ES2617200T3 - Procedimientos para supervisar la capacidad de respuesta al tratamiento anti-SMAD7 - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene enfermedad inflamatoria del intestino (EII) al tratamiento con al menos una terapia dirigida contra el homólogo 7 de mothers against decapentaplegic (anti-SMAD7), comprendiendo el procedimiento: determinar la cantidad de al menos una población celular seleccionadas entre el grupo que consiste en: linfocitos T Receptor de quimiocina 9 C-C+ (CCR9+) secuencia Forkhead P3+ (FoxP3+), linfocitos T CCR9+ Interferón-gamma+ (IFN-gamma+), linfocitos T CCR9+ interleucina-17A+ (IL17A+), linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-gamma y linfocitos T IL17A+, en al menos una muestra de sangre periférica obtenida del sujeto, en el que, mayores cantidades de la población celular de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, y/o menores cantidades de al menos una de las poblaciones celulares de linfocitos T CCR9+ IFN-gamma+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-gamma+ y linfocitos T IL17A+, en la al menos una muestra de sangre periférica con respecto a un nivel de control conocido de la al menos una población celular es predictivo de la capacidad de respuesta del sujeto que padece EII a la terapia dirigida contra SMAD7.

Description

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IFN-gamma+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+, respectivamente. Un sujeto se puede identificar como probablemente sensible, o sensible (por ejemplo, susceptible), al tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7 si se produce un aumento en la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3 en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el control, y/o si existe una disminución en las cantidades de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ en una muestra obtenida del sujeto, en comparación con el control.
Como alternativa, un sujeto se puede identificar como probablemente no sensible, o no sensible (por ejemplo, resistente), al tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7 si se produce una disminución en la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3+ en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el control, y/o si existe un aumento en las cantidades de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ en una muestra obtenida del sujeto, en comparación con el control.
En determinadas realizaciones, la cantidad de linfocitos T FoxP3+ CD103+, linfocitos T CD103+ y/o linfocitos T integrina α4β7+, también se puede medir. Los sujetos que son sensibles al tratamiento muestran una cantidad constante de estas poblaciones celulares durante el tratamiento, en comparación con los niveles anteriores al tratamiento.
En otras realizaciones, los procedimientos divulgados se pueden usar para determinar si es probable que un sujeto inicie una remisión tras padecer EII. Por ejemplo, se puede identificar que un sujeto inicie probablemente una remisión si se produce un aumento en la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3 en la muestra obtenida del sujeto, en comparación con el control, y/o si existe una disminución en las cantidades de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ en una muestra obtenida del sujeto, en comparación con el control.
Por comodidad de uso, algunos términos de la memoria descriptiva, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas, se recogen en esta sección.
Como se usa en el presente documento, "CCR9" (receptor 9 de quimiocina (motivo C-C) también conocida como CDw199, GPR-9-6, GPR28, CKR-9 C-C, receptor 28 acoplado a la proteína G) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 10803 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "FoxP3"(secuencia P3 de forkhead también conocida como JM2, AND, DIETER, IPEX, MGC141961, MGC141963, PIDX, XPID) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 50943 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "IFN-gamma" o "IFN-γ" (interferón gamma también conocida como IFNG, IFG, IFI) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 3458 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "IL17A" (interleucina 17A también conocida como CTLA8, IL-17, IL-17A, IL17, antígeno 8 asociado a linfocitos T citotóxicos; proteína 8 asociada a linfocitos T citotóxicos; serina esterasa 8 asociada a linfocitos T citotóxicos) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 3605 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "CD103" (antígeno CD103 también conocido como integrina, alfa e; antígeno 1 del linfocito de la mucosa, péptido alfa; HUMINAE, integrina alfa-IEL; integrina alfa-E; antígeno HML-1; y MGC141996) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 3682 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "a4β7" (integrina, alfa 4 beta 7 también conocida como subunidad beta del receptor de dirección intestinal ITGB7) significa el gen humano codificado por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 3695 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "SMAD7" (también conocido como CRCS3, FLJ16482, MADH7, MADH8, homólogo 7 de MAD (mothers against decapentaplegic, Drosophila), homólogo 8 de MAD, SMAD, homólogo 7 de madres contra DPP, homólogo 8 de madres contra DPP) significa la proteína humana codificada por el gen identificado por mediante el n.º ID Entrez Gene 4092 y variantes alélicas de la misma.
Como se usa en el presente documento, "Índice de actividad de la enfermedad de Crohn" o "CDAI" se refiere a una medida o índice utilizado para evaluar el progreso de los pacientes que padecen EC como se describe en Best y col., GASTROENTEROLOGY, 70:439-44 (1976). Puntuaciones CDAI de 150 o menores están generalmente asociadas con la enfermedad inactiva, y son indicativas de mejores pronósticos que puntuaciones más altas. Los valores mayores de 150 están generalmente asociados con una enfermedad más activa, y valores por encima de 450 están asociados con una enfermedad muy grave. Las puntuaciones CDAI se pueden utilizar para determinar lo bien que un paciente responde a un tratamiento, y se puede utilizar para identificar pacientes en remisión. En determinadas realizaciones, una respuesta clínica de referencia significa que el sujeto muestra una disminución en la puntuación CDAI de al menos 100 puntos. En un ensayo clínico, una puntuación de 150 o menos está generalmente asociada con
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la remisión.
Como se usa en el presente documento, "índice de actividad de la colitis ulcerosa" o "UCDAI" se refiere a una medida
o índice utilizado para evaluar el progreso de los pacientes que padecen CU como se describe en Sutherland y col., Gastroenterology, 92:1894-98 (1987). El UCDAI es una serie de calificadores relacionados con los síntomas de la CU incluyendo frecuencia de deposición, sangrado rectal, el aspecto del revestimiento del colon, y una puntuación del médico de la actividad de la enfermedad. Cada uno de estos calificadores recibe un número del 0 al 3, donde 3 es la actividad patológica más elevada. En un ensayo clínico, la remisión se define frecuentemente como una puntuación UCDAI de 1 o menos, y la mejora es una reducción en 3 o más puntos de la puntuación obtenida al principio del ensayo clínico. El UCDAI se puede utilizar en ensayos clínicos para determinar lo bien que un paciente responde a un tratamiento, y se puede utilizar para identificar pacientes en remisión. Otros índices habitualmente utilizados para medir la gravedad de la CU en pacientes incluyen los índices Truelove y Witts, el índice de St. Mark, el índice de actividad de colitis ulcerosa simple (SCCAI), el índice Lichtiger, la puntuación de síntomas de colitis ulcerosa (UCSS), y el índice de la clínica Mayo.
Como se usa en el presente documento, "respuesta" o "capacidad de respuesta" al tratamiento significa que un sujeto que tiene enfermedad de Crohn muestra: (a) una disminución en la puntuación CDAI, por ejemplo, una disminución en la puntuación CDAI de 20 puntos, 30 puntos, 40 puntos, 50 puntos, 60 puntos, 70 puntos, 80 puntos, 90 puntos, 100 puntos o más; (b) una puntuación CDAI de menos de 150; y/o (c) la inducción de la remisión. Con respecto a un sujeto con CU, "respuesta" o "capacidad de respuesta" al tratamiento significa que el sujeto muestra (a) una disminución en la puntuación UCDAI, por ejemplo, una disminución en la puntuación UCDAI de 1 punto, 2 puntos o más; (b) una puntuación CDAI de 1 o menos; y/o (c) la inducción de la remisión.
Terapia dirigida contra SMAD7
El tratamientos anti-SMAD7 incluye terapias dirigidas contra SMAD7 (por ejemplo, terapias de sentido contrario dirigidos contra SMAD7 y anticuerpos dirigidos contra SMAD7). Los oligonucleótidos de sentido contrario son secuencias de oligonucleótidos cortas complementarias del ARNm mensajero (ARNm), que codifica la proteína diana (por ejemplo, SMAD7). Las secuencias de oligonucleótidos de sentido contrario se hibridan con el ARNm produciendo un híbrido bicatenario que puede llevar a la activación de enzimas catalíticas ubicuas, tal como RNasa H, que degrada las hebras híbridas ADN/ARN evitando de esta forma la traducción de proteínas.
En determinadas realizaciones, un oligonucleótido de sentido contrario dirigido contra SMAD7 puede dirigirse al sitio de destino 403, 233, 294, 295, 296, 298, 299, y/o 533 (es decir, los nucleótidos 403, 233, 294, 295, 296, 298, 299, y 533, respectivamente) del ARNm humano SMAD7 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
En determinadas realizaciones, un oligonucleótido de sentido contrario se puede derivar del siguiente oligonucleótido de sentido contrario dirigido contra SMAD7 5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’ (SEQ ID NO: 3).
Se contempla en el presente documento que un oligonucleótido de sentido contrario dirigido a SMAD7 puede comprender una estructura mixta en la que los restos citosina de un par CpG se sustituye por una 5’-metilcitosina (abreviada como Me-dC). También se pueden situar enlaces metilfosfonato en los extremos 5’ y/o 3’ de un oligonucleótido de sentido contrario (abreviado como MeP).
Las terapias con un oligonucleótido de sentido contrario dirigido a SMAD7 incluyen, pero no se limita a 5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’ (SEQ ID NO: 4), en la que X es un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada entre el grupo que consiste en citosina y 5-metilcitosina o un nucleósido de 2’-O-metilcitosina, y en la que Y es un nucleótido que comprende una base nitrogenada seleccionada entre el grupo que consiste en guanina y 5-metilguanina o un nucleósido de 2’-O-metilguanina, siempre que al menos uno de los nucleótidos X o Y comprenda una base nitrogenada metilada;
5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’ (SEQ ID NO: 5), en la que X es 5-metil 2’-desoxicitidin 5’-monofosfato; 5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3’ (SEQ ID NO: 6), en la que X es 5-metil 2’-desoxicitidin 5’-monofosfato; 5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’ (SEQ ID NO: 7), en la que X es 5-metil 2’-desoxicitidin 5’-monofosfato y Z es metilfosfonato de 2’-desoxiguanosina; 5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’ (SEQ ID NO: 8), en la que X es 5-metil 2’-desoxicitidin 5’-monofosfato y Z es metilfosfonato de 2’-desoxiguanosina; 5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’ (SEQ ID NO: 9), en la que X es 5-metil 2’-desoxicitidin 5’-monofosfato. (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con números 7.807.818 y 6.159.697).
En una realización ilustrativa, la terapia dirigida contra SMAD7 de sentido contrario se puede formular en un transportador farmacéuticamente aceptable y se puede administrar por vía oral a un sujeto que padece EII.
Muestra de sangre
Se puede obtener una muestra de sangre periférica de un sujeto usando técnicas bien conocido en la materia. Las muestras de sangre pueden incluir células mononucleares de sangre periférica (PMBC) o sangre completa con agotamiento de RBC. PBMC se puede aislar a partir de muestras de sangre completa usando procedimientos de
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centrifugación con densidad diferente (por ejemplo, gradiente de densidad en Ficoll). Por ejemplo, sangre completa (por ejemplo, sangre completa anticoagulada) se distribuye sobre el medio de separación y se centrifuga. Al finalizar la etapa de centrifugación, las siguientes capas aparecen a la vista, observadas de arriba abajo: plasma/plaquetas, PBMC, medio de separación y eritrocitos/granulocitos. La capa PBMC se puede recoger y lavar para eliminar contaminantes.
Muestra de tejido
Una muestra de tejido de un sujeto (por ejemplo, una muestra de tejido obtenida del intestino delgado y/o del intestino grueso de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que padece EC o CU), se puede usar como fuente de células, fuente de ARN, fuente de proteínas, o una fuente de secciones finas para inmunohistoquímica (IHQ) para medir la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ en la muestra. La muestra de tejido se puede obtener usando instrumentos y procedimientos de biopsia convencionales. La biopsia endoscópica, la biopsia con escisión y la biopsia con incisión son ejemplos de procedimientos médicos reconocidos que puede usar el experto en la técnica para obtener muestras de tejido gastrointestinal. La muestra de tejido debe ser lo suficientemente grande como para proporcionar un número suficiente de células, ARN, proteína, o secciones finas para medir el nivel de expresión del gen marcador (por ejemplo, CCR9, FoxP3, IFN-γ, y/o IL17A) o visualizar las células individuales mediante citometría de flujo, IHC, o ELISA, por ejemplo, el nivel de expresión de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o IL17A+.
La muestra de tejido puede estar en cualquier forma suficiente para clasificación celular, extracción de ARN, extracción de proteínas, o preparación de secciones finas. De acuerdo con ello, la muestra de tejido puede ser reciente, estar conservada mediante técnicas criogénicas adecuadas, o conservada mediante técnicas no criogénica. Un procedimiento normalizado para manipular especímenes de biopsia clínica es fijar la muestra de tejido en formalina y, a continuación, incluirla en parafina. Las muestras de esta forma se conocen normalmente con tejido fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE). Las técnicas adecuadas de preparación de tejidos para análisis posterior son bien conocidas del experto en la técnica.
Citometría de flujo
Las poblaciones de células se pueden clasificar en función de marcadores superficiales mediante citometría de flujo (por ejemplo, análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACTS)). Los procedimientos para clasificar y contar células mediante análisis FACS están bien descritas y son conocidas del experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Robinson "Current Protocols in Cytometry" John Wiley & Sons Inc., Nueva York. En general, las células obtenidas a partir de una muestra de sangre se pueden preparar en una suspensión monocelular. A continuación las muestras se marcan con una etiqueta fluorescente (por ejemplo, un anticuerpo marcado de forma fluorescente con un marcador de la superficie celular presente en la población o poblaciones de células a identificar). La fluorescencia puede ser un director indirecto. Para la fluorescencia directa, una etiqueta fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, u otro fluorocromo) está unido covalentemente unido a un anticuerpo primario. Para la fluorescencia indirecta, el anticuerpo primario que se une a un marcador presente en la superficie celular no está mercado con una etiqueta fluorescente. El anticuerpo primario se une a la superficie de la célula de la población celular diana. El anticuerpo no unido se elimina en un paso de lavado. Se añade un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente que se une al anticuerpo primario, y cualquier anticuerpo no unido se elimina en un paso de lavado.
El análisis FACS se puede llevar a cabo sobre células vivas o fijadas. Los instrumentos FACS están disponibles para los expertos en la técnica e incluyen FACScan, FACStar Plus, y FACSCaIibur (Becton-Dickinson). Programas informáticos de análisis FACS están disponibles para los expertos en la técnica e incluyen FlowJo, CeIIQuest Pro (Becton-Dickinson), y WinMDI (interfaz de documento múltiple de Windows para citometría de flujo).
Un experto en la técnica apreciará que el análisis FACS se puede llevar a cabo con un solo anticuerpo o con múltiples anticuerpos para identificar, contar, y clasificar diferentes poblaciones celulares. Por ejemplo, se puede detectar una marca de población celular y clasificarse a partir de las células que no expresan el marcador especificado (por ejemplo, se pueden identificar poblaciones de linfocitos T FoxP3+ mediante un anticuerpo específico de FoxP3; se pueden identificar poblaciones de linfocitos T IFN-γ+ mediante un anticuerpo específico de IFN-γ; y se pueden identificar poblaciones de linfocitos T IL17A+ mediante un anticuerpo específico de IL17A).
Un instrumento FACS provisto de múltiples láseres y detectores de fluorescencia permite el uso de etiquetas de anticuerpos múltiples y pueden identificar con precisión una población de células diana. Para conseguir la detección, las células se pueden marcar con múltiples anticuerpos, cada uno de ellos marcados con una etiqueta fluorescente diferente. Por ejemplo, una muestra de sangre se puede marcar simultáneamente con un anticuerpo de ratón marcado con APC dirigido contra CCR9 humana y un anticuerpo marcado con PE dirigido contra FoxP3 humana para la detección de poblaciones de linfocitos T CCR9+ FoxP3+.
Los anticuerpos ilustrativos que se pueden usar para determinar poblaciones de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, poblaciones de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, y/o poblaciones de linfocitos T CCR9+ IL17A+ mediante análisis FACS incluyen anticuerpos con marca fluorescente dirigidos contra CCR9 humana, tales como anticuerpo de ratón marcado
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lavan y se bloquean con una proteína no específica como la albúmina de suero bovino entre etapas. Las muestras se pueden contrateñir con hematoxilina y/o eosina.
Los anticuerpos dirigidos contra CCR9 adecuados para IFIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra CCR9 humana de Enzo Life Sciences (número de catálogo ALX-210-847-C200), un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CCR9 humana de GenWay Biotech (número de catálogo 18-461-10269-0.05 ml), un anticuerpo CCR9 de Novus Biologicals (número de catálogo NBP1-44201), y un anticuerpo policlonal de ratón dirigido contra CCR9 humana de R&D Systems (número de catálogo MAB179).
Los anticuerpos dirigidos contra FoxP3 adecuados para IFIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra FoxP3 de Abbiotec (número de catálogo 250655), un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra FoxP3 humana de Abgen (número de catálogo AF1438a), un anticuerpo policlonal de ratón dirigido contra FoxP3 humana de LifeSpan BioSciences (número de catálogo LS-C51576-40), y un anticuerpo policlonal de ratón dirigido contra FoxP3 humana de MBL International (número de catálogo M120-3).
Los anticuerpos dirigidos contra IFN-gamma adecuados para IFIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IFN-gamma de Abbiotec (número de catálogo 250707), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IFN-gamma humana de BioLegend (número de catálogo 506512), un anticuerpo monoclonal de cabra dirigido contra IFN-gamma humana de R&D Systems (número de catálogo AF-285-NA), y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IFN-gamma humana de Cell Sciences (número de catálogo CP2008).
Los anticuerpos dirigidos contra ILI7A adecuados para IFIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IL17A humana de Proteintech Group (número de catálogo 13082-1-AP) y un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra IL17 humana de R&D Systems (número de catálogo AF-317-NA).
Los anticuerpos dirigidos contra CD103 adecuados para IFIC están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal E de ratón dirigido contra integrina alfa humana de Abeam (número de catálogo ab33266) y un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra CD103 humana de AbD Serotec (número de catálogo P38570).
Los anticuerpos dirigidos contra integrina α4β7 están comercialmente disponibles de BD Biosciences.
Enzimoinmunoanálisis de adsorción
En algunas realizaciones, las poblaciones de células se pueden identificar mediante enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Específicamente, linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ de una población de células dada se puede determinar mediante, por ejemplo, un ELISA celular. Por ejemplo, someter a ensayo una población de linfocitos CCR9+ FoxP3+ mediante ELISA requiere al menos un anticuerpo contra una proteína CCR9, por ejemplo, al menos un anticuerpo contra CCR9, al menos un anticuerpo dirigido contra una proteína FoxP3, por ejemplo, al menos un anticuerpo contra FoxP3, y/o al menos un anticuerpo secundario, por ejemplo, al menos un anticuerpo secundario marcado. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo dirigido contra CCR9 y el anticuerpo dirigido contra FoxP3 puede estar no marcados o bien estar marcados con etiquetas diferentes, por ejemplo, diferentes etiquetas fluorescentes. En determinadas realizaciones, el anticuerpo dirigido contra CCR9 y el anticuerpo dirigido contra FoxP3+ son anticuerpos diferentes, por ejemplo, ratón, rata, un conejo, etc., así, permitiendo la detección diferencial mediante anticuerpos secundarios marcados, por ejemplo, fluorescentes o unidos a enzimas.
La realización de una prueba ELISA, por ejemplo, un ELISA celular, requiere al menos un anticuerpo de captura, al menos un anticuerpo de detección, y/o al menos un anticuerpo secundario unido a una enzima o marcado fluorescente. Por ejemplo, someter a ensayo una población de linfocitos CCR9+ FoxP3+ mediante la prueba ELISA celular puede requerir un anticuerpo policlonal dirigido contra CCR9 como el anticuerpo de captura. El anticuerpo policlonal dirigido contra CCR9 se inmoviliza sobre un soporte sólido tal como una placa de microtitulación de poliestireno. Las células obtenidas a partir de una muestra de sangre se añaden a continuación, y se deja formar el complejo con el anticuerpo unido. Las células no unidas se eliminan con un lavado. Un anticuerpo de detección, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra FoxP3, se añade a lo anterior y se deja unir a las células. El anticuerpo de detección está unido a una enzima, de forma tanto directa como indirecta, por ejemplo, mediante un anticuerpo secundario que reconoce específicamente el anticuerpo de detección. Normalmente, entre cada una de las etapas, la placa, con las células unidas, se lava con un tampón de lavado, por ejemplo, una solución detergente suave. Los protocolos ELISA también incluyen una o más etapas de bloqueo, que implican el uso de una proteína de unión no específica tal como una albúmina de suero bovino para bloquear la unión no específica de reactivos proteicos a la placa. Tras una etapa de lavado final, la placa se revela mediante la adición de un sustrato enzimático adecuado, para producir una señal visible, que indica la cantidad de linfocitos CCR9+ FoxP3+ de la muestra. El sustrato puede ser, por ejemplo, un sustrato cromogénico o un sustrato fluorogénico.
Los procedimientos ELISA, los reactivos y los equipos, son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles.
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Están comercialmente disponibles muchos anticuerpos dirigidos contra CCR9 adecuados para ELISA, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal dirigido contra CCR9 de Abeam (número de catálogo ab38567), un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra CCR9 humana de Enzo Life Sciences (número de catálogo ALX-210-847-C200), y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CCR9 humana de Novus Biologicals (número de catálogo H00010803-D01P).
Están comercialmente disponibles muchos anticuerpos dirigidos contra FoxP3 adecuados para ELISA, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra FoxP3 de Abbiotec (número de catálogo 250655), un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra FoxP3 humana de Abgen (número de catálogo AF1438a), y un anticuerpo policlonal de ratón dirigido contra FoxP3 humana de LifeSpan BioSciences (número de catálogo LS-C82119-100).
Están comercialmente disponibles muchos anticuerpos dirigidos contra IFN-gamma adecuados para ELISA, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IFN-gamma de Abbiotec (número de catálogo 250707), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IFN-gamma humana de BioLegend (número de catálogo 507502), y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IFN-gamma humana de Cell Sciences (número de catálogo CP2008).
Los anticuerpos dirigidos contra IL17A adecuados para ELISA están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IL17A humana de Proteintech Group (número de catálogo 13082-1-AP) y un anticuerpo monoclonal de cabra dirigido contra IL17A humana de R&D Systems (número de catálogo MAB317).
Los anticuerpos dirigidos contra CD103 adecuados para ELISA están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, un anticuerpo E de conejo dirigido contra integrina alfa humana de Novus Biologicals (número de catálogo 36520002).
Los anticuerpos dirigidos contra integrina α4β7 están comercialmente disponibles de BD Biosciences.
En otra realización, la cantidad de una población de células se determina clasificando las células mediante citometría de flujo y midiendo a continuación la cantidad de ARN que codifica al menos un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en CCR9, FoxP3, IFN-gamma, e IL17A a partir de la población clasificada. Los procedimientos para el aislamiento y cuantificación del ARN son bien conocidos en la técnica.
Muestras de control
Una muestra de control puede incluir una muestra de sangre obtenida del sujeto antes del tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7. La muestra de control proporciona un nivel inicial para seguir la evolución de un sujeto en tratamiento. Una muestra de control se puede obtener del sujeto el mismo día en que se administra por primera vez la terapia dirigida contra SMAD7 (por ejemplo, el Día 1 de un régimen de tratamiento). En otras realizaciones, una muestra de control se puede obtener del sujeto al menos un día antes de iniciar una terapia dirigida contra SMAD7 (por ejemplo, el Día 0 de un régimen de tratamiento). Como alternativa, una muestra de control se puede obtener de un sujeto 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o más antes de iniciar una terapia dirigida contra SMAD7. Por ejemplo, la regulación en exceso o defecto de determinadas muestras celulares se puede medir antes del tratamiento (por ejemplo, una muestra del control), durante el tratamiento, y/o después del tratamiento para seguir la respuesta del sujeto al tratamiento, por ejemplo, una terapia dirigida contra SMAD7.
En algunas realizaciones, se puede establecer un nivel de control para un sujeto basándose en la vigilancia a largo plazo de determinadas poblaciones de células en el sujeto. En tales casos, se contempla que un sujeto puede someterse a varios ciclos de tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7. La cantidad de una determinada población de células detectada después de múltiples ciclos de tratamiento se puede comparar con un nivel de control anterior para el sujeto para determinar si el sujeto ha respondido al tratamiento y/o es probable que responda a un tratamiento posterior con una terapia dirigida contra SMAD7. En otras realizaciones, se puede establecer un nivel de control o inicial para un sujeto basándose en una medición promedio de una determinada población de células determinada a partir de múltiples muestras iniciales obtenidas con el tiempo (por ejemplo, obtenidas durante varias semanas, meses, o años). De acuerdo con ello, cualquier prueba o ensayo realizado como se divulga en el presente documento se puede comparar con un nivel de control anterior o establecido, y puede que no sea necesario obtener una nueva muestra de control de un sujeto para la comparación, por ejemplo, si el sujeto está recibiendo más de un ciclo de tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7.
Interpretación de datos
La capacidad de respuesta de un sujeto al tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7 se puede interpretar con respecto a la muestra del control obtenida del sujeto antes del tratamiento. un sujeto se puede identificar como sensible al tratamiento (por ejemplo, susceptible o con respuesta probable) al tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7 si se produce un aumento en la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3+ en la muestra obtenida del sujeto, o una disminución en las cantidades de linfocitos T CCR9+ IFN-gamma+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+ y/o linfocitos T IL17A+ en la muestra obtenida del sujeto, en comparación con la muestra
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del control. La muestra se puede obtener en el día 8 o posterior al inicio de la terapia para determinar la capacidad de respuesta al tratamiento. En algunas realizaciones, la muestra se puede obtener a 28, 56, y/o 84 días y/o más. En otras realizaciones, la muestra se puede obtener después del día 8, por ejemplo, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, y/o un año o más después del inicio de la terapia para controlar la capacidad de respuesta al tratamiento.
Como alternativa, un sujeto se puede identificar como resistente al tratamiento (por ejemplo, incapacidad de respuesta
o sin respuesta probable) al tratamiento con una terapia dirigida contra SMAD7 si se produce una disminución en la cantidad de linfocitos T CCR9+ FoxP3+ en la muestra obtenida del sujeto, o un aumento en las cantidades de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, y/o linfocitos T CCR9+ IL17A+ en la muestra obtenida del sujeto, en comparación con la muestra del control. La muestra se puede obtener en el día 8 o posterior al inicio de la terapia para determinar la resistencia al tratamiento. En algunas realizaciones, la muestra se puede obtener el día 28, 56, 84 o más días después del tratamiento inicial. En otras realizaciones, la muestra se puede obtener después del día 8, por ejemplo, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, y/o un año o más después del inicio de la terapia para controlar la capacidad de respuesta al tratamiento.
Kits de ensayo
Se describe un kit de ensayo que comprende determinados componentes para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento. Un kit de ensayo puede aumentar la comodidad, velocidad y reproducibilidad del comportamiento de los ensayos divulgados. Por ejemplo, un kit de ensayo basado en FACS ilustrativo puede incluir anticuerpos para identificar, clasificar, y contar células, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra CCR9, anticuerpos dirigidos contra FoxP3, anticuerpos dirigidos contra anti-IFN y/o anticuerpos dirigidos contra anti-IL17A. El kit de ensayo puede contener no solamente anticuerpos, sino también tampones, reactivos e instrucciones detalladas para identificar, clasificar, y contar células, usando tecnología FACS. El kit puede incluir también un protocolo de ensayo y todos los componentes fungibles necesarios para el ensayo, salvo la muestra o muestras de células y tejidos.
un kit de ensayo basado en IHC ilustrativo puede contener materiales para determinar las poblaciones celulares mediante IHC. Un kit de IHC, por ejemplo, puede contener un anticuerpo primario dirigido contra una proteína CCR9, por ejemplo, un anticuerpo de ratón dirigido contra CCR9 humana, y un anticuerpo primario dirigido contra una proteína FoxP3, por ejemplo, un anticuerpo de ratón dirigido contra FoxP3 humana, y un anticuerpo secundario conjugado con una enzima indicadora, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. El kit de ensayo puede contener no solamente anticuerpos, sino también tampones, reactivos e instrucciones detalladas para identificar, poblaciones celulares usando tecnología IHC.
un kit de ensayo basado en ELISA ilustrativo puede contener materiales para determinar las poblaciones celulares mediante ELISA. Un kit para prueba ELISA celular, por ejemplo, puede contener un anticuerpo de captura dirigido contra una proteína CCR9, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CCR9 humana, y un anticuerpo de detección contra una proteína FoxP3, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra FoxP3 humana, y/o un anticuerpo secundario conjugado con una enzima indicadora, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. En otras realizaciones, el kit de ensayo contiene no solamente anticuerpos, sino también tampones, reactivos e instrucciones detalladas para identificar poblaciones celulares usando la tecnología ELISA.
Ejemplos
La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos. Los ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos, y no deben considerarse como limitantes del alcance o el contenido de la invención en forma alguna.
Ejemplo 1: Ensayo Clínico en fase I para evaluar la seguridad y eficacia de un tratamiento con una molécula de sentido contrario dirigida contra SMAD7 en pacientes con EC
Quince pacientes con EC activa se inscribieron en un ensayo clínico en fase I para evaluar la seguridad y eficacia de una terapia con una molécula de sentido contrario dirigida contra SMAD7 para el tratamiento de la EC. Los pacientes se seleccionaron inicialmente entre un grupo de 21 solicitantes y los inscritos se asignaron a una de tres cohortes de igual tamaño (Fig. 2). No había diferencias significativas en las características demográficas o clínicas entre los pacientes inscritos. Sin embargo, los pacientes de la cohorte 1 tenían una duración de la enfermedad más prolongada, en comparación con los pacientes de las otras dos cohortes, y los pacientes de las cohortes 1 y 2 se habían sometido con mayor frecuencia a resección intestinal en comparación con los pacientes de la cohorte 3 (Fig. 3). Los pacientes recibieron 40 mg/día (N= 5; Cohorte I); 80 mg/día (N=5; Cohorte 2); o 160 mg/día (N=5; Cohorte 3) de GED-0301, un oligonucleótido de sentido contrario Smad7 (GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC, en la que X es 5-metil-2’-desoxicitidin 5’ monofosfato (5-Me-dC) (SEQ ID NO: 6)) durante 7 días.
Los pacientes que cumplen todos los criterios siguientes fueron candidatos para su inclusión: 1.) Consentimiento informado por escrito, firmado y fechado personalmente por el paciente antes de cualquier procedimiento relacionado con el estudio; 2.) Pacientes de sexo masculino o femenino entre 18-45 años de edad; 3.) Pacientes femeninas no en edad fértil; las pacientes femeninas en edad fértil con un resultado negativo en la prueba de embarazo durante la sección inicial, y que utilicen un procedimiento anticonceptivo eficaz durante el estudio; 4.) Los pacientes con EC activa en el momento de la visita de selección, definida como una puntuación CDAI >220 y <400 durante al menos una
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semana antes de la inscripción; 5.) EC limitada al íleon final y/o colon derecho; 6.) sin tratamiento con anti TNF-α, otras sustancias biológicas, inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina, metotrexato), en los 90 días anteriores a la inscripción; 7.) Pacientes con resistencia a esteroides o corticodependencia; y 8.) Capacidad para comprender y cumplir con los procedimientos y restricciones del estudio.
Los sujetos se excluyeron del estudio si cumplían alguno de los siguientes criterios: 1.) Mujeres embarazadas o lactantes; 2.) Pacientes con EC en estómago y/o intestino delgado proximal, o pacientes con lesiones confinadas al colon transversal y/o izquierdo; 3.) Uso en los 90 días anteriores a la primera dosis de inmunomoduladores y sustancias biológicas (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina, metotrexato, infliximab, adalimumab natalizumab); 4.) Presencia de complicaciones locales (por ejemplo, abscesos, estructuras y fístulas), displasias y neoplasias, y manifestaciones extraintestinales; 5.) Dilatación endoscópica con globo anterior, estricturaplastia o resección quirúrgica de constricciones por EC; 6.) Pacientes sometidos a proctocolectomía; 7.) Cualquiera de las siguientes alteraciones en valores de laboratorio: APTT > 1,5 x límite superior normal del laboratorio clínico (ULN); recuento de plaquetas <100.000/mm3; creatinina sérica >1,5 x ULN; bilirrubina total >1,5 x ULN (salvo el síndrome de Gilbert); AST y ALT >1,5 x ULN; intervalo QTc >450 ms para hombres y >470 ms para mujeres; 8.) Antecedentes médicos actuales
o relevantes de enfermedad física o psiquiátrica grave, severa o inestable (aguda o progresiva), incluidas las infecciones, neoplasias, trastornos médicos que pueden requerir tratamiento (por ejemplo, insuficiencia renal o hepática) o que hace que el sujeto probablemente no pueda completar el estudio en su totalidad, o cualquier dolencia que suponga un riesgo indebido derivado de la medicación o los procedimientos del estudio; 9.) Pacientes que fuman
o que consumen productos de tabaco de cualquier otra forma; 10.) Antecedentes de alcoholismo o drogodependencia en el último año; 11.) Pacientes que presentan potencialmente poca fiabilidad (por ejemplo, alteraciones mentales); 12.) Hipercapacidad de respuesta conocida a oligonucleótidos o cualquier ingrediente de los productos del estudio; 13.) Pacientes que usaron otro agente en investigación, o que participaron en un ensayo clínico en los 12 meses anteriores a la aleatorización.
La seguridad del GED-0301 se evaluó diariamente teniendo en cuenta los siguientes puntos: exploraciones físicas, peso corporal (kg), signos vitales (presión arterial sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, temperatura corporal), ECG (12 puntas), recopilación de EA y EAG. Las muestras de sangre se analizaron para determinar: hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, recuento de glóbulos rojos, recuento de glóbulos blancos, total y diferencial, MCH, recuento de plaquetas, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, creatinina, BUN, glucosa, ácido úrico, proteínas, bilirrubinas, fosfatasa alcalina, CPK, AST, ALT, γ-GT, Na, K, colesterol y triacilglicéridos, activación del complemento (mediante la supervisión de BB, C5a y C3a). También se realizó un análisis de orina (pH, cetonas, leucocitos, proteína, glucosa, exploración citobacteriológica).
No se observaron anomalías en los valores de laboratorio ni cambios en los signos vitales de ningún paciente durante el estudio. No se documentó un aumento significativo en los niveles séricos de los factores del complemento. Todas las muestras de las tres cohortes proporcionaron valores por debajo del límite de cuantificación inferior, salvo una muestra de un solo paciente de la cohorte 1 (paciente 5, día 7, 6 horas), que proporciona un resultado de 11,2 ng/ml de GED0301.
No se registraron eventos adversos graves. Se registraron veinticinco efectos adversos (EA) en 11 pacientes, y los eventos más normales se calificaron como leves (Fig. 4). Los investigadores clasificaron los EA como no relacionados con el tratamiento en 14 (56 %) de los casos. Once de estos 14 EA, incluidas anomalías en valores de laboratorio, se registraron en 8 pacientes antes de la administración del fármaco. Se consideró que era improbable que los EA estuvieran relacionados con el fármaco del estudio en 12 casos (48 %), y probablemente relacionados con el fármaco del estudio en un caso (4 %). Este fue un aumento en el recuento ter triacilglicéridos séricos durante la administración del fármaco del estudio. No se apreció una relación aparente entre la dosis y la respuesta en los EA derivados del tratamiento. Un paciente de la cohorte 2 tuvo una leve recaída de la enfermedad en el día 84, mientras que otro paciente de la cohorte 3 experimentó dos episodios de dolor abdominal y vómitos, que requirieron tratamiento diario con esteroides. Un paciente tratado con 80 mg/día experimentó una elevada presión diastólica en el día 1, pocos minutos después de la administración de GED0301 y una inversión de la onda T (en puntas precordiales) el día 84. Después de un cuidadoso examen por cardiólogos, ambos EA se consideraron secundarios al tratamiento con budesonida recibido por el paciente durante los últimos meses. El día 31 un paciente con antecedentes de enfermedad alérgica registró una rinitis alérgica. Este EA se resolvió muy rápidamente después de la administración de un compuesto antihistamínico.
Un comité de seguridad independiente (con experiencia en toxicología, farmacovigilancia y enfermedad inflamatoria del intestino clínica) se reunió para supervisar y evaluar los parámetros de seguridad. También se tomaron muestras de sangre el día 1 y el día 7 a las 0, 2, 6, 12 y 24 horas después de la dosificación, para análisis farmacocinético y aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La eficacia del tratamiento se estableció mediante la evaluación en diferentes puntos temporales (por ejemplo, día 8, 28, 60, y 90) el número de pacientes que cumplieron los criterios de remisión (CDAI <150) o consiguieron una respuesta clínica definida como una disminución de 70 puntos
o más, desde el valor inicial de la puntuación CDAI.
Ejemplo 2: SMAD7 se expresa en los folículos del intestino humano y en las placas de Peyer
Se dispuso de muestras intestinales de cuatro pacientes de EC que se han sometido a resección quirúrgica de la
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enfermedad crónicamente activa y que respondieron mal al tratamiento médico. Estas muestras se usaron para el análisis de SMAD7 por inmunohistoquímica.
Se cortaron secciones de tejido de pacientes con EC, se desparafinizaron, y se deshidrataron en xileno y etanol. Con el fin de la recuperación del antígeno, los cortes se incubaron en un horno microondas durante 10 minutos en tampón citrato 0,01 M, pH 6. Para bloquear la peroxidasa endógena, los cortes se incubaron a continuación en H2O2 al 2 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. La incubación con un anticuerpo de ratón dirigido contra SMAD7 humana se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar con suero salino tamponado con Tris, los cortes se incubaron con un anticuerpo de conejo dirigido contra el anticuerpo de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células inmunorreactivas se visualizaron mediante adición de diaminobenzadina como sustrato, y se contratiñeron levemente con hematoxilina. Como control negativo los cortes de tejido se procesaron usando antisuero de conejo normal purificado en lugar del anticuerpo primario contra SMAD7.
Estos estudios mostraron que SMAD7 se expresa en los folículos del intestino humano y en las placas de Peyer (Fig. 5). Estas observaciones sugieren que la regulación por defecto o la inactivación génica de SMAD7 con la SEQ ID NO: 6 puede permitir que TGF-beta 1 actúe en dichas estructuras, así, reduciendo la fracción de linfocitos T que expresan citoquinas inflamatorias (por ejemplo, IFN-gamma) y mejorando el porcentaje de linfocitos T reguladores (que se denominan en el presente documento como Tregs).
Ejemplo 3: El tratamiento con un oligonucleótido de sentido contrario dirigido contra SMAD7 modula la expresión de citoquinas inflamatorias en linfocitos T cultivados
Se investigó el efecto de GED0301 sobre la expresión de citoquinas inflamatorias en linfocitos positivos para CCR9. Para determinar el efecto de la exposición a GED0301 en linfocitos positivos para CCR9, PBMC, aisladas de cinco pacientes con EC activa corticodependiente que no estaban inscritos en el ensayo clínico, se suspendieron en medio de cultivo sin suero X-vivo (Lonza, Verviers, Bélgica), suplementado con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml), y cultivado en presencia o ausencia de oligonucleótido contra Smad7 de sentido contrario (GED0301) o de sentido directo (2 μg/ml) durante 48 horas. Los oligonucleótidos contra Smad7 tanto de sentido directo como de sentido contrario se combinaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para facilitar la transfección eficaz de las células cultivadas. Las células se tiñeron y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos dirigidos contra CCR9, β7, IFN-γ, e IL17A para determinar el porcentaje de linfocitos T que expresan bien IFN-γ o IL17A en las poblaciones CCR9+ o β7+ en cada condición de tratamiento.
La expresión de IFN-γ e IL17A en las poblaciones CCR9+ and β7+ de las PBMC cultivadas anteriores se analizó para determinar si GED0301 inhibe directamente la expresión de citoquinas inflamatorias en linfocitos CCR9+. El tratamiento de las PBMC con EC con GED0301 (Smad7 de sentido contrario) redujo significativamente los porcentajes de linfocitos CCR9+ que expresan IFN-γ e IL-17A (Fig. 6A), mientras que la fracción de linfocitos T β7+ que expresan citoquinas permanece inalterada (Fig. 6B). Por ejemplo, el porcentaje de linfocitos CCR9+ que expresan IFN-γ fue 78,9 ± 7,3 en las células no tratadas; 78,3 ± 7,3 en las células tratadas con la hebra de sentido directo; y 54 ± 7,2 en las células tratadas con GED0301. De manera similar, el porcentaje de linfocitos CCR9+ que expresan IL-17A fue 77,4 ± 7,3 en las células no tratadas; 74,3 ± 6,4 en las células tratadas con la hebra de sentido directo; y 53,9 ± 5,7 en las células tratadas con GED0301. Por el contrario, los porcentajes de linfocitos β7+ que expresan IFN-γ no tratados, tratados con la hebra directa, y con GED0301 fueron 13,1 ± 1,2; 11,7 ± 0,7, y 11 ± 0.8, respectivamente, y los porcentajes de linfocitos β7+ que expresan IL-17A no tratados, tratados con la hebra directa, y con GED0301 fueron 12,1 ± 1,5; 10,4 ± 1,2, y 10,6 ±1,1. Por lo tanto, la exposición directa de PBMC de EC cultivadas CCR9+ a GED0301 da como resultado una disminución en la expresión de citoquinas inflamatorias.
Ejemplo 4: El tratamiento con un oligonucleótido de sentido contrario dirigido contra SMAD7 modula la expresión de poblaciones de linfocitos T
En este ejemplo se describe un estudio que investiga la fracción circulante de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+, linfocitos T IL17A+, linfocitos T FoxP3+ CD103+ y linfocitos T integrina α4β7+ ya que el estado de activación de estas poblaciones de linfocitos Treg reflejan la respuesta inmunitaria que se produce en los folículos y en las placas de Peyer del intestino. En los estudios descritos a continuación, para cada cohorte sometida a ensayo, las poblaciones de linfocitos T se midieron en el Día 0 para determinar una medida inicial para cada paciente. Se administró GED-0301 como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 durante 7 días, y las poblaciones de linfocitos T se volvieron a medir el Día 8, Día 28, y para algunas poblaciones de células, en el Día 84.
La manipulación de la combinación periférica de linfocitos Treg ha sido una diana particular para el tratamiento de las enfermedades inmunomediadas y el trasplante. Estudios anteriores habían demostrado que el número de linfocitos Treg de sangre periféricas se podía aumentar mediante anticuerpos dirigidos contra TNF alfa, y dicho aumento solamente se observaba en pacientes que respondían a las terapias dirigidas contra TNF alfa. El efecto de una terapia contra TNF alfa sobre los linfocitos Treg se puede mediar con TGF-beta1.
El efecto de la terapia con el oligonucleótido de sentido contrario SMAD7 se investigó para determinar si terapia con el oligonucleótido de sentido contrario SMAD7 regula positivamente el número de linfocitos Treg como resultado de una
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mayor actividad de TGF-beta 1. El efecto de la terapia con el oligonucleótido de sentido contrario SMAD7 también se estudió para determinar si un tratamiento de ese tipo conduce a cambios en el número de linfocitos Treg FoxP3+ y si este efecto está asociada con cambios en los porcentajes de los linfocitos efectores Th1/Th17.
Además, los linfocitos T CCR9+ se enriquecen en la circulación periférica de pacientes con enfermedad de Crohn y tienen características de células T de la mucosa, incluyendo un fenotipo de activación, capacidad de respuesta a la activación de CD2, y la capacidad de fabricar citoquinas tanto inflamatorias (por ejemplo, IFN-gamma) como reguladoras (por ejemplo, MO). El efecto de la terapia con el oligonucleótido de sentido contrario SMAD7 también se estudió para determinar si un tratamiento de ese tipo conduce a cambios en el número de linfocitos CCR9+ en circulación.
Para el aislamiento de PBMC y el análisis mediante citometría de flujo, se recogieron muestras de sangre (10 mg) en tubos que contenían heparina, se diluyeron con RPM11640(1:1) y se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque. Con este fin, los tubos se centrifugaron a 1800 rpm durante 30 minutos, y las PBMC resultantes se recogieron y se lavaron en RPMI1640 dos veces.
Las PBMC se resuspendieron en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 % inactivado, penicilina (100 U/ml), y estreptomicina (100 mg/ml). Se caracterizó el fenotipo de las células mediante citometría de flujo utilizando los siguientes anticuerpos: anticuerpo marcado con APC dirigido contra CCR9 humana y anticuerpo marcado con PE dirigido contra Foxp3 humana. Todos los anticuerpos se usaron a una dilución final 1:50.
Las PBMC se sembraron también en placas de cultivo de 96 pocillos con fondo en U, y se estimularon con Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 10 ng/ml), ionomicina (1 mg/ml), y brefeldina A (10 mg/ml). Después de 5 horas, las células se tiñeron para determinar la expresión de CCR9 usando los anticuerpos anteriores, así como para IFN-gamma e IL-17A usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo para FITC dirigido contra IFN-gamma humana, anticuerpo marcado con Alexa Fluor® 647 dirigido contra IL-17A humana, y anticuerpo marcado con PE dirigido contra IL17A humana. Todos los anticuerpos se usaron a una dilución final 1:50. Se incluyeron controles adecuados emparejados por isotipo en todos los experimentos. El anticuerpo para FITC dirigido contra IFN-gamma humana se obtuvo de Beckton Dickinson y el resto de los anticuerpos usados en el presente documento se obtuvieron de EBiosciences.
Los valores se expresan como promedio, y las diferencias entre grupos se compararon usando la prueba U de Mann Whitney. La significancia estadística (p < 0,05) se determinó usando la prueba de pares coincidentes de Wilcoxon.
Se investigó el efecto del tratamiento con GED0301 sobre la fracción de linfocitos inflamatorios/contrarreguladores. El tratamiento con GED0301 no alteró significativamente el porcentaje de linfocitos CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD161 +, CD62L+, α4β7+, o CCR9+ en circulación, según se controla los días 8 y 28 del ensayo clínico (Fig. 7). De manera similar, no se observaron cambios significativos en la fracción de linfocitos interleucina (IL)-17A+, linfocitos IL-10+, linfocitos FoxP3+, interferón (IFN)-γ-y linfocitos α4β7+ que expresan IL-17A, o linfocitos CD103+ que expresan FoxP3 después del tratamiento con GED0301.
Las Tablas I y Ia muestran los resultados de la Cohorte 1, que recibió 40 mg de GED-0301/día durante 7 días. La Tabla I muestra el porcentaje de una población dada de linfocitos T sobre la población total de células los días 0, 8, 28. La Tabla Ia muestra el porcentaje de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T FoxP3+ y linfocitos T CD103+ FoxP3+ en el total de la población celular los días 0, 8, 28 y 84.
La Tabla Il muestra los resultados de la Cohorte 2, que recibió 80 mg de GED-0301/día durante 7 días. La Tabla II muestra el porcentaje de una población dada de linfocitos T sobre la población total de células los días 0, 8, y 28. La Tabla IIa muestra el porcentaje de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T FoxP3+ y linfocitos T CD103+ FoxP3+ en el total de la población celular los días 0, 8, 28 y 84.
La Tabla III muestra los resultados de la Cohorte 3, que recibió 160 mg de GED-0301/día durante 7 días. La Tabla III muestra el porcentaje de una población dada de linfocitos T sobre la población total de células los días 0,8, y 28. La Tabla III muestra el porcentaje de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T FoxP3+ y linfocitos T CD103+ FoxP3+ en el total de la población celular los días 0, 8, 28 y 84.
La Tabla IV muestra los resultados combinados del total de pacientes procedentes de las Cohortes 1-3. La Tabla IV muestra el porcentaje de una población dada de linfocitos T sobre la población total de células los días 0, 8, y 28. La Tabla IVa muestra el porcentaje de linfocitos T CCR9+ FoxP3+, linfocitos T FoxP3+ y linfocitos T CD103+ FoxP3+ en el total de la población celular los días 0, 8, 28 y 84.
Tabla I
Día 0
Día 8 Día 28
Población celular
Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín.
CCR9+IFN-g+
1,5 % 3,25 % 0,70 % 0,3 % 1,6 % 0,13 % 0,80 % 0,85 % 0,40 %
CCR9+IL-17A+
0,28 % 2,8 % 0,02 % 0,44 % 2,7 % 0,05 % 0,15 % 0,90 % 0,00 %
CCR9+FoxP3+
0,07 % 0,20 % 0,01 % 0,25 % 0,70 % 0,02 % 0,18 % 0,21 % 0,10 %
IFN-g+
14,5 % 22,99 % 6,29 % 7,97 % 13,82 % 3,5 % 11,00 % 27,00 % 4,95 %
IL-17A+
1,4 % 2,50 % 0,4 % 1,2 % 2,80 % 0,64 % 1,02 % 4,70 % 0,30 %
FoxP3+
0,80 % 2,20 % 0,19 % 0,90 % 2,50 % 021 % 1,50 % 3,20 % 0,20 %
FoxP3+ CD103+
0,18 % 4,60 % 0,03 % 0,30 % 0,40 % 0,07 % 0,28 % 0,80 % 0,10 %
integrina α4β7+
2,70 % 2,90 % 2,30 % 1,35 % 2,40 % 0,51 % 0,99 % 2,60 % 0,73 %
imagen7
Tabla II
Día 0
Día 8 Día 28
Población celular
Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín.
CCR9+IFN-g+
1,40 % 14,00 % 0,40 % 1,00 % 5,20 % 0,50 % 9,40 % 20,00 % 0,56 %
CCR9+IL-17A+
0,80 % 9,80 % 0,28 % 0,3 % 5,20 % 0,09 % 1,21 % 4,50 % 0,40 %
CCR9+FoxP3+
0,50 % 0,60 % 0,20 % 0,40 % 0,50 % 0,20 % 0,40 % 0,50 % 0,16 %
IFN-g+
9,80 % 20,90 % 4,80 % 5,70 % 34,00 % 1,70 % 14,95 % 34,00 % 4,50 %
IL-17A+
0,70 % 5,80 % 0,20 % 0,19 % 4,60 % 0,00 % 1,00 % 4,60 % 0,22 %
FoxP3+
1,70 % 2,30 % 0,60 % 1,10 % 1,60 % 0,80 % 0,80 % 1,60 % 0,60 %
FoxP3+ CD103+
0,20 % 0,40 % 0,12 % 0,23 % 0,34 % 0,14 % 0,34 % 0,06 % 0,07 %
integrina α4β7+
2,40 % 4,20 % 0,92 % 3,29 % 7,00 % 1,40 % 3,38 % 4,80 % 1,10 %
Tabla IIa
Día 0
Día 8 Día 28 Día 84
Pob. celular
Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín.
CCR9+ FoxP3+
0,50 % 0,60 % 0,20 % 0,40 % 0,50 % 0,20 % 0,40 % 0,50 % 0,16 % 0,60 % 5,00 % 0,10 %
FoxP3+
1,70 % 2,30 % 0,60 % 1,10 % 1,60 % 0,80 % 0,80 % 1,60 % 0,60 % 1,80 % 4,00 % 0,15 %
FoxP3+ CD103+
0,20 % 0,40 % 0,12 % 0,23 % 0,34 % 0,14 % 0,34 % 0,06 % 0,07 % 0,20 % 1,10 % 0,10 %
Tabla III
Día 0
Día 8 Día 28
Población celular
Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín.
CCR9+IFN-g+
14,00 % 35,00 % 2,80 % 8,00 % 16,00 % 0,40 % 10,30 % 31,00 % 1,30 %
CCR9+IL-17A+
4,40 % 7,80 % 3,50 % 4,00 % 8,00 % 0,30 % 1,50 % 280,00 % 1,00 %
CCR9+FoxP3+
0,80 % 1,20 % 0,10 % 1,30 % 1,90 % 0,70 % 0,70 % 1,5 % 0,28 %
IFN-g+
10,80 % 26,00 % 3,60 % 8,50 % 15,00 % 1,70 % 13,00 % 29,00 % 3,40 %
IL-17A+
2,10 % 3,60 % 1,00 % 1,20 % 5,30 % 1,10 % 1,50 % 5,60 % 0,80 %
FoxP3+
2,80 % 3,30 % 1,70 % 2,10 % 4,60 % 1,60 % 1,50 % 4,40 % 0,80 %
FoxP3+ CD103+
0,80 % 1,20 % 0,20 % 0,70 % 1,80 % 0,50 % 0,70 % 1,40 % 0,24 %
integrina α4β7+
2,80 % 6,30 % 2,50 % 1,10 % 6,80 % 0,60 % 3,50 % 5,20 % 0,90 %
Tabla IIIa
Día 0
Día 8 Día 28 Día 84
Pob. celular
Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín.
CCR9+ FoxP3+
0,80 % 1,20 % 0,10 % 1,30 % 1,90 % 0,70 % 0,70 % 1,5 % 0,28 % 0,40 % 0,8 % 0,12 %
FoxP3+
2,80 % 3,30 % 1,70 % 2,10 % 4,60 % 1,60 % 1,50 % 4,40 % 0,80 % 0,40 % 8,49 % 0,23 %
FoxP3+ CD103+
0,80 % 1,20 % 0,20 % 0,70 % 1,80 % 0,50 % 0,70 % 1,40 % 0,24 % 0,20 % 1,40 % 0,10 %
Tabla IV
Día 0
Día 8 Día 28
Población celular
Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín. Mediana Máx. Mín.
CCR9+IFN-g+
2,8 % 35,00 % 0,40 % 1,0 % 16,00 % 0,13 % 5,05 % 31,00 % 0,40 %
CCR9+IL-17A+
2,8 % 9,8 % 0,02 % 0,44 % 8,00 % 0,05 % 1,00 % 280,00 % 0,00 %
CCR9+FoxP3+
0,20 % 1,20 % 0,01 % 0,50 % 1,90 % 0,02 % 0,40 % 4,00 % 0,10 %
IFN-g+
10,60 % 26,00 % 3,60 % 7,2 % 34,00 % 1,70 % 13,00 % 34,00 % 3,40 %
IL-17A+
1,4 % 5,80 % 0,20 % 1,10 % 5,30 % 0,00 % 1,06 % 5,60 % 0,22 %
FoxP3+
1,70 % 3,30 % 0,19 % 1,23 % 4,60 % 0,21 % 1,25 % 4,40 % 0,20 %
FoxP3+ CD103+
0,20 % 4,60 % 0,03 % 0,34 % 1,80 % 0,07 % 0,34 % 1,40 % 0,07 %
integrina α4β7+
2,70 % 6,30 % 0,92 % 2,00 % 7,00 % 0,51 % 2,60 % 5,2 % 0,073 %
Tabla IVa
Día 0
Día 8 Día 28 Día 84
Pob. celular
Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Máx. Mín.
CCR9+ FoxP3+
0,20 % 1,20 % 0,01 % 0,50 % 1,90 % 0,02 % 0,40 % 4,00 % 0,10 % 0,46 % 5,00 % 0,01 %
FoxP3+
1,70 % 3,30 % 0,19 % 1,23 % 4,60 % 0,21 % 1,25 % 4,40 % 0,20 % 1,06 % 8,49 % 0,50 %
FoxP3+ CD103+
0,20 % 4,60 % 0,03 % 0,34 % 1,80 % 0,07 % 0,34 % 1,40 % 0,07 % 0,20 % 1,40 % 0,02 %
Como se muestra en cada una de las tablas anteriores, se observó una disminución significativa en las poblaciones de 5 linfocitos T que expresan CCR9+ IFN-γ+ en el día 8 (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 2,8 % el día 0 y una expresión del 1,0 % el día 8; véase la Fig. 8B).
También se observó una disminución en las poblaciones de linfocitos T CCR9+ IL 17A+ (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 2,8 % el día 0 y una expresión del 0,44 % el día 8; véase la Fig. 8D). También se observó una disminución significativa desde el día 0 al día 28 para las poblaciones de linfocitos T CCR9+ IL17A+ (por ejemplo,
10 la Tabla IV muestra una expresión del 1,00 % el día 28; véase la Fig. 8D). La disminución seguía estando presente el día 84 (median expresión 1 %; intervalo 0,08 %-4,8 %).
Se observó un aumento en las poblaciones de linfocitos T CCR9+ FoxP3+ entre el día 8 y el día 84 (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 0,2 % el día 0 y una expresión del 0,5 % el día 8; véase la Fig. 8F).
Se observó una disminución significativa en las poblaciones de linfocitos T IFN-γ+ en el día 8 (por ejemplo, la Tabla IV 15 muestra una expresión del 10,6 % el día 0 y una expresión del 7,2 % el día 8; véase la Fig. 8A).
También se observó una disminución en las poblaciones de linfocitos T IL17A+ (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 1,4 % el día 0 y una expresión del 1,1 % el día 8; véase la Fig. 8C).
También se observó una disminución en las poblaciones de linfocitos T FoxP3+ en el día 8 (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 1,7 % el día 0 y una expresión del 1,23 % el día 8; véase la Fig. 8E).
20 No se observaron cambios en las poblaciones de linfocitos T FoxP3+ CD103+ (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 0,2 % el día 0 y una expresión del 0,34 % el día 8) y en las poblaciones de linfocitos T integrina α4β7 (por ejemplo, la Tabla IV muestra una expresión del 2,7 % el día 0 y una expresión del 2 % el día 8).
Los resultados mostrados en las Tablas I-IV demuestran que la inhibición de SMAD7 con GED-0301 en pacientes de EC modula la expresión de las poblaciones de linfocitos T específicos. En particular, los inventores observaron una 25 regulación por defecto en las poblaciones de linfocitos T CCR9+ IFN-γ+, linfocitos T CCR9+ IL17A+, linfocitos T FoxP3+, linfocitos T IFN-γ+, e IL17A+ después del tratamiento con GED-0301 en el día 8 y una regulación en exceso
imagen8
pacientes de la cohorte 2 y 287 (intervalo 221-400) para los pacientes de la cohorte 3. En las tres cohortes, los pacientes respondieron al tratamiento (por ejemplo, se observó para cada paciente una disminución de 70 puntos o más desde la puntuación CDAI inicial), de tal forma que, en el día 8, los 15 pacientes mostraron una disminución en la puntuación CDAI y 12/15 pacientes de las Cohortes 1-3 entraron en remisión (es decir, puntuación CDAI < 150). (Tabla 5 V-VII). Específicamente, 4/5 pacientes de la cohorte 1, 3/5 pacientes de la cohorte 2 y 5/5 pacientes de la cohorte 3 tenían una puntuación CDAI <150 (Tablas V-VII). En el día 28, la respuesta clínica fue evidente también en los 15 pacientes (Tabla V-VII) y hubo una disminución significativa en la puntuación CDAI comparada con el valor inicial (P < 0,0001). La remisión clínica en el día 28 se registró en 13/15 pacientes (86 %) (5/5 de la cohorte 1, 3/5 de la cohorte 2 y 5/5 de la cohorte 3) (Tabla V-VII). En el día 84, la puntuación CDAI total fue significativamente menor que la medida 10 al principio (Tabla V-VII, P < 0,0001) y 9/15 (60 %) pacientes seguían en remisión. En particular, esto se observó en 3 pacientes de la cohorte 1, 2 pacientes de la cohorte 2, y 4 pacientes de la cohorte 3 (Tabla V-VII). Se observó una disminución significativa en la puntuación CDAI desde el valor inicial hasta el día 8, 28 y 84 incluso cuando el análisis se realizó en cada cohorte (Fig. 9). Los resultados sugieren que existe una correlación entre la inducción de la remisión y/o la mejora en el resultado y las subpoblaciones de linfocitos T. Además, las puntuaciones CDAI observadas el día
15 84 muestran un aumento en comparación con los puntos temporales anteriores (por ejemplo, días 8 y 28), que era coherente con las correspondientes fluctuaciones en determinadas poblaciones de linfocitos T a día 84 (por ejemplo, las poblaciones de linfocitos T CCR9+ FoxP3+ aumentaron entre el día 0 y el día 8, pero el día 84, parece que esta población de linfocitos T disminuye).
Las realizaciones anteriores deben considerarse ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita en el
20 presente documento. El alcance de la invención se indica mediante las reivindicaciones adjuntas y no según la descripción anterior, y se pretende que todos los cambios que están incluidos en el significado y gama de las reivindicaciones estén abarcados por las mismas.

Claims (1)

  1. imagen1
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EP11425234 2011-09-15
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US201161576556P 2011-12-16
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20030149A1 (it) 2003-04-02 2004-10-03 Giuliani Spa Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico
US8912154B2 (en) 2008-11-13 2014-12-16 Nogra Pharma Limited Antisense compositions and methods of making and using same
RU2667960C2 (ru) 2012-04-18 2018-09-25 Ногра Фарма Лимитед Способы лечения диабета и/или улучшения выживания панкреатических островков после трансплантации
CA2903597C (en) * 2013-03-15 2023-04-04 Nogra Pharma Limited Methods of treating colorectal cancer
US10006029B2 (en) 2013-03-15 2018-06-26 Nogra Pharma Limited Methods of treating colorectal cancer
US20160139123A1 (en) * 2013-07-12 2016-05-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Shear Wave Imaging Method and Installation for Collecting Information on a Soft Solid
US10473669B2 (en) 2014-05-09 2019-11-12 Nogra Pharma Limited Methods for treating inflammatory bowel disease
MX2017004973A (es) * 2014-10-17 2017-12-07 Nogra Pharma Ltd Metodos y composiciones para tratar a un sujeto con un oligonucleotido antisentido de smad7.
CA2964673A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Nogra Pharma Limited Methods for dosing and monitoring smad7 antisense oligonucleotide treatment using biomarker levels
MA41271A (fr) * 2014-12-26 2017-10-31 Celgene Alpine Invest Company Ii Llc Méthodes d'utilisation d'oligonucléotides antisens ciblant smad7
CN108139385A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于诊断和治疗炎症性肠病的方法
EP3356530A4 (en) * 2015-09-30 2019-04-10 Celgene Alpine Investment Company II, LLC TLR MODULATORS AND ASSOCIATED METHODS OF USE
WO2017055611A2 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Nogra Pharma Limited Methods of using smad7 antisense oligonucleotides based on biomarker expression
EP3420082A4 (en) 2016-02-23 2019-10-16 Celgene Alpine Investment Company II, LLC METHOD FOR THE TREATMENT OF DARM FIBROSIS USING SMAD7 INHIBITION
WO2019051173A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATORS OF SMAD7 EXPRESSION
US11619832B2 (en) 2018-03-08 2023-04-04 Coopervision International Limited Identification of contact lens wearers predisposed to contact lens discomfort
CN110082538B (zh) * 2019-04-19 2021-12-03 中山大学附属第六医院 CCR9+IL-17+Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159697A (en) 2000-01-19 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of Smad7 expression
RU2185627C2 (ru) * 2000-09-11 2002-07-20 Новосибирская государственная медицинская академия Способ определения чувствительности (восприимчивости) к внутривенной лазеротерапии больных ишемической болезнью сердца
ES2388968T3 (es) 2001-11-02 2012-10-22 Giuliani International Limited Inhibidores de Smad7 para el tratamiento de enfermedades del SNC
ITRM20030149A1 (it) 2003-04-02 2004-10-03 Giuliani Spa Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico
US20090275496A1 (en) 2004-05-07 2009-11-05 Peptimmune, Inc. Effective quantitation of complex peptide mixtures in tissue samples and improved therapeutic methods
ES2563955T3 (es) * 2005-08-02 2016-03-16 Centenary Institute Of Cancer Medicine & Cell Biology Método para identificar linfocitos T reguladores
JP2009529659A (ja) * 2006-03-10 2009-08-20 マウント シナイ ホスピタル 栄養膜細胞の細胞死、分化、浸潤、および／または細胞融合および代謝回転に関連する状態の診断用組成物および治療方法
EP2167647A2 (en) * 2007-06-13 2010-03-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Regulatory t cells and methods of making and using same
US20110008795A1 (en) 2008-02-28 2011-01-13 Sysmex Corporation Marker for detection of il-17-producing helper t-cell, and method for detection of il-17-producing helper t-cell
JP2010051307A (ja) * 2008-07-28 2010-03-11 Eisai R & D Management Co Ltd Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化誘導を調節する物質のスクリーニング方法
US8912154B2 (en) 2008-11-13 2014-12-16 Nogra Pharma Limited Antisense compositions and methods of making and using same
MX337287B (es) 2009-07-10 2016-02-22 Transgene Sa Biomarcador para seleccionar pacientes y metodos relacionados.
US8766034B2 (en) 2010-09-22 2014-07-01 Cedars-Sinai Medical Center TL1A model of inflammation fibrosis and autoimmunity
RU2667960C2 (ru) 2012-04-18 2018-09-25 Ногра Фарма Лимитед Способы лечения диабета и/или улучшения выживания панкреатических островков после трансплантации
US10006029B2 (en) 2013-03-15 2018-06-26 Nogra Pharma Limited Methods of treating colorectal cancer
CA2903597C (en) 2013-03-15 2023-04-04 Nogra Pharma Limited Methods of treating colorectal cancer
US10473669B2 (en) 2014-05-09 2019-11-12 Nogra Pharma Limited Methods for treating inflammatory bowel disease
MX2017004973A (es) 2014-10-17 2017-12-07 Nogra Pharma Ltd Metodos y composiciones para tratar a un sujeto con un oligonucleotido antisentido de smad7.
CA2964673A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Nogra Pharma Limited Methods for dosing and monitoring smad7 antisense oligonucleotide treatment using biomarker levels
WO2017055611A2 (en) 2015-09-30 2017-04-06 Nogra Pharma Limited Methods of using smad7 antisense oligonucleotides based on biomarker expression

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