MXPA06014548A - Bioensayo de arn. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para caracterizar el estado patologica del rinon, a metodos de caracterizacion de un agente, a metodos de evaluacion de las caracteristicas protectoras y terapeuticas renales de un agente y a metodos de control del efecto de un agente farmaceutica sobre el rinon de un sujeto, referidos a la medida de un marcador de ARN renal en la orina de un sujeto.

Description

BIOENSAYO DE ARN REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente no provisional de los EE.UU. n° de serie 11/046,301 , presentada el 28 de enero de 2005 y de la solicitud de patente provisional de EE.UU. n° de serie 60/584,461 , presentada el 30 de junio de 2004, e incorporadas a la presente memoria como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para caracterizar el estado patológico del riñon, a métodos para caracterizar un agente, a métodos para evaluar las características protectoras y terapéuticas renales de un agente y a métodos de control del efecto de un agente farmacéutico sobre el riñon de un sujeto, referidos a medir un marcador de ARN renal en la orina de un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el campo farmacéutico, se han hecho grandes esfuerzos por minimizar el potencial toxicológico de agentes farmacéuticos. Entre los riesgos asociados a la exposición a agentes tóxicos, está la posibilidad de causar lesiones o muerte a células del cuerpo, lo que puede dar como resultado daño en órganos vitales. Mandel y Metáis (1948) reseñaron el descubrimiento de ácidos nucleicos extracelulares en plasma humano. Lo, K.W. et al. (1999) y Kopreski, M. eí al. (1999) han reseñado ambos la detección de ARN derivado de tumor en el plasma de pacientes de cáncer. Chen, X.Q. et al. (2000) han propuesto el uso de ARN de telomerasa como marcador de detección en el suero de pacientes con cáncer de mama. Poon, L.L. et al. (2000) han reseñado la presencia de ARN fetal en plasma materno. La patente de EE.UU. n° 6,329,179 da a conocer el uso de ARN extracelular derivado de o asociado a tumor que se encuentra en circulación en el plasma o fracción sérica de la sangre para la detección, control o evaluación de cáncer o afecciones premalignas. La patente de EE.UU. n° 6,156,504 da a conocer la detección, identificación o control de la existencia, progresión o estado clínico de neoplasmas benignos, premalignos o malignos en seres humanos o animales que contienen una mutación asociada al neoplasma mediante la detección del ácido nucleico mutado del neoplasma en fracciones de plasma o suero. La patente de EE.UU. n° 6,020,124 da a conocer la detección de ADN soluble de genes mutados y oncogenes en fluidos biológicos.

Ya que se considera que el ARN es lábil, los investigadores han examinado los posibles mecanismos mediante los que el ARN se protege de degradación en el plasma humano. Hasselmann, D.O et al. (2001 ) han reseñado que, en un modelo in vitro, el ARNm en cuerpos apoptóticos liberados por células de melanoma se protegía de la degradación cuando se incubaba en suero humano. Ng, E.K.O. et al. (2002) han reseñado que una porción sustancial del ARNm plasmático está asociada a partícula. La solicitud de patente de EE.UU. de cesión común con la presente n° 10/745823 da a conocer métodos para evaluar el potencial de daño celular de un agente determinando la capacidad del agente de aumentar la liberación de ARN mensajero en células. Los métodos convencionales disponibles para determinar si un agente causa daño de tejido y celular en el riñon incluyen medir características físicas y químicas de la orina (por ejemplo, color, transparencia, olor, volumen, osmolalidad, densidad relativa, pH y presencia de sedimentos, proteína, glucosa, bilirrubina, sangre, urobilinógeno, nitrito y enzimas), realizar un ensayo de función renal, medir el nitrógeno de urea en la sangre y medir la creatina sérica. Sin embargo, la capacidad de utilizar dichos indicadores para la detección temprana depende de una serie de factores, incluyendo la rapidez de la liberación enzimática y la sensibilidad de la detección. Por tanto, existe un interés creciente por desvelar indicadores biológicos o biomarcadores de toxicidad tempranos adicionales que tengan mayor especificidad y sensibilidad comparados con los métodos tradicionales para detectar toxicidad. La proteína regulada por andrógeno específica de riñon (KAP) se expresa en las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales renales. Toóle eí al. (1979); Meseguer y Catterall (1987). La molécula de lesión renal 1 (KIM-1 ), una proteína de membrana expresada en células epiteliales de túbulo proximal, se regula positivamente después de lesión isquémica, así como después de tratamiento con los nefrotóxicos S-(1 , 1 ,2,2-tetrafluoroetil)-L-cisteína (TFEC), ácido fólico y cisplatino. Ichimura et al. (1998); Ichimura et al. (2004). La expresión del factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) se induce en el riñon después de lesión isquémica y después de tratamiento con el nefrotóxico cloruro mercúrico. Homma et al. (1995). El factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1 ) y el factor de crecimiento de queratinocitos (FGF-7), miembros de la familia de proteínas del factor de crecimiento de fibroblastos, y el receptor de FGF-7, FGFR2 lllb, se inducen en el riñon después de tratamiento con TFEC. Ichimura et al. (1995); Ichimura et al. (1996). Las proteínas de canal de agua, acuaporina 1 , 2 y 3, se expresan elevadamente en el riñon. Agre eí al. (1993); Fushimi eí al. (1993) e Ishibashi eí al. (1994). La glicoproteína de Tamm-Horsfall se expresa en células epiteliales renales y se localiza en las asas ascendentes gruesas de los bucles de Henle y los túbulos contorneados distales del riñon. Sikri eí al. (1981 ); y Zhu, X. eí al. (2002). La expresión del gen de respuesta de crecimiento temprano Egr-1 , el protooncogén c-fos y el gen de respuesta al estrés hsp 70 se activa después de lesión isquémica del riñon. Ouellette et al. (1990); Bardella y Comolli (1994).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, a métodos de caracterización del estado patológico del riñon de un sujeto, que comprenden obtener una muestra de orina a partir de un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano, y medir la cantidad de marcador de ARN renal en dicha muestra de orina. En una realización preferida, dicho método comprende además caracterizar dicho sujeto por tener un estado patológico del riñon, a condición de que dicha muestra de orina contenga al menos una cantidad dos veces mayor de dicho marcador de ARN renal que la que se mide en un sujeto control que no tiene un estado patológico del riñon. Un aspecto adicional de esta invención proporciona métodos de caracterización de un agente que comprenden tratar a un sujeto mamífero no humano con un agente, y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad de un marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto. En una realización preferida, dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1 , HB-EGF, FGF-1 , FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1 , acuaporina 2, acuaporina 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1 , c-fos y hsp 70. Un aspecto adicional de esta invención se refiere a métodos para evaluar las características protectoras renales de un agente, que comprenden tratar un sujeto mamífero no humano con un primer agente, estando caracterizado dicho primer agente por aumentar la cantidad de un marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto, tratar dicho sujeto con un segundo agente, y medir el efecto de dicho segundo agente en la reducción de la cantidad de dicho marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto causada por dicho primer agente. Otro aspecto de esta invención proporciona métodos de control del efecto de un agente farmacéutico sobre el riñon de un sujeto, que comprenden tratar un sujeto humano con un agente farmacéutico, y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad de un marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto. En una realización preferida de todos los métodos de esta invención, dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1 , HB-EGF, FGF-1 , FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1 , acuaporina 2, acuaporina 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1 , c-fos y hsp 70.

Definiciones Los términos utilizados en la presente memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin embargo, para aclarar aún más la presente invención y por conveniencia, se proporciona a continuación el significado de ciertos términos y frases empleados en la memoria descriptiva, incluyendo los ejemplos y reivindicaciones adjuntas. "Agente" significa un medio químico, biológico o físico para producir un efecto. Un agente puede ser uno o una combinación de dos o más sustancias químicas o bioquímicas, patógenos biológicos o perturbaciones físicas. "Secuencia de nucleótidos" y "polinucleótido" significan ADN o ARN, tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. El término "secuencia complementaria de nucleótidos" significa una secuencia de nucleótidos que se asocia (une) a otra secuencia de nucleótidos según el apareamiento de un nucleótido de guanidina (G) con un nucleótido de citidína (C) y un nucleótido de adenosina (A) con un nucleótido de timidina (T), excepto en ARN, en el que se reemplaza una T por un nucleótido de uridina (U), de modo que U se une con A. "Estado patológico" significa un estado de anormalidad biológica e incluye estados anormales de un órgano, tipo de tejido o tipo celular. El término incluye anormalidad independientemente de la causa, y puede incluir enfermedades que surgen, por ejemplo, de anormalidades fisiológicas, anormalidades genéticas o agentes patogénicos, lesiones físicas o toxicidades causadas por agentes xenobióticos. "Marcador de ARN" significa un polinucleótido de ARN, o un fragmento del mismo, que tiene una secuencia específica que se transcribe a partir de la información genética del ADN de una célula. El término marcador de ARN incluye polinucleótidos de ARNm, o fragmentos de los mismos, que se han procesado por una célula, por ejemplo, mediante adición de caperuza en 5', ayuste de ARN y poliadenilación en 3', después de copiar a partir de la correspondiente secuencia de ADN. Cuando "marcador de ARN" está seguido por el nombre del órgano, tipo de tejido o tipo celular (por ejemplo, "marcador de ARN renal"), el término significa que el marcador de ARN se transcribe en ese órgano, tipo de tejido o tipo celular. Con los fines de esta invención, dicho uso del término designará preferiblemente marcadores de ARN que se transcriben sólo en el órgano, tipo de tejido o tipo celular designado. Sin embargo, el término incluye también un marcador de ARN que puede utilizarse para identificar el órgano, tipo de tejido o tipo celular particular de interés dentro del contexto de la invención. Por ejemplo, en los métodos de esta invención que implican la caracterización de un estado patológico del riñon midiendo un marcador de ARN renal en la orina, el marcador de ARN particular no tiene que ser necesariamente uno expresado exclusivamente en el riñon, a condición de que cualquier expresión, por ejemplo en un segundo órgano o tejido, sea improbable de detectar en la orina como resultado de la patología de ese segundo órgano o tejido.

Abreviaturas: Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin embargo, para aclarar aún más la presente invención, por conveniencia, se proporciona a continuación el significado de ciertas abreviaturas: "°C" significa grado centígrado, "ADNc" significa ADN complementario, "CT" significa número de ciclos de amplificación, "di" significa decilitro(s), "ADN" significa ácido desoxirribonucleico, "EDTA" significa ácido etilendiaminotetraacético, "g" significa gramo, "kg" significa kilogramo, "NaOH" significa hidróxido de sodio, "ARNm" significa ARN mensajero, "mg" significa miligramo, "ml" significa mililitro, "ng" significa nanogramo, "PCR" significa reacción en cadena con polimerasa, "PBS" significa solución salina tamponada con fosfato, "ARN" significa ácido ribonucleico, "RPM" significa revoluciones por minuto y "PCR-Tl" significa reacción en cadena con polimerasa de transcriptasa inversa.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La Figura 1 muestra las secuencias de cebadores de PCR y sondas de PCR que pueden utilizarse para amplificar y detectar KIM-1 y KAP de rata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Durante el recambio celular normal, las células de mamífero liberan ARN que es detectable en el plasma. Esta invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que la liberación de ARN por células del riñon se exacerba por la lesión celular causada por agentes químicos, que este efecto es detectable en la orina de un mamífero y que es un indicador útil de lesión renal. Un aspecto de esta invención hace uso de la naturaleza específica de tipo de tejido y específica de tipo celular de la transcripción génica (concretamente, para un tipo de tejido o tipo celular particular, en el que algunos genes pueden transcribirse y otros no) y de la disposición de ayuste específica de tipo de tejido y tipo celular de ciertos transcritos génicos. Los ARN que son distintivos de un tipo de tejido o tipo celular particular pueden utilizarse como biomarcadores de lesión biológica, fisiológica o toxicológica para órganos, tejidos o tipos celulares específicos. La invención proporciona métodos de ensayo de agentes potencialmente tóxicos, la identificación de agentes terapéuticos, el ensayo de la eficacia de los agentes terapéuticos y la caracterización del estado patológico del riñon basándose en la liberación de ARN por células renales en la orina como indicador de lesión celular o muerte celular. Las técnicas de detección de ARN conocidas por los expertos en la técnica, o que resultarán evidentes basándose en esta descripción, son útiles en la práctica de esta invención. Una realización proporciona métodos no invasivos in vivo para la detección temprana de la nefrotoxicidad de un agente. Según dichos métodos, se ensaya la orina de un sujeto para determinar el nivel de ARN de un marcador de ARN renal específico. Se evalúa la toxicidad del agente basándose en su capacidad de causar la liberación celular de ARN medida en la orina del sujeto de ensayo. Dichos métodos serían útiles como ensayos in vivo para la evaluación de la nefrotoxicidad de agentes de ensayo utilizando, por ejemplo, animales de ensayo. Los métodos pueden utilizarse también clínicamente para controlar no invasivamente pacientes después de tratamiento con fármaco como aviso temprano de la posible nefrotoxicidad.

En una realización adicional, la presente invención proporciona métodos no invasivos para evaluar las características protectoras o terapéuticas renales de un agente de ensayo. Según dichos métodos, una reducción en la cantidad de un marcador de ARN renal liberado, por ejemplo, por células del riñon que se tratan con un agente que es conocido por aumentar la liberación de un marcador de ARN renal, indicará que el agente de ensayo tiene un efecto protector o terapéutico deseado sobre el riñon. En la práctica de los métodos de esta invención, se recoge la orina de un sujeto en un tubo o vial de recogida estéril. Preferiblemente, todo el equipo y envases de recogida están libres de ARN extraño.

Preferiblemente, la orina se congela rápidamente después y se almacena a 80°C. Generalmente, la detección de ARN para la práctica de los métodos de esta invención conlleva un proceso multietapa: (1 ) extracción de ARN; (2) amplificación, que puede implicar transcripción inversa de ARN a su ADNc; y (3) detección. Aunque no se pretende limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que el ARN extracelular está presente extracelularmente como complejos de proteína-ARN, lípoproteína-ARN, lípido-ARN o ADN-ARN, y que dichos complejos pueden interferir con la amplificación y detección de los niveles de ARN. Por tanto, es preferible según esta teoría utilizar una etapa de extracción para disociar el ARN de sus complejos asociados antes de amplificación y detección. Puede utilizarse en la práctica de la invención cualquiera de una serie de métodos de extracción de ácido nucleico conocidos por los expertos en la técnica. Aunque muchos de los métodos publicados se pretenden para extracción de ARN intracelular, pueden utilizarse como se describen en la bibliografía o con modificaciones que resultarán evidentes para los expertos en la técnica, basándose en la presente descripción. Por ejemplo, el ARN extracelular puede extraerse utilizando partículas de sílice, perlas de vidrio o diatomeas, como en los métodos descritos en Boom et al., (1990) o Cheung eí al. (1994). En un método ejemplar para extraer ARN de medios de crecimiento celular para los métodos in vitro de la invención, los medios que se han separado de las células mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante centrifugación o filtración) se tratan con agentes estabilizantes del ARN tales como una sustancia caotrópica, por ejemplo, (iso)tiocianato de guanidinio como se describe en la patente de EE.UU. n° 5,234,809. Se une después el ARN a un agente aglutinante sólido, tal como partículas de sílice. La fase sólida de ARN puede separarse después de la fase líquida mediante filtración. El ARN puede eluirse después de las partículas de sílice utilizando un tampón constituido por Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0). En un método de extracción ejemplar a partir de orina, se mezclan aproximadamente 0.1 ml a aproximadamente 1.0 ml de orina con 40 µl de una suspensión acuosa de sílice, preparada como se describe a continuación, y aproximadamente 900 µl de tampón de lisis, preparado como se describe a continuación, y se mezclan a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se centrifuga después la mezcla a 12,000 x g durante 1 minuto y se retira el sobrenadante. Se lava después el sedimento de sílice-ARN resultante dos veces con aproximadamente 450 µl de un tampón de lavado, preparado como se describe a continuación, seguido de aproximadamente 1 ml de etanol al 70% (vol/vol). Finalmente, se lava el sedimento con 1 ml de acetona y se seca aproximadamente a 56°C durante aproximadamente 10 minutos. Se eluye después el ARN del sedimento de sílice suspendiéndolo en aproximadamente 20 a 50 µl de agua tratada con procarbonato de dietilo a 56°C durante aproximadamente 10 minutos, seguido de centrifugación a aproximadamente 12,000 veces la gravedad durante aproximadamente 3 minutos. Como alternativa, el ARN puede eluirse utilizando un tampón constituido por Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8.0) y un inhibidor de ARNasa (por ejemplo, RNAsin®, Promega, Madison, Wl) con o sin una proteasa, tal como proteasa K, según el método descrito en Boom eí al. (1991 ). El sobrenadante resultante que contiene ARN se recoge para amplificación y detección. La suspensión acuosa de sílice descrita anteriormente puede prepararse suspendiendo 60 g de dióxido de silicio (Sigma-Aldrich Corp., St. Louís, MO) en 500 ml de agua desmineralizada estéril doblemente destilada. Se deja asentar después la suspensión durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. Se retira el sobrenadante y se resuspenden las partículas en agua desmineralizada estéril doblemente destilada añadida para igualar un volumen de 500 ml. Una vez se ha asentado la suspensión, se retiran aproximadamente 440 ml del sobrenadante y se ajusta el pH de la suspensión aproximadamente a pH 2 utilizando ácido clorhídrico. Se prepara el tampón de lisis descrito anteriormente disolviendo 120 g de tiocianato de guanidinio en 100 ml de clorhidrato de Tris (Tris-HCl) 0.1 M (pH 6.4) y 22 ml de EDTA 0.2 M, ajustado a pH 8.0 con NaOH, y 2.6 g de Tritón X-100 (Sigma-Aldrich Corp.). Se prepara el tampón de lavado descrito anteriormente disolviendo 120 g de tiocianato de guanidinio en 100 ml de Tris-HCl 0.1 M (pH 6.4). Pueden utilizarse métodos alternativos para extraer ARN incluyendo, pero sin limitación, centrifugación mediante un gradiente de cloruro de cesio, por ejemplo, como se describe por Chirgwin eí al. (1979), y coprecipitacíón de ARN extracelular a partir de plasma o suero con gelatina, por ejemplo, como se describe genéricamente en Fournie eí al. (1986). Otros métodos de extracción de ARN resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la presente descripción. Los métodos preferidos de extracción de ARN de la orina incluyen el uso de un kit RNeasy™ (n° de cat. 74124, Qiagen Inc., Valencia, CA) o un kit QlAamp Viral RNA (Qiagen Inc.). Antes de amplificación y detección, puede ser deseable purificar adicionalmente el ARN mediante la retirada de las trazas de ADN. Puede conseguirse una purificación adicional utilizando ADNasa según los métodos descritos en Rashtchian, A. (1994). El ARN que se ha extraído y, si se desea, purificado, como se describe anteriormente, puede amplificarse utilizando un ensayo de amplificación de ácido nucleico para el marcador de ARN renal deseado. Puede utilizarse cualquier marcador de ARN renal en la práctica de la invención. Los marcadores de ARN renal preferidos incluyen proteína regulada por andrógeno específica de riñon (KAP) (como se describe, por ejemplo, en Toóle eí al. (1979) y Meseguer y Catterall (1987), molécula de lesión renal 1 (KIM-1 ) (como se describe, por ejemplo, en Ichimura eí al. (1998) e Ichimura eí al. (2004)), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (como se describe, por ejemplo, en Homma eí al. (1995)), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1 ), factor de crecimiento de queratinocitos (FGF-7), receptor de FGF-7, FGFR2 lllb (como se describe, por ejemplo, en Ichimura eí al. (1995) e Ichimura eí al. (1996)), proteínas de canal de agua acuaporina 1 , 2 y 3 (como se describen, por ejemplo, en Agre eí al. (1993), Fushimi et al. (1993) e Ishibashi et al. (1994)), glicoproteína de Tamm-Horsfall (como se describe, por ejemplo, en Sikri eí al. (1981 ) y Zhu, X. eí al. (2002)), Egr-1 y c-fos (como se describen, por ejemplo, en Ouellette eí al. (1990); Bardella y Comolli (1994)) y el gen de respuesta al estrés hsp 70 (como se describe, por ejemplo, en Bardella y Comolli (1994)). Puede utilizarse en la práctica de la invención cualquier ensayo de amplificación de ácido nucleico capaz de permitir la detección de pequeños números de moléculas de ARN. Los ensayos aplicables incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena con polimerasa de transcriptasa inversa (PCR-Tl), reacción en cadena con ligasa (véase, por ejemplo, Abravaya, K. eí al. (1995), amplificación de señal de ADN ramificado (véase, por ejemplo, Jrdea, M.S. eí al., (1993)); amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico isotérmico (NASBA) (véase, por ejemplo, Kievits T. eí al. (1991 )) y otros ensayos de replicación de secuencia autosostenida. La realización preferida para amplificación de ARN para esta invención es mediante el uso de PCR-TI. Los métodos para amplificación de ARN utilizando PCR-TI son bien conocidos por los expertos en la técnica y están bien descritos en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Ausubel eí al. (1994) e lnnis eí a/. (1990)). Como apreciarán los expertos en la técnica basándose en la presente descripción, la elección de los cebadores que se van a utilizar para la amplificación y las sondas para la detección del producto de amplificación, por ejemplo mediante PCR-TI, dependerá de los tipos de células que se evalúen mediante los métodos de la invención. Para los métodos in vitro de esta invención, dicha evaluación implica el uso de cultivos celulares que comprenden uno o más tipos celulares. Para los métodos in vivo, la evaluación puede implicar un gran número de tipos celulares diferentes en el cuerpo de un sujeto. En consecuencia, los conjuntos de sondas y cebadores deberían dirigirse a uno o más genes transcritos de dichas células, de tal modo que la transcripción de los mismos pueda utilizarse para identificar aquellas células.

Preferiblemente, dicha sondas y cebadores se dirigirán a ARN que sean únicos del tipo celular particular. Es también preferible que dichos genes se transcriban a un nivel relativamente alto, y preferiblemente continuamente, independientemente del estado de la célula o de las condiciones que afecten a la célula. Los métodos para preparar y utilizar sondas y cebadores son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook eí al. (1989), Ausubel eí al. (1994) e Innis eí al. (1990). Los pares cebadores de PCR pueden derivarse de secuencias conocidas, por ejemplo, utilizando programas informáticos pretendidos con ese fin tales como Primer (versión 0.5, 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Los oligonucleótidos para uso como cebadores se seleccionan utilizando un software conocido en la técnica con dicho fin. Por ejemplo, el software OLIGO® versión 6 (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO, www.oliqo.net) es útil para la selección de pares cebadores de PCR de hasta 100 nucleótidos cada uno, y para el análisis de oligonucleótidos y polinucleótidos mayores de hasta 5.000 nucleótidos a partir de una secuencia polinucleotídica de entrada de hasta 32 kilobases. Programas de selección de cebador similares han incorporado rasgos adicionales para capacidades extendidas. Por ejemplo, el programa de selección de cebador PrimOU (disponible para el público en el Genome Center de la Universidad de Tejas, South West Medical Center, Dallas, TX, ftp://ftp.genome.ou.edu/pub/programs/primou_src.tar) es capaz de elegir cebadores específicos a partir de secuencias de megabases y es por tanto útil para diseñar cebadores de aplicación en todo el genoma. El programa de selección de cebador Primer3 versión 0.9 (disponible para el público en el Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA, http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html) permite al usuario introducir una "biblioteca no cebadora" en la que las secuencias a evitar como sitios de unión de cebador están especificadas por el usuario. Primer3 es útil, en particular, para la selección de oligonucleótidos para micromatrices. (El código fuente para los dos últimos programas de selección de cebador puede obtenerse también a partir de sus fuentes respectivas y modificarse para satisfacer las necesidades específicas del usuario). El programa PrimeGen (disponible para el público en el UK Human Genome Mapping Project Resource Centre, Cambridge, RU, http://www.hqmp.mrc.ac.uk Reqistered/Option/primeqen.html) diseña cebadores basados en alineamientos de secuencia múltiples, permitiendo así la selección de cebadores que hibridan con las regiones más conservadas o menos conservadas de las secuencias de ácido nucleico alineadas. Por tanto, este programa es útil para la identificación tanto de fragmentos de oligonucleótidos y polinucleótidos únicos como conservados. Otros métodos de selección de oligonucleótido resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la presente descripción. El ARN que se ha extraído y/o amplificado, como se describe anteriormente, puede detectarse utilizando un método de detección. Los métodos de detección de ARN son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook eí al. (1989), Ausubel eí al. (1994) e Innis eí al. (1990). Un sistema de detección preferido utiliza detección a tiempo real de ARN durante los ciclos de PCR utilizando un ciclador térmico integrado, una fuente de luz inductora de fluorescencia y un detector. Es un instrumento ejemplar para realizar dicha detección el ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los métodos alternativos para la detección de ARN resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la presente descripción. Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, electroforesis en gel seguida de análisis de transferencia Southern (véase, por ejemplo, Nguyen, T.D. (1989)), métodos de detección ELISA (véanse, por ejemplo, Landgraf, A. et al. (1991 ), Coutlee, F. et al. (1989) y Bobo, L., et al. (1990)) y métodos que utilizan detección por electroquimioluminiscencia (véanse, por ejemplo, Blackbum, G.F. (1991 ) y DiCesare, J. et al. (1993)). Los métodos de detección por electroforesis pueden implicar una comparación de bandas de dos o más poblaciones de ARN. Las bandas presentes en una autorradiografía de un gel de una población de ARN, y no presentes en otra, corresponden a la presencia de un ARN particular en una población y no en la otra, y por tanto indican un gen que es probable que se exprese diferencialmente (véanse, por ejemplo, Williams, J.G. (1990), Welsh, J. et al. (1990), Woodward, S.R. (1992), Nadeau, J.H. (1992), Liang, P. eí al. (1992), Welsh, J. eí al. (1992) y Liang, P. et al. (1993)). Finalmente, los métodos de detección para la presente invención pueden implicar el uso de matrices o micromatrices. Las matrices y micromatrices son conjuntos de distintos polinucleótidos u oligonucleótidos sintetizados sobre un sustrato tal como papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En una realización preferida, las matrices y micromatrices pueden prepararse y utilizarse según los métodos descritos en la patente de EE.UU. n° 5,837,832, la publicación de solicitud de patente PCT número WO 95/11995, Lockhart eí al. (1996) y Schena, M. eí al., (1996). En otras realizaciones, dichas matrices se producen mediante los métodos descritos en la patente de EE.UU. n° 5,807,522. Las descripciones de todas las patentes, solicitudes y números de acceso a genes (incluyendo información asociada), publicaciones y documentos, por ejemplo, folletos o boletines técnicos, citados en la presente memoria se incorporan expresamente por la presente como referencia en su totalidad. Se cree que un experto en la técnica puede utilizar la presente invención en su más completa extensión utilizando la presente descripción, incluyendo los ejemplos, dibujos, listados de secuencias y reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos han de considerarse como meramente ilustrativos de la práctica de la invención y no limitativos del resto de la descripción en modo alguno.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Los días 0 y 1 , se recogió la orina evacuada por cuatro ratas Sprague-Dawley macho (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), una vez por la mañana y una vez por la noche. Se realizó la evacuación estimulando manualmente el abdomen y tórax de cada rata mientras se mantenían sobre lámina de aluminio libre de ARN. Se combinó la orina de todas las ratas para cada periodo de tiempo, se congeló rápidamente y se almacenó a 80°C. Al inicio del día 2, se administró a cada rata cisplatino mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg. Los días 2 y 3, se recogió de nuevo la orina evacuada, una vez por la mañana y una vez por la noche, se combinó y se congeló rápidamente. El día 4, se recogió la orina evacuada por la mañana, se combinó y se congeló rápidamente. Se sacrificaron después las ratas y se recogieron los riñones para necropsia. Se fijó el tejido renal en formalina tamponada neutra al 10% y se procesó para histopatología mediante recorte, deshidratación, incrustación en parafina, seccionamiento, montaje en portaobjetos de vidrio y tinción con tintes de hematoxilina y eosina. Todos los animales exhibieron una necrosis moderada de las células tubulares epiteliales caracterizada por necrosis de células individuales asociada a áreas de regeneración de célula epitelial tubular. Se utilizó una porción de orina para cada periodo de tiempo (650 µl) para extracción de ARN utilizando el mini-kit RNeasy™ (Qiagen Inc., Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Se analizó en la orina, utilizando PCR-TI, la presencia de los marcadores de ARN KIM-1 y KAP. Para KIM-1 , se utilizó 5'- AAACTCCATCATATACTCCTGCAGACT-3' como cebador de codificación, 5'-ATTCTTACAGTGTGATTATTCCAGGCCTCCTCTGAG-3' como cebador inverso y 5'-TTCTCTGCGGCTTCCTCAAA-3' como sonda. Para KAP, se utilizó 5'-GTGCTGACTGTGGCTTTCC-3' como cebador de codificación, 5'-TCAAAGATTGAATCCTGTAGTTCTTCATTGAT-3' como cebador inverso y 5'-CCAGTTTGGACATAGATTC-3' como sonda. Se realizó la PCR-TI en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Bíosystem). Los resultados del ejemplo 1 se proporcionan en los cuadros 1 y 2 a continuación.

CUADRO 1 KIM-1 CUADRO 2 KAP * el cambio en veces se calcula como 2 , siendo N igua al CT medio pre- dosificación menos el CT medio del día de dosificación.

El ejemplo 1 ilustra los métodos de esta invención referidos a medir un marcador de ARN renal en la orina de un sujeto.

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Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método de caracterización del estado patológico del riñon de un sujeto, que comprende obtener una muestra de orina a partir de un sujeto mamífero y medir la cantidad de un marcador de ARN renal en dicha muestra de orina.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente caracterizar dicho sujeto por tener un estado patológico del riñon, a condición de que dicha muestra de orina contenga al menos una cantidad dos veces mayor de dicho marcador de ARN renal que la que se mide en un sujeto control que no tiene estado patológico del riñon.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1 , HB-EGF, FGF-1 , FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1 , acuaporina 2, acuaporina 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1 , c-fos y hsp 70.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque dicho sujeto es un ser humano.

5.- Un método de caracterización de un agente que comprende: tratar un sujeto mamífero no humano con un agente; y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad de un marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1 , HB-EGF, FGF-1 , FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1 , acuaporina 2, acuaporina 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1 , c-fos y hsp 70. 7 '.- Un método de evaluación de las características protectoras o terapéuticas renales de un agente, que comprende: tratar un sujeto mamífero no humano con un primer agente, en el que dicho primer agente se caracteriza por aumentar la cantidad de un marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto; tratar dicho sujeto con un segundo agente; y medir el efecto de dicho segundo agente en la reducción de la cantidad de dicho marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto causada por dicho primer agente. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1 , HB-EGF, FGF-1 , FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1 , acuaporina 2, acuaporina 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1 , c-fos y hsp-70. 9.- Un método de control del efecto de un agente farmacéutico sobre el riñon de un sujeto, que comprende: tratar un sujeto humano con un agente farmacéutico; y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad de dicho marcador de ARN renal liberada en la orina de dicho sujeto. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho marcador de ARN renal se selecciona de KAP, KIM-1, HB-EGF, FGF-1, FGF-7, FGFR2 lllb, acuaporina 1, acuaporina 2, acuaporina, 3, glicoproteína de Tamm-Horsfall, Egr-1, c-fos y hsp 70.