ES2316970T3 - Oligonucleotidos (odn) antisentido contra smad7 y usos en el campo medico de los mismos. - Google Patents
Oligonucleotidos (odn) antisentido contra smad7 y usos en el campo medico de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Oligonucleótidos antisentido fosforotioato contra Smad7 de hasta 21 nucleótidos de longitud, que comprenden la siguiente secuencia (SEC ID Nº 2): 5''-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3'' en la que X es un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada del grupo constituido por citosina, 5metilcitosina y 2''-O-metilcitosina, y en la que Y es un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada del grupo constituido por guanina, 5-metilguanina y 2''-O-metilguanina, a condición de que al menos uno de los nucleótidos X o Y comprenda una base nitrogenada metilada.
Description
Oligonucleótidos (ODN) antisentido contra Smad7
y usos en el campo médico de los mismos.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos (ODN) antisentido contra Smad7 y a usos de los
mismos en el campo médico.
Particularmente, la invención se refiere a
secuencias de ODN antisentido de Smad7 modificadas adecuadamente
que muestran una sorprendente actividad biológica de inhibición
específica de la expresión de Smad7 y son por lo tanto utilizables
en el campo médico como agentes biológicos terapéuticos, en
particular en el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal
crónica (EII).
La enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa
(CU) son las formas principales de enfermedad inflamatoria
intestinal crónica en seres humanos. Ambas enfermedades son
entidades clínicas complejas cuya patogénesis depende estrictamente
de la interacción entre diferentes factores genéticos, ambientales e
inmunitarios.
A pesar de que EC y CU muestran diferencias
marcadas tanto a nivel patofisiológico como clínico, el enfoque
terapéutico para los pacientes que las padecen comparten muchos
elementos comunes. La variabilidad de la presentación clínica, del
tipo y extensión de las lesiones y de la clase de complicaciones
influye en la elección terapéutica, aunque el tratamiento
farmacológico representaría el primer enfoque predominante.
La salicilazosulfapiridina y el ácido
5-aminosalicílico son medicamentos de eficacia
probada en la gestión de la forma leve de EII y en la terapia de
mantenimiento de la remisión.
En las fases con actividad moderada a grave y en
los casos en que está implicado el estado general de salud, es
necesario volverse al uso de corticosteroides. Del análisis a medio
y largo plazo de los historiales de caso mundiales principales,
parece que la remisión clínica es obtenible sólo en dos tercios de
los pacientes que reciben corticosteroides, y sólo en un 50% de
estos pacientes no ocurre ninguna recaída después de la supresión
de los medicamentos.
La administración continua de corticosteroides,
además de inducir el fenómeno de dependencia de medicamentos, está
empeorada debido a un muy alto riesgo de efectos secundarios.
También el tratamiento inmunosupresor, que a
menudo acompaña o sustituye a la terapia con corticosteroides, no
siempre asegura una contención de la flogosis y el control de los
síntomas, y además tiene las desventajas de numerosas
contraindicaciones y efectos secundarios graves (Podolsky,
2002).
La nueva generación de medicamentos que se puso
a disposición en los 90 son agentes biológicos. El conocimiento más
en profundidad del historial natural de la EII y de los mecanismos
patofisiológicos principales ha contribuido a guiar la intervención
médica de un modo concreto. Por tanto, apareció un desarrollo de
bioterapias orientadas a controlar "rutas" inflamatorias
específicas mediante el uso de proteínas humanas recombinantes,
anticuerpos monoclonales quiméricos humanizados y proteínas de
fusión. Según el contexto, los agentes que han mostrado una mejor
eficacia en el tratamiento de EC son anticuerpos monoclonales
quiméricos dirigidos a bloquear TNF-\alpha, una
citocina proinflamatoria sobreproducida durante la EII (Seegers y
col., 2002). Este compuesto, que está actualmente en la fase IV de
ensayo clínico, es eficaz en la contención de la inflamación en
aproximadamente un 60-70% de los pacientes
tratados. No obstante, se han apuntado algunos efectos secundarios
con una considerable frecuencia de incidencia y reconocibles en la
reactivación de infecciones microbianas latentes, fenómenos de
hipersensibilidad y formación de autoanticuerpos. Este último
fenómeno podría estar basado en el hecho de que los anticuerpos
anti-TNF-\alpha neutralizan la
citocina TNF-\alpha que tiene numerosas funciones
biológicas.
Además de su efecto antiinflamatorio, el
TNF-\alpha toma parte también en aquellos
mecanismos implicados en la inducción y mantenimiento de la
tolerancia inmunitaria. Por lo tanto, un bloqueo de la actividad de
TNF-\alpha podría potenciar paradójicamente
reacciones inmunitarias excesivas (Sandborn y col., 2002).
Todas estas observaciones sugieren la necesidad
de nuevos estudios en modelos animales de EII mediante los que sea
posible identificar nuevos principios activos para usar en un
tratamiento mejor y duradero de dichas patologías (Fiocchi,
2001).
El tratamiento
anti-TNF-\alpha, así como otras
bioterapias tales como la administración de citocinas
antiinflamatorias, por ejemplo IL-10, representa un
enfoque terapéutico extracelular orientado a controlar efectos
biológicos de moléculas secretadas por células inflamatorias.
El estudio de las rutas de transducción de señal
activadas por la interacción de citocina con sus receptores ha
expuesto la opción de usar nuevas estrategias terapéuticas capaces
de modular específica y selectivamente la expresión intracelular de
moléculas inflamatorias y no inflamatorias importantes.
En condiciones normales, la mucosa intestinal es
el asiento de un infiltrado inflamatorio "fisiológico" que se
mantiene por un frágil equilibrio entre las moléculas
proinflamatorias y antiinflamatorias.
Con relación a lo anterior, desempeña un papel
importante el TGF-\beta1, una citocina
multifuncional capaz de regular el crecimiento, diferenciación y
actividad de muchas células inmunes y no inmunes.
Estudios tanto in vitro como in
vivo han demostrado que el TGF-\beta1 actúa
como un potente inmunorregulador capaz de controlar la inflamación
intestinal mucosa y que la inhibición de su actividad da como
resultado el desarrollo de colitis que muestra una similitud
inmunomorfológica con EC o CU (Powrie F. y col., 1996; Neurath M.
F. y col., 1996; Ludviksson B. R. y col., 1997).
De hecho, ratones deficientes en genes de
TGF-\beta1 exhiben respuestas inflamatorias
multifocales graves, que implican también el intestino, asociadas a
una producción excesiva de citocinas inflamatorias por numerosos
tipos celulares, incluyendo células T (Shull M. M. y col., 1992;
Christ M. y col. 1994).
De forma similar, la inhibición de la
señalización de TGF-\beta1 en ratones mediante la
expresión de una forma mutante negativa dominante del receptor RII
de TGF-\beta1 da como resultado una
susceptibilidad potenciada a desarrollar colitis experimental (Hahm
K.B. y col., 2001).
Finalmente, se ha mostrado que la inhibición
específica de la señalización de TGF-\beta1 en
células T mediante la expresión de un receptor de tipo II de
TGF-\beta negativo dominante causa una enfermedad
autoinmunitaria caracterizada por infiltraciones inflamatorias
graves en pulmón y colon y la presencia de anticuerpos autoinmunes
en circulación (Gorelik L. y col., 2000). Estos datos indican que la
pérdida de actividad de una sola molécula antiinflamatoria podría
ser suficiente para alterar la homeostasis intestinal y para
permitir respuestas inmunitarias que conducen a lesión de
tejido.
La actividad antiinflamatoria de
TGF-\beta1 empieza con la interacción de la
molécula con un complejo de receptores de serina/treonina cinasa
transmembrana heterodiméricos constituidos por dos subunidades,
denominadas TGF-\beta1 R1 y
TGF-\beta1 R2 respectivamente. Tras la unión de
TGF-\beta1, los receptores rotan relativamente
dentro del complejo anteriormente mencionado, dando como resultado
un proceso de transfosforilación y la posterior activación de
TGF-\beta1 R1 mediante el
TGF-\beta1 R2 constitutivamente activo y capaz de
autofosforilación.
La propagación de la señal desencadenada por
TGF-\beta1 al núcleo está mediada por proteínas
pertenecientes a la familia Smad. El TGF-\beta1
R1 activado fosforila directamente las proteínas Smad2 y Smad3, que
se vuelven capaces de interaccionar con Smad4, posibilitando así
que el complejo Smad2-3/Smad4 se transloque al
núcleo, donde participa en el control transcripcional de algunos
genes (Heldin C-H. y col., 1997).
El papel de Smad3 en la actividad
antiinflamatoria de TGF-\beta1 estaba apoyado por
estudios en modelos animales, que muestran que la deleción del gen
que codifica Smad3 está asociada a una sensibilidad celular
reducida ante TGF-\beta1, y con un desarrollo
relacionado de enfermedad inflamatoria caracterizada por una
infiltración masiva de células T y formación de abscesos piogénicos
a nivel gastrointestinal (Yang X. y col., 1999).
También otras proteínas intracelulares, por
ejemplo Smad7, pertenecen a la familia de proteínas Smad. Dicha
proteína, que ocupa TGF-\beta1 R1, interfiere con
la unión de Smad2/Smad3 al receptor, evitando así la fosforilación
y activación. Por tanto, una expresión aumentada de proteína Smad7
está asociada a una inhibición de la señalización mediada por
TGF-\beta1 (Hayashi H. y col., 1997).
La evaluación de la expresión de
TGF-\beta1 en mucosa intestinal de pacientes con
EII muestra que la producción de dicha molécula está
paradójicamente potenciada en comparación con la que puede
comprobarse en el intestino de pacientes normales (Lawrance IC. y
col., 2001).
En un artículo reciente, el autor de la presente
invención muestra que las muestras mucosas de pacientes con EII se
caracterizan por altos niveles de Smad7 y por niveles reducidos de
Smad3 activa, indicando por tanto que durante la EII se compromete
el mecanismo de señalización mediado por
TGF-\beta1. El autor de la presente invención
mostró adicionalmente que la anulación selectiva de Smad7 por un
oligonucleótido antisentido específico
5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3' (SEC ID
Nº 1) restaura la sensibilidad de las células mononucleares de
lámina propia (CMLP) ante TGF-\beta1, dando como
resultado una regulación negativa de la producción de citocina
proinflamatoria, tal como por ejemplo
TNF-\alpha.
Además, experimentos ex vivo llevados a
cabo también en muestras de mucosa intestinal de pacientes con EII
mostraron que la administración de ODN antisentido de Smad7 restaura
el mecanismo de señalización de TGF-\beta1 y
permite una producción reducida de citocina (Monteleone y col.,
2001).
Durante la EII, la mucosa intestinal se infiltra
con un alto número de células T. Estas células se consideran los
mediadores principales de lesión tisular que actúan en dichas
enfermedades.
El número aumentado de células T en la mucosa
intestinal de pacientes con EII depende parcialmente de la
resistencia de dichas células ante estímulos que inducen su muerte
(apoptosis).
Se cree que el bloqueo de la apoptosis de
células T desempeña un papel clave en el mantenimiento de la
respuesta inflamatoria mucosa en EII (Boirivant y col., 1999). Es
más, la potenciación de la muerte de células T se asocia a una
resolución de la inflamación intestinal. El mecanismo exacto
subyacente de la resistencia de células T frente a la apoptosis
durante EII no es todavía conocido, aunque parecen estar implicadas
citocinas liberadas localmente.
Los datos de experimentos de cultivo celular
in vitro y estudios in vivo indican que el
TGF-\beta1 puede evitar o desencadenar la muerte
de células T y que la capacidad del factor de mediar ambas
respuestas es específica de sitio (Han SH. y col., 1998; Rasura M.
y col., 1996).
Ratones con deficiencia de Smad3 exhiben un
masivo aumento del número de células inflamatorias al nivel
intestinal, sugiriendo por tanto un papel de
TGF-\beta1 en el control de la apoptosis de
células T intestinales al nivel intestinal (Yang y col., 1999).
Por lo tanto, la inhibición de Smad7 por el uso
de ODN antisentido de Smad7 sintético puede representar un enfoque
bioterapéutico "endógeno" novedoso y aceptable para
enfermedades inflamatorias crónicas, en particular para EII, puesto
que como se menciona anteriormente, restaura la sensibilidad de
células T ante TGF-\beta1.
Los oligonucleótidos antisentido (ODN) son
secuencias oligonucleotídicas sintéticas cortas complementarias del
ARN mensajero (ARNm) que codifica la proteína diana de la inhibición
específica y orientada. Dichas secuencias, que hibridan con el
ARNm, producen un tramo híbrido bicatenario, y éste conduce a la
activación de enzimas catalíticas ubicuas tales como ARNasas H, que
degradan las cadenas híbridas de ADN/ARN que se desarrollan en la
naturaleza para desencadenar la duplicación de ADN, evitando por
tanto la traducción de proteína.
La selección de las regiones y secuencias de
ARNm más adecuadas para hibridar con el ODN tiene características
empíricas, aunque el ODN complementario de la región de inicio de la
transcripción 5' y de las regiones de corte y empalme habitualmente
resultan ser más eficaces. El diseño de un número notable de ODN
antisentido, después de identificar los sitios diana posibles, no
crea dificultades gracias a las tecnologías de síntesis
automatizada recientes y avanzadas propiedad de compañías
especializadas en dicho campo.
Por el contrario, la identificación del ODN más
activo, para posibles aplicaciones terapéuticas, requiere un
trabajo de cribado a largo plazo mediante ensayos de eficacia de
prueba cuantitativa. Con relación a lo anterior, son ya conocidas
secuencias de ODN antisentido contra dianas específicas, entre ellas
Smad7 (patente de EE.UU. nº US 6.159.697; asignada a ISIS
Pharmaceuticals Inc.).
El uso de ODN antisentido para regulación génica
tanto in vitro como in vivo está impedido por algunos
problemas tales como la dificultad de pasar a través de membranas
celulares, debido a la naturaleza polianiónica y después hidrófila
de estas moléculas, y la rápida degradación enzimática.
Para superar estos obstáculos, es necesario
recurrir a la modificación química del ODN antisentido tal como,
por ejemplo la fosforotioación, como en el caso de la secuencia
específica de Smad7 anteriormente mencionada (Monteleone y col.,
2001), o la fosforoamidación, que son sustituciones de átomos de
azufre o nitrógeno en lugar de aquellos átomos de oxígeno que no
son átomos puente del engarce fosfodiéster.
Así como en muchos productos biotecnológicos, la
demostración de una actividad biológica apunta a una actividad
terapéutica potencial.
Es más, el ODN puede usarse en estudios tanto de
funciones génicas como proteicas implicadas en la patogénesis de
diferentes enfermedades o con fines terapéuticos. Aunque en el campo
de la solicitud anterior la metodología antisentido era exitosa por
la facilidad de los principios de guía, el desplazamiento de
experimentación in vitro a in vivo es más complejo,
especialmente en lo que respecta a los aspectos farmacocinéticos,
farmacodinámicos y toxicológicos de estos nuevos medicamentos
(Maggi A., 1998).
Por ejemplo, el ODN antisentido de Smad7 usado
en los experimentos anteriores llevados a cabo por el autor de la
presente invención (SEC ID Nº 1), que muestran actividad biológica
in vitro, podrían mostrar un riesgo aumentado de efectos
indeseables in vivo. De hecho, dicho ODN contiene dos pares
nucleotídicos CG que se convierten en CpG después de
fosforotioación, un proceso esencial para potenciar la estabilidad
de ODN. Estas últimas son secuencias dotadas de una potente
actividad estimulante del sistema inmunitario, por lo tanto, el uso
del ODN anteriormente mencionado como tal podría empeorar el curso
de cualquier enfermedad inmunitaria, enfermedad de Crohn y colitis
ulcerosa incluidas.
No podría teorizarse un enfoque terapéutico
similar especialmente en el caso de enfermedad de Crohn, una
patología mediada por una clase particular de linfocitos T, llamada
Th1, bajo el estímulo de interleucina 12. Es más, las moléculas de
CpG, como inductoras potentes de la síntesis de
IL-12, podrían inducir un desarrollo adicional de
células Th1.
Además, la administración in vivo de ODN
antisentido que contiene dinucleótidos CpG está acompañada de un
riesgo aumentado de efectos secundarios, en comparación con
oligonucleótidos sin CpG. En particular, se ha probado un riesgo
aumentado de hiperplasia del sistema reticuloendotelial de bazo,
riñón e hígado, así como una proliferación aumentada de células
hematopoyéticas (Agrawal S. y col., 2002).
Es otro problema del uso de ODN está ligado a
los efectos secundarios resultantes de la acción de los metabolitos
derivados de la degradación de la molécula, que resultan bastante
susceptibles al ataque de nucleasa, puesto que no están protegidos
en los extremos 5' y 3'.
De ahí la necesidad de una modificación química
del esqueleto de ODN antisentido fosforotioato en pares CpG y
extremos 5' y 3'. No obstante, las modificaciones anteriormente
citadas de la secuencia de ODN podrían conducir a la reducción o
pérdida de la actividad biológica de inhibición de la síntesis de
Smad7 y, algunas veces, incluso a la inversión de la actividad
deseada tanto in vitro como in vivo.
Igualmente, puede ser importante disponer de
modelos de EII experimentales adecuados para estudios in vivo
que permitan aumentar el conocimiento sobre los mecanismos que
implican la pérdida de regulación de la respuesta inmunitaria y su
papel en el inicio de la patología de EII y sobre la posibilidad de
modular o evitar dicha respuesta, limitando por tanto la progresión
de la inflamación a nivel mucoso. Con relación a lo anterior, la
colitis mediada por TNBS representa un modelo extendido y válido de
inflamación mucosa que muestra similitudes inmunomorfológicas
notables con EC humana (Neurath M. y col., 2000).
A la vista de lo anterior, sería deseable
disponer de nuevos agentes biológicos terapéuticos, como ODN
antisentido de Smad7, que fueran activos tanto in vitro como
in vivo para el tratamiento de EII mediante un "enfoque
bioterapéutico endógeno".
El autor de la presente invención ha encontrado
ahora secuencias de ODN antisentido adecuadamente modificadas que
exhiben una actividad biológica in vivo mayor de inhibición
de la expresión de Smad7 en modelos experimentales de EII en
comparación con su actividad inhibidora in vitro, y también
mayor que la de otras secuencias conocidas que muestran las mismas
modificaciones y ensayadas en los mismos modelos.
En particular, las secuencias de ODN que exhiben
una mayor actividad biológica in vivo se diseñaron según la
secuencia de ODN antisentido fosforotioato de SEC ID Nº 1 orientada
al sitio 403 de ARN de Smad7 humana, usada por el autor de la
presente invención en el transcurso de experimentos previos.
En vista del uso potencial y futuro de dicho ODN
antisentido fosforotioato de Smad7 para el tratamiento de
patologías humanas, se modificó dicha secuencia en los dinucleótidos
CpG allí contenidos, indicados de aquí en adelante como XY, debido
a su inmunogenicidad ya mencionada.
El estudio llevado a cabo por el autor ha
permitido ensayar la eficacia in vivo e in vitro de
diferentes ODN antisentido de Smad7 conocidos y novedosos y su
posible toxicidad, e investigar si bloquear la expresión de Smad7
da como resultado la resolución de la inflamación mucosa en modelos
experimentales de EII.
Las secuencias de ODN antisentido adecuadamente
modificadas mencionadas anteriormente según la presente invención,
además de una actividad biológica in vivo mayor, mostraron
una ausencia sorprendente de efectos secundarios en animales, a
pesar de lo que sucede después de la administración de otras
secuencias durante el transcurso del mismo estudio. Adicionalmente,
las secuencias de ODN según la invención mostraron su eficacia para
limitar la infiltración linfocítica y la propagación posterior de
la inflamación, lo que es una evidencia no encontrada para las
otras secuencias de ODN antisentido ensayadas en la presente
memoria.
El papel de Smad7 como diana biológica aparece
claramente en estos estudios en modelos experimentales, junto con
los posibles efectos terapéuticos de su inhibición.
Además, dentro del contexto de la presente
invención, se ha encontrado otro papel de Smad7 en la inducción de
la apoptosis de células T durante la EII. De hecho, mediante el uso
de algunos ODN antisentido de Smad7, se ha mostrado que el
TGF-\beta1 regula la apoptosis de células T
intestinales y que la actividad de un factor defectivo da cuenta de
la resistencia celular ante estímulos apopotóticos, que son
responsables de mantener la respuesta inflamatoria mucosa.
Por lo tanto, son objetos de la presente
invención oligonucleótidos antisentido fosforotioato de Smad7 de
hasta 21 oligonucleótidos de longitud que comprenden la siguiente
secuencia (SEC ID Nº 2):
5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3'
en la que X es un nucleótido que
comprende una base nitrogenada seleccionada del grupo constituido
por citosina, 5-metilcitosina y
2'-O-metilcitosina y en la que Y es
un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada del
grupo constituido por guanina, 5-metilguanina y
2'-O-metilguanina, a condición de
que al menos uno de los nucleótidos X o Y comprenda una base
nitrogenada
metilada.
Son otros objetos de la presente invención las
secuencias oligonucleotídicas de los estereoisómeros de
oligonucleótido antisentido diferentes, tales como diastereómeros y
enantiómeros, en cuanto a los átomos de fósforo del engarce
internucleosídico incluidos en la secuencia. Es más, el engarce
internucleosídico puede ser fosforotioato o metilfosfonato, y en
ambos casos el fósforo unido a cuatro grupos químicos diferentes
representa un centro quiral.
Los oligonucleótidos antisentido según la
presente invención pueden tener al menos un nucleótido
metilfosfonato en la secuencia que está situado, por ejemplo, en
sólo uno de los extremos 5' o 3' o en ambos extremos 5' y 3' o a lo
largo de la secuencia oligonucleotídica.
En una realización preferida, el nucleótido
metilfosfonato puede ser X o Y, de tal modo que el engarce
internucleosídico sea el engarce entre dichos nucleótidos.
Pueden llevarse a cabo modificaciones
adicionales en los extremos 5' y 3' y/o a lo largo de la secuencia
del ODN antisentido para aumentar la estabilidad de la molécula,
evitando así la degradación por nucleasas y reduciendo el riesgo de
efectos indeseables derivados de las acciones de metabolitos.
Los oligonucleótidos antisentido según la
presente invención pueden tener adicionalmente al menos un
nucleótido de la secuencia que es un 5'-monofosfato
de 2'-O-metilrribonucleótido que
está situado, por ejemplo, en sólo uno de los extremos 5' o 3' o en
ambos extremos 5' y 3' o a lo largo de la secuencia
oligonucleotídica.
Son objetos adicionales de la presente invención
los oligonucleótidos antisentido anteriormente citados en los que
los 2'-desoxirribonucleótidos se reemplazan por
ribonucleótidos y la 2'-desoxitimidina se reemplaza
por uridina, de tal modo que las secuencias desoxirribonucleotídicas
antisentido se convierten en las correspondientes secuencias
ribonucleotídicas antisentido.
Se representa una realización preferida de la
presente invención mediante oligonucleótidos antisentido que tienen
la secuencia (SEC ID Nº 3):
5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se representa otra realización preferida
mediante oligonucleótidos antisentido que tienen la secuencia (SEC
ID Nº 4):
5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
y Z es metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro aspecto, es una realización preferida
de la presente invención un oligonucleótido antisentido que tiene
la secuencia (SEC ID Nº 15):
5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
y Z es metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina.
Las secuencias de ODN antisentido según la
presente invención pueden usarse ventajosamente en el campo médico;
por lo tanto, son objetos adicionales de la presente invención
composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los
oligonucleótidos antisentido anteriormente dados a conocer como
principios activos, junto con uno o más coadyuvantes y/o
excipientes farmacéuticamente aceptables, que son conocidos por un
experto en este campo.
Adicionalmente, la invención se refiere al uso
de las secuencias oligonucleotídicas antisentido anteriormente
citadas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de
las patologías asociadas a la expresión de Smad7. En particular,
dichas patologías asociadas a la expresión de Smad7 son EII, tales
como por ejemplo EC y CU.
La presente invención se describe ahora, con
fines ilustrativos pero no limitantes, según sus realizaciones
preferidas, con referencia particular a las figuras de los dibujos
adjuntos, en los que:
la Figura 1 muestra el efecto sobre el número de
linfocitos T intestinales después de 40 horas de tratamiento de
muestras mucosas de pacientes de EC con ODN antisentido y con
sentido de Smad7
5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCT
CCCMe-dCGCAMePG-3' (SEC ID Nº 4);
CCCMe-dCGCAMePG-3' (SEC ID Nº 4);
la Figura 2 muestra el análisis de la expresión
del complejo p-Smad2/Smad3 y del complejo
Smad2/Smad3 total en CMLP aisladas del intestino de ratones
tratados con TNBS (TNBS), no tratados (no trat.) y tratados con
etanol (EtOH) como controles;
la Figura 3 muestra el análisis de la expresión
de Smad7 en CMLP aisladas del intestino de ratones tratados con
TNBS (TNBS), no tratados (no trat.) y tratados con etanol (EtOH)
como controles;
la Figura 4 muestra los cambios porcentuales de
peso en ratones con colitis inducida por TNBS tratada o no con
oligonucleótido antisentido de Smad7
MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC
(SEC ID Nº 15) o con un control (con sentido); la figura es
representativa de tres experimentos separados en los que se han
estudiado 14 ratones para cada grupos;
la Figura 5 muestra el aspecto macroscópico del
colon extraído de un ratón con colitis inducida por TNBS y de un
ratón con colitis inducida por TNBS tratada con oligonucleótido
antisentido de Smad7 (SEC ID Nº 15); la figura es representativa de
tres experimentos separados en los que se han estudiado 14 ratones
para cada grupo;
la Figura 6 muestra el aspecto histológico de
una sección de colon de ratones sin colitis o con colitis inducida
por TNBS tratada o no con oligonucleótido antisentido de Smad7 (SEC
ID Nº 15) o con un control (con sentido); la figura es
representativa de tres experimentos separados en los que se han
estudiado 14 ratones por cada grupo. Aumentos: 40x.
Ejemplo
1
Se sintetizaron todos los ODN antisentido de
Smad7 por MWG Biotech AG (MWG Biotech S.r.l., Florencia) empleando
técnicas automatizadas estándar con un sintetizador de ADN
automatizado usando protocolos de química de fosforoamidina
estándar (Lesiak K. y col., 1993; Xiao W. y col., 1996).
Se sintetizaron oligonucleótidos que contenían
5-metil-2'-desoxicitidina
(5-Me-dC) según procedimientos de
síntesis conocidos (Sanghvi y col, 1993) usando fosforoamiditas
comercialmente disponibles, mientras que se consiguió la síntesis
de oligonucleótidos modificados que contienen grupos metilfosfonato
(MeP) usando protocolos conocidos (Maier MA. y col., 2002).
Se ha llevado a cabo la purificación de las
moléculas oligonucleotídicas mediante tecnología HPSF, desarrollada
por MWG Biotech. Dicho procedimiento de purificación ha revelado una
alta eficacia, puesto que permite eliminar las secuencias fallidas
sintetizadas durante el proceso de síntesis química automatizada
tales como, por ejemplo, secuencias n-1,
n-2, n-x, que los procedimientos
clásicos de purificación estándar no son capaces de eliminar.
La tecnología anteriormente mencionada, además
de permitir obtener un 100% de las secuencias de longitud deseada
sin productos fallidos indeseables, permite evitar la siguiente
etapa de desalado, puesto que las secuencias purificadas están
exentas tanto de sales como de iones metálicos.
Dada la ausencia de cualquier sal, se analizaron
eventualmente los oligonucleótidos mediante técnicas de
espectrometría de masas MALDI-TOF según protocolos
estándar (Guerlavais T. y col., 2002; Ragas JA. y col., 2000). Se
esterilizaron entonces los oligonucleótidos y se cuantificó la
disolución resultante por densidad óptica (DO) mediante
espectrofotómetro de UV/visible. Finalmente, se resuspendieron las
moléculas en PBS 1x estéril antes de usar.
Todos los ODN antisentido usados se orientan a
sitios de ARNm Smad7 que tienen un 100% de homología entre ser
humano y ratón. En todos los oligonucleótidos siguientes, el engarce
internucleosídico es un engarce fosforotioato.
Las secuencias de ODN antisentido que se están
usando en el presente estudio se han diseñado según la secuencia de
ADN antisentido fosforotioato
5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3' (SEC ID
Nº 1) orientada al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana, usada por el
autor de la presente invención en el transcurso de experimentos
previos (Monteleone y col., 2001).
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3'
(SEC ID Nº 4) se orienta al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana. Este
es un oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina
perteneciente a los pares CpG de SEC ID Nº 1 se reemplazó por
5-metilcitosina (indicada en la presente memoria
como Me-dC). Además, se dispusieron engarces
metilfosfonato en los extremos de la molécula (indicados en la
presente memoria como MeP).
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GTTTGGTCCTGAACATGC-3' (SEC ID Nº
5) se orienta al sitio 294 de ARNm de Smad7 humana.
Se tomaron muestras de mucosa de especímenes de
resección de 6 pacientes con EC moderada a grave y de 4 pacientes
con CU grave. Además, se tomaron muestras de mucosa intestinal de 10
pacientes no afectados por EII que experimentan colectomía por
carcinoma de colon (se obtuvo la aprobación ética por el comité
local). Se prepararon CMLP usando el procedimiento de
DTT-EDTA-colagenasa y se
resuspendieron en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich S.r.l.,
Milán) suplementado con un reactivo de sustitución de suero
HL-1 (Biowhittaker, Wokingham, R.U.).
Se cultivaron las células en presencia y
ausencia de TGF-\beta1
(Sigma-Aldrich, concentración final en el intervalo
de 1 a 5 ng/ml) y se analizó después de 48 horas de incubación el
nivel de apoptosis.
En otros experimentos, se resuspendieron CMLP
aisladas de intestino de pacientes con EII en RPMI 1640 suplementado
con HL-1 y se cultivaron en presencia y ausencia
del ODN antisentido de Smad7 anteriormente mencionado (SEC ID Nº 4,
SEC ID Nº 5) y en presencia de un oligonucleótido con sentido de
control (ambos usados a una concentración de 2 \mug/ml). Después
de 24 horas, se usó una alícuota de CMLP para extraer proteínas y
evaluar la expresión de Smad7. Se lavaron extensamente las células
restantes, se resuspendieron en RPMI 1640 más HL-1,
se cultivaron en presencia o ausencia de
TGF-\beta1 (5 ng/ml) durante 48 horas y se analizó
entonces la apoptosis.
Se analizó la apoptosis mediante tinción con
yoduro de propidio (PI) seguida de citometría de flujo.
Se lavaron las células, se incubaron durante 15
minutos a 37ºC en 5 \mul de ribonucleasa A (0,6 \mug/ml,
30-60 unidades Kunitz,
Sigma-Aldrich) y se enfriaron entonces en hielo. Se
añadió yoduro de propidio (100 \mug/ml) antes del análisis por
citometría de flujo.
Se identificaron las células T usando un
anticuerpo monoclonal específico anti-CD3 (DAKO
Ltd., Cambridgeshire, R.U.).
Se homogeneizaron CMLP y se extrajeron las
proteínas totales en tampón A que contenía Hepes 10 mM (pH 7,9),
KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM y EGTA 0,2 mM. Se suplementó el tampón con
ditiotreitol 1 mM (DTT), aprotinina 10 \mug/ml, leupeptina 10
\mug/ml y fluoruro de fenimetanosulfonilo 1 mM (todos los
reactivos de Sigma-Aldrich).
Se analizó la proteína Smad7 usando un
anticuerpo de conejo específico anti-Smad7 humana
(dilución final 1:400, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA; EE.UU.).
Se usaron anticuerpos de cabra anti-conejo
conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako Ltd) a una
dilución final 1:20.000 para detectar la unión de anticuerpo
primario y se visualizó la inmunorreactividad con un kit de
quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Se cultivaron explantes mucosos tomados de
especímenes quirúrgicos de pacientes en presencia o ausencia de ODN
antisentido de Smad7 (SEC ID No 4, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, ambos
usados a una concentración final de 10 \mug/ml) durante 40
horas.
Como control negativo, se cultivó un explante en
presencia de ODN con sentido de Smad7.
Al final del cultivo, se recogieron los
explantes mucosos y se usaron para analizar el número de linfocitos
T de lámina propia mediante inmunohistoquímica.
Con este fin, se prepararon secciones mucosas y
se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-CD3
(DAKO). Se usaron anticuerpos de cabra anti-ratón
conjugados con fosfatasa alcalina (DAKO) para detectar la unión de
anticuerpo primaria.
Los resultados obtenidos en los diferentes
experimentos muestran cómo el TGF-\beta1
potenciaba, de modo dependiente de la dosis, la apoptosis de
linfocitos T aislados del intestino de sujetos normales.
La Tabla 1 muestra el porcentaje de linfocitos T
apoptóticos después de 48 horas de cultivo. Los números son los
resultados de 4 experimentos separados en los que se usaron células
T aisladas del intestino de cuatro sujetos normales.
En contraposición, los linfocitos T aislados de
cuatro pacientes de EII mostraron una resistencia parcial ante la
señal de apoptosis inducida por TGF-\beta1, como
se muestra en los resultados reproducidos en la Tabla 2, que
muestran el porcentaje de linfocitos T apopotóticos después de 48
horas de cultivo.
En particular, a partir del análisis de los
datos mostrados en la Tabla 2, no se observó ningún aumento
significativo de la apoptosis cuando se cultivaban células de
pacientes con EII en presencia de TGF-\beta1 a
concentración 0,2 ng/ml o 1 ng/ml. En contraposición, la
estimulación de células T de pacientes con EII con
TGF-\beta1 5 ng/ml daba como resultado un pequeño
aumento de la apoptosis.
El tratamiento de linfocitos T aislados de
pacientes con EII con el ODN antisentido de Smad7 SEC ID Nº 4
restauraba la sensibilidad celular ante
TGF-\beta1, dando como resultado una apoptosis
celular aumentada, como se muestra en los valores de porcentaje de
linfocitos T reproducidos en la Tabla 3. Los datos se refieren a
cuatro experimentos separados en los que se cultivaron células T
del intestino de cuatro pacientes con EII con medio solo (no
estimuladas) o pretratadas con medio y oligonucleótidos con sentido
(control) o antisentido durante una noche, y estimuladas entonces
con TGF-\beta1 (1 ng/ml).
Además, usando cultivo de órganos ex
vivo, el autor de la presente invención demostró que el
tratamiento de biopsias de EII con ODN antisentido de Smad7 según
la presente invención reducía significativamente el número de
células T CD3+ mucosas, como se muestra en la inmunohistoquímica de
la Figura 1. Esto último muestra que el tratamiento con el ODN
antisentido reduce el número de células T CD3+ mucosas.
Conjuntamente, estas observaciones sugieren la
posibilidad de que un alto nivel de Smad7 desempeñe un papel
crucial en la prolongación de la supervivencia de células T,
contribuyendo así a la propagación de la inflamación local en
EII.
Por tanto, bloquear la Smad7 podría representar
una estrategia prometedora para controlar la inflamación mucosa en
estas afecciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Todos los ODN antisentido y con sentido de Smad7
se sintetizaron por MWG Biotech S.r.l. (Florencia) empleando las
técnicas estándar descritas anteriormente.
El ODN antisentido usado se orienta a sitios de
ARNm de Smad7 que tienen un 100% de homología entre ser humano y
ratón. En todos los oligonucleótidos siguientes, el engarce
internucleosídico es un engarce fosforotioato. Se usaron todas las
siguientes secuencias en los experimentos llevados a cabo en modelos
experimentales de colitis inducida.
El ODN antisentido de Smad7 de SEC ID Nº 1
(5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3') se
orienta al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana ya usado por el autor
de la presente invención en el transcurso de experimentos publicados
en un artículo previo (Monteleone y col., 2001).
Para el estudio adicional referente al papel de
Smad7 sobre la regulación de la apoptosis de células T en CMLP
aisladas del intestino de pacientes con EII, se usaron las
siguientes secuencias oligonucleotídicas antisentido SEC ID Nº 4 y
SEC ID Nº 5.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3'
(SEC ID Nº 4) se orienta al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana. Este
es un oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina
perteneciente a los pares CpG en la posición 3 y 16 de la SEC ID Nº
1 se reemplazó por 5-metilcitosina (indicada como
MedC). Además, los engarces metilfosfonato se dispusieron en los
extremos de la molécula (indicados como MeP).
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GTTTGGTCCTGAACATGC-3' (SEC ID Nº
5) se orienta al sitio 294 de ARNm de Smad7 humana. Los engarces
internucleosídicos incluidos en la presente memoria son engarces
fosforotioato.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GTTTGGTCCTGAACAT-3' (SEC ID Nº 6)
se orienta al sitio 296 del ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GTTTGGTCCTGAACATG-3' (SEC ID Nº
7) se orienta al sitio 295 de ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-AGCACCGAGTGCGTGAGC-3' (SEC ID Nº
8) se orienta al sitio 577 de ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-MePAGCACMedCGAGTGMedCGTGAGCMeP-3'
(SEC ID Nº 9) se orienta al sitio 577 de ARNm de Smad7 humana. Este
es un oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina en
la posición 6 y 12 de SEC ID Nº 8 se reemplazó por
5-metilcitosina. Además, los engarces metilfosfonato
se dispusieron en los extremos de la molécula.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-CGAACATGACCTCCGCAC (SEC ID Nº 10) se orienta al
sitio 233 de ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-Me-d CGA ACA TGA CCT
CMe-d CG CAC-3' (SEC ID Nº 11) se
orienta al sitio 233 de ARN de Smad7 humana. Este es un
oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina en la
posición 1 y 14 de SEC ID Nº 10 se reemplazó por
5-metilcitosina.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GTMedCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAG-3'
(SEC ID Nº 12) se orienta al sitio 403 de ARMm de Smad7 humana.
Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina
perteneciente a los pares CpG en la posición 3 y 16 de la SEC ID Nº
1 se reemplazó por 5-metilcitosina (indicada como
Me-dC).
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-GATCGTTTGGTCCTGAA-3' (SEC ID Nº
13) se orienta al sitio 299 de ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
5'-ATCGTTTGGTCCTGAAC-3' (SEC ID Nº
14) se orienta al sitio 298 de ARNm de Smad7 humana.
La secuencia de ODN antisentido de Smad7
MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC
(SEC ID Nº 15) se orienta al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana.
Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en el que la citosina
perteneciente a los pares CpG en posición 3 y 16 de la SEC ID Nº 1
se reemplazó por 5-metilcitosina (indicada como
MedC). Además, los engarces metilfosfonato se dispusieron en uno de
los extremos de los oligonucleótidos y en el residuo de guanina en
posición 20.
Se mantuvieron ratones macho SJL/J de 5 a 6
semanas de edad en una instalación animal exenta de patógeno
específico. Para la inducción de colitis, se administraron 2,5 mg
de TNBS (pH 1,5-2,0; Sigma Aldrich) en etanol al 50%
por el recto a ratones ligeramente anestesiados mediante un catéter
de 3,5 F. Se insertó la punta del catéter 4 cm proximal al borde
del ano, entonces se instilaron lentamente 100 ml de fluido
(TNBS/etanol) en el colon.
Para asegurar la distribución del TNBS por todo
el colon y ciego, se mantuvieron los ratones en posición vertical
durante 30 segundos después de la inyección. Se administró a algunos
de los ratones etanol al 50% sólo usando la misma técnica y se
usaron como controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron tejidos extirpados de los ratones a
los tiempos indicados de muerte en disolución de formalina al 10%
(Sigma Aldrich), se embebieron en parafina, se cortaron en secciones
de tejido y se tiñeron con hematoxilina y toxina. Se examinó en las
secciones teñidas la evidencia de colitis usando diferentes
criterios tales como la presencia de infiltración linfocítica,
alargamiento y/o distorsión de criptas, ulceración franca y
engrosamiento de la pared intestinal.
Se graduó de 0 a 4 el grado de inflamación en
secciones transversales microscópicas del colon del siguiente
modo:
- 0:
- sin evidencia de inflamación;
- 1:
- bajo nivel de infiltración linfocítica observado en <10% de un campo de gran aumento (hpf= campo de gran aumento), sin cambios estructurales observados;
- 2:
- infiltración linfocítica moderada con infiltración observada en <10-25% de un hpf, alargamiento de cripta, engrosamiento de la pared intestinal que no se extiende más allá de la capa mucosa;
- 3:
- alto nivel de infiltración linfocítica con infiltración observada en <25-50% de un hpf, engrosamiento de la pared intestinal que se extiende más allá de la capa mucosa;
- 4:
- grado notable de infiltración linfocítica con infiltración observada en >50% de un hpf, alta densidad vascular, alargamiento de cripta con distorsión, engrosamiento de pared intestinal transmural con ulceración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células mononucleares de lámina
propia (CMLP) de especímenes colónicos. Se lavaron los especímenes
en primer lugar con HBSS (disolución de sal equilibrada de Hanks,
Sigma-Aldrich) exenta de calcio y magnesio y se
cortaron en trozos de 0,5 cm. Se incubaron entonces dos veces, cada
vez durante 15 minutos en HBSS que contenía EDTA (0,37 mg/ml) y
ditiotreitol (0,145 mg/ml) a 37ºC. Se digirieron entonces los
tejidos en RPMI que contenía colagenasa D (400 U/ml, Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) y ADNasa I (0,01 mg/ml,
Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) en un incubador
agitado a 37ºC.
Se resuspendieron las CMLP liberadas del tejido
en 100% de Percoll, se dispusieron bajo un gradiente de Percoll al
40% (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) y se centrifugaron a
1.800 rpm durante 30 minutos, obteniéndose la población enriquecida
en linfocitos.
Para evaluar la eficacia in vitro del ODN
antisentido de Smad7, se resuspendieron las CMLP aisladas de
ratones tratados con TNBS en RPMI 1640
(Sigma-Aldrich) suplementado con un reactivo de
sustitución de suero HL-1 (Biowhittaker) a una
concentración final de 1 x 10^{6}/ml en placas de 24 pocillos.
Para la transfección de ODN antisentido, se usaron 2 \mul de
reactivo Lipofectamine 2000 (LF, Invitrogen Italia SRL, San Giuliano
Milanese) por cada ml de medio de cultivo siguiendo el protocolo.
Se combinaron entonces 2 \mug/ml de ODN antisentido y LF y se
dejaron incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadió
entonces directamente la mezcla obtenida a las células. Después de
cultivo durante una noche, se retiraron las células de la placa y
se usaron para análisis de Smad7 por transferencia Western.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos días después del tratamiento con TNBS, se
administraron a ratones por el recto 150 \mug de cada
oligonucleótido antisentido o con sentido de Smad7. Se examinaron
al menos 5 ratones por grupo. El quinto día, se sacrificaron los
ratones, se tomaron muestras mucosas intestinales completas y se
analizó el contenido de Smad7 y Smad3 mediante transferencia
Western. Además, se evaluó el grado de inflamación mucosa
intestinal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se homogeneizaron tanto células mononucleares de
lámina propia como especímenes colónicos enteros usando el
procedimiento anterior. Se reveló entonces la expresión de Smad7
mediante transferencia Western.
Al final, se depuraron las transferencias usando
una disolución comercialmente disponible (Piece) y se sondearon con
anticuerpos anti-actina
(Sigma-Aldrich) para verificar que la misma cantidad
de proteína llenaba cada pocillo. Se realizó la detección usando un
kit de quimioluminiscencia (Pierce). Se analizó la intensidad de
las bandas mediante un densitómetro.
Se analizó también tanto en las proteínas de
muestras de CLMP como de especímenes colónicos enteros el contenido
de proteína Smad3 fosforilada y total mediante transferencia Western
usando anticuerpos comercialmente disponibles (Santa Cruz).
Para el análisis de Smad3 fosforilado, se usaron
un anticuerpo de conejo anti-humano específico de
Smad3 capaz de reconocer proteínas Smad2/3 fosforiladas como
antígeno (dilución final 1:500) y un anticuerpo de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
picante (dilución 1:20.000). Se visualizó la inmunorreactividad con
un kit de quimioluminiscencia (Pierce).
Después de la detección se depuraron las
transferencias usando una disolución comercialmente disponible
(Pierce) y se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-humano específico de Smad3 humana (dilución
final 1:500) seguido de un anticuerpo de conejo
anti-cabra conjugado con peroxidasa de rábano
picante (dilución 1:20.000); se visualizó entonces la
inmunorreactividad con el kit de quimioluminiscencia anteriormente
mencionado (Pierce).
Se determinó la cantidad de
TGF-\beta1 activo en las muestras de mucosa
intestinal. Con este objetivo, se extrajeron las proteínas totales
de muestras de mucosa de ratones con o sin colitis inducida por TNBS
como se indica anteriormente. Se analizaron los niveles de
TGF-\beta1 activo usando un kit ELISA
comercialmente disponible (R&D Systems, Space
Import-Export Srl, Milán). Se midió la densidad
óptica en un lector ELISA Dynatech MR 5000 a una longitud de onda
de 490 nm. Se expresaron los datos como pg/100 \mug de proteínas
totales.
Después de recibir TNBS, los ratones
desarrollaron diarrea y pérdida de peso como evidencia de la
inducción de colitis. El colon estaba macroscópicamente agrandado y
el análisis histológico de su mucosa mostró lesiones inflamatorias
de moderadas a graves.
Para examinar si la inducción de colitis por
TNBS estaba asociada a cambios en la producción de
TGF-\beta1, se tomaron especímenes colónicos de
ratones con o sin colitis y se analizó el contenido de
TGF-\beta1 activo mediante ELISA.
Como varios tipos celulares que tienen el
potencial de sintetizar TGF-\beta1 están presentes
al nivel intestinal, se usó para la evaluación toda la mucosa
intestinal en lugar de CMLP solas.
En ausencia de colitis, se detectaron bajos
niveles de TGF-\beta1 activo (85\pm12 y
94\pm26 pg/\mug de proteína total en ratones no estimulados y
de control respectivamente). Se midieron niveles significativamente
potenciados de TGF-\beta1 en muestras mucosas de
ratones con colitis inducida por TNBS (985\pm120 pg/\mug de
proteína total) (p<0,01). Aunque este resultado parece sugerir
que durante la colitis inducida por TNBS podría haber una actividad
creciente de TGF-\beta1, el análisis de los
niveles intracelulares de Smad3 activa en CMLP intestinales
aisladas de ratones con colitis exhibe sorprendentemente una
fosforilación reducida de Smad3, que está asociada a una inducción
potenciada de Smad7 (Figura 2 y 3). En particular, la figura 2
ilustra la presencia de una banda correspondiente a Smad2/3 activa
(fosforilada) en CMLP aislada de intestino no afectado, pero no de
ratones con colitis inducida por TNBS. En la figura 3, se ha
mostrado que las dos bandas, la banda inferior de 47 kDa
correspondiente a la Smad7 libre y la banda superior de 102 kDa
correspondiente al complejo TGF-\beta1
R1-Smad7, están presentes sólo en especímenes de
CMLP aislados del intestino de ratones con colitis inducida por
TNBS. Estos datos indican que la inflamación local estimula la
síntesis de TGF-\beta1, que sin embargo no es
capaz de suprimir la inflamación mucosa.
Según la presente invención, se ha evaluado si
tratar ratones TNBS con ODN antisentido de Smad7 podría restaurar
la función de TGF-\beta1 endógeno y limitar la
inflamación continua.
En primer lugar, se ha ensayado la eficacia del
ODN antisentido de Smad7 anteriormente mencionado (SEC ID Nº 1 y
SEC ID Nº 4-15) para reducir la expresión de Smad7
en experimentos tanto in vitro como in vivo.
Con respecto a los experimentos in vitro,
se transfectaron las CMLP aisladas del intestino de ratones con
colitis inducida por TNBS con cada uno de los ODN antisentido de
Smad7 y se incubaron durante una noche. Se llevó a cabo el análisis
de Smad7 mediante transferencia Western.
Con respecto a los experimentos in vivo,
se administraron a ratones tratados con TNBS ODN antisentido de
Smad7 y después de 3 días se sacrificaron los animales, se tomaron
especímenes de tejido y se llevó a cabo el análisis de Smad7
mediante transferencia Western.
La Tabla 4 resume los resultados de estos
experimentos y muestra el porcentaje de inhibición obtenido por
cada oligonucleótido antisentido de Smad7 en experimentos tanto
in vitro como in vivo. Los datos indican media \pm
error estándar (EE) de cuatro experimentos in vitro separados
y media \pm EE de cinco experimentos in vivo
separados.
Todos los ODN antisentido eran eficaces en la
reducción de la expresión de Smad7 cuando se transfectaron in
vitro en CMLP aisladas de modelos de murino tratados con TNBS. A
partir del análisis del valor del porcentaje de inhibición mostrado
en la Tabla 4, es notable que las secuencias oligonucleotídicas
antisentido SEC ID Nº 4, 10, 11, 12 y 15 mostraron la mayor
eficacia.
No obstante, el porcentaje de inhibición de la
expresión de Smad7 obtenido mediante el tratamiento in vivo
con las secuencias oligonucleotídicas SEC ID Nº 10 y 11 no difería
significativamente del documentado en experimentos in
vitro.
En cambio, el tratamiento con ODN antisentido de
SEC ID Nº 4 y 12 y 15 dio como resultado claramente un mayor
porcentaje de inhibición de Smad7 que el obtenido en experimentos
in vitro, es decir, 55% frente a 34%, 42% frente a 32% y 56%
frente a 34% respectivamente (P<0,01).
En contraposición, el tratamiento de ratones con
oligonucleótido antisentido de SEC ID Nº 7 causó una reducción de
la expresión de Smad7 in vivo que era de menor entidad que la
resultante cuando se transfectó el oligonucleótido antisentido en
CMLP in vitro, es decir, 10% frente a 17%, P<0,01.
En total, estos resultados sugieren que sólo la
modulación específica en una secuencia de ODN antisentido de Smad7
es capaz de mejorar su perfil farmacocinético, bioquímico y
biofísico.
No se documentó señal alguna de toxicidad aguda
en ratones que recibían oligonucleótidos antisentido (SEC ID Nº 1
y SEC ID Nº 4-15). Uno de cada 5 tratados con TNBS
murió después de 3 días (20%). De forma similar, 1/5 de los ratones
que recibían el oligonucleótido antisentido de Smad7 murió después
de 4 días.
No se documentó mortalidad en el grupo de
ratones tratado con ODN antisentido de Smad7 de SEC ID Nº 1 y SEC
ID Nº 4-15.
El uso de secuencias de ODN antisentido de SEC
ID Nº 13 y SEC ID Nº 14 está asociado a una actividad de inhibición
in vitro razonable (11% y 9,5%, respectivamente). No
obstante, la administración in vivo de dichas secuencias
estaba inesperadamente unida a un marcado empeoramiento de la
colitis, hasta causar la muerte de todos los ratones después de 72
horas de tratamiento.
El análisis macroscópico de las muestras
intestinales tomadas de estos ratones ha revelado la presencia de
una colitis grave y ésta estaba asociada a un aumento sustancial de
la expresión de Smad7 intestinal.
Como se dice anteriormente, se ensayó la
eficacia de ODN antisentido de Smad7 para limitar la inflamación
continua. Con este fin, se administraron a ratones después de la
inducción de colitis oligonucleótidos antisentido de SEC ID Nº 1,
4, 5 y 15, considerando 5 animales por cada grupo.
Siguiendo el tratamiento con ODN antisentido de
Smad7, se ha revelado una reducción de la inflamación mucosa. Este
resultado era particularmente evidente en ratones tratados con los
oligonucleótidos antisentido 4 y 15. Es más, la gravedad de la
colitis de grado 3-4 en ratones con colitis que no
reciben antisentido alcanzó el grado 2 ó 3 después de la
administración de las secuencias oligonucleotídicas antisentido 1 ó
5 respectivamente, mientras que en ratones tratados con las
secuencias oligonucleotídicas 4 ó 15, la inflamación no ha superado
el grado 1.
Para examinar si los oligonucleótidos
antisentido de Smad7 eran eficaces también cuando se administraban
por vía oral, se trataron ratones con colitis inducida por TNBS el
día después de la inducción de colitis con los oligonucleótidos
antisentido de Smad7 4 ó 15 o de control (con sentido).
Con este fin, se resuspendieron oligonucleótidos
en una disolución de bicarbonato. El volumen final de disolución
administrada a cada ratón fue de 350 \mul y contiene dosis de
oligonucleótido equivalentes a 250, 500 ó 1000 \mug. Se
administró dicha disolución por vía oral a través de un catéter.
El quinto día, se sacrificaron los ratones y se
evaluaron el análisis de la expresión de Smad7 y del grado de
inflamación como se indica en los párrafos anteriores. Todos los
ratones tratados con oligonucleótido antisentido, y no con el
oligonucleótido con sentido de control, mostraron una reducción
significativa de la expresión de Smad7 y una fosforilación
aumentada de Smad3 independientemente de la dosis de oligonucleótido
que se esté usando.
Se asoció sustancialmente la inhibición de Smad7
a una recuperación de peso, como se muestra en la Figura 4. La
Figura 4 exhibe una gráfica que muestra el cambio de porcentaje de
peso de los ratones con colitis inducida por TNBS tratada o no
tratada con oligonucleótido antisentido de Smad7 (SEC ID Nº 15) o de
control (con sentido). Se administraron ambos oligonucleótidos por
vía oral a una dosis de 250 \mug a través de catéter dos días
después de la inducción de colitis. La pérdida de peso documentable
el segundo día en cada uno de los tres grupos indica que el
tratamiento con TNBS inducía la colitis. Se probó adicionalmente
que, a partir del cuarto día, los ratones tratados con
oligonucleótido antisentido de Smad7, pero no con el control,
mostraban una recuperación del peso corporal. La recuperación
aparente y ligera mostrada el quinto día en ratones con colitis
inducida por TNBS es debida al hecho de que el 21,4% de los ratones
con colitis murieron el 4º día y por lo tanto no se consideraron en
la evaluación del peso corporal del 5º día.
Se correlacionó la inhibición de Smad7 con una
notable supresión de la inflamación tisular como se muestra en las
Figuras 5 y 6. La Figura 5 exhibe las imágenes de colon extraído de
un ratón con colitis por TNBS y de un ratón con colitis por TNBS
tratada con oligonucleótidos antisentido de Smad7 (SEC ID Nº 15). Se
administró el oligonucleótido por vía oral a una dosis de 250
\mug mediante un catéter el segundo día después de la inducción
de colitis. Se ha mostrado que el colon de ratón con colitis por
TNBS está altamente inflamado, acortado y engrosado. Por el
contrario, el ratón que recibe antisentido de Smad7 muestra un colon
de longitud y grosor normales y sin señales macroscópicas de
flogosis. La Figura 6 exhibe el aspecto histológico de una sección
de colon de un ratón sin colitis o de ratones con colitis por TNBS
tratada o no tratada con oligonucleótido antisentido de Smad7 (SEC
ID Nº 15) o de control (con sentido). Se administraron ambos
oligonucleótidos por vía oral a una dosis de 250 \mug mediante
catéter el segundo día después de la inducción de colitis. Se ha
mostrado que, en ratones sin colitis, las glándulas parecen
rectilíneas y uniformes con un contenido normal de células
mucíparas y elementos inflamatorios de lámina propia. Por el
contrario, en el colon de ratones tratados con TNBS que reciben o
no el oligonucleótido de control, había una destrucción total de la
estructura glandular, con una masiva infiltración de células
mucíparas e inflamatorias en la lámina propia. En la sección cólica
de los ratones tratados con TNBS y que reciben oligonucleótido
antisentido de Smad7, se demostró la presencia de una estructura
glandular normal y la ausencia de flogosis.
Conjuntamente, estas observaciones sugieren que
el uso de ODN antisentido, que muestra la mayor eficacia de
inhibición de Smad7 acompañado por la ausencia de efectos
secundarios después de administración in vivo, puede
representar una estrategia terapéutica prometedora en el control de
la inflamación mucosa durante EII, especialmente si dichas
características de eficacia y toxicidad se comparaban con los
resultados conseguidos con otras secuencias de ODN antisentido con
la misma eficacia en la inhibición in vitro de Smad7.
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<141>
04-02-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RM2003A000149
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-02-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia antisentido fosforotioato
orientada al sitio 403 de ARNm de Smad7 humana
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<220>
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado a ARNm de Smad7 humana
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fosforotioato modificado orientado a ARNm de Smad7
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5-metil-2'-desoxicitidina
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5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
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\hfill20
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado al sitio 403 de ARNm de Smad7
humana
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2'-desoxiguanosina
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<222> (3)..(3)
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5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
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<222> (16)..(16)
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<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
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<222> (16)..(16)
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<223> "n": metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
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<221> modified_base
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<222> (20)..(20)
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<223> metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntngcccctt ctcccngcan
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 294 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttgtcct gaaacatgc
\hfill18
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<210> 6
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 296 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttggtcct gaacat
\hfill16
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<210> 7
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 295 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttggtcct gaacatg
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 577 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipagcaccgagt gcgtgagc
\hfill18
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<210> 9
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado al sitio 577 de ARNm de Smad7
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n": metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
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<220>
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<221> modified_base
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<222> (1)..(1)
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<223> metilfosfornato de
2'-desoxiguanosina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
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<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
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<222> (12)..(12)
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<223> m5c
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n": metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipngcacngagt gngtgagn
\hfill18
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<210> 10
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 233 de ARNm de Smad7 humana
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(18)
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipcgaacatgac ctccgcac
\hfill18
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<210> 11
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado al sitio 233 de ARNm de Smad7
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n": monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
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<222> (1)..(1)
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<223> m5c
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<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipngaacatgc ctcngcac
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado al sitio 403 de ARNm de Smad7
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtngcccctt ctcccngcag
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 299 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgtttgg tcctgaa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato orientado al sitio 298 de ARNm de Smad7 humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgtttggt cctgaac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
fosforotioato modificado orientado el sitio 403 de ARNm de Smad7
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n": metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n":
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n": metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntngcccctt ctcccngcan c
\hfill21
Claims (15)
1. Oligonucleótidos antisentido fosforotioato
contra Smad7 de hasta 21 nucleótidos de longitud, que comprenden la
siguiente secuencia (SEC ID Nº 2):
5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3'
en la que X es un nucleótido que
comprende una base nitrogenada seleccionada del grupo constituido
por citosina, 5-metilcitosina y
2'-O-metilcitosina, y en la que Y es
un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada del
grupo constituido por guanina, 5-metilguanina y
2'-O-metilguanina, a condición de
que al menos uno de los nucleótidos X o Y comprenda una base
nitrogenada
metilada.
2. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 1, en los que al menos un oligonucleótido de la
secuencia está metilfosfonatado.
3. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 2, en los que dicho al menos un nucleótido
metilfosfonato está dispuesto en sólo uno de los extremos 3' o 5' o
en ambos extremos 3' y 5' o a lo largo de la secuencia
oligonucleotídica antisentido.
4. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 2, en los que el nucleótido metilfosfonato es Y.
5. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 2, en los que el nucleótido metilfosfonato es X.
6. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 1, en los que al menos un nucleótido de la secuencia
es un 5'-monofosfato de
2'-O-metilrribonucleótido.
7. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 6, en los que dicho al menos un
5'-monofosfato de
2'-O-metilrribonucleótido está
dispuesto en sólo uno de los extremos 3' o 5' o en ambos extremos 3'
y 5' o a lo largo de la secuencia oligonucleotídica.
8. Oligonucleótidos antisentido según
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que los
2'-desoxinucleótidos están reemplazados por los
correspondientes ribonucleótidos.
9. Oligonucleótidos antisentido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que tienen secuencia (SEC
ID Nº 4):
5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
y Z es metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina.
10. Oligonucleótidos antisentido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que tienen secuencia (SEC
ID Nº 5):
5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina
y Z es metilfosfonato de
2'-desoxiguanosina.
11. Oligonucleótidos antisentido según la
reivindicación 1 que tienen secuencia (SEC ID Nº 3):
5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'
en la que X es
5'-monofosfato de
5-metil-2'-desoxicitidina.
12. Oligonucleótidos antisentido como se
definen en las reivindicaciones 1 a 11 para uso en el campo
médico.
13. Composición farmacéutica que comprende al
menos uno de los oligonucleótidos antisentido como se definen en
las reivindicaciones 1 a 11 como principio activo, junto con uno o
más coadyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. Uso de los oligonucleótidos antisentido
como se definen en las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de las patologías asociadas a
la expresión de Smad7 que son enfermedades inflamatorias
crónicas.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que
las enfermedades inflamatorias crónicas son enfermedades
inflamatorias intestinales tales como enfermedad de Crohn y colitis
ulcerosa.
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|---|---|---|---|
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| IT2003RM000149 ITRM20030149A1 (it) | 2003-04-02 | 2003-04-02 | Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico |
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|---|---|---|---|
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