NO334022B1 - Antisens oligonukleotider (ODN) mot SMAD7 og anvendelser derav i det medisinske området - Google Patents
Antisens oligonukleotider (ODN) mot SMAD7 og anvendelser derav i det medisinske området Download PDFInfo
- Publication number
- NO334022B1 NO334022B1 NO20054861A NO20054861A NO334022B1 NO 334022 B1 NO334022 B1 NO 334022B1 NO 20054861 A NO20054861 A NO 20054861A NO 20054861 A NO20054861 A NO 20054861A NO 334022 B1 NO334022 B1 NO 334022B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- smad7
- stated
- antisense oligonucleotide
- antisense
- seq
- Prior art date
Links
- 102000049873 Smad7 Human genes 0.000 title claims abstract description 107
- 101700026522 SMAD7 Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title claims description 51
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 title claims description 51
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 title claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 23
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 66
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 7
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RGDVNLHBCKWZDA-XLPZGREQSA-N 2'-deoxy-5-methyl-5'-cytidylic acid Chemical group O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGDVNLHBCKWZDA-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OAYUQZNXYHVNAX-FPKZOZHISA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one;methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O.C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OAYUQZNXYHVNAX-FPKZOZHISA-N 0.000 claims description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- UFLDDSWIGVXVPQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-methyl-2,9-dihydro-1h-purin-6-one Chemical compound N1=CNC2(C)C1=NC(N)NC2=O UFLDDSWIGVXVPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- ATNBHVMVZZBVKX-NYNCVSEMSA-N [(2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical group C1=CC(N)=NC(=O)N1[C@@]1(C)C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 ATNBHVMVZZBVKX-NYNCVSEMSA-N 0.000 claims 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 74
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 abstract description 35
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 79
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 51
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 45
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 26
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 18
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 101000652166 Homo sapiens Mothers against decapentaplegic homolog 7 Proteins 0.000 description 16
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 16
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 16
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 16
- 102000049939 Smad3 Human genes 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 15
- 101710143111 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 11
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 9
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 8
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 7
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 5
- 102000057208 Smad2 Human genes 0.000 description 5
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 2
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108700031297 Smad3 Proteins 0.000 description 2
- 108700031279 Smad7 Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 2'-deoxythymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000011803 SJL/J (JAX™ mice strain) Methods 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007374 Smad Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007945 Smad Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700032504 Smad2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012321 colectomy Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 230000004609 intestinal homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003550 mucous cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008289 pathophysiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009523 phase IV clinical trial Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000023454 regulation of T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 1
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
- C12N2310/3125—Methylphosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/314—Phosphoramidates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3521—Methyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelsen angår antisensoligonukleotider mot Smad7 og anvendelser derav i det medisinske området.
Særlig angår oppfinnelsen Smad7 antisens ODN-sekvenser som er egnet modifiserte, som viser en overraskende biologisk aktivitet til å spesifikt inhibere Smad7-ekspresjon og som derfor er nyttige i det medisinske området som terapeutisk biologiske midler, særlig ved behandling av kronisk inflammatorisk tarmsykdom (IBD).
Crohns sykdom (CD) og ulcererende kolitt (UC) er de viktigste formene for kronisk inflammatorisk tarmsykdom hos mennesker. Begge sykdommene er komplekse kliniske tilfeller, hvis patogenese er strengt avhengig av interaksjonen mellom forskjellige genetiske, omgivelses- og immunfaktorer.
Til tross for at CD og UC viser markerte forskjeller både på patofysiologisk og klinisk nivå, deler den terapeutiske tilnærmingen hos lidende pasienter mange felles elementer. Variabilitet av den kliniske presentasjonen, av type og utstrekning av lesjonene, og av typen av komplikasjoner påvirker det terapeutiske valget, selv om farmakologisk behandling ville representere den første dominerende tilnærmingen.
Salisylazosulfapyridin og 5-aminosalisylsyre er legemidler med bevist effektivitet i håndteringen av den milde formen av IBD og remisjonsopprettholdelseterapi.
I fasene med moderat til alvorlig aktivitet og i tilfeller hvori den generelle tilstanden er involvert, er det nødvendig å vende seg mot anvendelsen av kortikosteroider. Fra middels og langtids analyse av de viktigste sykdomshistoriene verden over, synes det at klinisk remisjon bare kan oppnås i to tredjedeler av pasientene som mottar kortikosteroider, og bare i 50% av disse pasientene skjer det ikke noe tilbakefall etter opphold av legemidler.
Den kontinuerlige administreringen av kortikosteroider, ved siden av å indusere legemiddelavhengighetsfenomen, blir forverret på grunn av en meget høy risiko for bivirkninger.
Immunoundertrykkende behandling, som ofte følger eller erstatter kortikosteroidal terapi, sikrer heller ikke alltid betennelseskontroll og kontroll av symptomer, og har ytterligere ulempene med tallrike kontraindikasjoner og alvorlige bivirkninger (Podolsky, 2002).
Den nye generasjonen av legemidler som ble tilgjengelig i 1990-årene, er biologiske midler. Større dybdekunnskap om den naturlige historien til IBD og til viktige patofysiologiske mekanismer har bidratt til å styre medisinsk intervensjon i en konkret retning. Således skjedde en utvikling av bioterapier rettet mot å kontrollere spesifikke inflammatoriske "ruter" gjennom anvendelsen av rekombinante humane proteiner, monoklonale kimære humaniserte antistoffer og fusjonsproteiner. I denne sammenhengen er midler som har vist en bedre effektivitet i CD-behandling, monoklonale kimære antistoffer rettet mot å blokkere TNF-a, et proinflammatorisk cytokin som overproduseres under IBD (Seegers et al., 2002). Denne forbindelsen som nå er i fase IV i klinisk utprøving, er effektiv til inflammasjonskontroll i 60-70% av de behandlede pasientene. Ikke desto mindre har noen bivirkninger blitt pekt på som har en betydelig insidensfrekvens og er gjenkjennelige ved reaktivering av latente mikrobielle infeksjoner, hypersensitivitetsfenomen og dannelse av autoantistoffer. Det siste fenomenet kunne være basert på det faktum at anti-TNF-a nøytraliserer cytokin TNF-a som har tallrike biologiske funksjoner.
I tillegg til dens inflammatoriske virkning, tar TNF-a også del i de mekanismene som er involvert i induksjon og opprettholdelse av immunologisk toleranse. Derfor kunne en blokk av TNF-a-aktivitet paradoksalt nok oppmuntre utstrakte immunologiske reaksjoner (Sandborn et al., 2002).
Alle disse bemerkningene forslår behovet for nye undersøkelser på dyremodeller av IBD hvorved det skal være mulig å identifisere nye aktive prinsipper som skal anvendes i en bedre og mer varig behandling av slike patologier (Fiocchi, 2001).
Anti-TNF-a-behandling, så langt som de andre bioterapiene, så som administrasjonen av antiinflammatoriske cytokiner, for eksempel IL-10, representerer en terapeutisk ekstracellulær tilnærming rettet mot å kontrollere biologiske virkninger av molekyler utskilt av inflammatoriske celler.
Undersøkelsen av signaltransduksjonsruter aktivert av cytokininteraksjon med deres reseptorer, har skissert sjansen til å anvende nye terapeutiske strategier som er i stand til spesifikt og selektivt å modulere den intracellulære ekspresjonen av viktige inflammatoriske og ikke-inflammatoriske molekyler.
Under normale betingelser er en intestinal slimhinne setet for et "fysiologisk" inflammatorisk infiltrat som opprettholdes av en skjør balanse mellom proinflammatoriske og antiinflammatoriske molekyler.
I forbindelse med det ovenstående, er en viktig rolle spilt av TGF-(3l, et multifunksjonelt cytokin som er i stand til å regulere vekst, differensiering og aktivitet i mange immune og ikke-immune celler.
Både in vitro og in vivo undersøkelser har vist at TGF-pi virker som en kraftig immunoregulator som er i stand til å kontrollere slimhinneintestinal inflammasjon, og at inhibisjonen av dens aktivitet resulterer i utviklingen av kolitt som viser immunomorfologisk likhet med CD eller UC (Powrie F. et al., 1996; Neurath M.F. et al, 1996; Ludviksson B.R. et al., 1997).
Faktum er at mus som mangler TGF-pl -gener viser alvorlige multifokale inflammatoriske responser som også involverer tarmen, assosiert med en utstrakt inflammatorisk cytokinproduksjon av tallrike celletyper, inkludert T-celler (Shull M.M. et al., 1992; Christ M. et al., 1994).
På samme måte resulterer inhibisjon av TGF-P 1-signalisering i mus ved å uttrykke en dominant negativ mutant form av TGF-pi-reseptoren RII, i en forsterket tendens til å utvikle eksperimentell kolitt (Hahm K.B. et al., 2001).
Avslutningsvis ble det vist at spesifikk inhibisjon av TGF-pi-signalisering i T-celler ved å uttrykke en dominant negativ TGF-pi-reseptor type II forårsaker en autoimmun sykdom kjennetegnet ved alvorlige inflammatoriske infiltrasjoner i lunge og tykktarm, og nærværet av sirkulerende autoimmune antistoffer (Gorelik L., et al., 2000). Disse dataene indikerer at tapet av aktivitet av et enkelt antiinflammatorisk molekyl kan være tilstrekkelig til å forandre intestinal homeostase og å tillate immunresponser som fører til vevsskade.
TGF-pi antiinflammatorisk aktivitet starter med interaksjon av molekylet med et kompleks av heterodimere transmembrane serin/treoninkinasereseptorer som består av to underenheter, kalt henholdsvis TGF-pl RI og TGF-pl R2. Ved TGF-pi-binding roterer reseptorene relativt innenfor det ovenfor nevnte komplekset og resulterer i en transfosforyleringsprosess og påfølgende aktivering av TGF-pi RI ved den konstitutivt aktive TGF-pi R2 og er i stand til autofosforylering.
Utbredelsen av TGF-pi-utløst signal til kjernen blir mediert av proteiner som tilhører Smad-familien. Aktivert TGF-pi RI fosforylerer direkte Smad2- og Smad3-proteiner som blir i stand til å interagere med Smad4, for således å muliggjøre komplekse Smad2-3/Smad4 for å translokere til kjernen hvor den deltar i den transkripsjonene kontrollen av noen gener (Heldin C-H. et al., 1997).
Rollen til Smad3 i den TGF-P1 antiinflammatoriske aktiviteten ble understøttet av studier på dyremodeller som viser at delesjonen av det kodende genet for Smad3 er assosiert med redusert cellemottakelighet for TGF-P 1, og i en relatert utvikling av inflammatorisk sykdom kjennetegnet av en massiv infiltrasjon av T-celler og pyogen abscessdannelse på gastrointestinalt nivå (Yang X. et al., 1999).
Også andre intracellulære proteiner, for eksempel Smad7, tilhører Smad-proteinfamilien. Slike proteiner som okkuperer TGF-P 1 RI interfererer med bindingen av Smad2/Smad3 til reseptoren, og forhindrer således fosforylering og aktiveringen. Følgelig er en økt ekspresjon av Smad7-proteinet assosiert med en inhibisjon av TGF-P 1-mediert signalisering (Hayashi H. et al., 1997).
Evaluering av TGF-pl-ekspresjon i intestinal slimhinne fra IBD-pasienter viser at nevnte molekylproduksjon er paradoksalt forsterket sammenlignet med hva som kan vises i tarmen til normale pasienter (Lawrance IC. et al., 2001).
I en nylig artikkel viser forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen at slimhinneprøver fra IBD-pasienter er kjennetegnet av høye nivåer av Smad7 og av reduserte nivåer av aktivt Smad3 for således å angi at under IBD er mekanismen for TGF-P 1-mediert signalisering kompromittert. Forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen viste videre at selektiv Smad7-opphevelse av et spesifikt antisens oligonukleotid 5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3' (SEKV.ID. nr. 1) gjenoppretter mottakeligheten av lamina propria mononukleære celler (LPMC) til TGF-P 1, som resulterer i en nedregulering av proinflammatorisk cytokinproduksjon, så som for eksempel TNF-a.
Videre viste også ex vivo eksperimenter utført på intestinale slimhinneprøver fra IBD-pasienter at administrering av Smad7 antisens ODN gjenoppretter TGF-pi-signaliseringsmekanismen og tillater en redusert cytokinproduksjon (Monteleone et al., 2001).
Under IBD er intestinal slimhinne infiltrert med et høyt antall T-celler. Disse cellene er vurdert å være de viktigste mediatorene ved vevsskade som virker ved slike sykdommer.
Det økte antallet T-celler i intestinal slimhinne fra IBD-pasienter er spesielt avhengige av motstanden til slike celler mot stimuli som induserer deres død (apoptose).
Det er ment at blokken av T-celleapoptose spiller en nøkkelrolle i å opprettholde den mukosale inflammatoriske responsen i IBD (Boirivant et al., 1999). Forsterket T-celledød assosieres virkelig med en oppløsning av den intestinale inflammasjonen. Den nøyaktige mekanismen som ligger under motstanden hos T-celler mot apoptose under IBD er ennå ikke kjent, selv om lokalt frigjorte cytokiner synes å være involvert.
Data fra cellekultur in vitro eksperimenter og in vivo undersøkelser angir at TGF-P 1 enten kan hindre eller utløse T-celledød og at kapasiteten til faktoren til å mediere begge responser setespesifikk (Han SH. et al., 1998; Arsura M. et al., 1996).
Smad3 "knockout"-mus utviser en massiv økning i antallet inflammatoriske celler på intestinalt nivå, og foreslår således en rolle for TGF-P 1 i å kontrollere intestinal T-celleapoptose på intestinalt nivå (Yang et al., 1999).
Derfor kan Smad7-inhibisjon ved anvendelse av Smad7 syntetisk antisens ODN representere en ny og akseptabel "endogen" bioterapeutisk tilnærming til kronisk inflammatoriske sykdommer, særlig til IBD ettersom, som nevnt ovenfor, den gjenoppretter T-cellenes mottakelighet for TGF-(31.
Antisensoligonukleotider (ODN) er korte syntetiske oligonukleotidsekvenser som er komplementære til budbringer-RNA (m-RNA) som koder for målproteinet til den
spesifikke og målrettede inhibisjonen. Slike sekvenser som hybridiseres til m-RNA gir et dobbelttrådet hybridtrekk, og dette fører til aktivering av allestedsnærværende katalytiske enzymer så som RNaser H, som degraderer DNA/RNA hybridtråder som utvikles i naturen for å utløse DNA-duplikasjon, og forhindrer således proteintranslasjon.
Seleksjonen av de mest egnede m-RNA-regionene og sekvenser for å hybridisere til ODN har empiriske kjennetegn selv om ODN komplementært til den transkripsjonelle initieringsregionen 5' og til spleiseregionene vanligvis resulterer mer effektivt. Konstruksjonen av et bemerkelsesverdig antall av antisens ODN, etter identifisering av mulige målseter, gir ikke vanskeligheter takket være de nylige og avanserte automatiserte synteseteknologiene eid av spesialiserte firmaer på et slikt område.
Tvert imot krever identifikasjonen av de mer aktive ODN, for mulige terapeutiske anvendelser, et langtids screeningsarbeid gjennom effektivitetsanalyser i kvantitative tester. I forbindelse med det ovenstående, er antisens ODN-sekvenser mot spesifikke mål, blant hvilke Smad7, allerede kjent (USA patentnr. US 6,159,697; ISIS Pharmaceuticals Inc.).
Krieg AM. "Mechanisms and applications of immune stimulatory CpG oligodeoxynucleotides", Biochim Biophys Acta. 1999, Vol. 1489, side, 107-116 angir antisensoligonukleotider med metylerte CG motiver for å redusere bivirkningsrisikoen.
Anvendelsen av antisens ODN både for in vitro og in vivo genregulering, er hindret av enkelte problemer så som vanskeligheten med å passere gjennom cellulære membraner på grunn av den polyanioniske og den hydrofile naturen til disse molekylene og den hurtige enzymatiske degraderingen.
For å overkomme disse hindringene er det nødvendig å gå tilbake til kjemisk modifisering av antisens ODN så som for eksempel fosfortioation, som i tilfellet av den ovenfor nevnte Smad7-spesifikke sekvensen (Monteleone et al., 2001), eller fosforamidering som er substitueringer av svovel- eller nitrogenatomer i stedet for de oksygenatomene som ikke er broatomene til fosfodiesterkoblingen.
Så vel som mange bioteknologiske produkter, peker demonstrering av en biologisk aktivitet ut en potensiell terapeutisk aktivitet.
ODN kan virkelig anvendes enten i undersøkelser av både genfunksjoner og proteinfunksjoner involvert i patogenesen i forskjellige sykdommer, eller for terapeutiske hensikter. Mens i det første anvendelsesområdet var antisensmetoden vellykket for lettheten av styringsprinsippene, er skiftning fra in viiro til in vivo eksperimentering mer kompleks, særlig med hensyn til farmakokinetiske, farmakodynamiske og toksikologiske aspekter av disse nye legemidlene (Maggi A., 1998).
For eksempel kunne Smad7 antisens ODN brukt i tidligere eksperimenter utført av forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen (SEKV.ID. nr. 1), som viser in vitro biologisk aktivitet, vise en økt risiko for uønskede virkninger in vivo. Faktum er at slike ODN inneholder to nukleotid CG-par som blir CpG etter fosfortioering, en essensiell prosess for å forsterke ODN-stabilitet. Sistnevnte er sekvenser utstyrt med en kraftig stimulerende aktivitet på immunsystemet, derfor kunne anvendelsen av ovennevnte ODN som sådan forverre forløpet til enhver immunologisk sykdom, Crohns sykdom og ulcererende kolitt inkludert.
En lignende terapeutisk tilnærming kunne ikke hypotetiseres, spesielt i tilfellet av Crohns sykdom, en patologi mediert av en spesiell klasse av T-lymfocytter, kalt Thl, under interleukin 12-stimulering. CpG-molekyler kunne virkelig, som kraftige induktorer av IL-12-syntese, indusere en ytterligere utvikling av Thl-celler.
I tillegg er in vivo administrering av antisens ODN som inneholder CpG-nukleotider fulgt av en økt risiko for bivirkninger sammenlignet med oligonukleotider uten CpG. Særlig er det blitt vist en økt risiko for hyperplasi av det retikuloendoteliale systemet i milten, nyrer og lever, så vel som en økt proliferering av hematopoietiske celler (Agrawal S. et al., 2002).
Et annet problem ved anvendelse av ODN er bundet til bivirkninger som resulterer fra virkningen av metabolitter avledet fra degraderingen av molekylet, hvis resultat er svært utsatt for nukleaseangrep, siden det ikke er beskyttet på 5'- og 3'-endene.
Deri ligger nødvendigheten av en kjemisk modifikasjon av fosfortioat antisens ODN-ryggraden til CpG-par og til 5'- og 3'-endene. Ikke desto mindre kunne de ovenfor nevnte modifikasjonene av ODN-sekvensen føre til reduksjon eller tap av den biologiske aktiviteten til inhibisjon av Smad7-syntese og, noen ganger, til og med inversjon av den ønskede aktiviteten både in vitro og in vivo.
Likeledes kan det være viktig å disponere eksperimentelle IBD-modeller egnet for in vivo studier som tillater en forstørrelse av kunnskapen om mekanismene som involverer tap av reguleringen av immunresponsen og deres rolle ved igangsettelse av IBD-patologi, og på muligheten til å modulere eller forhindre slik respons, for således å begrense inflammasjonsutvikling på slimhinnenivå. I forbindelse med det ovenstående, representerer TNBS-mediert kolitt en utvidet og verdifull modell for slimhinneinflammasjon som viser slående immunomorfologiske likheter med humant CD (Neurath M. et al., 2000).
I lys av det ovenstående, vil det være ønskelig å disponere nye terapeutiske biologiske midler så som Smad7 antisens ODN, som er aktive både in vitro og in vivo, for behandling av IBD gjennom en "endogen" bioterapeutisk tilnærming.
Forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen har nå funnet egnede modifiserte antisens ODN-sekvenser som utviser en høyere in vivo biologisk aktivitet av inhibisjon av Smad7-ekspresjon i eksperimentelle modeller av IBD sammenlignet med deres in vitro inhibitoriske aktivitet, og også høyere enn den til andre kjente sekvenser som viser samme modifikasjoner og testet på de samme modellene.
Særlig ble ODN-sekvenser som utviser en høyere in vivo biologisk aktivitet konstruert i henhold til fosfortioat antisens ODN-sekvensen, SEKV.ID. nr. 1, som målretter setet 403 til det humane Smar7 RNA, anvendt av forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen i løpet av tidligere eksperimenter.
I lys av den potensielle og fremtidige anvendelsen av slike Smad7 fosfortioat antisens ODN for behandling av humane patologier, ble nevnte sekvens modifisert på CpG-dinukleotider som var inneholdt deri, heretter angitt som XY, på grunn av deres allerede nevnte immunogenisitet.
Undersøkelsen utført av forfatteren har gjort det mulig å teste in vivo og in vitro effektivitet til forskjellige kjente og nye Smad7 antisens ODN og deres mulige toksisitet, og å undersøke om blokkering av Smad7-ekspresjon resulterer i en oppløsning av slimhinneinflammasjon i eksperimentelle modeller for IBD.
De ovenfor nevnte egnede modifiserte antisens ODN-sekvensene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen viste, i tillegg til en høyere biologisk aktivitet in vivo, et overraskende fravær av bivirkninger i dyr, på tross av det som hender etter administrering av andre sekvenser i løpet av den samme undersøkelsen. Videre viste ODN-sekvenser i henhold til oppfinnelsen deres effektivitet til å begrense lymfocyttisk infiltrasjon og senere utbredelse av inflammasjon, som er resultater ikke funnet for de andre antisens ODN-sekvensene som er testet heri.
Rollen til Smad7 som biologisk mål vises klart fra disse undersøkelsene i eksperimentelle modeller, sammen med de mulige terapeutiske virkningene av dens inhibisjon.
Videre, i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen, har en rolle til Smad7 på induksjonen av T-celleapoptose under IBD blitt funnet. Faktum er at gjennom anvendelsen av noen Smad7 antisens ODN, er det blitt vist at TGF-P 1 regulerer intestinal T-celleapoptose og at en defekt faktoraktivitet er ansvarlig for cellemotstand til apoptotiske stimuli som er ansvarlige for å opprettholde den mukosale inflammatoriske responsen.
Derfor er hensiktene med den foreliggende oppfinnelsen Smad7 fosforotioat antisensoligonukleotider opptil 21 nukleotider i lengde som omfatter den følgende sekvens (SEKV.ID. nr. 2):
5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3'
hvori X er et nukleotid som omfatter en nitrogenholdig base valgt fra gruppen som består av cytosin, 5-metylcytosin og 2'-0-metylcytosin og hvori Y er et nukleotid som omfatter en nitrogenholdig base valgt fra gruppen som består av guanin, 5-metylguanin og 2'-0-metylguanin, forutsatt at minst ett av nukleotidene X eller Y omfatter en metylert nitrogenholdig base.
Andre hensikter med den foreliggende oppfinnelsen er oligonukleotidsekvensene til forskjellige antisens oligonukleotidstereoisomerer så som diastereoisomerer og enantiomerer, i tillegg til fosforatomer i internukleosidkoblingen inkludert i sekvensen. Internukleosidkoblingen kan virkelig være fosfortioat eller metylfosfonat og for begge tilfeller er fosforet bundet til fire forskjellige kjemiske grupper og representerer et kiralt senter.
Antisensoligonukleotider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan ha minst ett metylfosfonatnukleotid i sekvensen som for eksempel er plassert enten på bare en av 5'- eller 3'-endene eller i begge 5'- eller 3'-endene eller langs oligonukleotidsekvensen.
I en foretrukket utforming kan metylfosfonatnukleotidet være enten X eller Y, på en slik måte at den internukleotidkoblingen er koblingen mellom nevnte nukleotider.
Ytterligere modifikasjoner kan utføres på 5'- og 3'-endene og/eller langs sekvensen til antisens ODN for å øke stabiliteten til molekylet og således forhindre nedbrytning av nukleaser og reduksjon av risikoen for uønskede virkninger avledet fra metabolittvirkningene.
Antisensoligonukleotider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan ha ytterligere minst ett nukleotid i sekvensen som er et 2'-0-metylribonukleotid 5'-monofosfat, som for eksempel er plassert enten i bare en av 5'- eller 3'-endene eller i både 5'- og 3'-endene eller langs oligonukleotidsekvensen.
Ytterligere hensikter med den foreliggende oppfinnelsen er det ovenfor nevnte antisens oligonukleotidet hvori 2'-deoksyribonukleotidene er erstattet av ribonukleotider og 2'-deoksytymidin er erstattet av uridin på en slik måte at antisens deoksyribonukleotidsekvensene blir de tilsvarende antisens
ribonukleotidsekvensene.
En foretrukket utforming av den foreliggende oppfinnelsen er representert av antisens oligonukleotider som har sekvensen (SEKV.ID. nr. 3):
5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'
hvori X er 5-metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat.
En annen foretrukket utforming er representert av antisens oligonukleotider som har sekvensen (SEKV.ID. nr. 4):
5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3<*>
hvori X er 5-metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat og Z er 2'-deoksyguanosinmetylfosfonat.
I henhold til en annen side, er en foretrukket utforming av den foreliggende oppfinnelsen antisens oligonukleotid som har sekvensen (SEKV.ID. nr. 15):
5<*->ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3<*>
hvori X er 5-metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat og Z er 2'-deoksyguanosinmetylfosfonat.
Antisens ODN-sekvenser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes på det medisinske området; derfor er ytterligere hensikter ved den foreliggende oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter minst ett av de av de ovenfor beskrevne antisens oligonukleotidene som aktivt prinsipp sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanser og/eller eksipienter som er kjent for en person med kunnskap på området.
Videre angår oppfinnelsen anvendelsen av de ovennevnte
antisensoligonukleotidsekvensene til fremstilling av et legemiddel for behandling av patologier assosiert med Smad7-ekspresjon og som er kroniske inflammasjonssykdommer. Særlig er slike patologier assosiert med Smad7-ekspresjon IBD så som for eksempel CD og UC.
Den foreliggende oppfinnelsen skal nå beskrives, for illustrerende men ikke begrensende hensikter, i henhold til de foretrukne utforminger, med spesiell referanse til figurer i de vedlagte tegninger, hvori: Figur 1 viser effekten på antallet av intestinale T-lymfocytter etter 40 timers behandling av slimhinneprøver fra CD-pasienter med Smad7 ODN antisens og sens 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3* (SEKV.ID. nr. 4); Figur 2 viser analyse av ekspresjonen av p-Smad2/Smad3-kompleks og det totale Smad2/Smad3-komplekset i LPMC isolert fra tarmen til TNBS-behandlede mus (TNBS), ubehandlet (Unt), behandlet med etanol (EtOH) som kontroller; Figur 3 viser analyse av Smad7-ekspresjon i LPMC isolert fra tarmen til TNBS-behandlede mus (TNBS), ubehandlede (Unt), behandlet med etanol (EtOH) som kontroller; Figur 4 viser prosentvis forandring i vekt hos mus med TNBS-indusert kolitt behandlet eller ikke med Smad7 antisensoligonukleotid MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC (SEKV.ID. nr. 5) eller med en kontroll (sens); hvor figuren er representativ for tre separate eksperimenter hvori fjorten mus for hver gruppe er blitt undersøkt; Figur 5 viser makroskopisk aspekt av kolon ekstrahert fra mus med TNBS-indusert kolitt og fra en mus med TNBS-indusert kolitt behandlet med Smad7 antisensoligonukleotid (SEKV.ID. nr. 15); figuren er representativ for tre separate eksperimenter hvori fjorten mus i hver gruppe ble undersøkt; Figur 6 viser histologisk aspekt av et kolonsnitt fra mus uten kolitt eller med TNBS-indusert kolitt behandlet eller ikke med Smad7 antisensoligonukleotid (SEKV.ID. nr. 15) eller med en kontroll (sens); figuren er representativ for tre separate eksperimenter hvori fjorten mus i hver gruppe er blitt undersøkt. Forstørrelse 40X.
EKSEMPEL 1: Undersøkelse av virkningen av Smad7 antisens oligonukleotider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen på intestinal T- celleapoptose
MATERIALER OG METODER
Syntese av antisens ODN
Alle Smad7 antisens ODN ble syntetisert ved MWG Biotech AG (MWG Biotech S.r.l., Firenze) som anvender standard automatiserte teknikker med en automatisert DNA-syntetiseringsanordning som benytter standard fosforamidittkjemiprotokoller (Lesiak K. et al., 1993; Xiao W. et al., 1996).
Oligonukleotider som inneholder 5-metyl-2'-doksycytidin (5-Me-dC) ble syntetisert i henhold til kjente syntesemetoder (Sanghvi et al., 1993) ved å bruke kommersielt tilgjengelige fosforamiditter, mens syntese av modifiserte oligonukleotider som inneholder metylfosfonatgrupper (MeP) blir utført ved å bruke kjente protokoller (Maier MA. et al., 2002).
Rensing av oligonukleotidmolekylene er blitt utført med HPSF-teknologi, utviklet av MWG Biotech. Slike rensemetoder har vist en høy effektivitet siden de tillater å fjerne gale sekvenser syntetisert under den automatiserte kjemiske synteseprosessen så som for eksempel n-1, n-2, n-x sekvenser, som klassiske standard rensemetoder ikke er i stand til å fjerne.
Den ovennevnte teknologien tillater, ved siden av gjøre det mulig å oppnå 100% av sekvenser med ønsket lengde uten uønskede falske produkter, å unngå neste desaltingsoperasjon siden de rensede sekvensene er fri for både salt- og metallioner.
I fravær av ethvert salt, ble oligonukleotidene til slutt analysert med MALDI-TOF massespektrometriteknikker i henhold til standardprotokoller (Guerlavais T. et al., 2002; Ragas JA. et al., 2000). Deretter ble oligonukleotidene sterilisert og den resulterende oppløsningen ble kvantifisert som optisk tetthet (OD) ved UV/synlig spektrofotometer. Avslutningsvis ble molekylene resuspendert i steril PBSlx før bruk.
Alle de anvendte antisens ODN-mål Smad7 m-RNA-setene har 100% homologi mellom menneske og mus. I alle de følgende oligonukleotidene er internukleosidkoblingen en fosfortioatkobling.
Antisens ODN-sekvensene som ble anvendt i den foreliggende undersøkelsen er blitt konstruert i henhold til fosfortioat antisens ODN-sekvensen 5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3' (SEKV.ID. nr. 1) som målretter sete 403 i det humane Smad7 m-RNA anvendt av forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen i løpet av tidligere eksperimenter (Monteleone et al., 2001).
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3' (SEKV.ID. nr. 4) målretter sete 403 på det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukletid hvori cytosinet som hører til CpG-parene i SEKV.ID. nr. 1 ble erstattet av 5-metylcytosin (heretter angitt som Me-dC). I tillegg ble metylfosfonatkoblinger plassert i endene av molekylet (heretter angitt som MeP).
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-GTTTGGTCCTGAACATGC-3' (SEKV.ID. nr.
5) målretter sete 294 i det humane Smad7 m-RNA.
Slimhinneprøver ble tatt fra reseksjonsprøver fra 6 pasienter med moderat-til-alvorlig CD og 4 pasienter med alvorlig UC. I tillegg ble tarmslimhinneprøver tatt fra 10 upåvirkede IBD-pasienter som gjennomgikk kolektomi for koloncarcinom (etisk godkjennelse ble oppnådd av lokal komité). LPMC ble fremstilt ved å bruke DTT-EDTA-kollagenasefremgangsmåten og resuspendert i RPMI 1640 (Sigma-Aldrich S.r.l., Milano) supplert med en serumerstatningsreagens HL-1 (Biowhittaker, Wokingham, UK).
Cellene ble dyrket i nærvær og fravær av TGF-P 1 (Sigma-Aldrich, avsluttende konsentrasjon varierte fra 1 til 5 ng/ml) og etter 48 timers inkubasjon ble de analysert for apoptosenivå.
I andre eksperimenter ble LPMC isolert fra IBD-pasienttarmer resuspendert i RPMI 1640 supplert med HL-1 og dyrket i nærvær og fravær av den ovennevnte Smad7 antisens ODN (SEKV.ID. nr. 4, SEKV.ID. nr. 5), og i nærvær av et kontroll sens oligonukleotid (begge brukt i en konsentrasjon på 2^g/ml). Etter 24 timer ble en porsjon av LPMC brukt til å ekstrahere proteiner og evaluere Smad7-ekspresjon. De gjenværende cellene ble utstrakt vasket og resuspendert i RPMI 1640 pluss HL-1 og dyrket i nærvær eller fravær av TGF-P 1 (5 ng/ml) i 48 timer og deretter analysert for apoptose.
Analyse av apoptose ved flowcytometri
Apoptose ble analysert ved propidiumjodid (PI) -farging etterfulgt av flowcytometri.
Cellene ble vasket, innkubert i 15 minutter ved 37°C i 5 u.1 ribonuklease A (0,6 jag/ml, 30-60 Kunitzenheter, Sigma-Aldrich) og deretter avkjølt på is. Propidiumjodid (100 u.g/ml) ble tilsatt før analyse ved flowcytometri.
T-celler ble identifisert ved å bruke et spesifikt monoklonalt anti-CD3-antistoff (DAKO Ltd., Cambridgeshire, UK).
Proteinekstraksion og Western Blot- analyse
LPMC ble homogenisert og totale proteiner ble ekstrahert i buffer A som inneholdt 10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KC1, 0,1 mM EDTA og 0,2 mM EGTA. Buffer ble supplert med 1 mM ditiotreitol (DTT), 10 u,g/ml aprotinin, 10fxg/ml leupeptidin og 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (alle reagenser fra Sigma-Aldrich).
Smad7-protein ble analysert ved å bruke et spesifikt kanin anti-humant Smad7-antistoff (1:400 endelig fortynning, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA; USA). Geit anti-kanin-antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase (Dako Ltd) ble brukt ved 1:20000 endelig fortynning for å detektere primær antistoffbinding og immunoreaktivitet ble visualisert med et kjemiluminescenssett (Pierce, Rockford,
IL, USA).
Organkultur
Slimhinneeksplantater tatt fra kirurgiske prøver fra pasienter dyrket i nærvær eller fravær av Smad7 antisens ODN (SEKV.ID. nr. 4, SEKV.ID. nr. 5; begge brukt ved en endelig konsentrasjon på 10 jig/ml) i 40 timer.
Som negativ kontroll ble et slimhinneeksplantat dyrket i nærvær av Smad7 sens
ODN.
Ved avslutning av dyrkingen, ble slimhinneeksplantater innsamlet og brukt for å analysere antallet av lamina propria T-lymfocytter ved immunohistokjemi.
For denne hensikten ble slimhinnesnitt fremstilt og farget med et monoklonalt anti-CD3-antistoff (DAKO). Geit anti-mus-antistoffer konjugert til alkalisk fosfatase (DAKO) ble brukt til å detektere primær antistoffbinding.
RESULTATER
Resultatene oppnådd i de forskjellige eksperimentene viser hvordan TGF-P 1 doseavhengig forsterket apoptose av T-lymfocytter isolert fra tarmen til normale personer.
Tabell 1 viser prosentandelen av apoptotiske T-lymfocytter etter 48 timer i kultur. Tallene er resultatene av 4 separate eksperimenter hvori T-celler isolert fra tarmen til fire normale individer ble brukt.
I kontrast til dette, viste T-lymfocytter isolert fra fire IBD-pasienter en delvis motstand mot TGF-pl-indusert apoptosesignal som vist i resultatene reprodusert i tabell 2, som viser prosentandelen av apoptotiske T-lymfocytter etter 48 timers dyrking.
Særlig fra analysen av data vist i tabell 2, ble ingen meningsfull økning i apoptose sett når T-celler fra IBD-pasienter ble dyrket i nærvær av enten 0,2 ng/ml eller 1 ng/ml TGF-P 1-konsentrasjon. I kontrast til dette, resulterte stimulering av T-celler fra IBD-pasienter med 5 ng/ml TGF-P 1 i en liten økning i apoptose.
Behandling av T-lymfocytter isolert fra IBD-pasienter med Smad7 antisens ODN SEKV.ID. nr. 4 gjenopprettet cellemottakeligheten til TGF-P 1, og resulterte i forsterket celleapoptose som vist i prosentandelverdiene av T-lymfocytter reprodusert i tabell 3. Dataene refererer til fire separate eksperimenter hvori T-celler isolert fra tarmen til fire IBD-pasienter ble dyrket med medium alene (ustimulert) eller forbehandlet med medium og sens (kontroll) eller antisens oligonukleotider natten over og deretter stimulert med TGF-P 1 (1 ng/ml).
Videre viste forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen ved bruke ex vivo organkultur at behandling av IBD-biopsier med Smad7 antisens ODN i henhold til den foreliggende oppfinnelsen signifikant reduserte antallet av mukosale CD3+ T-celler som vist i immunohistokjemien i figur 1. Det siste viser at behandling med antisens ODN reduserer antallet av mukosale CD3+ T-celler.
Sammen foreslår disse observasjonene muligheten for at høyt Smad7-nivå spiller en avgjørende rolle i forlengelse av T-celleoverlevelse for derved å bidra til utbredelse av lokal inflammasjon i IBD.
Således kunne blokkering av Smad7 representere en lovende strategi for å kontrollere slimhinneinflammasjon i disse tilfellene.
EKSEMPEL 2: In vivo og in vitro undersøkelser på virkningene av administrering av Smad7 antisens og sens oligonukleotider i eksperimentelle modeller for TNBS-indusert kolitt.
MATERIALER OG METODER
Alle Smad7 antisens og sens ODN ble syntetisert med MWG Biotech S.r.l.
(Firenze) ved å anvende standardteknikker som tidligere beskrevet.
De anvendte antisens ODN mål Smad7 m-RNA-setene har 100% homologi mellom menneske og mus. I alle de følgende oligonukleotidene er internukleosidkoblingen en fosfortioatkobling. Alle de følgende eksensene ble brukt i eksperimentene utført på de eksperimentelt induserte kolittmodellene.
Smad7 antisens ODN SEKV.ID. nr. 1 (5<*->GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3') målretter sete 403 i det humane Smad7 m-RNA allerede brukt av forfatteren av den foreliggende oppfinnelsen i løpet av eksperimentene publisert i en tidligere artikkel (Monteleone et al., 2001).
I den videre undersøkelsen som angår rollen til Smad7 på regulering av T-celleapoptose i LPMC isolert fra tarmen til IBD-pasienter, ble de følgende antisens oligonukleotidsekvensene SEKV.ID. nr. 4 OG SEKV.ID. nr. 5 brukt.
Smad7 antisens ODN-sekvens 5'-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3' (SEKV.ID. nr. 4) målretter sete 403 i det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukleotid hvori cytosinet som tilhører CpG-parene i posisjon 3 og 16 i SEKV.ID. nr. 1 ble erstattet med 5-metylcytosin (angitt som Me-dC). I tillegg ble metylfosfonatkoblinger plassert i endene av molekylet (angitt som MeP).
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5*-GTTGGTCCTGAACATGC-3' (SEKV.ID. nr. 5) målretter sete 294 i det humane Smad7 m-RNA. Internukleosidkoblinger inkludert deri er fosfortioatkoblinger.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-GTTTGGTCCTGAACAT-3' (SEKV.ID. nr. 6) målretter sete 296 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-GTTTGGTCCTGAACATG-3' (SEKV.ID. nr. 7) målretter sete 295 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5*-AGCACCGAGTGCGTGAGC-3' (SEKV.ID. nr.
8) målretter sete 577 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-MePAGCACMedCGAGTGMedCGTGAGCMeP-E' (SEKV.ID. nr. 9) målretter sete 577 på det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukleotid hvori cytosinet i posisjon 6 og 12 i SEKV.ID. nr. 8 ble erstattet med 5-metylcytosin. I tillegg ble metylfosfonatkoblingen plassert i endene av molekylet.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-CGAACATGACCTCCGCAC (SEKV.ID. nr.
10) målretter sete 233 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-Me-d CGA ACA TGA CCT CMe-d CG CAC-3'
(SEKV.ID. nr. 11) målretter sete 233 i det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukleotid hvori cytosinet i posisjon 1 og 14 i SEKV.ID. nr. 10 ble erstattet med 5-metylcytosin.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-GTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAG-3'
(SEKV.ID. nr. 12) målretter sete 403 i det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukleotid hvori cytosinet som tilhører CpG-parene i posisjon 3 og 16 i SEKV.ID. nr. 1 ble erstattet med 5-metylcytoskin (angitt som Me-dC).
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-GATCGTTTGGTCCTGAA-3* (SEKV.ID. nr.
13) målretter sete 299 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen 5'-ATCGTTTGGTCCTGA AC-3' (SEKV.ID. nr.
14) målretter sete 298 i det humane Smad7 m-RNA.
Smad7 antisens ODN-sekvensen MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-DCGCAMePGC (SEKV.ID. nr. 15) målretter sete 403 i det humane Smad7 m-RNA. Dette er et blandet ryggradsoligonukleotid hvori cytosinet som tilhører CpG-parene i posisjon 3 og 16 i SEKV.ID. nr. 1 ble erstattet med 5-metylcytoskin (angitt som Me-dC). I tillegg ble metylfosfonatkoblingene plassert i en av endene av oligonukleotidene og guaninresten i posisjon 20.
Induksjon av kolitt
Fem til seks uker gamle SJL/J hannmus ble opprettholdt i en spesifikk patogenfri dyrestall. For induksjon av kolitt ble 2,5 mg TNBS (pH 1,5-2,0; Sigma Aldrich) i 50% etanol administrert pr rektum til lett anesteserte mus gjennom et 3,5 F kateter. Kateterspissen ble innført 4 cm proksimalt til analt senter, og deretter ble 100 ml væske (TNBS/etanol) langsomt installert i kolon.
For å sikre distribusjon av TNBS i hele kolon og cecum, ble musene holdt i en vertikal stilling i 30 sekunder etter injeksjon. Noen av musene ble administrert med 50% etanol alene ved å bruke den samme teknikken og ble brukt som kontroller.
Histologisk vurdering av kolitt
Vev fjernet fra musene på angitte dødstidspunkter ble fiksert i 10% formalinoppløsning (Sigma Aldrich), innbakt i parafin, skåret i vevssnitt og farget med hematossilin og eosin. Fargede snitt ble undersøkt for bevis på kolitt ved å bruke forskjellige kriterier så som nærvær av lymfocyttinifltrasjon, forlengelse og/eller forvrenging av krypter, ren sårdannelse og fortykkelse av tarmveggen.
Graden av inflammasjon på mikroskopiske tverrsnitt av kolon ble gradert fra 0 til 4 som følger: 0: Intet tegn på inflammasjon;
1: lavt nivå av lymfocyttinfiltrasjon med infiltrasjon sett i et <10% høyforstørrelsesfelt (hpf = høyforstørrelsesfelt), ingen strukturelle forandringer observert;
2: moderat lymfocyttinfiltrasjon med infiltrasjon sett i <10-25% hpf, kryptforlenging, tarmveggtykkelse som ikke strekker seg ut over slimhinnelaget;
3: høyt nivå av lymfocyttinfiltrasjon med infiltrasjon sett i <25-50% hpf, fortykning av tarmveggen som strekker seg ut over slimhinnelaget;
4: markert grad av lymfocyttinfiltrasjon med infiltrasjon sett i >50% hpf, høy vaskulær tetthet, kryptforlengelse med forvridninger, transmural tarmveggfortykkelse med sårdannelse.
Isolering av lamina propria mononukleære celler ( LPMC) og behandling av celler med Smad7 antisens ODN
Lamina propria mononukleære celler (LPMC) ble isolert fra kolonprøver. Prøvene ble først vasket i HBSS-kalsiummagnesiumfri (Hanks balanserte saltoppløsning, Sigma-Aldrich) og skåret i 0,5 cm stykker. De ble deretter innkubert to ganger, hver gang i 15 minutter i HBSS som inneholder EDTA (0,37 mg/ml) og ditiotreitol (0,145 mg/ml) ved 37°C. Vevene ble deretter fordøyd i RPMI som inneholdt kollagenase D (400 U/ml, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) og DNase I (0,01 mg/ml, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) i en risteinnkubator ved 37°C.
LPMC frigjort fra vevet ble resuspendert i 100% Percoll, lagfordelt under en 40% Percollgradient (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) og spunnet ved 1800 rpm i 30 minutter for å oppnå den lymfocyttanrikede populasjonen.
For å vurdere in vitro effektivitet av Smad7 antisens ODN ble LPMC isolert fra TNBS-behandlede mus resuspendert i RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) supplert med en serumerstatningsreagens HL-1 (Biowhittaker) i en avsluttende konsentrasjon på 1 x IO<6>ml i 24 brønners plater. For transfeksjon av antisens ODN, ble 2 ul av lipofektamin 2000-reagens (LF, Invitrogen Italia SRL, San Giuliano, Milano) anvendt for hver ml av cellemedium ifølge protokollen. Deretter ble 2 u.g/ml av antisens ODN og LF kombinert og tillatt å innkubere i 20 minutter ved romtemperatur. Den oppnådde blandingen ble deretter tilsatt direkte til cellene. Etter dyrking natten over ble cellene fjernet fra platen og brukt for analyse av Smad7 med Western blotting.
Behandling av mus med Smad7 antisens ODN
To dager etter behandling med TNBS ble musene administrert 150 u.g av hver av Smad7 antisens eller sens oligonukleotid per rektum. Minst 5 mus i hver gruppe ble undersøkt. På den femte dagen ble musene ofret og slimhinneprøver fra hele tarmen ble tatt og analysert for Smad7- og Smad3-innhold ved Western blotting. I tillegg ble graden av slimhinneinflammasjon evaluert.
Proteinekstraksion og Western Blot- analvse
Både lamina propria mononukleære celler og hele kolonprøver ble homogenisert ved å bruke ovennevnte prosedyre. Deretter ble Smad7-ekspresjon vist ved Western blotting.
Avslutningsvis ble blottene strippet ved å bruke en kommersielt tilgjengelig oppløsning (Pierce) og probet med anti-aktin antistoffer (Sigma-Aldrich) for å verifisere den samme mengden av protein fylt i hver brønn. Deteksjon ble utført ved å bruke et kjemiluminescenssett (Pierce). Intensiteten i båndene ble analysert ved et densitometer.
Både LPMC og proteiner fra hele kolonprøver ble analysert for innhold av fosforylert og totalt Smad3-protein ved Western blotting ved å bruke spesifikke kommersielt tilgjengelige antistoffer (Santa Cruz).
For analysen av fosforylert Smad3 ble det brukt et spesifikt kanin anti-humant antistoff som var i stand til å gjenkjenne fosforylerte Smad2/3-proteiner som antigener (1:500 avsluttende fortynning), og et geit anti-kanin antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (1:20000 fortynning). Immunoreaktivitet ble visualisert med et kjemiluminescenssett (Pierce).
Etter deteksjon ble blottene strippet ved å bruke en kommersielt tilgjengelig oppløsning (Pierce) og innkubert med et spesifikt geit anti-humant Smad3-antistoff (1:500 endelig fortynning) etterfulgt av et kanin anti-geit antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (1:20000 fortynning); deretter ble immunoreaktiviteten visualisert med det ovenfor nevnte kjemiluminescenssettet (Pierce).
Test ELISA
Mengden av aktivt TGF-|31 ble bestemt i prøvene fra tarmslimhinnen. Med dette mål ble totale proteiner ekstrahert fra slimhinneprøvene fra mus med eller uten TNBS-indusert kolitt som ovenfor angitt. Nivåene av aktivt TGF-(31 ble analysert ved å bruke et kommersielt tilgjengelige ELISA-sett (R&D Systems, Space Import-Export Sri, Milano). Optisk tetthet ble målt på en Dynatech MR 5000 ELISA-leser på bølgelengen 490 nm. Data ble uttrykt som pg/100 u,g totale proteiner.
RESULTATER
Etter å ha mottatt TNBS, utviklet musene diaré og vekttap som var tegn på induksjon av kolitt. Kolon ble makroskopisk forstørret og histologisk analyse av slimhinnen viste moderate til alvorlige inflammatoriske lesjoner.
For å undersøke om induksjon av TNBS-kolitt var assosiert med forandringer i produksjonen av TGF-P 1, ble kolonprøver tatt fra mus med eller uten kolitt og analysert for innholdet av aktivt TGF-P 1 ved ELISA.
Idet flere celletyper som har potensiale til å syntetisere TGF-P 1 er tilstede på intestinalt nivå, ble hele tarmmucosa brukt for evalueringen heller enn LPMC alene.
I fravær av kolitt, ble lave nivåer av aktivt TGF-pl detektert (85 + 12 og 94 ± 26 pg/u.g av totalt protein i henholdsvis ustimulerte og kontrollmus). Signifikant forhøyede TGF-P 1-nivåer ble målt i slimhinneprøver fra mus med TNBS-indusert kolitt (985 ± 120 pg/u,g av totalt protein) (p < 0,01). Selv om disse resultatene synes å foreslå at under TNBS-indusert kolitt kunne det være en økende TGF-P 1-aktivitet, viste analyse av intracellulære nivåer av aktiv Smad3 i intestinal LPMC isolert fra mus med kolitt overraskende en Smad3-fosforylering som skal assosieres med en forhøyet induksjon av Smad7 (figurene 2 og 3). Særlig illustrerer figur 2 nærværet av et bånd som tilsvarer den aktive (fosforylerte) Smad2/3 i LPMC isolert fra upåvirket tarm, men ikke fra mus med TNBS-indusert kolitt. I figur 3 er det blitt vist at de to båndene, hvor det nedre 47 Kda-båndet korresponderer til det frie Smad7 og det øvre 102 Kda-båndet korresponderer til TGF-P 1 Rl-Smad7-komplekset, er tilstede bare i LPMC-prøver isolert fra tarmen til mus med TNBS-indusert kolitt. Disse dataene indikerer at lokal inflammasjon stimulerer syntesen av TGF-P 1 som imidlertid ikke er i stand til å dempe slimhinneinflammasjonen.
I henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er det blitt evaluert om det å behandle TNBS-mus med Smad7 antisens ODN kunne gjenopprette den endogene TGF-pl - funksjonen og begrense den pågående inflammasjonen.
For det første er det blitt testet om effektiviteten til den ovennevnte Smad7 antisens ODN (SEKV.ID. nr. 1 og SEKV.ID. nr. 4-15) representerer Smad7-ekspresjon i både in vitro og in vivo eksperimenter.
Med hensyn til in vitro eksperimenter, ble LPMC isolert fra tarmen til mus med TNBS-indusert kolitt transfektert med hver av Smad7 antisens ODN og inkubert natten over. Smad7-analyse ble utført ved Western blotting.
Med hensyn til in vivo eksperimenter, ble TNBS-behandlede mus administrert med Smad7 antisens ODN og etter 3 dager ble dyrene ofret, vevsprøver ble tatt og Smad7-analyse ble utført ved Western blotting.
Tabell 4 oppsummerer resultatene fra disse eksperimentene og viser prosent inhibisjon oppnådd ved hvert Smad7 antisens oligonukleotid både i in vitro og in vivo eksperimenter. Dataene angir gjennomsnitt ± standardavvik (SEM) av fire separate in vitro eksperimenter og gjennomsnitt ± SEM for fem separate in vivo eksperimenter.
(<*>) Sekvensene nr. 16 og (<**>) nr. 12 i patent US6159697 av ISIS.
Alle antisens ODN var effektive til å redusere Smad7-ekspresjon når de ble transfektert in vitro i PLMC isolert fra TNBS-behandlede murine modeller. Fra analysen av verdien av prosentvis inhibisjon vist i tabell 4, er det bemerkelsesverdig at antisens oligonukleotidsekvensene SEKV.ID. nr. 4, 10, 11, 12 og 15 viste den beste effektiviteten.
Ikke desto mindre var prosentandelen av Smad7-ekspresjoninhibisjon oppnådd ved in vivo behandling med oligonukleotidsekvensene SEKV.ID. nr. 10 og 11 ikke signifikant forskjellig fra den dokumentert i in vitro eksperimenter.
I stedet resulterte behandling av mus med antisens ODN, SEKV.ID. NR. 5 og 12 og 15, klart i en større prosentandel av Smad7-inhibisjon enn den oppnådd i in vitro eksperimenter, det vil si henholdsvis 55% vs 34%, 42% vs 32% og 56% vs 34%
(P<0,01).
I kontrast til dette, forårsaket behandling av mus med antisens oligonukleotid SEKV.ID. nr. 7 en reduksjon i Smad7-ekspresjon in vivo som var lavere enn den som resulterte når antisens oligonukleotidet ble transfektert i LPMC in vitro, det vil si 10% vs 17%, P< 0,01.
Totalt foreslår disse resultatene at bare spesifikk modifikasjon inn i Smad7 antisens ODN-sekvens er i stand til å forbedre dens farmakokinetiske, biokjemiske og biofysiske profil.
Intet tegn på akutt toksisitet ble dokumentert i mus som mottok antisens oligonukleotider (SEKV.ID. nr. 1 og SEKV.ID. nr. 4-15). En av 5 behandlet med TNBS døde etter 3 dager (20%). På samme måte døde 1/5 av musene som mottok Smad7 sens oligonukleotid etter 4 dager.
Ingen dødelighet ble dokumentert i musegruppen behandlet med Smad7 antisens ODN, SEKV.ID. n. 1 og SEKV.ID. nr. 4-15.
Anvendelse av antisens ODN-sekvensene SEKV.ID. nr. 13 og SEKV.ID. nr. 14 er assosiert med en rimelig in vitro inhibisjonsaktivitet (henholdsvis 11% og 9,5%). Ikke desto mindre ble in vivo administrering av slike sekvenser uventet satt i forbindelse med en markert forverring av kolitten, opptil å forårsake død i alle musene etter 72 timers behandling.
Makroskopisk analyse av tarmprøvene tatt fra disse musene har vist nærvær av alvorlig kolitt og dette ble assosiert med en betydelig økning i den intestinale Smad7-ekspresjonen.
Som nevnt ovenfor, ble effektiviteten til Smad7 antisens ODN til å begrense pågående inflammasjon testet. For denne hensikten ble mus etter induksjon av kolitt administrert med antisensoligonukleotider, SEKV.ID. nr. 1, 4, 5 og 15, med 5 dyr i hver gruppe.
Etter behandling med Smad7 antisens ODN er det blitt vist en reduksjon av slimhinneinflammasjon. Dette resultatet var spesielt klart hos mus behandlet med antisensoligonukleotidene 4 og 15. Kolittalvorligheten av grad 3-4 hos mus med kolitt som ikke mottok antisens, nådde virkelig gradering 2 eller 3 etter administrering av antisensoligonukleotidsekvensene 1 eller 5 henholdsvis, mens mus behandlet med oligonukleotidsekvensene 4 eller 15 oversteg ikke inflammasjon med gradering 1.
For å undersøke om Smad7 antisensoligonukleotider også var effektive ved oral administrering, ble mus med TNBS-indusert kolitt behandlet dagen etter induksjon av kolitt med Smad7 antisens oligonukleotid 4 eller 15 eller kontroll (sens).
For denne hensikten ble oligonukleotidene resuspendert i en bikarbonatoppløsning. Endelig volum på oppløsningen administrert til hver mus var 350 u.1 og inneholdt oligonukleotiddoser tilsvarende 250, 500 eller 1000 u.g. En slik oppløsning ble administrert per os gjennom et kateter.
På den femte dagen ble musene ofret og analyse av Smad7-ekspresjon og av inflammasjonsgraden ble evaluert som angitt i tidligere avsnitt. Alle musene behandlet med antisensoligonukleotid, og ikke med kontroll sensoligonukleotid, viste en meningsfull reduksjon av Smad7-ekspresjon og en økt Smad3-fosforylering, uavhengig av den anvendte oligonukleotiddosen.
Hovedsakelig var Smad7-inhibisjon assosiert med en vektgjenopprettelse som vist i figur 4. Figur 4 viser en kurve som viser prosentvis forandring i vekten til musene med TNBS-indusert kolitt, behandlet eller ikke behandlet med Smad7 antisens oligonukleotid (SEKV.ID. nr. 15) eller kontroll (sens). Begge oligonukleotider ble administrert per os med en dose på 250 jag gjennom et kateter to dager etter induksjonen av kolitt. Vekttapet som var dokumenterbart på dag to i hver av de tre gruppene indikerer at behandlingen med TNBS induserte kolitt. Videre ble det vist at med utgangspunkt i den fjerde dagen, viste mus behandlet med Smad7 antisens oligonukleotid, men ikke med kontroll, en gjenopprettelse av kroppsvekt. Den tilsynelatende og lette gjenopprettelsen på dag fem hos mus med TNBS-indusert kolitt skyldes det faktum at 21,4% av musene med kolitt døde den fjerde dagen og ble derfor ikke vurdert ved evalueringen av kroppsvekten på den femte dagen.
Smad7-inhibisjon var korrelert til en markert undertrykkelse av vevsinflammasjon som vist i figurene 5 og 6. Figur 5 viser bildene av kolon ekstrahert fra en mus med TNBS-kolitt og fra en mus med TNBS-kolitt behandlet med Smad7 antisens oligonukleotider (SEKV.ID. nr. 15). Oligonukleotidet ble administrert per os i en dose på 250 u.g gjennom et kateter, på dag to etter induksjonen av kolitt. Det er blitt vist at kolon fra mus med TNBS-kolitt er meget inflammert, forkortet og fortykket. I motsetning til dette, viser musen som mottok Smad7 antisens en kolon av normal lengde og tykkelse og ingen makroskopiske tegn på flogose. Figur 6 utviser histologiske aspekter av et kolonsnitt fra en mus uten kolitt eller fra mus med TNBS-kolitt behandlet eller ikke behandlet med Smad7 antisens oligonukleotid (SEKV.ID. nr. 15) eller kontrollen (sens). Begge oligonukleotidene ble administrert per os i en dose på 250 u,g gjennom kateter den andre dagen etter induksjon av kolitt. Det er blitt vist at i musen uten kolitt, viste kjertlene seg å være rektilineære og ensartet med et normalt innhold av slimceller og inflammatoriske elementer i lamian propria. Tvert i mot, i kolon fra TNBS-behandlede mus som mott eller ikke kontrolloligonukleotid, var det en total destruksjon av kjertelstruktur, infiltrasjon med slimproduserende og massivt inflammatoriske celler i lamina propria. I kolonsnittene til musene behandlet med TNBS og som mottok Smad7 antisens oligonukleotid, ble det vis nærvær av normal kjertelstruktur og fravær av betennelse.
Sammen foreslår disse observasjonene at anvendelse av antisens ODN, som viser høyere effektivitet til Smad7-inhibisjon fulgt av fravær av bivirkninger, etter in vivo administrering, kan representere en lovende terapeutisk strategi ved kontroll av slimhinneinflammasjon under IBD, særlig når slike kjennetegne på effektivitet og toksisitet ble sammenlignet med resultater oppnådd med andre antisens ODN-sekvenser med samme effektivitet i Smad7 in vitro inhibisjon.
LITTERATURLISTE
Podolsky D.K., N. Engl. J. Med., 2002 Ago; bind 347; nr. 6.
Seegers D. et al. Aliment. Pharmacol. Ther., 2002; bind 16: 53-58.
Sandborn J., et al. Gastroenterology, 2002 Mag; bind 122: nr. 6.
Fiocchi C, J. Clin. Invest., 2001 Ago; bind 108: 523-526.
Powrie F., et al. J Exp Med 1996; 183: 2669-2674.
Neurath M.F., et al. J Exp Med 1996; 183: 2605-2616.
Ludviksson B.R., et al. J Immunol 1997; 159: 3622-3628.
Shull M.M., et al. Nature 1992; 359: 693-699.
Christ M., et al. J Immunol 1994; 153: 1936-1946.
Hahm K.B., et al. Gut. 2001; 49: 190-198.
Gorelik L., et al. Immunity 2000; 12: 171-181.
Heldin C-H., et al. Nature 1997; 390: 465-471.
Yang X., et al. Embo J 1999; 18: 1280-1291.
HayashiH., et al. Cell 1997; 89: 1165-1173.
Lawrance IC. et al. Inflamm Bowel Dis 2001; 7: 16-26.
Monteleone G., et al. J. Clin. Invest., 2001 Glu; bind 108: 601-609.
Boirivant M., et al. Gastroenterology 1999; 116: 557-565.
Han SH., et al. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 287: 1105-12.
Arsura M., et al. Immunity 1996; 5: 31-40.
Brevetto statunitense US 6,159,697.
Maggi A., Biotecnologie Fharmacologiche, 1998; Cap. 8: 125-131.
Agrawal S., Molecular Medicine Today, 2002; bind 6: 72-81.
Neurath M., Fuss I., Strober W., Int Rev Immunol, 2000; bind 19: 51-62.
Lesiak K. et al., Bioconjugate Chem., 1993; bind 4: 467.
Xiao W. et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1996; bind 6: 247-258.
Sanghvi et al, Nuclei Acids Research, 1993; bind 21: 3197-3203.
Maier MA. et al. Org Lett., 2002; bind 2: 1819-1822.
Guerlavais T., et al. Anal Bioanal Chem., 2002; bind 374: 57-63.
Ragas J.A., et al. Analyst., 2000; bind 125: 575-581.
Claims (15)
1. Antisensoligonukleotidfosfortioat mot Smad7 opptil 21 nukleotider i lengde,karakterisert vedat det omfatter den følgende sekvens (SEKV.ID. nr. 2): 5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3<*>
hvori X er et nukleotid som omfatter en nitrogenholdig base som er valgt fra gruppen som består av cytosin, 5-metylcytosin og 2'-0-metylcytosin og hvori Y er et nukleotid som omfatter en nitrogenholdig base valgt fra gruppen som består av guanin, 5-metylguanin og 2'-0-metylguanin, forutsatt at minst ett av nukleotidene X eller Y omfatter en metylert nitrogenholdig base.;
2. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 1,
karakterisert vedat minst ett nukleotid i sekvensen er metylfosfonat.;
3. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 2,
karakterisert vedat nevnte minst ene metylfosfonatnukleotid er plassert enten på bare en av 3'- eller 5'-endene eller på begge 3'- og 5'-endene eller langs antisensoligonukleotidsekvensen.;
4. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 2,
karakterisert vedat metylfosfonatnukleotidet er Y.;
5. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 2,
karakterisert vedat metylfosfonatnukleotidet er X.;
6. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 1,
karakterisert vedat minst ett nukleotid i sekvensen er et 2'-0-metylribonukleotid 5'-monofosfat.;
7. Antisensoligonukleotid som angitt i krav 6,
karakterisert vedat minst ett 2'-0-metylribonukleotid 5'-monofosfat er plassert på bare en av 3'- eller 5'-endene eller i begge 3'- og 5'-endene eller langs oligonukleotidsekvensen.;
8. Antisensoligonukleotid som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat 2'-deoksyribonukleotider er erstattet av tilsvarende ribonukleotider.;
9. Antisensoligonukleotid som angitt i ethvert av kravene 1 til 8,karakterisert vedat det har sekvensen (SEKV.ID. nr. 4): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3<*>
hvori X er metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat og Z er 2'-deoksyguanosinmetylfosfonat.
10. Antisensoligonukleotid som angitt i ethvert av kravene 1 til 8,karakterisert vedat det har sekvensen (SEKV.ID. nr. 15): 5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3'
hvori X er 5-metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat og Z er 2'-deoksyguanosinmetylfosfonat.
11. Antisensoligonukleotid som angitt i ethvert av kravene 1,karakterisert vedat det har sekvensen (SEKV.ID. nr. 3): 5'- GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'
hvori X er 5-metyl 2'-deoksycytidin 5'-monofosfat.
12. Antisensoligonukleotid som kravene 1 til 11, for anvendelse i det medisinske området.
13. Farmasøytisk sammensetning,
karakterisert vedat den omfatter minst ett av antisensoligonukleotidene som angitt i kravene 1 til 11 som aktivt prinsipp sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanser og/eller eksipienter.
14. Anvendelse av antisensoligonukleotider som angitt i kravene 1 til 11 for fremstilling av et legemiddel for behandling av patologier assosiert med Smad7-ekspresjon og som er kroniske inflammasjonssykdommer.
15. Anvendelse som angitt i krav 14,
hvori de kroniske inflammatoriske sykdommene er Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT2003RM000149 ITRM20030149A1 (it) | 2003-04-02 | 2003-04-02 | Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico |
PCT/IT2004/000117 WO2004087920A1 (en) | 2003-04-02 | 2004-03-08 | Antisense oligonucleotides (odn) against smad7 and uses in medical field thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20054861L NO20054861L (no) | 2005-10-20 |
NO334022B1 true NO334022B1 (no) | 2013-11-18 |
Family
ID=29765741
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20054861A NO334022B1 (no) | 2003-04-02 | 2005-10-20 | Antisens oligonukleotider (ODN) mot SMAD7 og anvendelser derav i det medisinske området |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (18) | US7700757B2 (no) |
EP (1) | EP1608753B1 (no) |
JP (2) | JP4559411B2 (no) |
KR (1) | KR100822972B1 (no) |
CN (1) | CN100556461C (no) |
AT (1) | ATE417102T1 (no) |
AU (1) | AU2004225666B2 (no) |
CA (1) | CA2520541C (no) |
CY (1) | CY1108870T1 (no) |
DE (1) | DE602004018288D1 (no) |
DK (1) | DK1608753T3 (no) |
ES (1) | ES2316970T3 (no) |
IT (1) | ITRM20030149A1 (no) |
MX (1) | MXPA05010549A (no) |
NO (1) | NO334022B1 (no) |
NZ (1) | NZ542718A (no) |
PL (1) | PL1608753T3 (no) |
PT (1) | PT1608753E (no) |
RU (1) | RU2339697C2 (no) |
SI (1) | SI1608753T1 (no) |
WO (1) | WO2004087920A1 (no) |
Families Citing this family (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1456380T3 (da) * | 2001-11-02 | 2012-07-30 | Giuliani Int Ltd | SMAD7-inhibitorer til behandling af CNS-sygdomme |
ITRM20030149A1 (it) | 2003-04-02 | 2004-10-03 | Giuliani Spa | Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico |
JP5719776B2 (ja) * | 2008-11-13 | 2015-05-20 | ノグラ ファーマ リミテッド | アンチセンス組成物およびその作製および使用 |
CN102282155B (zh) | 2008-12-02 | 2017-06-09 | 日本波涛生命科学公司 | 磷原子修饰的核酸的合成方法 |
US9744183B2 (en) | 2009-07-06 | 2017-08-29 | Wave Life Sciences Ltd. | Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof |
DK2620428T3 (da) | 2010-09-24 | 2019-07-01 | Wave Life Sciences Ltd | Asymmetrisk hjælpegruppe |
CA2815212A1 (en) * | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Curna, Inc. | Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua |
DK2734208T3 (en) | 2011-07-19 | 2017-06-19 | Wave Life Sciences Ltd | PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS |
CN104040349B (zh) | 2011-09-15 | 2017-07-04 | 诺格尔制药有限公司 | 用于监测对抗smad7疗法的反应性的方法 |
MX370149B (es) * | 2012-04-18 | 2019-12-03 | Nogra Pharma Ltd | Inhibidores de la expresión o función de smad7 para usarse en el tratamiento de diabetes y/o la promoción de la supervivencia de islotes pancreáticos después del trasplante. |
EP2872485B1 (en) | 2012-07-13 | 2020-12-16 | Wave Life Sciences Ltd. | Asymmetric auxiliary group |
CN104684923B (zh) | 2012-07-13 | 2018-09-28 | 株式会社新日本科学 | 手性核酸佐剂 |
RU2015104762A (ru) | 2012-07-13 | 2018-08-31 | Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. | Хиральный контроль |
US10006029B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-06-26 | Nogra Pharma Limited | Methods of treating colorectal cancer |
CN105008394B (zh) * | 2013-03-15 | 2021-10-22 | 诺格尔制药有限公司 | 治疗结肠直肠癌的方法 |
US9637744B2 (en) * | 2013-06-13 | 2017-05-02 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of erythropoietic protoporphyria |
WO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
US10322173B2 (en) | 2014-01-15 | 2019-06-18 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
JPWO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
PT3094728T (pt) | 2014-01-16 | 2022-05-19 | Wave Life Sciences Ltd | Desenho quiral |
AU2015257589A1 (en) * | 2014-05-09 | 2016-11-24 | Nogra Pharma Limited | Methods for treating inflammatory bowel disease |
WO2015179693A1 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds and their use |
US20170247695A1 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-31 | Celgene Corporation | Isotopologues of smad7 antisense oligonucleotides |
WO2016059243A2 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Nogra Pharma Limmited | Methods for dosing and monitoring smad7 antisense oligonucleotide treatment using biomarker levels |
AU2015332624A1 (en) * | 2014-10-17 | 2017-05-04 | Nogra Pharma Limited | Methods and compositions for treating a subject with a SMAD7 antisense oligonucleotide |
MA41271A (fr) * | 2014-12-26 | 2017-10-31 | Celgene Alpine Invest Company Ii Llc | Méthodes d'utilisation d'oligonucléotides antisens ciblant smad7 |
WO2016130832A1 (en) | 2015-02-13 | 2016-08-18 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Toll-like receptor 9 antagonist and methods of use thereof |
WO2016196897A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions |
EP3316894A4 (en) | 2015-07-02 | 2019-06-19 | City of Hope | COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USING PHOSPHOROIDED OLIGODESOXYNUCLEOTIDE AND METHOD OF USE THEREOF |
EP3356530A4 (en) * | 2015-09-30 | 2019-04-10 | Celgene Alpine Investment Company II, LLC | TLR MODULATORS AND ASSOCIATED METHODS OF USE |
US11162097B2 (en) | 2016-02-23 | 2021-11-02 | Nogra Pharma Limited | Methods of treating intestinal fibrosis using SMAD7 inhibition |
WO2018112235A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a smad7 inhibitor |
US10517889B2 (en) | 2017-09-08 | 2019-12-31 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of SMAD7 expression |
CN112004546A (zh) * | 2017-12-30 | 2020-11-27 | 科罗拉多大学董事会 | Ptd-smad7融合蛋白治疗剂 |
US10768615B2 (en) * | 2018-02-26 | 2020-09-08 | Sanskar Agrawal | System and method for automated hospital beds |
Family Cites Families (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6096722A (en) * | 1990-08-14 | 2000-08-01 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of cell adhesion molecule expression and treatment of cell adhesion molecule-associated diseases |
RU95104940A (ru) * | 1992-07-27 | 1997-01-10 | Хайбрайдон | Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения |
US6884787B2 (en) * | 2001-07-14 | 2005-04-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of transforming growth factor-beta 3 expression |
DK0667148T3 (da) * | 1992-11-06 | 2002-07-22 | Hisamitsu Pharmaceutical Co | Peroralt farmaceutisk præparat, der udløses i den nedre del af mavetarmkanalen |
US20020177568A1 (en) * | 1992-12-07 | 2002-11-28 | Stinchcomb Dan T. | Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of NF-kappa B |
WO1994025588A2 (en) * | 1993-04-30 | 1994-11-10 | Biognostik Gesellschaft für Biomolekulare Diagnostik mbH | ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF IMMUNOSUPPRESSIVE EFFECTS OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TGF-β) |
GB9516268D0 (en) * | 1995-08-08 | 1995-10-11 | Danbiosyst Uk | Compositiion for enhanced uptake of polar drugs from the colon |
AU725192B2 (en) * | 1996-02-16 | 2000-10-05 | Brigham And Women's Hospital | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease |
US6099823A (en) | 1996-02-16 | 2000-08-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease |
US5783566A (en) * | 1996-05-10 | 1998-07-21 | California Institute Of Technology | Method for increasing or decreasing transfection efficiency |
US5856462A (en) * | 1996-09-10 | 1999-01-05 | Hybridon Incorporated | Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides |
JPH10295381A (ja) | 1997-04-23 | 1998-11-10 | Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk | 新規シグナル伝達因子、およびそれをコードする遺伝子 |
AU747576B2 (en) | 1997-05-20 | 2002-05-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Smad7 and uses thereof |
AU731909B2 (en) * | 1997-07-01 | 2001-04-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal |
US5874416A (en) * | 1997-11-07 | 1999-02-23 | Sheikhnejad; Gholamreza | RAS antisense inhibition |
WO1999050296A1 (en) | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Eli Lilly And Company | Treatment and prevention of vascular disease |
JPH11335269A (ja) * | 1998-05-19 | 1999-12-07 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | 遺伝子関連医薬の経口投与固形製剤 |
EP1469009A2 (en) | 1998-05-21 | 2004-10-20 | Isis Parmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides |
US6228642B1 (en) | 1998-10-05 | 2001-05-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-(α) (TNF-α) expression |
US5962673A (en) | 1998-11-20 | 1999-10-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of inhibitor-kappa B kinase-alpha expression |
US6479465B2 (en) * | 1999-03-24 | 2002-11-12 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of treating colitis using STAT-4 anti-sense oligonucleotides |
US6159697A (en) | 2000-01-19 | 2000-12-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of Smad7 expression |
US20020147140A1 (en) * | 2000-01-31 | 2002-10-10 | Rosen Craig A. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
WO2001055320A2 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
WO2001062207A2 (en) * | 2000-02-23 | 2001-08-30 | The Regents Of The University Of California | Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation |
EP1268774A2 (en) * | 2000-03-21 | 2003-01-02 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in prokaryotes |
AU2001264559A1 (en) | 2000-06-05 | 2001-12-17 | Avalon Pharmaceuticals | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets |
AU2001289617A1 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-08 | Epigenomics Ag | Diagnosis of diseases associated with signal transduction |
US20030134324A1 (en) | 2000-08-07 | 2003-07-17 | Munger William E. | Identifying drugs for and diagnosis of Benign Prostatic Hyperplasia using gene expression profiles |
WO2002068579A2 (en) | 2001-01-10 | 2002-09-06 | Pe Corporation (Ny) | Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof |
AU2002306849A1 (en) | 2001-03-21 | 2002-10-08 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in microorganisms |
US20030087259A1 (en) | 2001-04-18 | 2003-05-08 | Clancy Brian M. | Methods and compositions for regulating bone and cartilage formation |
AUPR638101A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Bioa Pty Limited | Composition and method for treatment of disease |
DK1456380T3 (da) | 2001-11-02 | 2012-07-30 | Giuliani Int Ltd | SMAD7-inhibitorer til behandling af CNS-sygdomme |
EP1308459A3 (en) | 2001-11-05 | 2003-07-09 | Research Association for Biotechnology | Full-length cDNA sequences |
JP2003135075A (ja) * | 2001-11-05 | 2003-05-13 | Research Association For Biotechnology | 新規な全長cDNA |
EP1578367A4 (en) | 2002-11-01 | 2012-05-02 | Genentech Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES |
AU2003296944A1 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-30 | George Koob | A method for treatment of drug addiction and for screening of pharmaceutical agents therefor |
WO2004083389A2 (en) | 2003-03-13 | 2004-09-30 | Exelixis Inc. | Mbcats as modifiers of the beta-catenin pathway and methods of use |
ITRM20030149A1 (it) | 2003-04-02 | 2004-10-03 | Giuliani Spa | Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico |
US20040265833A1 (en) * | 2003-06-23 | 2004-12-30 | Cathy Lofton-Day | Methods and nucleic acids for the analysis of colorectal cell proliferative disorders |
CA2533803A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-02-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation |
ITRM20030393A1 (it) | 2003-08-11 | 2005-02-12 | Giuliani Spa | Uso di oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 per il trattamento delle patologie mediate dal fattore di trascrizione nucleare nf-kb. |
FR2862659B1 (fr) | 2003-11-21 | 2006-02-10 | Pasteur Institut | Genome de legionella pneumophila souche paris- applications diagnostiques et epidemiologiques |
WO2005077403A1 (en) | 2004-02-04 | 2005-08-25 | Stryker Corporation | Therapeutic methods using smads |
JP5650367B2 (ja) | 2004-02-27 | 2015-01-07 | アンティセンス ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 医薬組成物 |
WO2005098041A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Detection and treatment of fibrotic disorders |
WO2007022642A2 (en) | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Replicor Inc. | Anti-inflammatory molecules and their uses |
US20080015160A1 (en) | 2005-11-04 | 2008-01-17 | Johji Inazawa | Method for detecting cancer and a method for suppressing cancer |
WO2007099345A1 (en) | 2006-03-02 | 2007-09-07 | Betagenon Ab | Medical use of bmp-2 and/ or bmp-4 |
AU2007238608A1 (en) | 2006-04-14 | 2007-10-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Identifying and modulating molecular pathways that mediate nervous system plasticity |
EP2049691A4 (en) | 2006-07-26 | 2010-06-16 | Genizon Biosciences Inc | SUSCEPTIBILITY TREASURES FOR MORBUS CROHN |
WO2008046964A2 (en) | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Panu Jaakkola | Novel useful inhibitors |
WO2009151600A2 (en) | 2008-06-10 | 2009-12-17 | Tufts University | Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation |
JP5719776B2 (ja) | 2008-11-13 | 2015-05-20 | ノグラ ファーマ リミテッド | アンチセンス組成物およびその作製および使用 |
US8110355B2 (en) | 2009-02-20 | 2012-02-07 | GenRemedy, LLC | Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis |
CN104040349B (zh) | 2011-09-15 | 2017-07-04 | 诺格尔制药有限公司 | 用于监测对抗smad7疗法的反应性的方法 |
MX370149B (es) | 2012-04-18 | 2019-12-03 | Nogra Pharma Ltd | Inhibidores de la expresión o función de smad7 para usarse en el tratamiento de diabetes y/o la promoción de la supervivencia de islotes pancreáticos después del trasplante. |
US10006029B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-06-26 | Nogra Pharma Limited | Methods of treating colorectal cancer |
CN105008394B (zh) | 2013-03-15 | 2021-10-22 | 诺格尔制药有限公司 | 治疗结肠直肠癌的方法 |
AU2015257589A1 (en) | 2014-05-09 | 2016-11-24 | Nogra Pharma Limited | Methods for treating inflammatory bowel disease |
WO2016059243A2 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Nogra Pharma Limmited | Methods for dosing and monitoring smad7 antisense oligonucleotide treatment using biomarker levels |
AU2015332624A1 (en) | 2014-10-17 | 2017-05-04 | Nogra Pharma Limited | Methods and compositions for treating a subject with a SMAD7 antisense oligonucleotide |
CA3000569A1 (en) | 2015-09-30 | 2017-04-06 | Nogra Pharma Limited | Methods of using smad7 antisense oligonucleotides based on biomarker expression |
US20210207143A1 (en) | 2016-02-24 | 2021-07-08 | Nogra Pharma Limited | Methods of Treating Celiac Disease Using SMAD7 Inhibition |
US20190328770A1 (en) | 2016-12-30 | 2019-10-31 | Nogra Pharma Limited | Compositions of smad7 antisense oligonucleotide and methods of treating or preventing psoriasis |
-
2003
- 2003-04-02 IT IT2003RM000149 patent/ITRM20030149A1/it unknown
-
2004
- 2004-03-08 SI SI200431026T patent/SI1608753T1/sl unknown
- 2004-03-08 DE DE602004018288T patent/DE602004018288D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-08 US US10/551,643 patent/US7700757B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-08 EP EP04718384A patent/EP1608753B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-08 JP JP2006507636A patent/JP4559411B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-08 AU AU2004225666A patent/AU2004225666B2/en not_active Ceased
- 2004-03-08 KR KR1020057018531A patent/KR100822972B1/ko active IP Right Grant
- 2004-03-08 DK DK04718384T patent/DK1608753T3/da active
- 2004-03-08 PL PL04718384T patent/PL1608753T3/pl unknown
- 2004-03-08 PT PT04718384T patent/PT1608753E/pt unknown
- 2004-03-08 RU RU2005133711A patent/RU2339697C2/ru active
- 2004-03-08 AT AT04718384T patent/ATE417102T1/de active
- 2004-03-08 WO PCT/IT2004/000117 patent/WO2004087920A1/en active Application Filing
- 2004-03-08 CN CNB2004800123449A patent/CN100556461C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-08 NZ NZ542718A patent/NZ542718A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-03-08 CA CA2520541A patent/CA2520541C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-08 MX MXPA05010549A patent/MXPA05010549A/es active IP Right Grant
- 2004-03-08 ES ES04718384T patent/ES2316970T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-10-20 NO NO20054861A patent/NO334022B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-10 US US11/501,756 patent/US20070042985A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-11-03 US US12/264,058 patent/US7807818B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-10 CY CY091100264T patent/CY1108870T1/el unknown
-
2010
- 2010-06-02 JP JP2010126606A patent/JP5039172B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-08-11 US US12/854,558 patent/US8106182B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-12-20 US US13/332,134 patent/US20120136043A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-03-15 US US13/836,634 patent/US8648186B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2013-12-30 US US14/144,029 patent/US9006418B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-04-30 US US14/266,343 patent/US8907078B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-02-03 US US14/613,181 patent/US9096854B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-04-13 US US14/685,091 patent/US9279126B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-07-31 US US14/815,339 patent/US9382541B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-03-07 US US15/063,077 patent/US9605264B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2016-07-01 US US15/201,061 patent/US9518264B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2016-11-18 US US15/355,329 patent/US10036022B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-03-13 US US15/457,631 patent/US9951334B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-03-22 US US15/928,494 patent/US10738309B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2018-07-26 US US16/046,389 patent/US10633660B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2020
- 2020-03-31 US US16/836,213 patent/US20200325480A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO334022B1 (no) | Antisens oligonukleotider (ODN) mot SMAD7 og anvendelser derav i det medisinske området |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: NOQRA PHARMA LTD, IE |
|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |