencionado segundo agente
sobre la reducción de la cantidad del mencionado marcador de ARN de
riñón liberada en la orina del mencionado sujeto causada por el
mencionado primer agente,
siendo el mencionado marcador de ARN de riñón la
KAP.
6. Un procedimiento para controlar el efecto de
un agente farmacéutico sobre el riñón de un sujeto humano tratado
con un agente farmacéutico, que comprende medir el efecto del
mencionado agente sobre la cantidad de un marcador de ARN de riñón
liberada en la orina del mencionado sujeto, siendo el mencionado
marcador de ARN de riñón la KAP.
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