MXPA05010549A - Oligonucleotidos (odn) antisense contra smad7 y su utilizacion en el campo medico. - Google Patents

Abstract

El invento esta relacionado a secuencias de oligonucleotidos antisense (ODN) contra Smad7 adecuadamente modificados, y sus usos en el campo medico como agentes biologicos terapeuticos, en particular en el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa.

Description

OLIGONUCLEÓTIDOS (ODN) ANTISENSE CONTRA SMAD7 Y SU UTILIZACIÓN EN EL CAMPO MÉDICO El invento actual está relacionado con oligonucleótidos antisense (ODN) contra de Smad7 y los usos del mismo dentro del campo médico. En especial el invento refiere a secuencias ODN antisense Smad7 adecuadamente modificadas, que muestran una actividad biológica sorprendente de inhibición específica de expresión de Smad7 y por lo tanto son útiles en el campo médico como agentes biológicos terapéuticos, en especial en el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales (IBD). La enfermedad de Crohn (CD) y colitis ulcerosa (UC) son las principales formas de enfermedades inflamatorias gastrointestinales en humanos. Ambas enfermedades son entidades clínicas complejas, cuyas patogénesis depende estrictamente de la interacción entre diferentes factores genéticos, ambientales y inmunológicos. A pesar de que CD y UC muestran diferencias notables tanto en su nivel patofisiológico como clínico, el enfoque terapéutico para pacientes que sufren estas enfermedades comparte muchos elementos en común. La variación en la presentación clínica, el tipo y la extensión de las lesiones, y los tipos de complicaciones influyen en la elección terapéutica, aunque el tratamiento farmacológico representaría el primer enfoque predominante. Salicilazosulfapiridina y 5-ácido amino salicílico son drogas de eficacia comprobada en el manejo de la forma leve de IBD y en terapia de mantenimiento de remisión.

En las fases con actividad moderada a severa y en los casos en donde el estado general esta involucrado, es necesario recurrir al uso de corticosteroides. Basado en análisis de mediano a largo plazo de historiales clínicos principales alrededor del mundo, parece que remisión clínica se obtiene solamente en dos terceras partes de los pacientes que reciben corticosteroides, y solamente en el 50% de estos pacientes no ocurre ninguna recaída después de la suspensión de la droga. La administración continua de corticosteroides, además de inducir el fenómeno de dependencia de la droga, se empeora debido al muy alto riesgo de efectos secundarios. Además tratamiento inmunosupresivo, que a menudo acompaña o reemplaza terapia corticosteroidal, no siempre asegura la contención de flogosis y el control de las síntomas, y además tiene la desventaja de varias contraindicaciones y efectos secundarios severos (Podolsky, 2002). La nueva generación de drogas que se hacían disponibles en los años 90, son agentes biológicos. Un conocimiento mas profundo de la naturaleza de IBD y los principales mecanismos patofisiológicos ha contribuido a dirigir la intervención médica de manera concreta. Así, el desarrollo de bioterapias dirigidas al control de vías inflamatorias específicas ha ocurrido a través del uso de proteínas humanas recombinantes, anticuerpos humanizados quiméricos monoclonales y proteínas de fusión. En este contexto, los agentes que han mostrado mas eficacia en el tratamiento de CD son anticuerpos quiméricos monoclonales dirigidos a bloquear TNF-a, citosina pro-inflamatorio que se sobre produce en IBD (Seegers et al., 2002). Este compuesto, que esta presente en la fase IV de la prueba clínica, es efectivo en la contención de inflamación en alrededor de 60-70% de los pacientes tratados. Sin embargo, se han señalado con cierta frecuencia de incidencia efectos secundarios y estos son reconocidos en la reactivación de infecciones microbiales latentes, fenómenos de hipersensibilidad y formación de auto-anticuerpos. El último fenómeno se podría deber al hecho de que el anti-TNF-a neutraliza el citosina TNF-a que tiene varias funciones biológicas. Además de los efectos inflamatorios, TNF-a también juega un papel en los mecanismos involucrados en la inducción y mantenimiento de tolerancia inmunológico. Por lo tanto, un bloqueo de la actividad de TNF-a paradójicamente podría alentar excesivas reacciones inmunológicas (Sandborn et al., 2002). Todos estos comentarios sugieren la necesidad de nuevos estudios sobre IBD en modelos animales con el fin de hacer posible la identificación de principios activos nuevos que se pueden usar en un mejor y mas duradero tratamiento de tales patologías (Fiocchi, 2001). Tratamiento anti-TNF-g, en cuanto a las otras bioterapias, tales como la administración de citosinas anti-infiamatorias, por ejemplo, IL-10, representa un enfoque terapéutico extracelular dirigido al control de los efectos biológicos de moléculas secretadas por células inflamatorias. El estudio de las vías de la transducción de señales activadas por la interacción de citosina con sus receptores ha resumido la oportunidad de usar estrategias terapéuticas nuevas capaces de modular específica y selectivamente la expresión intracelular de importantes moléculas inflamatorias y no-inflamatorias.

Bajo condiciones normales, la mucosa del intestino es el lugar de un infiltrado inflamatorio "fisiológico", que se mantiene a través de un equilibrio frágil entre moléculas pro-inflamatorios y anti-inflamatorios. En relación a lo anterior, es importante el papel que juega TGF-ß?, una citosina multifuncional capaz de regular el crecimiento, la diferenciación y la actividad de muchas células inmunes y no-inmunes. Estudios in vitro y in vivo han mostrado que TGF-ß? actúa como inmunoregulador potente capaz de controlar inflamación mucosa intestinal, y que la inhibición de su actividad da como resultado el desarrollo de colitis que muestra semejanzas inmunomorfológicas con CD o UC (Powrie F. et al., 1996; Neurath M. Fet al., 1996; Ludviksson B. R. et al., 1997). De hecho, genes TGF-ß? genes deficientes en ratones muestran severas respuestas inflamatorias multifocales, que también involucran al intestino, asociados con una producción excesiva de citosinas inflamatorias por varios tipos de células, incluyendo células T (Shull M. M. et al, 1992; Christ M. et al.1994). Asimismo, la inhibición de señalización TGF-ß? en ratones a través de la expresión de una forma muíante negativa dominante del receptor tipo RII de TGF-ß?, da como resultado una susceptibilidad aumentada para el desarrollo de colitis experimental (Hahm K.B. et al., 2001). Finalmente, se ha mostrado que la inhibición específica de señalización TGF-ß? en células T a través de la expresión de un receptor TGF-ß dominante negativo tipo II causa una enfermedad autoinmune caracterizada por infiltraciones inflamatorias severas en el pulmón y colon y la presencia y circulación de anticuerpos auto inmunes (Gorelik L. et al., 2000). Estos datos indican que la pérdida de actividad de una sola molécula anti-inflamatoria podría ser suficiente para alterar el homeostasis intestinal y permitir respuestas inmunes que llevan a daño tisutal. La actividad TGF-ß? anti-inflamatoria empieza con la interacción de la molécula con un complejo de receptores serinas/treoninas heterodiméricos transmembranas que consiste en dos sub-unidades, llamadas TGF-ß? Rl y TGF-ß? R2, respectivamente. Al formar el enlace TGF-ß?, los receptores giran relativamente dentro del arriba mencionado complejo, dando como resultado un proceso de trans-fosforilación y la subsiguiente activación de TGF-ß? Rl a través de la constitutivamente activo TGF- ? R2 y capaz de auto-fosforilación.

La propagación de la señal activada por TGF-ß? al núcleo se media a través de proteínas que pertenecen a la familia Smad. TGF-ß? Rl activado, fosforiliza directamente proteínas Smad2 y Smad3, y estas adquieren la capacidad de interactuar con Smad4, así facilitando que el complejo Smad2-3/Smad4 se translocaliza al núcleo, en donde participa en el control transcripcional de algunos genes (Heldin C-H. et al., 1997). El papel de Smad3 en la actividad anti-inflamatoria TGF-ß? está apoyado por estudios en modelos animales, que muestran que la eliminación del gene de codificación para Smad3 esta asociado con la respuesta reducida de la célula a TGF-ß?, y con un desarrollo relacionado de enfermedad inflamatoria caracterizada por una infiltración masiva de células T y la formación de abscesos piogénicos a nivel gastrointestinal (Yang X. et al., 1999). También otras proteínas intracelulares, por ejemplo Smad7, pertenecen a la familia de proteínas de Smads. Tal ocupación de la proteína a TGF-ß? Rl interfiere con el enlace de Smad2/Smad3 al receptor, así impidiendo la fosforilación y la activación. Por lo tanto, una expresión aumentada de la proteína Smad7 se asocia con la inhibición de la señalización mediada por TGF-ß? (Hayashi H. et al., 1997). La evaluación de la expresión TGF-ß? en la mucosa intestinal de pacientes con IBD muestra que dicha producción de moléculas paradójicamente es aumentada en comparación con lo se puede probar en el intestino de pacientes normales (Lawrance IC. et al., 2001). En un artículo reciente el autor del invento actual muestra que las muestras de mucosa de pacientes con IBD se caracterizan por altos niveles de Smad7 y por niveles reducidos de Smad3 activo, así indicando que durante IBD el mecanismo de señalización mediada por TGF-ß? se compromete. El autor del invento actual además demuestra que la abrogación Smad7 por un oligonucleótido antisense específico 51 -GTCGCCCCTTCTCCCCGC AGC-3 ' (SEQ ID No 1) restaura la receptividad de células mononucleares de lamina propia (LPMC) a TGF-ß 1 , dando como resultado una regulación hacia abajo de la producción de citosina pro-inflamatoria, por ejemplo de TNF-a. Además, experimentos ex vivo llevados a cabo en muestras intestinales de pacientes con IBD muestran que la administración de el ODN antisense Smad7 restaura el mecanismo de señalización TGF-ß? y permite una producción de citosina reducida (Monteleone et al., 2001). Durante IBD, se infiltra la mucosa intestinal con un gran número de células T. Se considera que estas células son los mediadores principales de daño tisutal que actúan en tales enfermedades.

El número aumentado de células T en la mucosa intestinal de pacientes con IBD depende en parte de la resistencia de dichas células en contra de estímulos que inducen su muerte (apoptosis). Se cree que el bloqueo de la apoptosis de células T juega un papel en el mantenimiento de la respuesta de mucosa inflamatoria en IBD (Boirivant et al., 1999). De hecho, aumentar la muerte de células T se asocia con una resolución de la inflamación intestinal. No se conoce aún el mecanismo exacto en el fondo de la resistencia de células T en contra de apoptosis durante IBD, aunque parecen estar involucrados citosinas liberadas localmente. Los datos de los experimentos de cultivo de células in vitro y estudios in vivo indican que TGF-ß? puede prevenir o activar la muerte de la célula T y que la capacidad del factor para mediar ambas respuestas es específica de sitio (Han SH. et al., 1998; Arsura M. et al., 1996). Ratones bloqueados con Smad3 exhiben un aumento masivo en el número de células inflamatorias a nivel intestinal, así surgiendo un papel de TGF-ß? en el control de apoptosis intestinal de células T a nivel intestinal (Yang et al., 1999). Por lo tanto la inhibición de Smad7 a través del uso de ODN antisense Smad7 sintético puede representar un enfoque "endógeno" bioterapéutico novedoso y aceptable para enfermedades inflamatorias crónicas, en especial para IBD, ya que, como se mencionó con anterioridad, restaura la receptividad de células T a TGF-ß? . Oligonucleótidos antisense (ODN) son secuencias oligonucleotídicas sintéticas cortas que son complementarias al ARN mensajero (ARNm) que se codifica para la proteína objetivo de la inhibición específica y dirigida. Tales secuencias, con hibridación al ARNm, forman una característica híbrida bicatenaria, y esto lleva a la activación de las omnipresentes encimas catalíticas, tales como RNasas H que degradan cadenas híbridas de ADN/ARN que se desarrollan en la naturaleza para activar la duplicación de ADN, así impidiendo la translación de proteína. Tiene características empíricas la selección de las regiones y secuencias ARNm mas adecuadas para la hibridización a los ODN aunque usualmente resultan mas efectivos los ODN complementarios a la región transcripcional 5' y a las regiones de empalme. El diseño de un número sorprendente de oligonucleótidos antisense, después de identificar los sitios de blancos posibles, no causa dificultades, gracias a las tecnologías recientes y avanzadas de síntesis automatizado que pertenecen a compañías especializadas en el campo. Al contrario, la identificación de los ODN mas activos, para posibles aplicaciones terapéuticas, requiere de un trabajo de selección de largo plazo a través de ensayos de eficacia en pruebas cuantitativas. Relacionado con lo anterior, las secuencias de ODN antisense en contra de blancos específicos, entre ellos Smad7, ya se conocen ( Patente EEUU No. US 6,159,697; asignada a ISIS Pharmaceuticals Inc.). El uso de ODN antisense tanto para regulación de genes in vitro como in vivo se impide por algunas problemas, tales como, la dificultad de pasar a través de las membranas celulares, debido a la naturaleza polianiónica y luego hidrófilo de estas moléculas, y la rápida degradación enzimática. Con el fin de superar estos obstáculos, es necesario recurrir a la modificación química del ODN antisense, por ejemplo, fosforotioación, como en el caso de la arriba mencionada secuencia específica de Smad7 (Monteleone et al., 2001), o fósforo-amidación, que son sustituciones de átomos de azufre o nitrógeno en lugar de aquellos átomos de oxígeno que no son los átomos de puente en el ligamiento fosfodiéster. Además de muchos productos biotecnológicos, la demostración de la actividad biológica muestra una potencial actividad terapéutica. De hecho ODN puede usarse tanto en estudios de funciones de genes y de proteínas involucradas en el patogénesis de distintas enfermedades como con propósitos terapéuticos. Mientras que en el campo de aplicación anterior fue exitosa la metodología antisense por la facilidad de los principios de guía, el cambio de experimentación in vitro a in vivo es mas complejo, especialmente en cuanto a aspectos farmacocinéticos, farmacodinámicos y toxicológicos de estas nuevas drogas (Maggi A., 1998). Por ejemplo, el ODN antisense Smad7 que se uso en los experimentos anteriores llevados a cabo por el autor del presente invento (SEQ ID No 1), que muestran la actividad biológica in vitro, podrían demostrar un riesgo incrementado de efectos no deseados in vivo. De hecho, tales ODN contienen dos parejas CG nucleotídicos que se convierten en CpG después de la fosforotioación, un proceso esencial para aumentar la estabilidad de ODN. Las últimas son secuencias dotadas con una actividad estimulante potente del sistema inmunológico, y por lo tanto el uso del arriba mencionado ODN como tal podría empeorar el curso de cualquier enfermedad inmunológica, incluyendo la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. No se podría plantear como hipótesis un enfoque terapéutico similar, especialmente en el caso de la enfermedad de Crohn, una patología mediada por una clase particular de linfocitos T, llamados Thl, bajo el estímulo interleuquina 12. De hecho moléculas CpG, como inductores potentes del síntesis IL-12, podrían inducir un nuevo desarrollo de las células Th 1. Además, administración in vivo de ODN antisense que contiene dinucleótidos CpG se acompaña con un riesgo aumentado de efectos secundarios, comparado con oligonucleótidos sin CpG. En particular, se ha probado un riesgo incrementado de hiperplasia del sistema reticuloendotelial del bazo, riñon y hígado así como una proliferación aumentada de células hematopoyéticas (Agrawal S. et al., 2002). Otro problema del uso de ODN se debe a los efectos secundarios que resultan de la acción de los metabolitos derivados de la degradación de la molécula, que resulta ser bastante susceptible al ataque nucleasa, ya que no esta protegido en los extremos 5 y 3 . Por lo tanto existe la necesidad de la modificación química del esqueleto ODN antisense fosforotioato a pares CpG y a terminaciones 5' y 3'. Sin embargo, las arriba mencionadas modificaciones a la secuencia ODN podrían llevar a una reducción o pérdida de la actividad biológica de inhibición de la síntesis de Smad7 y, a veces, hasta a la inversión de la actividad deseada tanta in vitro como in vivo. Así mismo puede ser importante disponer de modelos de IBD experimentales aptos para estudios in vivo, que permiten incrementar los conocimientos de los mecanismos involucrados en la pérdida de la regulación de la respuesta inmunitaria y su papel en la aparición de la patología IBD y en la posibilidad de modular o prevenir tal respuesta, así limitando la progresión de inflamación a nivel mucosa. Relacionado a lo arriba mencionado, la colitis TNBS mediada representa un amplio y válido modelo de inflamación mucosa que muestra semejanzas inmunomorfológicas asombrosas con el CD humano (Neurath M. et al., 2000). Visto desde la perspectiva antedicha, sería deseable disponer de nuevos agentes biológicos terapéuticos, como ODN antisense Smad7, que son activos tanto in vítro como in vivo, en el tratamiento de IBD a través del "enfoque bioterapéutico endógeno". El autor del invento actual ahora ha encontrado secuencias ODN antisense adecuadamente modificadas que muestran una actividad biológica incrementada in vivo de la inhibición de la expresión Smad7 en modelos experimentales de IBD comparada con su actividad inhibidor in vitro, y también más alta que la actividad de otras secuencias conocidas que muestran las mismas modificaciones y que se prueban en los mismos modelos. En particular, las secuencias de ODN que exhiben una actividad biológica in vivo mas alta fueron diseñadas según la secuencia SEQ ID No 1 de ODN antisense fosforotioato focalizando el sitio 403 de ARN Smad7 humano, usado por el autor del invento actual en el transcurso de experimentos anteriores. Tomando en cuenta el potencial y uso futuro de dichos ODN antisense Smad7 fosforotioatos en el tratamiento de patologías humanas, se modificó dicha secuencia en los dinucleótidos CpG que están contenidos en estos, aquí indicados como XY, por su ya mencionada inmunogenicidad..

El estudio que el autor llevó a cabo ha permitido la prueba in vivo y in vitro de la eficacia de diferentes ODNs antisense Smad7 conocidos y novedosos y su posible toxicidad, y la investigación de si el bloquear la expresión Smad7 resulta en la resolución de la inflamación mucosa en modelos experimentales de IBD. Las arriba mencionadas secuencias adecuadamente modificadas de ODN antisense según el invento actual, además de una actividad biológica in vivo mas alta, mostraron una ausencia sorprendente de efectos secundarios en animales, a pesar de lo que sucede después de la administración de otras secuencias en el transcurso del mismo estudio. Además, las secuencias de ODN según el invento mostraron su eficacia en limitar infiltración Iinfocítica y la propagación posterior de inflamación, que es una evidencia no encontrada en otras secuencias de ODN antisense aquí probado. El papel de Smad7 como un blanco biológico aparece claramente de estos estudios en modelos experimentales, junto con los posibles efectos terapéuticos de su inhibición. Además, dentro del contexto del invento actual, se ha encontrado otro papel de Smad7 en la inducción de apoptosis de células T durante IBD. De hecho, a través del uso de algunos ODN antisense Smad7, se ha mostrado que TGF-ß? regula apoptosis de células T intestinales y que una actividad de factor defectivo explica la resistencia celular a estímulos apoptóticos, que son responsables de mantener la respuesta inflamatoria mucosa. Por lo tanto los objetos del invento actual son oligonucleótidos antisense Smad7 fosforotioatos de hasta 21 nucleótidos de largo que conforman una porción de por lo menos 10 nucleótidos de la siguiente secuencia (SEQ ID No 2): 5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3 en donde X es un nucleótido que consiste en una base nitrogenada seleccionado del grupo que consiste en citosina, 5-metilcitosina y 2 -0-metilcitosina y en donde Y es un nucleótido que consiste en una base nitrogenada seleccionada del grupo que consiste en guanina, 5-metilguanina y 2'-0-metilguanina, siempre y cuando por lo menos uno de los nucleótidos X o Y consiste en una base nitrogenada metilado; o una secuencia complementaria a este. Otros objetos del invento actual son secuencias oligonucleotídicos de distintos estereoisómeros de oligonucleótidos antisense, tales como diaestereoisómeros y enantiómeros, como los átomos fósforos de ligamiento internucleosídico incluido en la secuencia. En efecto el ligamiento internucleosídico puede ser fosforotioato o metilfosfonato y en ambos casos el fósforo ligado a cuatro diferentes grupos químicos representa un centro quiral. Oligonucleótidos antisense según el invento actual pueden tener por lo menos un nucleótido metilfosfonato en la secuencia, la cual está colocado, por ejemplo, ya sea en solamente uno de los dos extremos 5' o 3' o en los dos extremos 5' y 3' o a lo largo de la secuencia oligonucleotídica. En una incorporación preferida el nucleótido metilfosfonato puede ser X o Y, de tal manera que el ligamiento internucleosídico es un ligamiento entre dichos nucleótidos. Se pueden llevar a cabo otras modificaciones en los extremos 5' y 3' y/o a lo largo de la secuencia del ODN antisense con el fin de incrementar la estabilidad de la molécula, así previniendo la degradación por nucleasa y reduciendo el riesgo de efectos indeseables derivados de las acciones metabolitos.

Los oligonucleótidos antisense según el invento actual además pueden tener por lo menos un nucleótido de la secuencia que sea un 2'-0-metilribonucleótido 5'-monofosfato, que se coloca, por ejemplo, ya sea solamente en uno de los extremos 5' y 3' o en los dos extremos 5' y 3? a lo largo de la secuencia oligonucleotídica. Otros objetos del invento actual son el arriba mencionado oligonucleótido antisense en donde se reemplazan 2'-deoxiribonucleótidos con ribonucleótidos y 2'-deoxitimidina es reemplazado con uridina de tal manera que las secuencias deoxiribonucleotídicas antisense vuelven las secuencias ribonucleotídicas antisense correspondientes. Una incorporación preferida del invento actual está representada por oligonucleótidos antisense que tienen la secuencia (SEQ ID No 3): 5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3' en donde X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5'-monofosfato. Otra incorporación preferida esta representada por oligonucleótidos antisense que tienen la secuencia (SEQ ID No 4): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3' en donde X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5'-monofosfato y Z es 2'-deoxiguanosina metilfosfonato. Según otro aspecto, una incorporación preferida del invento actual es un oligonucleótido antisense que tiene la secuencia (SEQ ID No 15): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3' en donde X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5'-monofosfato y Z es 2'-deoxiguanosina metilfosfonato.

Secuencias ODN antisense según el invento actual pueden usarse ventajosamente en el campo médico; y por lo tanto otros objetos del invento actual son compuestos farmacéuticos que contienen por lo menos uno de los arriba revelados oligonucleótidos antisense como sustancia activa junto con uno o mas adyuvantes farmacéuticamente aceptables y/o excipientes, que son conocidos por cualquier persona con conocimientos en el campo. Además el invento esta relacionado con el uso de las anteriormente mencionadas secuencias de oligonucleótidos antisense en la preparación de un medicamento para el tratamiento de patologías asociadas con la expresión Smad7. En especial, tales patologías asociadas con la expresión Smad7 son IBD, tales como, por ejemplo, CD y UC. En seguida se describirá el invento actual, con propósitos ilustrativos, no limitantes, según su incorporación preferida, con referencia particular a las figuras de las ilustraciones adjuntas, en donde: La Figura 1 muestra el efecto en el número de linfocitos T intestinales después de 40 horas de tratamiento de muestras mucosas de pacientes CD con ODN antisense Smad7 y sentido 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3' (SEQ ID No 4); La Figura 2 muestra el análisis de la expresión del complejo p-Smad2/Smad3 y de la totalidad del complejo Smad2/Smad3 en LPMC aislado del intestino de ratones (TNBS) tratados con TNBS, y tratados con etanol (EtOH) como controles; La Figura 3 muestra el análisis de la expresión Smad7 en LPMC aislado del intestino de ratones (TNBS) tratados con TNBS, sin tratar (Unt), tratados con etanol (EtOH) como controles; La Figura 4 muestra los cambios de porcentaje en el peso de ratones con colitis inducido por TNBS tratados o no con oligonucleótidos antisense Smad7 MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC (SEQ. ID No 15) o con un control (sentido); la figura es representativa de tres diferentes experimentos en donde se han estudiado catorce ratones de cada grupo; La Figura 5 muestra el aspecto macroscópico del colon extraído de un ratón con colitis inducido con TNBS tratado con oligonucleótido antisense Smad7 (SEQ. ID No 15); La figura es representativo de tres diferentes experimentos en donde se han estudiado catorce ratones de cada grupo; La Figura 6 muestra el aspecto histológico de una sección de colon de ratones sin colitis o con colitis inducido con TNBS tratados o no con oligonucleótido antisense Smad7 (SEQ. ID No 15) o con un control (sentido); La figura es representativo de tres diferentes experimentos en donde se han estudiado catorce ratones de cada grupo. Aumento 40X.

EJEMPLO 1: Estudio sobre el efecto de oligonucleótidos antisense Smad7 según el invento actual en apoptosis de células T.

MATERIALES Y MÉTODOS Síntesis de ODN antisense Todos los ODN antisense Smad7 fueron sintetizados de por MWG Biotech AG (MWG Biotech S.r.l., Florence) utilizando técnicas estándares automatizados con un sintetizador de ADN automatizado usando protocolos químicos fosforoamidito estándares (Lesiak K. et al., 1993; Xiao W. et al., 1996).

Se sintetizaron oligonucleótidos que contienen 5-metil-2'-deoxicitidina (5-Me-dC) según los métodos conocidos de síntesis (Sanghvi et al., 1993) usando fosforoamiditos disponibles comercialmente, mientras que se logró la síntesis de oligonucleótidos modificados que contienen grupos de metilfosofonatos (MeP) usando protocolos conocidos (Maier MA. et al., 2002).

Se ha llevado a cabo la purificación de las moléculas de oligonucleótidos utilizando tecnología HPSF, desarrollado por MWG Biotech. Dicho método de purificación ha revelado una alta eficacia ya que permite remover las secuencias de falla sintetizadas durante el proceso de síntesis química automatizada, por ejemplo, las secuencias n-1, n-2, n-x, que los métodos de purificación clásicos estándares no tienen la capacidad de remover.

La arriba mencionada tecnología, además de facilitar la obtención de 100% de las secuencias de longitud deseadas sin fallas no deseables del producto, permite evitar la siguiente operación de desalinización, ya que las secuencias purificadas están libres tanto de iones de sales como de metales. Dada la ausencia de cualquier sal, eventualmente se analizaron los oligonucleótidos por medio de técnicas de espectrometría de masas MALDI-TOF según protocolos estándares (Guerlavais T. et al., 2002; Ragas JA. et al., 2000). Luego se esterilizaron los oligonucleótidos y se cuantificó la solución resultante usando densidad óptica (DO) a través de un espectrofotómetro UV/visible. Finalmente se resuspendieron las moléculas en PBSlx estéril antes de usarlas. Todos los sitios de ODN antisense con blanco Smad7 que se usaron fueron 100% homólogos entre humanos y ratones. En todos los siguientes oligonucleótidos el ligamiento inter-nucleósido es un ligamiento fosforilado.

Las secuencias de ODN antisense que se usan en el estudio actual han sido diseñadas según la secuencia ODN antisense fosforotioato 5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3' (SEQ ID No 1) dirigido al sito 403 del Smad7 m-ARN humano, usado por el autor del invento actual en el transcurso de experimentos anteriores (Monteleone et al, 2001). La secuencia del ODN antisense 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3' (SEQ ID No 4) alcanza el sitio 403 del Smad7 m-ARN humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina que pertenece a pares de CpG de SEQ ID No 1 fueron reemplazados por 5-metilcitosina (aquí llamada Me-dC). Además, ligamientos de metilfosfonato se colocaron en las terminaciones de la molécula (aquí llamado MeP). La secuencia de ODN antisense Smad7 antisense 5'-GTTTGGTCCTGAAC ATGC-3 ' (SEQ ID No 5) alcanza el sitio 294 del Smad7 m/ARN humano. Se tomaron muestras de mucosa de especímenes de resección de 6 pacientes con CD moderado a severo y de 4 pacientes con UC severo. Además, se tomaron muestras mucosas intestinales de 10 pacientes IBD no afectados a quienes que les practicaban una colectomía para carcinoma de colon (se obtuvo permiso ético del comité local). Se preparó LPMC usando el procedimiento de colagenasa DTT-EDTA y se resuspendido en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich S.r.l., Milán) suplido con un reactivo de sustitución de suero HL-1 (Biowhittaker, Wokingham, UK).

Se cultivaron las células en la presencia y ausencia de TGF-ß? (Sigma-Aldrich, con concentraciones finales en el rango de 1 a 5 ng/ml) y después de 48 horas de incubación se analizaron para determinar el nivel de apoptosis. En otros experimentos, se resuspendió LPMC aislado del intestino de pacientes con IBD en RPMI 1640 complementado con HL-1 y se cultivó en la presencia y ausencia del arriba mencionado ODN antisense Smad7 (SEQ ID No 4, SEQ ID No 5), y en la presencia de un oligonucleótido sentido de control (los dos usados en una concentración de 2 µg ml). Después de 24 horas, se usó un alícuota de LPMC para extraer proteínas y evaluar la expresión Smad7. Se lavaron extensivamente las células que quedaron y se resuspendieron en RPMI 1640 con HL-1 y se cultivaron en la presencia y la ausencia de TGF-ß? (5 ng/ml) durante 48 horas y luego se analizó para determinar apoptosis.

Análisis de apoptosis por medio de citometría de flujo Se analizó la apoptosis por medio de coloración con yoduro de propidio (PI) y en seguida por citometría de flujo. Se lavaron las células, se incubaron durante 15 minutos a 37°C en 5 µ? ribonucleasa A (0,6 µ^???, 30-60 unidades Kunitz, Sigma- Aldrich), y luego se enfrío sobre hielo. Se agregó yoduro de propidio (100 µg/ml) antes del análisis por medio de citometría de flujo. Se identificaron las células T usando un anticuerpo monoclonal anti-CD3 específico (DAKO Ltd., Cambridgeshire, UK).

Extracción de proteína y análisis con la técnica de Western Blot Se homogenizó LPMC y se extrajeron proteínas totales en tampón A que contenía 10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA y 0,2 mM EGTA. Se complementó el tampón con 1 mM di-tiotreitol (DTT), 10 µg/ml aprotinina, 10 µg/ml leupeptina y 1 mM fluoruro de metanosulfonilo (todos los reactivos son de Sigma-Aldrich). Se analizó proteína Smad7 usando un anticuerpo específico de conejo anti-humano Smad7 (1:400 dilución final, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA; USA). Se usaron anticuerpos de chivo anti-conejos conjugados a peroxidasa de rábano (Dako Ltd) a una dilución final de 1 :20.000 para detectar la fijación de anticuerpos primarios y se visualizó la inmuno-reactivadad con un kit de quimiluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, USA).

Cultivo de órgano Explantes mucosos de especímenes de pacientes de cirugía se cultivaron en la presencia o ausencia de ODN antisense Smad7 (SEQ ID No 4, SEQ ID No 5; ambos usados a una concentración final de 10 µg/ml) durante 40 horas. Se cultivó en la presencia de ODN sentido Smad7 un explante mucoso como control negativo. Al final del cultivo, se recolectaron explantes mucosos y se usaron para analizar el número de linfocitos T lamina propria a través de inmuno-histoquímica. Con este propósito, se prepararon secciones mucosas y se entintaron con un anticuerpo (DAKO) monoclonal anti-CD3. Se usaron anticuerpos de chivo anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (DAKO) para detectar la fijación primaria del anticuerpo.

RESULTADOS Los resultados obtenidos en los varios experimentos muestran como apoptosis de linfocitos T aislados del intestino de sujetos normales aumentaba dosis-dependientemente con TGF-ß? La Tabla 1 muestra el porcentaje de linfocitos T apoptóticos después de 48 hora de cultivo. Los números son los resultados de cuatro diferentes experimentos en los cuales se usaron células T aisladas del intestino de cuatro sujetos normales. Tabla 1 En contraste, linfocitos T aislados de cuatro pacientes con IBD mostraron una resistencia parcial a la señal apoptosis inducida con TGF-ß?-como se muestran en los resultados reproducidos en la Tabla 2 que muestra el porcentaje de linfocitos T apoptóticos después de 48 horas de cultivo.

Tabla 2 En particular, no se observó ningún incremento significante en la apoptosis según el análisis de los datos mostrados en la Tabla 2 cuando se cultivaron células T de pacientes IBD en la presencia ya sea de concentraciones de 0,2 ng/ml o 1 ng/ml de TGF-ß?. En contraste, la estimulación de las células T de pacientes IBD con 5 ng/ml de TGF-ß? resultó en un pequeño incremento en apoptosis. El tratamiento de linfocitos T aislados de pacientes IBD con ODN antisense Smad7 ODN SEQ ID No 4 restauró la respuesta celular a TGF-ß?, dando como resultado una apoptosis celular aumentada, como se muestra en la Tabla 3 en valores porcentuales de linfocitos T reproducidos. Los datos refieren a cuatro diferentes experimentos en los cuales se cultivaron células T aisladas de los intestinos de cuatro pacientes IBD en un medio solo (sin estimulación) o pre-tratadas con un medio y un sentido (control) o oligonucleótidos antisense durante toda la noche y que luego fueron estimuladas con TGF-ß? (1 ng/ml).

Tabla 3 Además, usando cultivo de órgano ex vivo, el autor del invento actual demostró que el tratamiento de biopsias de IBD con ODN antisense Smad7 según el invento actual disminuyó significativamente el número de células mucosas T CD3+, como se muestra en la inmnunohistoquímica de la Figura 1. Esta última muestra que el tratamiento con el ODN antisense reduce el número de células T CD3+. Juntos estas observaciones sugieren la posibilidad de que altos niveles de Smad7 juegan un papel crucial en la prolongación de la supervivencia de células T, así contribuyendo a la propagación de inflamación local en IBD. Así, el bloquear el Smad7 podría representar una estrategia prometedora en el control de inflamación mucosa bajo estas condiciones.

EJEMPLO 2: Estudios In vivo y in vitro sobre los efectos de la administración de oligonucleótidos antisense Smad7 y sentido en modelos experimentales de colitis inducido con TNBS.

MATERIAL Y MÉTODO Fue sintetizado todo el ODN antisense Smad7 y sentido por MWG Biotech S.r.l. (Firenze) empleando las técnicas estándares previamente descritas. El ODN antisense con blanco de sitios Smad7 m-ARN con 100% homología entre humanos y ratones fue usado. En los siguientes oligonucleótidos el ligamiento internucleótido es un ligamiento fosforotioato. Se usaron todas las siguientes secuencias en experimentos llevados a cabo en modelos experimentales de colitis inducido. El ODN antisense Smad7 SEQ ID No 1 (5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3') se dirige al sitio 403 del Smad7 m-ARN humano usado por el autor del invento actual en el transcurso de los experimentos publicados en un artículo previo (Monteleone et al., 2001). Para más estudios que tienen que ver con el papel de Smad7 en la regulación de apoptosis de células T en LPMC aislado del intestino de pacientes IBD, se usó la siguiente secuencia de oligonucleótidos antisense SEQ ID No 4 e SEQ ID No 5. La secuencia ODN antisense Smad7 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3' (SEQ ID No 4) se dirige al sitio 403 del m-ARN Smad7 humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina que pertenece a los pares CpG en la posición 3 y 16 del la SEQ ID No 1 fueron reemplazados por 5-metilcitosina (señalado como Me-dC). Además, se colocaron ligamientos de metilfosfonato en los extremos de la molécula (señalado como MeP). La secuencia de ODN antisense Smad7 5'-GTTTGGTCCTGAACATGC-3' (SEQ ID No 5) se dirige al sitio 294 del m- ARN Smad7 humano. Los ligamientos internucleótidos incluidos en este son ligamientos fosforotioatos. La secuencia ODN antisense Smad7 5'-GTTTGGTCCTGAACAT-3 ' (SEQ ID No 6) se dirige al sitio 296 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 5*-GTTTGGTCCTGAACATG-3* (SEQ ID No 7) se dirige al sitio 295 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 5 -AGCACCGAGTGCGTGAGC-3' (SEQ ID No 8) se dirige al sitio 577 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 5'-MePAGCACMedCGAGTGMedCGTGAGCMeP-3's (SEQ ID No 9) se dirige al sitio 577 del m-ARN Smad7 humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina en la posiciones 6 y 12 de la SEQ ID No 8 fueron reemplazados con 5-metilcitosina. Además, los ligamientos metilfosfonatos fueron colocados en los extremos de la molécula. La secuencia ODN antisense Smad7 5'-CGAACATGACCTCCGCAC (SEQ ID No 10) se dirige al sitio 233 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 5 -Me-d CGA ACA TGA CCT CMe-d CG CAC-3' (SEQ ID No 11) se dirige al sitio 233 del m-ARN Smad7 humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina en las posiciones 1 y 14 de la secuencia SEQ ID No 10 fueron reemplazados con 5-metilcitosina. La secuencia ODN antisense Smad7 5'-GTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAG-3' (SEQ ID No 12) se dirige al sitio 403 del m-ARN Smad7 humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina que pertenece a los pares CpG en las posiciones 3 y 16 de SEQ ID No 1 fueron reemplazados con 5-metilcitosina (señalado como Me-dC). La secuencia ODN antisense Smad7 5'-GATCGTTTGGTCCTGAA-3' (SEQ ID No 13) se dirige al sitio 299 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 5 '- ATCGTTTGGTCCTGAAC-3 ' (SEQ ID No 14) se dirige al sitio 298 del m-ARN Smad7 humano. La secuencia ODN antisense Smad7 MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC (SEQ ID No 15) se dirige al sitio 403 del m-ARN Smad7 humano. Este es un oligonucleótido de esqueleto mixto en donde la citosina que pertenece a los pares CpG en las posiciones 3 y 16 de la SEQ ID No 1 fueron reemplazados con 5-metilcitosina (señalado como Me-dC). Además, los ligamientos metilfosfonatos fueron colocados en los extremos de los oligonucleótidos y el residuo guanina en la posición 20.

Inducción de colitis Se mantuvieron ratones machos SJL/J de cinco a seis semanas en un complejo animal libre de patógenos. Para inducir la colitis, se administro vía recto a los ratones ligeramente anestesiados con un catéter de 3.5 F, 2.5 mg TNBS (pH 1.5-2.0; Sigma Aldrich) en etanol. Se insertó la punta del catéter 4 cm de la orilla del ano, luego lentamente se administró 200 mi del fluido (TNBS/etanol) en el colon. Con el fin de asegurar la distribución del TNBS dentro del colon y intestino completo, se mantuvieron los ratones en una posición vertical durante 30 segundos después de la inyección. A algunos de los ratones se les administró 50% de etanol solo usando la misma técnica y estos se usaron como control.

Evaluación histológica de la colitis Se fijaron tejidos quitados de los ratones a tiempos indicados de muerte con una solución de 10% de formalina (Sigma Aldrich), incrustados en parafina, cortados en secciones de tejido y entintados con hematosilina y eosina. Se examinaron las secciones entintadas buscando evidencia de colitis usando diferentes criterio tales como la presencia de infiltración de linfocitos, la elongación y/o distorsión de criptas, ulceración manifiesta y engrosamiento de las paredes del intestino. Se clasificó el grado de inflamación en cortes trasversales microscópicos del colon en una escala de 0 a 4 de la siguiente manera: 0: ninguna evidencia de inflamación; 1 : bajo nivel de infiltración de linfocitos con la infiltración vista en un campo de poder de <10% del campo de alto poder (hpf=campo de alto poder), no se observaron ningunos cambios estructurales; 2: infiltración de linfocitos moderada con la infiltración vista en <10- 25% hpf, elongación de cripta, engrosamiento de la pared del intestino que no se extiende mas allá de la capa mucosa; 3: alto nivel de infiltración de linfocitos con la infiltración vista en <25-50% hpf, engrosamiento de la pared del intestino que extiende mas allá de la capa mucosa; 4: marcado grado de infiltración de linfocitos con la infiltración vista en >50% hpf, densidad vascular alta, elongación de la cripta con distorsión, engrosamiento transmural de la pared del intestino con ulceración.

Aislamiento de las células de lamina propria mononucleares ÍLPMC") y el tratamiento de células con ODN antisense Smad7 Se aislaron las células lamina propria mononucleares (LPMC) de los especímenes colónicos. Primero se lavaron los especímenes en HBSS libre de calcio y magnesio (Hanks' balanced salt solution, Sigma-Aldrich) y luego se cortaron en piezas de 0.5 cm. Se incubaron dos veces, cada vez durante 15 minutos en HBSS que contenía EDTA (0.37 mg/ml) y ditiotreitol (0.145 mg/ml) a 37°C. Luego se digirieron los tejidos en RPMI que contema colagenasa D (400 U/ml, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) y DNase I (0,01 mg/ml, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) en un incubador / agitador a 37°C. Se resuspendió el LPMC liberado de los tejidos en Percol al 100%, se colocó en capas bajo un Percoll gradiente a 40% (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), y se centrifugó a 1,800 rpm durante 30 minutos con el fin de obtener la población enriquecida en linfocitos. Con el fin de valorar la eficacia in vitro del ODN antisense Smad7, se resuspendió el LPMC aislado de los ratones tratados con TNBS, en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplidos con un reemplazo de suero reactivo HL-1 (Biowhittaker) a una concentración final de lxl06/ml en placas de 24 pocilios. Para la transfección de ODN antisense, se usaron 2 µ? del reactivo lipofectamina 2000 (LF, Invitrogen Italia SRL, San Giuliano Milanese) por cada mi de medio celular según el protocolo. Luego se combinaron 2 g/ml ODN antisense y LF y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó la mezcla así obtenida directamente a las células.

Después de cultivarlas toda la noche, se removieron las células de la placa y se usaron para el análisis de Smad7 usando la técnica de Western Blot.

Tratamiento de ratones con ODN antisense Smad7 Dos días después del tratamiento con TNBS, se administraron a los ratones vía recto 150 µg cada uno de oligonucleótido antisense o sentido Smad7. Se examinaron por lo menos 5 ratones de cada grupo. Al quinto día se sacrificaron los ratones y se tomaron muestras mucosas del intestino entero y se analizaron para el contenido de Smad7 y Smad3 usando la técnica de Western Blot. Además se determinó la entidad de inflamación de mucosa intestinal.

Extracción de proteína y análisis a través de la técnica de Western Blot Se homogenizaron tantas células mononucleares de lamina propria y especímenes colónicos usando el procedimiento anterior. Luego se reveló la expresión Smad7 a través de la técnica de Western Blot. Al final, se eliminaron las manchas usando una solución comercialmente disponible (Pierce) y se investigó usando anticuerpos anti-actin (Sigma Aldrich) con el fin de verificar que se había llenado cada pocilio con la misma cantidad de proteína. Se llevó a cabo la detección usando un kit de quimioluminiscencia (Pierce). Se analizó la intensidad de las bandas usando un densímetro. Se analizaron también tanto LPMC como proteínas de muestras de especímenes colónicos para su contenido de proteína de Smad3 fosforilado y total a través de la técnica de Western Blot usando anticuerpos específicos comercialmente disponibles (Santa Cruz).

Se usaron para el análisis de Smad3 fosforilado un anticuerpo de conejo antihumano capaza de reconocer proteínas Smad2/3 fosforilados como antígeno (dilución final 1 :500), y anticuerpo de chivo anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano (dilución de 1 :20,000). Se visualizó la inmunoreactividad con un kit de quimioluminiscencia (Pierce). Después de la detección, se eliminaron las manchas usando una solución comercialmente disponible (Pierce) y se incubaron con un anticuerpo específico de chivo anti-humando Smad3 (dilución final de 1 :500), seguido por una anticuerpo de conejo anti-chivo conjugado a peroxidasa de rábano (dilución de 1 :20,000); luego se visualizó la inmunoreactividad con el arriba mencionado kit de quimioluminiscencia (Pierce).

Prueba ELISA Se determinó la cantidad de TGF-ß? activo en muestras de mucosa intestinal Con este propósito se extrajeron proteínas de las muestras mucosas de ratones con o sin colitis inducido con TNBS como se indicó anteriormente.

Se analizaron los niveles de TGF-ß? activo usando un kit ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, Space Import-Export Srl, Milano).

Se midió la densidad óptica en un lector Dynatech MR 5000 ELISA a una longitud de onda de 490 nm. Se expresaron los datos como pg/100 µg de las proteínas totales.

RESULTADOS ~ Los ratones desarrollaron diarrea y sufrieron pérdida de peso después de recibir TNBS evidenciado por la inducción de colitis. Se aumentó macroscópicamente el colon y se analizó histológicamente la mucosa que mostró lesiones inflamatorias de moderadas a severas Se tomaron especímenes colónicos de ratones con o sin colitis y se los analizaron para determinar el contenido de TGF-ß? a través de ELISA para examinar si la inducción de Colitis TNBS estaba asociada con los cambios en la producción de TGF-ß? Como varios tipos de células con la potencial de sintetizar TGF-ß? están presentes a nivel intestinal, se usó para la evaluación la mucosa intestinal entera en lugar del LPMC solo. En la ausencia de colitis se detectaron bajos niveles de TGF-ß? activo (85+12 y 94+26 pg^g de proteína total en ratones sin estimular y de control respectivamente). Se midieron niveles significativamente aumentados de TGF-ß? en muestras mocosas de ratones con colitis inducido con TNBS (9851120 de la proteína total) (p<0.01). Aunque estos resultados parecen sugerir que durante colitis inducido con TNBS podría haber actividad incrementada de TGF-ß?, el análisis de niveles intracelulares de Smad3 activo en LPMC intestinal aislado de ratones con colitis sorprendentemente exhibe que una fosforilación de Smad3 reducida esta asociada con una inducción aumentada de Smad7 (Figuras 2 y 3). En particular, la Figura 2 ilustra la presencia de una banda que corresponde a Smad2/3 activo (fosforilado) en LPMC aislado del intestino no afectado, pero no de ratones con colitis inducida con TNBS. En la Figura 3 se ha mostrado que las dos bandas, la banda inferior 102 Kda que corresponde al Smad7 libre y la banda superior 102 Kda que corresponde al complejo TGF-ß? Rl-Smad7, están presentes solamente en especímenes LPMC aislados del intestino de ratones con colitis inducido con TNBS. Estos datos indican que la inflamación local estimula la síntesis de TGF-ß? que sin embargo no es capaz de reducir la inflamación mucosa. Según el invento actual, se evaluó si el tratar a ratones TNBS con ODN antisense Smad7 podría restaurar la función endógena TGF-ß? y limitar la inflamación continúa. Primero, se ha examinado la eficacia del arriba mencionado ODN antisense Smad7 (SEQ ID No ly SEQ ID No 4-15) en decrecer la expresión Smad7 tanto en experimentos in vitro como in vivo. En cuanto a experimentos in vitro, el LPMC aislado del intestino de ratones con colitis inducido con TNBS fue transfectado con cada ODN antisense Smad7 y se incubó toda la noche. Se llevó a cabo análisis de Smad7 usando la técnica de Western Blot. En cuanto a experimentos in vivo, se administró ODN antisense Smad7 a ratones tratados con TNBS y después de 3 días se sacrificaron los animales, se tomaron muestras de los tejidos y se llevó a cabo análisis con la técnica de Western Blot. La Tabla 4 resume los resultados de estos experimentos y muestra el porcentaje de inhibición obtenida por cada oligonucleótido antisense Smad7 tanto en los experimentos in vitro como in vivo. Los datos indican el medio ± la desviación estándar (SEM) de cuatro diferentes experimentos in vitro y el medio ± SEM de cinco diferentes experimentos in vivo.

Tabla 4 (*) Secuencias No 16 y (**) No 12 de la Patente de EEUU 6159697 por ISIS.

Fueron efectivos todos los ODN antisense en la reducción de la expresión de Smad7 cuando fueron transfectados in vitro en LPMC aislado de modelos murinos tratados con TNBS. Del análisis del valor de porcentaje de inhibición que se muestra en la Tabla 4, es notable que las secuencias oligonucleotídicas antisentida SEQ ID No 4, 10, 11, 12 y 15 muestran la mayor eficacia. Sin embargo, el porcentaje de inhibición de expresión Smad7 obtenido a través de tratamiento in vivo con las secuencias oligonucleotídicas SEQ ID No 10 y 11 no variaban significativamente de aquel documentado en experimentos in vitro. En cambio, tratamiento de ratones con ODN antisense SEQ ID No 4 y 12 y 15 claramente resultó en un mayor porcentaje de inhibición de Smad7 que aquel obtenido en experimentos in vitro, es decir 55% vs 34%, 42% vs 32% e 56% vs 34% respectivamente (P<0.0L>. En contraste, tratamiento de ratones con oligonucleótidos antisense SEQ ID ?? 7 causó una reducción en la expresión Smad7 in vivo que fue de entidad menor que aquel que resultó cuando el oligonucleótido antisense fue transfectado en LPMC in vitro, es decir 10% vs 17%, P<0.01. En general, los resultados sugieren que solamente modificaciones específicas dentro de la secuencia de ODN antisense Smad7 pueden mejorar su perfil farmacocinético, bioquímico y biofísico. No se documentó ninguna señal de toxicidad aguda en los ratones que recibieron oligonucleótidos antisense (SEQ ID No 1 y SEQ ID No 4-15). Uno de 5, tratados con TNBS, murió después de 3 días (20%). De manera similar, 1/5 de los ratones que recibieron el oligonucleótido sentido Smad7 murió después de 4 días. No se documentó ninguna mortalidad en el grupo de ratones tratado con ODN antisense Smad7 SEQ ID No 1 y SEQ ID No 4-15. El uso de las secuencias de ODN antisense SEQ ID No 13 y SEQ ID No 14 esta asociado con una actividad de inhibición in vitro razonable (11% y 9,5%, respectivamente). Sin embargo, la administración in vivo de tales secuencias fue inesperadamente asociada con un deterioro marcado de la colitis, hasta causar la muerte de todos los ratones después de 72 horas de tratamiento. Análisis macroscópica de muestras intestinales tomadas de estos ratones ha revelado la presencia de una colitis severa y se asoció esto con un incremento sustancial en la expresión intestinal Smad7. Como se mencionó con anterioridad, se examino la eficacia de ODN antisense Smad7 como limitante para inflamación continua. Con este propósito, después de la inducción de colitis, se administró a ratones oligonucleótidos antisense SEQ ID No 1, 4, 5 y 15 tomando 5 animales de cada grupo. Se ha revelado una reducción en la inflamación mucosa después del tratamiento con ODN antisense Smad7. Este resultado íue particularmente evidente en ratones tratados con oligonucleótidos antisense 4 y 15. De hecho, la severidad de la colitis de grado 3-4 en ratones con colitis que no recibieron el antisense llegó al grado 2 o 3 después de la administración de secuencias 1 o 5 de oligonucleótido antisense respectivamente, mientras que en ratones tratados con secuencias oligonucleotídicas 4 o 15, la inflamación no ha excedido el grado 1.

Con el fin de examinar si oligonucleótidos antisense Smad7 fueron efectivos también cuando se administraron oralmente, se trataron a ratones con colitis inducida con TNBS un día después de la inducción de colitis con oligonucleótido antisense Smad7 4 o 15 o de control (sentido). Con este propósito, se resuspendieron los oligonucleótidos en una solución de bicarbonato. El volumen final de la solución que se administró a cada ratón fue de 350 µ? y contenía dosis de oligonucleótidos equivalentes a 250, 500 o 1000 µg. Esta solución se administró per os a través de un catéter. En el quinto día se sacrificaron los ratones y se evaluaron el análisis de la expresión Smad7 y el grado de inflamación como se indicó arriba. Todos los ratones tratados con oligonucleótido antisense, y no con el control oligonucleótido sentido, mostraron una reducción significativa de la expresión Smad7 y un incremento de fosforilación de Smad3, independientemente de la dosis de oligonucleótido que se usó. Sustancialmente, se asoció la inhibición Smad7 con una recuperación de peso como se muestra en la Figura 4. La Figura 4 exhibe una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en el peso de los ratones con colitis inducido con TNBS tratados o no con oligonucleótido antisense Smad7 (SEQ. N. 15) o con control (sentido). Se administraron los dos oligonucleótidos per os a una dosis de 250 µg a través de un catéter dos días después de la inducción de la colitis. La pérdida de peso registrado al segundo día en cada uno de los tres grupos indica que el tratamiento con TNBS inducía la colitis. Además fue probado que empezando en el cuarto día, ratones tratados con oligonucleótido antisense Smad7, pero no con el control, mostraron una recuperación en el peso corporal. La aparente y ligera recuperación observada en el quinto día en ratones con colitis inducida con TNBS se debe al hecho de que el 21.4% de los ratones con colitis murieron en el cuarto día y por lo tanto no se les consideraron en la evaluación del peso corporal en el quinto día. Se correlacionó la inhibición de Smad7 con una supresión marcada de inflamación tisutal como se muestra en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 exhibe los imágenes del colon extraído de un ratón con colitis TNBS y de un ratón con colitis TNBS tratado con oligonucleótidos antisense Smad7 (SEQ. ID No 15). Se administró el oligonucleótido per os en una dosis de 250 µg a través de un catéter, en el segundo día de inducción de la colitis. Se ha mostrado que el colon del ratón con colitis TNBS es altamente inflamado, acortado y engrosado. Por lo contrario, el ratón que recibió antisense Smad7 muestra un colon de longitud y grosor normal y sin signos macroscópicos de flogosis. La Figura 6 exhibe el aspecto histológico de una sección del colon de un ratón sin colitis y de un ratón con colitis TNBS tratado o no tratado con oligonucleótido antisense Smad7 (SEQ ID No 15) o de control (sentido). Se administraron ambos oligonucleótidos per os a una dosis de 250 µg a través de un catéter en el segundo día después de la inducción de la colitis. Se ha mostrado que en el ratón sin colitis, las glándulas parecen rectilineares y uniformes con un contenido normal de células muciparos y una infiltración masiva de células inflamatorias en la lamina propria. Se demostró la presencia de una estructura glandular normal y la ausencia de flogosis en la sección cólica del ratón tratado con TNBS y que recibió oligonucleótido antisense Smad7. Juntas estas observaciones sugieran que el uso de ODN antisense, que muestra la mas alta eficacia en la inhibición de Smad7 acompañado por una ausencia de efectos secundarios, después de la administración in vivo, puede representar una estrategia terapéutica prometedora en el control de la inflamación mucosa durante IBD, especialmente si tales características de eficacia y toxicidad se compararon con los resultados que se lograron con otras secuencias de ODN antisense con la misma eficacia en la inhibición de Smad7 in vitro.

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Oligonucleótidos antisense fosforotioatos en contra de Smad7 de hasta una longitud de 21 nucleótidos que consisten en una porción de por lo menos 10 nucleótidos de la siguiente secuencia (SEQ ID No 2): 5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3' en que X es un nucleótido compuesto por una base nitrogenada seleccionada del grupo que consiste en citosina, 5-metilcitosina y 2 -0-metilcitosina y en que Y es un nucleótido compuesto de una base nitrogenada seleccionado del grupo que consiste en guanina, 5-metilguanina y 2'-0-metilguanina, siempre y cuando por lo menos uno de los nucleótidos X o Y esté compuesto por una base nitrogenada metilada; o la secuencia complementaria a ésta.

2. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 1, en que por lo menos un nucleótido de la secuencia es metilfosfonato.

3. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 2, en que dicho por lo menos un nucleótido metilfosfonato está colocado ya sea en solamente uno de los extremos 3' o 5' o en ambos extremos 3' y 5' o a lo largo de la secuencia oligonucleotídica antisense.

4. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 2, en que el nucleótido metilfosfonato es Y.

5. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 2, en que el nucleótido metilfosfonato es X.

6. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 1, en que por lo menos un nucleótido de la secuencia es un 2'-0-metil ribonucleótido 5'-monofosfato.

7. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 6, en que dicho por lo menos un 2'-0-metil ribonucleótido 5'-monofosfato está colocado solamente en uno de los extremos 3? 5? en ambos extremos 3' y 5' o a lo largo de la secuencia oligonucleotídica.

8. Oligonucleótidos antisense conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en que 2'-desoxirribonucleótidos son reemplazados con los ribonucleótidos correspondientes.

9. Oligonucleótidos antisense conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8 que tiene la secuencia (SEQ ID No 4): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3' en que X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5'-monofosfato y Z es 2'-deoxiguanosina metilfosfonato.

10. Oligonucleótidos antisense conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8 que tiene la secuencia (SEQ ID No 15): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3* f en que X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5'-monofosfato y Z es 2'- deoxiguanosina metilfosfonato.

11. Oligonucleótidos antisense conforme a la reivindicación 1 la secuencia (SEQ ID No 3): 5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3' en que X es 5-metil 2'-deoxicitidina 5 -monofosfato.

12. Oligonucleótidos antisense como se definieron en las 10 reivindicaciones 1 a la 11 para su uso en el campo médico.

13. El compuesto farmacéutico que contiene por lo menos uno de los oligonucleótidos antisense como se definieron en las reivindicaciones 1 a la 11 como ingrediente activo junto con uno o mas adyuvantes y/o excipientes 15 farmacéuticamente aceptables.

14. El uso de los oligonucleótidos antisense como se definieron en las reivindicaciones 1 a la 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las patologías asociadas con la expresión Smad7.

15. El uso según la reivindicación 14, en que las patologías asociadas con la expresión Smad7 son enfermedades inflamatorias crónicas.

16. El uso según la reivindicación 15, en que las enfermedades inflamatorias crónicas son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa.