JP5039172B2 - Ｓｍａｄ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）及びその医療分野での使用 - Google Patents

Description

本発明は、Ｓｍａｄ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）及びその医療分野での使用に関する。

特に本発明は、好適に修飾されたＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列に言及し、これは、Ｓｍａｄ７発現の特異的阻害という驚くべき生物活性を示し、したがって、治療用生物薬剤として医療分野において、特に慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置において使用可能である。

クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、ヒトにおいて主要な形態の慢性炎症性の腸疾患である。両疾患は、複合的な臨床実体であり、その病原は、様々な遺伝性、環境性及び免疫性因子の間での相互作用に強く依存している。

ＣＤ及びＵＣは、病態生理学及び臨床レベルの両方において明確な差異を示すが、苦しむ患者に対する治療アプローチは多くの共通要素を有する。たとえ薬理学的な処置が第１の有力なアプローチを代表するとしても、病変の広がりやタイプ、及び合併症の種類など、臨床症状の多様性は治療法の選択に影響を及ぼす。

サリチルアゾスルファピリジン及び５−アミノサリチル酸は、軽い形態のＩＢＤの扱いにおいて及び緩解維持療法において実証済みの効力を有する薬である。

中程度から重度の活性を有する相において、及び全身性の状態を伴う場合においては、コルチコステロイドの使用に移ることが必要である。主要な世界各国の病歴の中長期的な解析によれば、臨床的緩解は、コルチコステロイドを受けた患者の３分の２においてのみ得られ、それらの患者の５０％においてのみ、薬の中断後にいかなる再発も起きないようである。

コルチコステロイドの継続的投与は、薬物依存徴候を誘導することに加えて、非常に高い副作用の危険性のためにさらに厄介なものになる。

免疫抑制処置も、しばしばコルチコステロイド療法とともに又はその代わりに用いられるが、炎症の封じ込めや症状の制御を常に保証するものではなく、さらには、多数の禁忌及び重度の副作用という不利点を有する（非特許文献１）。

１９９０年代に利用可能になった新薬の世代に生物薬剤がある。ＩＢＤ自然史及び主要な病態生理学的機構についてのより詳しい知識は、具体的な医療介入の舵取りに貢献している。このように、特定の炎症「経路」を制御することを狙った生物療法の発展は、組換えのヒトタンパク質、モノクローナルキメラのヒト化抗体及び融合タンパク質を用いることによって起こった。その中で、ＣＤの処置においてより良い効力を示した薬剤は、ＴＮＦ−α、即ちＩＢＤの罹患中に過剰生産される炎症性サイトカインのひとつをブロックするように向けられたモノクローナルキメラ抗体である（非特許文献２）。この化合物は、現在のところ臨床試験の第四相にあるが、処置患者の約６０〜７０％において炎症封じ込めに有効である。しかしながら、幾つかの副作用が、かなりの発生頻度をもって、指摘されており、潜伏性の微生物感染の再活性化、過敏症徴候及び自己抗体の形成において確認もできている。後者の現象は、抗ＴＮＦ−αが、多数の生物学的機能を有するサイトカインＴＮＦ−αを中和するという事実に基づいていることもありうる。

炎症についての効果に加えて、ＴＮＦ−αは、免疫寛容の誘導と維持に関与する機構に対しても役割を持っている。したがって、ＴＮＦ−α活性のブロックは、逆説的であるが、過剰な免疫学的反応を促進しうるのである（非特許文献３）。

これら全ての所見は、そのような病態に対する、より優れたそして長期的に耐えうる処置に用いられる新たな有効成分を同定することが可能なＩＢＤの動物モデルについての新たな研究の必要性を示唆する（非特許文献４）。

例えば、ＩＬ−１０のごとき抗炎症サイトカインの投与のような他の生物療法と同様、抗ＴＮＦ−α処置は、炎症細胞から分泌される分子の生物学的効果を制御することを狙った治療細胞外アプローチを代表する。

サイトカインとその受容体との相互作用によって活性化されるシグナル伝達経路の研究は、重要な炎症性及び非炎症性分子の細胞内発現を特異的且つ選択的に変調することができる新たな治療戦略を用いる見込みを示した。

通常の条件下で、腸粘膜は、「生理学的に」炎症性の浸潤物の座位であり、炎症性及び抗炎症性の分子の間の微妙なバランスによって維持されている。

上記に関係して、ＴＧＦ−β１、即ち多くの免疫性及び非免疫性の細胞の成長、分化及び活動を調節することができる多機能サイトカインによって、重要な役割が果たされている。

インビトロ及びインビボ研究の両方が、ＴＧＦ−β１は粘膜性の腸の炎症を制御することができる強力な免疫調節物質として働き、その活性の阻害は、ＣＤ又はＵＣとの免疫形態学的類似性を示す大腸炎の発生という結果になることを実証している（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。

実際、ＴＧＦ−β１遺伝子欠損マウスは、やはり腸を含む重度の多巣性炎症応答を見せ、これは、多数のタイプの細胞による過剰な炎症性サイトカイン生産と関連がある（非特許文献８；非特許文献９）。

同様に、マウスにおいてＴＧＦ−β１受容体ＲＩＩの優性のネガティブ変異体を発現させることによるＴＧＦ−β１シグナル伝達の阻害は、実験上の大腸炎の発生に対する感受性が増大するという結果になる。（非特許文献１０）。

最後に、Ｔ細胞における優性ネガティブＴＧＦ−β受容体タイプＩＩの発現によるＴＧＦ−β１シグナル伝達の特異的阻害は、肺及び結腸における重度の炎症性浸潤並びに循環性の自己免疫抗体の存在を特徴とする自己免疫疾患を引き起こすことを示した（非特許文献１１）。これらのデータは、１つの抗炎症性分子の活性の喪失が、腸の恒常性を改変するためにそして組織障害につながる免疫応答を許容するために十分でありうることを示唆する。

ＴＧＦ−β１の抗炎症活性は、該分子の、ＴＧＦ−β１ Ｒ１とＴＧＦ−β１ Ｒ２とそれぞれ名付けられた２つのサブユニットからなるヘテロ二量体膜貫通セリン／スレオニンキナーゼ受容体の複合体との相互作用によって始まる。ＴＧＦ−β１が結合すると、該受容体は、上記複合体内で相対的に回転して、リン酸転移プロセスが起き、続いて、構成的に活性且つ自己リン酸化の可能なＴＧＦ−β１ Ｒ２によるＴＧＦ−β１ Ｒ１の活性化が起きる。

ＴＧＦ−β１誘発されたシグナルの核への伝播は、Ｓｍａｄファミリーに属するタンパク質によって媒介される。活性化されたＴＧＦ−β１ Ｒ１は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３タンパク質を直にリン酸化し、該タンパク質はＳｍａｄ４と相互作用することが可能になり、こうして、複合体Ｓｍａｄ２−３／Ｓｍａｄ４が核に転位置することを可能にし、核において幾つかの遺伝子の転写調節に関与する（非特許文献１２）。

ＴＧＦ−β１抗炎症活性におけるＳｍａｄ３の役割は、動物モデルにおける研究によって支持されており、Ｓｍａｄ３のコード遺伝子の欠失が、ＴＧＦ−β１に対する細胞応答性の減弱と関連があり、及び胃腸レベルでの化膿性の膿瘍形成とＴ細胞の大量の浸潤とを特徴とする炎症性疾患の関連発生と関連があることが示されている（非特許文献１３）。

また、他の細胞内タンパク質、例えばＳｍａｄ７も、Ｓｍａｄタンパク質ファミリーに属している。そのようなＴＧＦ−β１ Ｒ１を占拠するタンパク質は、受容体へのＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３の結合に干渉して、リン酸化及び活性化を阻止する。それ故、Ｓｍａｄ７タンパク質の増大した発現は、ＴＧＦ−β１媒介シグナル伝達の阻害と関連がある（非特許文献１４）。

ＩＢＤ患者からの腸粘膜におけるＴＧＦ−β１発現の評価は、前記分子生産が、正常な患者からの内臓において証明されうるものに比べて、逆説的であるが、増大されることを示した（非特許文献１５）。

最近の論文において、本発明の発明者は、ＩＢＤ患者からの粘膜試料は、高レベルのＳｍａｄ７と、低減されたレベルの活性Ｓｍａｄ３とを特徴としているが、これによって、ＩＢＤの罹患中には、ＴＧＦ−β１媒介のシグナル伝達の機構が損なわれていることを指し示すことを示している。本発明の発明者はまた、特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１）による選択的Ｓｍａｄ７抑止は、ＴＧＦ−β１に対する粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）応答性を修復し、その結果、例えばＴＮＦ−αのような、炎症性サイトカイン生産の下方調節が起きることを示した。

さらに、ＩＢＤ患者からの腸粘膜試料で実行されたエキソビボ実験もまた、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮの投与が、ＴＧＦ−β１シグナル伝達機構を修復するとともに、減弱されたサイトカイン生産を許容することを示した（非特許文献１６）。

ＩＢＤ罹患中に、腸粘膜は多数のＴ細胞で浸潤される。これらの細胞は、そのような疾患で働く組織傷害の主要な介在物であるとみなされる。

ＩＢＤ患者からの腸粘膜におけるＴ細胞の増大した個数は、部分的には、それら細胞の死（アポトーシス）を誘導する刺激に対するそれら細胞の抵抗性に依存する。

Ｔ細胞のアポトーシスのブロックは、ＩＢＤ罹患中に粘膜炎症応答で鍵となる役割を果たすと考えられている（非特許文献１７）。確かに、Ｔ細胞死を増大させることは、腸の炎症を解消することと関連がある。ＩＢＤにおけるアポトーシスに対するＴ細胞の抵抗性の基礎をなす明確な機構は、局所的に放出されるサイトカインが関与しているように見受けられるとしても、まだ知られてはいない。

細胞培養インビトロ実験及びインビボ研究からのデータは、ＴＧＦ−β１はＴ細胞死を防ぐこともその引き金を引くこともできること、及び両応答を媒介する該因子の能力が部位特異的であることを示唆する（非特許文献１８；非特許文献１９）。

Ｓｍａｄ３ノックアウトマウスは、腸レベルでの炎症細胞の個数に大きな増加を示し、これによって、腸レベルでの腸のＴ細胞アポトーシスを制御することにおけるＴＧＦ−β１の役割を示唆する（非特許文献１３）。

したがって、Ｓｍａｄ７合成アンチセンスＯＤＮの使用によるＳｍａｄ７阻害は、上記のように、ＴＧＦ−β１に対するＴ細胞の応答性を修復することから、慢性炎症性疾患、特にＩＢＤに対する新規で且つ容認される「内在性の」生物療法的アプローチを代表するかもしれない。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、上記特定の狙った阻害作用の標的タンパク質をコードする伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列である。そのような配列は、該ｍＲＮＡとハイブリッド形成し、二本鎖ハイブリッド形質を成し、これが、天然ではＤＮＡ複製の引き金を引くために発生するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を分解するＲＮアーゼＨのような広く存在する触媒酵素の活性化につながり、これによって、タンパク質翻訳が阻止される。

上記ＯＤＮとハイブリッド形成するための最も好適なｍＲＮＡ領域及び配列の選択は、転写開始領域５’及びスプライシング領域に相補的なＯＤＮが通常はより有効であるという結果になるとしても、経験的な特性を有する。可能な標的部位を同定した後で注目すべき数のアンチセンスＯＤＮを設計することは、当該分野の専門会社が所有する最近の進歩した自動合成技術のおかげで、困難をもたらすことはない。

逆に、可能な治療的応用のための、より活性の高いＯＤＮの同定は、定量的な試験において効力アッセイを通じた長期のスクリーニング作業を必要とする。上記に関係して、Ｓｍａｄ７を含めた特定の標的に対するアンチセンスＯＤＮ配列が既に知られている（特許文献１）。

インビトロ及びインビボの両方での遺伝子調節のためのアンチセンスＯＤＮの使用は、多陰イオン性でありしたがって親水性であるというこれら分子の性質のために細胞膜を通過することが困難であること、及び急速な酵素的分解のような、幾つかの問題によって妨げられる。

これらの障害を克服するためには、例えば、上記のＳｍａｄ７特異的配列の場合のようにホスホロチオエート化（非特許文献１６）や、リン酸ジエステル結合の架橋酸素ではない酸素原子に換えて硫黄又は窒素原子を置換することであるホスホロアミデート化のような、アンチセンスＯＤＮの化学修飾という手段をとることが必要である。

多くの生物工学的な製品と同様に、生物活性の実証によって潜在的な治療活性が指摘された。

確かに、ＯＤＮは、様々な疾患の病原に関与する遺伝子及びタンパク質の両方の機能の研究においても、治療目的のためにもどちらにも用いることができる。前者の適用分野では、アンチセンス方法論は、その指針原理が簡素であることによって成功したが、インビトロからインビボ実験への移行はより複雑であり、特に、これら新薬の薬物動態学的、薬力学的及び中毒学的な側面に関して複雑である（非特許文献２０）。

例えば、本発明の発明者によって実行された先の実験に用いられたＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ（配列番号１）は、インビトロで生物活性を示すが、インビボでは望ましくない効果の増大した危険性を示すことがありうる。実際、そのようなＯＤＮはヌクレオチドＣＧ対を２つ含有し、これらは、ＯＤＮ安定性を増大するために必須のプロセスであるホスホロチオエート化の後でＣｐＧになる。後者は、免疫系の強力な刺激活性を備える配列であり、したがって、そのような上記ＯＤＮの使用は、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むいかなる免疫性の疾患の経過をも悪化させうる。

インターロイキン１２の刺激下においてＴｈ１と名付けられたＴリンパ球の特別なクラスによって媒介される病態であるクローン病の場合には特に、類似の治療アプローチを仮定することはできないであろう。確かに、ＩＬ−１２合成の強力な誘導因子としてのＣｐＧ分子は、Ｔｈ１細胞のさらなる発育を誘導しうるであろう。

加えて、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスＯＤＮのインビボ投与は、ＣｐＧを持たないオリゴヌクレオチドに比べて、副作用の増大した危険性を伴う。特に、脾臓、腎臓及び肝臓の細網内皮系の過形成の増大した危険性、並びに造血細胞の増大した増殖が判明している（非特許文献２１）。

ＯＤＮの使用におけるもう１つの問題は、該分子は５’及び３’末端で保護されていないのでヌクレアーゼの攻撃をかなり受けやすく、その分解に由来する代謝産物の作用から結果として生じる副作用である。

そこで、ホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮバックボーンの、ＣｐＧ対への及び５’と３’末端への化学修飾の必要性にもかかわらず、ＯＤＮ配列の上記の修飾は、Ｓｍａｄ７合成の阻害の生物活性の低減又は損失及び、時には、インビトロ及びインビボの両方で望ましい活性の逆転につながる。

同様に、インビボでの研究に適した実験ＩＢＤモデルを用意することが重要であろう。これによって、免疫応答の制御の損失を伴う機構とＩＢＤ病態の発症におけるその役割とについての、及びそのような応答を変調又は防止し、よって粘膜レベルでの炎症の進行を制限する可能性についての知識を拡大することが許容される。上記に関係して、ＴＮＢＳ媒介大腸炎は、ヒトＣＤとの顕著な免疫形態学的類似性を示す粘液炎症の、広範且つ妥当なモデルを代表する（非特許文献２２）。

Ｂｒｅｖｅｔｔｏ ｓｔａｔｕｎｉｔｅｎｓｅ ＵＳ ６，１５９，６９７、譲受人：ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．

Ｐｏｄｏｌｓｋｙ Ｄ．Ｋ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００２ Ａｇｏ；Ｖｏｌ．３４７：Ｎｏ ６． Ｓｅｅｇｅｒｓ Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００２；Ｖｏｌ．１６：５３−５８． Ｓａｎｄｂｏｒｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００２ Ｍａｇ；Ｖｏｌ．１２２：Ｎｏ．６． Ｆｉｏｃｃｈｉ Ｃ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００１ Ａｇｏ；Ｖｏｌ．１０８：５２３−５２６． Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：２６６９−２６７４． Ｎｅｕｒａｔｈ Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３：２６０５−２６１６． Ｌｕｄｖｉｋｓｓｏｎ Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１５９：３６２２−３６２８． Ｓｈｕｌｌ Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５９：６９３−６９９． Ｃｈｒｉｓｔ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；１５３：１９３６−１９４６． Ｈａｈｍ Ｋ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．２００１；４９：１９０−１９８． Ｇｏｒｅｌｉｌｋ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００；１２：１７１−１８１． Ｈｅｌｄｉｎ Ｃ−Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９７；３９０：４６５−４７１． Ｙａｎｇ Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ １９９９；１８：１２８０−１２９１． Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９７；８９：１１６５−１１７３． Ｌａｗｒａｎｃｅ ＩＣ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ ２００１；７：１６−２６． Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００１ Ｇｉｕ；Ｖｏｌ．１０８：６０１−６０９． Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９９；１１６：５５７−５６５． Ｈａｎ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９８；２８７：１１０５−１２． Ａｒｓｕｒａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９６；５：３１−４０． Ｍａｇｇｉ Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅ Ｆａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃｈｅ，１９９８；Ｃａｐ．８：１２５−１３１． Ａｇｒａｗａｌ Ｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，２００２；Ｖｏｌ．６：７２−８１． Ｎｅｕｒａｔｈ Ｍ．，Ｆｕｓｓ Ｉ．，Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００；Ｖｏｌ．１９：５１−６２．

上記を考慮に入れると、「内在性の」生物療法的アプローチを通じたＩＢＤの処置用に、インビトロ及びインビボの両方で活性であるＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮのような新たな治療用生物薬剤を用意することが望ましいであろう。

本発明の発明者は、ＩＢＤの実験モデルにおいて示すＳｍａｄ７発現の阻害のインビボ生物活性が、それらのインビトロ阻害活性と比較してより高くなる、好適に修飾されたアンチセンスＯＤＮ配列を見出し、さらに、それは、同じ修飾を示し且つ同じモデルで試験した他の既知の配列の活性よりも高いものであることを見出した。

ＣＤ患者からの粘膜試料のＳｍａｄ７ＯＤＮアンチセンス及びセンス５’−ＭｅＰＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＭｅＰＧ−３’（配列番号４）による４０時間の処置の後における腸のＴリンパ球の数への効果を示す。 ＴＮＢＳ処置マウス（ＴＮＢＳ）、無処置（Ｕｎｔ）、コントロールとしてエタノール（ＥｔＯＨ）で処置したもの、の腸から単離されたＬＰＭＣにおけるｐ−Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体の及び全Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体の発現の解析を示す。 ＴＮＢＳ処置マウス（ＴＮＢＳ）、無処置（Ｕｎｔ）、コントロールとしてエタノール（ＥｔＯＨ）で処置したもの、の腸から単離されたＬＰＭＣにおけるＳｍａｄ７発現の解析を示す。 Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドＭｅＰＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＭｅＰＧＣ（配列番号１５）又はコントロール（センス）によって処置した又はしなかったＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスの体重の変化百分率を示す。該図は、各グループにつき１４匹のマウスが研究された３つの別々の実験を表す。 ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスから及びＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）によって処置したＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスから摘出した結腸の肉眼的側面を示す。該図は、各グループにつき１４匹のマウスが研究された３つの別々の実験を表す。 大腸炎に罹患していない、或いはＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）で処置した又はしなかった又はコントロール（センス）で処置したＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスからの結腸切片の組織学的な側面を示す。該図は、各グループにつき１４匹のマウスが研究された３つの別々の実験を表す。倍率４０倍。

特に、インビボでより高い生物活性を見せるＯＤＮ配列は、先の実験の過程において本発明の発明者によって用いられた、ヒトＳｍａｄ７ＲＮＡの部位４０３を標的にしたホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮ配列である配列番号１に従って設計した。

ヒト病態の処置用のそのようなＳｍａｄ７ホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮの潜在的且つ将来的な使用の観点から、前記配列は、既に記した免疫原性を理由に、それに含有されるＣｐＧジヌクレオチド、以後ＸＹとして指し示す、において修飾された。

本発明者によって実行された研究は、様々な既知及び新規のＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮのインビボ及びインビトロでの効力とその有りうる毒性とを試験することを許容するとともに、Ｓｍａｄ７発現をブロックすることがＩＢＤの実験モデルにおいて粘膜炎症の解消という結果になるかどうかを調査することを許容した。

本発明による上記の好適に修飾されたアンチセンスＯＤＮ配列は、インビボでより高い生物活性に加えて、同研究の経過において他の配列の投与の後に起きることからすると驚くほど副作用が無いことを示した。さらに、本発明によるＯＤＮ配列は、リンパ性の浸潤とその後の炎症の伝播とを制限する効力を示し、これは、本件において試験した他のアンチセンスＯＤＮ配列では見られなかった証拠のひとつである。

これら実験モデルにおける研究から、生物学的な標的としてのＳｍａｄ７の役割が、それの阻害の有りうる治療効果とともに明白になる。

さらにまた、本発明の脈絡内において、ＩＢＤ罹患中のＴ細胞アポトーシスの誘導についてのＳｍａｄ７の役割が見出された。実際に、あるＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮの使用を通じて、ＴＧＦ−β１が腸のＴ細胞アポトーシスを調節すること、及びある欠損した因子活性がアポトーシス刺激に対する細胞の抵抗性の根拠となることが示されている。ここで、アポトーシス刺激は、粘膜炎症性応答を維持するための要因である。

したがって、本発明の目的は、２１ヌクレオチド長までのＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエートであって、下記の配列（配列番号２）の少なくとも１０ヌクレオチドの部分：
５’−ＧＴＸＹＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＹＣＡＧ−３’
（上式中、Ｘは、シトシンと５−メチルシトシンと２’−Ｏ−メチルシトシンからなる群から選択される窒素性塩基を含むヌクレオチドであり、Ｙは、グアニンと５−メチルグアニンと２’−Ｏ−グアニンからなる群から選択される窒素性塩基を含むヌクレオチドであり、但し、ヌクレオチドＸ又はＹの少なくとも１つは、メチル化窒素性塩基を含む）；
又はそれに対する相補配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエートである。

本発明の他の目的は、前記配列中に含まれるヌクレオシド間結合のリン原子に関するジアステレオ異性体及び鏡像異性体のような、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド立体異性体のオリゴヌクレオチド配列である。確かに、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート又はメチルホスポネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｏｎａｔｅ）であり、どちらの場合でも、４つの異なる化学基に結合したリンは、キラル中心を代表する。

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオチドを前記配列中に有することができ、該メチルホスホネートヌクレオチドは、例えば、５’又は３’末端の一方のみ又は５’及び３’末端の両方に、或いは前記オリゴヌクレオチド配列に沿って位置している。

好ましい実施形態では、前記メチルホスホネートヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合が前記ヌクレオチドの間の結合である様態で、Ｘ又はＹのどちらかにすることができる。

前記アンチセンスＯＤＮの配列に沿って及び／又はその５’及び３’末端にさらなる修飾を施して、該分子の安定性を増大することもでき、これによって、ヌクレアーゼによる分解を防止するとともに、代謝作用に由来する望ましくない効果の危険性を低減する。

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−モノホスフェートである前記配列の少なくとも１つのヌクレオチドを有することができ、該２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−モノホスフェートは、例えば、５’又は３’末端の一方のみに又は５’及び３’末端の両方に、或いは前記オリゴヌクレオチド配列に沿って位置している。

本発明の別の目的は、アンチセンスデオキシリボヌクレオチド配列が、対応アンチセンスリボヌクレオチド配列になる様態で、２’−デオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに置き換えられており、２’−デオキシチミジンがウリジンに置き換えられている上記アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本発明の好ましい実施形態は、配列（配列番号３）：
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’
（上式中、Ｘは、５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートである）
を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドで代表される。

もう１つの好ましい実施形態は、配列（配列番号４）：
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’
（上式中、Ｘは、５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは、２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）
を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドで代表される。

もう１つの側面によれば、本発明の好ましい実施形態は、配列（配列番号１５）：
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’
（上式中、Ｘは、５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは、２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）
を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本発明によるアンチセンスＯＤＮ配列は、医学分野で好都合に用いることができ、したがって、本発明の別の目的は、この分野の熟練者に知られている１種又は複数の製薬的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤とともに、上記開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを有効成分として含む製薬組成物である。

さらに、本発明は、Ｓｍａｄ７発現に関連する病態の処置用の薬物の調製のための上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。特に、Ｓｍａｄ７発現に関連する病態は、例えばＣＤ及びＵＣのようなＩＢＤである。

さて、本発明を、限定的でなく例示の目的で、同封の図面を具体的に参照して発明の好ましい実施形態に従って説明する。

本発明によるＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの腸のＴ細胞アポトーシスへの効果についての研究

材料と方法
アンチセンスＯＤＮの合成
全てのＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮは、標準ホスホロアミダイト化学プロトコル（Ｌｅｓｉａｋ Ｋ．ら、１９９３年；Ｘｉａｏ Ｗ．ら、１９９６年）を用いた自動ＤＮＡシンセサイザーを使った標準自動手法を採用してＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．、フィレンツェ（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ））によって合成した。

５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−ＭｅｄＣ）を含有するオリゴヌクレオチドは、商業的入手可能なホスホロアミダイトを用いて既知の合成方法（Ｓａｎｇｈｖｉら、１９９３年）に従って合成した。一方、メチルホスホネート基（ＭｅＰ）を含有する修飾オリゴヌクレオチドの合成は、既知のプロトコル（Ｍａｉｅｒ ＭＡ．ら、２００２年）を用いて達成した。

オリゴヌクレオチド分子の精製を、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈによって開発されたＨＰＳＦ技術で実行した。そのような精製方法は、例えば、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−ｘ配列のような、標準的な精製用の典型的方法が取り除くことのできない、自動化学合成プロセス中に合成される失敗配列を取り除くことを許容するので、高い効率を見せた。

上記の技術は、望ましくない失敗産物のない望ましい長さの配列の１００％を得ることを可能にすることの他に、精製された配列には塩も金属イオンも含まれないので、その次の脱塩操作を回避することを許容する。

いかなる塩も非存在ならば、オリゴヌクレオチドを、標準プロトコルに従ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析手法で最終的に解析した（Ｇｕｅｒｌａｖａｉｓ Ｔ．ら、２００２年；Ｒａｇａｓ ＪＡ．ら、２０００年）。そして、オリゴヌクレオチドを滅菌して、得られた溶液をＵＶ／可視光分光光度計で光学濃度（ＯＤ）として定量した。最後に、使用の前に、該分子を、滅菌したＰＢＳ１ｘに再懸濁した。

全ての使用したアンチセンスＯＤＮは、ヒトとマウスの間で１００％の相同性を有するＳｍａｄ７ ｍＲＮＡ部位を標的とする。全ての下記のオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート結合である。

本研究において用いられるアンチセンスＯＤＮ配列は、先の実験の過程で本発明の発明者によって用いられたヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的としているホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１）に従って設計されている（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら、２００１年）。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＭｅＰＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＭｅＰＧ−３’（配列番号４）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的とする。これは、配列番号１のＣｐＧ対に属するシトシンが５−メチルシトシン（以下Ｍｅ−ｄＣとして指し示す）で置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。加えて、メチルホスホネート結合は、該分子の端に置かれた（以下、Ｍｅｐとして指し示す）。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣ−３’（配列番号５）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９４を標的とする。

粘膜試料を、中程度から重度のＣＤの患者６名及び重度のＵＣの患者４名の切除検体から取った。加えて、腸粘膜試料を、結腸癌腫のために結腸切除した無影響のＩＢＤ患者１０名から取った（倫理的な承認を地方委員会から得た）。ＬＰＭＣを、ＤＴＴ−ＥＤＴＡ−コラゲナーゼ手順を用いて調製して、血清置換剤ＨＬ−１（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、英国ウォキンガム）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．、ミラン）中に再懸濁した。

細胞を、ＴＧＦ−β１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度は１から５ｎｇ／ｍｌ）の存在及び非存在下で培養して、４８時間のインキュベーション後に、アポトーシスのレベルに関して解析した。

他の実験で、ＩＢＤ患者の腸から単離されたＬＰＭＣを、ＨＬ−１を補充したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、上記のＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ（配列番号４、配列番号５）の存在及び非存在下、及びコントロールのセンスオリゴヌクレオチドの存在下（どちらも２μｇ／ｍｌの濃度で用いた）で培養した。２４時間後に、ＬＰＭＣのアリコットを、タンパク質を抽出するとともにＳｍａｄ７発現を評価するために用いた。残りの細胞を、よく洗い、ＨＬ−１を加えたＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、ＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）の存在及び非存在下で４８時間培養し、アポトーシスについて解析した。

フローサイトメトリーによるアポトーシスの解析
アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に続くフローサイトメトリーで解析した。

細胞を洗い、１５分間３７℃で５μｌのリボヌクレアーゼＡ（０．６μｇ／ｍｌ、３０〜６０Ｋｕｎｉｔｚ単位、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中でインキュベートし、氷で冷却した。ヨウ化プロピジウム（１００μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーによる解析の前に添加した。

Ｔ細胞を、特異的モノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ Ｌｔｄ．、英国ケンブリッジシャー）を用いて同定した。

タンパク質抽出とウエスタンブロット解析
ＬＰＭＣをホモジナイズして、全タンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍＭ ＥＧＴＡを含有する緩衝液Ａ中で抽出した。緩衝液に、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（全ての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）を補充した。

Ｓｍａｄ７タンパク質を特異的ウサギ抗ヒトＳｍａｄ７抗体（１：４００最終希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）を用いて解析した。西洋わさびペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）を１：２０．０００最終希釈で用いて、一次抗体結合を検出するとともに、免疫反応性を、化学ルミネセンスキットを使って可視化した（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）。

器官（ｏｒｇａｎ）培養
患者の外科的検体から取った粘膜外植片を、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ（配列番号４、配列番号５、両方とも最終濃度１０μｇ／ｍｌで用いた）の存在及び非存在下で４０時間培養した。

ネガティブコントロールとして、粘膜外植片を、Ｓｍａｄ７センスＯＤＮの存在下で培養した。

培養の終わりに、粘膜外植片を収集して、免疫組織化学による粘膜固有層Ｔリンパ球の数の解析のために用いた。

この目的のために、粘膜切片を調製して、モノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ）で染色した。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ）を、一次抗体結合を検出するために用いた。

結果
様々な実験において得られた結果は、どのようにＴＧＦ−β１が、正常な被験者の腸から単離されたＴリンパ球のアポトーシスを用量依存的に増大させたかを示す。

表１は、４８時間の培養の後のアポトーシスのＴリンパ球の百分率を示す。番号は、４名の正常な被験者の腸から単離されたＴ細胞が用いられた４つの別々の実験の結果のことである。

対照的に、４名のＩＢＤ患者から単離されたＴリンパ球は、４８時間の培養の後のアポトーシスのＴリンパ球の百分率を示す表２に表した結果に示されるようにＴＧＦ−β１誘導アポトーシスシグナルに対して部分的な抵抗性を示した。

特に、表２に示されるデータの解析から、ＩＢＤ患者からのＴ細胞を、０．２ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌのどちらかのＴＧＦ−β１濃度の存在下で培養した場合には、アポトーシスにおける意味のある増大は見られなかった。対照的に、ＩＢＤ患者からのＴ細胞への５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１による刺激は、アポトーシスにおいて若干の増大という結果になった。

表３に表したＴリンパ球の百分率値に示されるように、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列番号４によるＩＢＤ患者からのＴリンパ球の処置は、ＴＧＦ−β１に対する細胞応答性を修復し、増大した細胞アポトーシスという結果になった。データは、４つの別々の実験に対応しており、該実験では、４名のＩＢＤ患者の腸から単離されたＴ細胞を、培地だけで培養し（無刺激）、或いは培地とセンス（コントロール）又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとで一晩前処置し、その後にＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。

さらに、エキソビボの器官培養を用いて、本発明の発明者は、本発明によるＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮによるＩＢＤバイオプシーの処置が、粘膜ＣＤ３＋ Ｔ細胞の数をかなり減らすことを実証したが、その様子が、図１の免疫組織化学図に示されている。これは（ｌａｔｔｅｒ）、アンチセンスＯＤＮによる処置が粘膜ＣＤ３＋ Ｔ細胞の数を低減することを示す。

総合して、これらの観察は、高いＳｍａｄ７レベルが、Ｔ細胞の生存を延長することに重大な役割を果たしており、これによって、ＩＢＤにおける局所炎症の伝播に寄与するという可能性を示唆している。

このように、Ｓｍａｄ７をブロックすることは、これらの条件において粘膜炎症を制御するための有力な戦略を代表しうる。

ＴＮＢＳ誘導大腸炎の実験モデルにおけるＳｍａｄ７アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドの投与の効果に関するインビボ及びインビトロでの研究

材料と方法
全てのＳｍａｄ７アンチセンス及びセンスＯＤＮは、先に記述した標準的手法を使ってＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．ｒ．ｉ．（フィレンツェ）によって合成した。

用いられたアンチセンスＯＤＮは、ヒトとマウスの間で１００％の相同性を有するＳｍａｄ７ ｍＲＮＡ部位を標的とする。次に示すオリゴヌクレオチドの全てにおいて、ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート結合である。次に示す配列の全てが、実験的誘導大腸炎モデルで実行された実験において用いられた。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列番号１（５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣ−３’）は、本発明の発明者によって先の論文（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら、２００１年）において出版された実験の過程で既に用いられたヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的とする。

ＩＢＤ患者の腸から単離されたＬＰＭＣにおけるＴ細胞アポトーシスの制御におけるＳｍａｄ７の役割に関するさらなる研究のために、次に示すアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、配列番号４ ｅ、配列番号５を用いた。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＭｅＰＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＭｅＰＧ−３’（配列番号４）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的とする。これは、配列番号１の位置３及び１６のＣｐＧ対に属するシトシンが５−メチルシトシン（以下Ｍｅ−ｄＣとして指し示す）で置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。加えて、メチルホスホネート結合が該分子の末端に置かれた（ＭｅＰとして指し示す）。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣ−３’（配列番号５）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９４を標的とする。これに含まれるヌクレオシド間結合は、ホスポロチオエート（ｐｈｏｓｐｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合である。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴ−３’（配列番号６）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９６を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧ−３’（配列番号７）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９５を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＡＧＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号８）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位５７７を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＭｅＰＡＧＣＡＣＭｅｄＣＧＡＧＴＧＭｅｄＣＧＴＧＡＧＣＭｅＰ−３’（配列番号９）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位５７７を標的とする。これは、配列番号８の位置６及び１２のシトシンが５−メチルシトシンで置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。加えて、メチルホスホネート結合が、該分子の末端に置かれた。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＣＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＣ（配列番号１０）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２３３を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−Ｍｅ−ｄ ＣＧＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＭｅ−ｄ ＣＧ ＣＡＣ−３’（配列番号１１）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２３３を標的とする。これは、配列番号１０の位置１及び１４のシトシンが５−メチルシトシンで置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的とする。これは、配列番号１の位置３及び１６のＣｐＧ対に属するシトシンが５−メチルシトシン（Ｍｅ−ｄＣとして指し示す）で置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＧＡＴＣＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡ−３’（配列番号１３）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９９を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列５’−ＡＴＣＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１４）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位２９８を標的とする。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列ＭｅＰＧＴＭｅ−ｄＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＭｅ−ｄＣＧＣＡＭｅＰＧＣ（配列番号１５）は、ヒトＳｍａｄ７ ｍＲＮＡの部位４０３を標的とする。これは、配列番号１の位置３及び１６のＣｐＧ対に属するシトシンが５−メチルシトシン（Ｍｅ−ｄＣとして指し示す）で置き換えられた混合バックボーンオリゴヌクレオチドである。加えて、メチルホスホネート結合が、該オリゴヌクレオチドの末端の一方と、位置２０のグアニン残基とに置かれた。

大腸炎の誘導
５から６週齢オスＳＪＬ／Ｊマウスを特定病原体除去動物施設で保育した。大腸炎の誘導のために、３，５Ｆカテーテルを通じて、５０％エタノール中の２．５ｍｇのＴＮＢＳ（ｐＨ１．５〜２．０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を直腸に投与してマウスを軽く麻酔した。カテーテルの先端を肛門縁から４ｃｍ中へ挿入して、１００ｍｌの流体（ＴＮＢＳ／エタノール）を結腸にゆっくりと滴下注入した。

結腸及び盲腸の全体へのＴＮＢＳ分布を保証するために、マウスを、上記注入の後３０秒間、垂直位置に保った。マウスの幾つかには、同じ手法を用いて５０％エタノールのみを投与して、コントロールとして用いた。

大腸炎の組織学的評価
指し示された死亡の時刻にマウスから取り出した組織を、１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定し、パラフィンに包埋して、組織切片に切り、ヘマトシリンとエオシンで染色した。染色した切片を、リンパ球浸潤、陰窩の伸長及び又は歪み、明白な潰瘍形成、及び腸壁の肥厚の存在のような様々な判断基準を用いて大腸炎の証拠に関して調査した。

結腸の顕微鏡断面の炎症の程度を次のように０から４の段階で評価した。
０：炎症の証拠無し。
１：強拡大視野（ｈｐｆ＝強拡大視野）の＜１０％で浸潤が見られる低レベルのリンパ球浸潤であり、構造的変化は観察されない。
２：ｈｐｆの＜１０〜２５％で浸潤が見られる中程度のリンパ球浸潤であり、陰窩伸長、粘膜層を越えて広がってはいない腸壁肥厚。
３：ｈｐｆの＜２５〜５０％で浸潤が見られる高レベルのリンパ球浸潤であり、粘膜層を越えて広がる腸壁の肥厚。
４：ｈｐｆの＞５０％で浸潤が見られる顕著な程度のリンパ球浸潤であり、高い血管密度、歪みのある陰窩伸長、潰瘍形成のある全層性腸壁肥厚。

粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）の単離、及び細胞のＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮによる処置
粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を結腸検体から単離した。該検体をまず、カルシウムマグネシウム除去のＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗い、０．５ｃｍ片に切った。そして、それらを２回インキュベートした。各回は、ＥＤＴＡ（０．３７ｍｇ／ｍｌ）とジチオスレイトール（０．１４５ｍｇ／ｍｌ）とを含有するＨＢＳＳ中において３７℃で１５分間であった。その後、該組織を、３７℃の震盪インキュベータで、コラゲナーゼＤを含有するＲＰＭＩ（４００Ｕ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）とＤＮアーゼＩ（０．０１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）中で消化した。

該組織から放たれたＬＰＭＣを、１００％パーコール中で再懸濁し、４０％パーコール勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）下で層状に置き、１８００ｒｐｍで３０分間遠心して、濃縮リンパ球集団を得た。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮのインビトロ効力を評価するために、ＴＮＢＳ処置マウスから単離したＬＰＭＣを、２４ウェルプレート上で最終濃度１×１０^６個／ｍｌで血清置換試薬ＨＬ−１（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁した。アンチセンスＯＤＮの形質移入のために、２μｌのリポフェクタミン２０００試薬（ＬＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｔａｌｉａ ＳＲＬ、サンジュリアーノミラネーゼ）を、プロトコルに従って細胞培地の各１ｍｌに使用した。その後、２μｇ／ｍｌのアンチセンスＯＤＮとＬＦを混ぜて、室温で２０分間インキュベートした。得られた混合物を、その後、そのまま細胞に添加した。一晩の培養後、細胞を、プレートから取り出し、ウエスタンブロッティングによるＳｍａｄ７の解析に用いた。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮによるマウスの処置
ＴＮＢＳによる処置の２日後に、マウスの直腸に各Ｓｍａｄ７アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド１５０ｇを投与した。グループ毎に少なくとも５匹のマウスを調べた。５日目に、マウスを犠牲にして、腸全体の粘膜試料を取り、ウエスタンブロッティングでＳｍａｄ７及びＳｍａｄ３の含有に関して解析した。加えて、腸粘膜炎症程度実体を評価した。

タンパク質抽出とウエスタンブロット解析
粘膜固有層単核細胞と全結腸検体の両方を、上記手順を用いてホモジナイズした。そして、Ｓｍａｄ７発現をウエスタンブロッティングで明らかにした。

終わりに、ブロット膜を、商業的入手可能な溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてストリッピングして、同量のタンパク質が各ウェルに充填されていたことを検証するために抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブした。検出は、化学ルミネセンスキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。バンドの強度を濃度計によって解析した。

また、ＬＰＭＣと全結腸検体試料タンパク質の両方を、リン酸化及び全量のＳｍａｄ３タンパク質の含有に関して、特異的な商業的入手可能な抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。

リン酸化Ｓｍａｄ３の解析のために、リン酸化Ｓｍａｄ２／３タンパク質を抗原として認識することが可能な特異的なウサギ抗ヒト抗体（１：５００最終希釈）、及び西洋わさびペルオキシダーゼ結合したヤギ抗ウサギ抗体（１：２００００希釈）を用いた。免疫反応性を化学ルミネセンスキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。

検出の後で、ブロット膜を、商業的入手可能な溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてストリッピングして、特異的なヤギ抗ヒトＳｍａｄ３抗体（１：５００最終希釈）に続いて西洋わさびペルオキシダーゼに結合したウサギ抗ヤギ抗体（１：２００００希釈）でインキュベートし、その後、免疫反応性を、上記の化学ルミネセンスキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。

試験ＥＬＩＳＡ
活性ＴＧＦ−β１の量を腸粘膜試料において測定した。この趣旨のために、上記に指し示したＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患した又は罹患していないマウスからの粘膜試料から全タンパク質を抽出した。活性ＴＧＦ−β１のレベルを、商業的入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｃｅ Ｉｍｐｏｒｔ−Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｒｉ、ミラノ）を用いて解析した。光学濃度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００ＥＬＩＳＡリーダーで、波長４９０ｎｍで測った。データは、ｐｇ／全タンパク質１００μｇで表した。

結果
ＴＮＢＳを受けた後で、マウスは、大腸炎の誘導の証拠によって下痢と体重減少を示した。その結腸は肉眼的にも大きくなり、その粘膜の組織学的な解析は、中程度から重度の炎症性病変を示した。

ＴＮＢＳ大腸炎がＴＧＦ−β１の生産における変化と関連があるかどうかを調べるために、結腸の検体を、大腸炎に罹患した又は罹患していないマウスから取り、活性ＴＧＦ−β１の含有に関してＥＬＩＳＡによって解析した。

ＴＧＦ−β１を合成する潜在力を有する幾つかの細胞のタイプが腸レベルで存在するので、ＬＰＭＣだけではなく全体の腸粘膜を評価のために用いた。

大腸炎の非存在下で、低レベルの活性ＴＧＦ−β１が検出された（無刺激の及びコントロールのマウスそれぞれにおいて、全タンパク質中８５±１２及び９４±２６ｐｇ／μｇ）。有意に増大されたＴＧＦ−β１のレベルが、ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスからの粘膜試料において測定された（全タンパク質中９８５±１２０ｐｇ／μｇ）（ｐ＜０．０１）。この結果は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎の罹患中には、ＴＧＦ−β１活性の増大がありうることを示唆するよう見えるけれども、大腸炎に罹患したマウスから単離された腸ＬＭＰＣにおける活性Ｓｍａｄ３の細胞内レベルの解析は、驚くべきことに、Ｓｍａｄ７の増大された誘導に関連づけられるＳｍａｄ３のリン酸化の減少を見せる（図２と３）。特に、図２は、影響を受けていない腸から単離されたＬＰＭＣにおける活性（リン酸化）Ｓｍａｄ２／３に対応するが、ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスからのものではないバンドの存在を示す。図３では、２つのバンド、即ち、遊離のＳｍａｄ７に対応する下方の４７Ｋｄａバンド、及びＴＧＦ−β１ Ｒ１−Ｓｍａｄ７複合体に対応する上方１０２Ｋｄａバンドが、ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスの腸から単離されたＬＰＭＣ検体においてのみに存在することが示されている。これらのデータは、局所的炎症がＴＧＦ−β１の合成を刺激するが、これは、粘膜炎症を緩和することができないということを指し示す。

本発明によれば、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮによってＴＮＢＳマウスを処置するが、内因性のＴＧＦ−β１機能を修復し、進行中の炎症を制限することができるかどうかを評価した。

第１に、インビトロ及びインビボの両方の実験で上記のＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ（配列番号１と配列番号４〜１５）のＳｍａｄ７発現を低減する効力を試験した。

インビトロ実験については、ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスの腸から単離したＬＰＭＣにそれぞれのＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮを形質移入し、一晩インキュベートした。Ｓｍａｄ７解析を、ウエスタンブロッティングによって実行した。

インビボ実験については、ＴＮＢＳ処置マウスに、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮを投与し、３日後に、その動物を犠牲にし、組織検体を取り、Ｓｍａｄ７解析をウエスタンブロッティングによって実行した。

表４は、これらの実験の結果をまとめたもので、インビトロとインビボの両方の実験においてそれぞれのＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドによって得られた阻害百分率を示す。データは、４つの別々のインビトロ実験の平均±標準偏差（ＳＥＭ）及び５つの別々のインビボ実験の平均±ＳＥＭを指し示す。

全てのアンチセンスＯＤＮは、ＴＮＢＳ処置ネズミモデルから単離されたＬＰＭＣにインビトロで形質移入されると、Ｓｍａｄ７発現を低減することにおいて有効である。表４に示す阻害百分率の値の解析から、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列である配列番号４、１０、１１、１２及び１５が大きな効力を示したことは注目すべきことである。

にもかかわらず、オリゴヌクレオチド配列である配列番号１０と１１によるインビボで処置によって得られたＳｍａｄ７発現阻害の百分率は、記録されたインビトロ実験のそれと大きく異なることはなかった。

代わりに、アンチセンスＯＤＮ配列番号４及び１２及び１５によるマウスの処置は、明らかに、Ｓｍａｄ７阻害の百分率が、得られたインビトロ実験のそれよりも大きいという結果になった。即ち、それぞれ、５５％対３４％、４２％対３２％、５６％対３４％（Ｐ＜０．０１）であった。

対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号７によるマウスの処置は、インビボでのＳｍａｄ７発現における減少を引き起こしたが、これは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロでＬＰＭＣ内に形質移入させたときに結果として得られるものよりも低い実体のものであり、即ち、１０％対１７％、Ｐ＜０．０１であった。

全体に、これらの結果は、Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列への特定の修飾のみが、その薬物動態学的、生化学的且つ生物物理学的なプロフィールを向上させることができることを示唆する。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１及び配列番号４〜１５）を受けたマウスにおいては、いかなる急性毒性の兆しも記録されなかった。ＴＮＢＳで処置すると、５匹中１匹が３日後に死亡した（２０％）。類似して、Ｓｍａｄ７センスオリゴヌクレオチドを受けたマウスの１／５が、４日後に死亡した。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮ配列番号１及び配列番号４〜１５によって処置されたマウスの群では死亡は記録されなかった。

アンチセンスＯＤＮ配列である配列番号１３及び配列番号１４の使用は、合理的なインビトロ阻害活性（それぞれ１１％及び９．５％）と関連がある。にもかかわらず、そのような配列のインビボでの投与は、予想外に、大腸炎の著しい悪化を伴い、なんと、７２時間の処置の後に全てのマウスの死亡を引き起こした。

これらのマウスから取られた腸試料の肉眼による解析は、重度の大腸炎の存在を明らかにし、これは、腸でのＳｍａｄ７発現のかなりの増大と関連があった。

上に述べたように、進行中の炎症を制限するＳｍａｄ７アンチセンスＯＤＮの効力を試験した。この目的のために、大腸炎誘導後のマウスに、各群５匹を考慮して、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号１、４、５及び１５を投与した。

Ｓｍａｄ７アンチセンスＯＤＮによる処置に続いて、粘膜炎症の低減が明らかにされた。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド４及び１５で処置したマウスにおいて特に明白であった。確かに、アンチセンスを受けなかった大腸炎に罹患したマウスにおいて大腸炎の重症度合３〜４が、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列１又は５の投与後にはそれぞれ度合２又は３になり、一方で、オリゴヌクレオチド配列４又は１５で処置されたマウスにおいて炎症は度合１を超えていない。

Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドが、経口投与されたときにも有効であるかどうかを調べるために、ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスを、大腸炎の誘導の翌日に、Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド４又は１５又はコントロール（センス）で処置した。

この目的で、オリゴヌクレオチドを炭酸水素塩溶液に再懸濁した。各マウスに投与した該溶液の最終体積は３５０μｌであったが、これは、２５０又は５００又は１０００μｇに相当するオリゴヌクレオチドの用量を含有する。そのような溶液を、カテーテルを通じて経口的に投与した。

５日目に、マウスを犠牲にし、Ｓｍａｄ７発現の及び炎症度合の解析を前段落に指し示したように評価した。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したがコントロールのセンスオリゴヌクレオチドでは処置しなかったマウスの全ては、用いられていたオリゴヌクレオチドの用量に非依存的に、Ｓｍａｄ７発現の意味ある低減と、増大したＳｍａｄ３リン酸化とを示した。

実質的に、Ｓｍａｄ７阻害は、図４に示すように、体重回復と関連があった。図４は、Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）又はコントロール（センス）で処置した又は処置しなかったＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスの体重の百分率変化を表すグラフを示す。両方のオリゴヌクレオチドは、大腸炎誘導の２日後にカテーテルを通じて２５０μｇの用量で経口的に投与した。３つの群のそれぞれにおいて２日目に記録することができた重量減少は、ＴＮＢＳによる処置が大腸炎を誘導したことを指し示す。さらに、Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたがコントロールでは処置されなかったマウスは、４日目から体重回復を示したことが判明した。ＴＮＢＳ誘導大腸炎に罹患したマウスにおいて５日目に見られる見かけ上の僅かな回復は、大腸炎に罹患したマウスの２１．４％が４日目に死亡し、したがって、それらは５日目の体重の評価で考慮に入れられなかったという事実によるものである。

Ｓｍａｄ７阻害は、図５と６に示すように、組織炎症の著しい抑制と相関していた。図５は、ＴＮＢＳ大腸炎に罹患したマウスから及びＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）で処置したＴＮＢＳ大腸炎に罹患したマウスから摘出した結腸のイメージを示す。オリゴヌクレオチドは、大腸炎誘導後の２日目にカテーテルを通じて２５０μｇの用量で経口的に投与した。ＴＮＢＳ大腸炎に罹患したマウスからの結腸は、ひどい炎症で、短縮し、肥厚していることが示されている。逆に、Ｓｍａｄ７アンチセンスを受けたマウスは、正常な長さと厚さで、炎症の肉眼的兆しの無い結腸を示した。図６は、大腸炎に罹患していないマウスからの、或いはＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１５）又はコントロール（センス）で処置した又は処置しなかったＴＮＢＳ大腸炎に罹患したマウスからの結腸切片の組織学的な側面を示す。両方のオリゴヌクレオチドは、大腸炎誘導後の２日目にカテーテルを通じて２５０μｇの用量で経口的に投与した。大腸炎に罹患していないマウスでは、腺が、粘液分泌性の細胞と固有層の炎症要素との正常な含有量を持って均一に且つ直線的に見えることが示されている。逆に、コントロールのオリゴヌクレオチドを受けた又は受けなかったＴＮＢＳ処置マウスの結腸では、腺構造の全面的な破壊があり、固有層において粘液分泌性及び大量の炎症性細胞浸潤を伴っていた。ＴＮＢＳで処置され且つＳｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドを受けたマウスの大腸切片において、正常な腺構造の存在と炎症の不在とが実証された。

総合して、これらの観察から、アンチセンスＯＤＮの使用は、インビボ投与の後で、副作用を伴わないＳｍａｄ７阻害のより高度な効力を示すが、特に、そのような効力及び毒性の特性を、Ｓｍａｄ７インビトロ阻害において同じ効力を有する他のアンチセンスＯＤＮ配列で達成される結果と比べた場合、ＩＢＤ罹患中の粘膜炎症の制御において有望な治療戦略を代表しうることが示唆される。

（参考文献）

Claims (9)

1. 配列（配列番号４）：
   ５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’
   （上式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）
   を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、該アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の結合の少なくとも１つがホスフォロチオエート結合である、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 配列（配列番号１５）：
   ５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’
   （上式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）
   を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、該アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の結合の少なくとも１つがホスフォロチオエート結合である、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 配列（配列番号３）：
   ５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’
   （上式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートである）
   を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、該アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の結合の少なくとも１つがホスフォロチオエート結合である、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 下記の配列：
   ５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ−３’
   （上式中、Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートである）
   を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、該アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の結合の少なくとも１つがホスフォロチオエート結合である、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 医療分野での使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. １種又は複数の医薬的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤とともに、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを有効成分として含む、医薬組成物。
7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、Ｓｍａｄ７発現に関連する病態の治療用製剤。
8. 前記Ｓｍａｄ７発現に関連する病態が慢性炎症性疾患である請求項７記載の治療用製剤。
9. 前記慢性炎症性疾患がクローン病及び潰瘍性大腸炎である請求項８記載の治療用製剤。