CN107980001B - 包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合于短活化RNA(saRNA)或反义寡核苷酸序列(ASO)的经分离化合物、这种化合物的组合物、以及通过一种所公开化合物或组合物来达成的治疗癌症和自体免疫疾病(伴有或不伴有刺激免疫应答)的方法、免疫刺激方法、使CEBPA活化的方法和使STAT转录因子的活性降低的方法。

Description

包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月2日提交的美国临时申请号：62/187,878和2015年12月7日提交的美国临时申请号：62/264,026的权益，所述美国临时申请各自的内容据此以整体方式以及出于所有目的并入本文。
以ASCII文本文件形式提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用
写入文件48440-570001WO_ST25.TXT(2016年6月14日创建，73,469字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)中的序列表据此以引用的方式并入本文。
公开背景
急性骨髓性白血病的特征在于不成熟的骨髓性祖细胞的积累。白血病发生由控制骨髓性谱系分化、自我更新和/或增殖的致癌基因、肿瘤抑制子或转录因子的去调控所致。转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)促进粒细胞和巨噬细胞的分化，并且负性调控造血干细胞自我更新。在应急粒细胞生成期间以及在白血病发生期间，C/EBPα被C/EBPβ和STAT3转录因子的转录活性取代。C/EBPα的突变或下调常常在患有AML的患者中观察到。短活化RNA(saRNA)能够诱导基因表达。saRNA和其它寡核苷酸治疗剂的临床应用中的一个因素是难以达成它们的靶向递送，另外，免疫系统对核酸的固有敏感性使临床应用复杂化。STAT3在癌细胞与非恶性肿瘤相关细胞两者中均起作用。然而，靶向诸如STAT3的转录因子由于它们缺乏酶活性而复杂，并且需要非药理学方法。用于抑制STAT3的反义技术具有有限作用，因为可用的反义寡核苷酸缺乏细胞选择性。本公开涉及用针对散播性癌症的稳定和适于全身性施用的saRNA缀合硫代磷酸化寡核苷酸治疗例如AML的癌症的化合物、组合物和方法。本公开也涉及用缀合于硫代磷酸化寡核苷酸的反义寡核苷酸治疗例如前列腺癌和胶质母细胞瘤的癌症的化合物、组合物和方法。
公开简述
在一个方面，本公开尤其提供一种用于调节靶标基因的表达的经分离化合物，其包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于寡核苷酸。在一个方面，本公开包括一种经分离化合物，其包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于目标基因的反义核酸序列或短活化RNA(saRNA)。在各实施方案中，ODN是长度为15至30个碱基的单链部分或完全硫代磷酸化寡脱氧核苷酸。
在各实施方案中，本公开的化合物包括用于增强基因表达的短活化RNA(saRNA)或用于抑制基因表达的反义序列。
在一个方面，本公开包括一种用化合物或包括化合物的组合物治疗受试者的癌症，伴有或不伴有用本公开的化合物或包括化合物的组合物刺激受试者中的免疫应答的方法。在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物或包括化合物的组合物增强细胞中的C/EBPα表达的方法，所述化合物包括C/EBPα的saRNA缀合于硫代磷酸化寡核苷酸。在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物或包括化合物的组合物抑制转录因子信号转导子和转录活化子(STAT)(STAT1–STAT6)的表达的方法，所述化合物包括STAT1–STAT6中的一者或多者的反义寡核苷酸(ASO)缀合于硫代磷酸化寡核苷酸。
在一个方面，本公开包括一种通过使细胞与有效量的化合物或包括化合物的组合物接触来抑制细胞生长的方法。
短活化RNA(saRNA)能够活化CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)。方法包括治疗骨髓瘤、急性骨髓性白血病、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、食道癌、皮肤癌、黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌、白血病或淋巴瘤。组合物可通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向受试者施用。
本公开的其它特征和优势将根据以下详细描述和权利要求而显而易知。
除非相反指示，否则本文中的所有出版物、参考文献、专利和/或专利申请参考文献都据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
附图简述
图1A-1F显示化学稳定化CpG-CEBPA saRNA寡核苷酸的设计。显示双链和单链CpG-CEBPA saRNA缀合物的序列。加下划线的是缀合物骨架中的硫代磷酸化位点；2’OMe修饰的核苷酸显示在矩形框内部并用斜体表示；指示包括C3接头的5个单元的接头(GlenResearch)的位置；AS＝反义链；SS＝有义链。图1A描绘包含SEQ ID NO:103和双链体链SEQID NO:2的缀合物序列。图1B描绘包含SEQ ID NO:104和双链体链SEQ ID NO:105的缀合物序列。图1C描绘包含SEQ ID NO:103的缀合物序列。图1D描绘包含SEQ ID NO:104的缀合物序列。图1E描绘包含SEQ ID NO:106和双链体链SEQ ID NO:107的缀合物序列。图1F描绘包含SEQ ID NO:108和双链体链SEQ ID NO:109的缀合物序列。
图2A和2B是通过实时定量PCR(qPCR)测量的mRNA表达水平的柱状图。图2C和2D是蛋白质表达水平的蛋白质印迹图像。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育从野生型(WT)或TLR9缺陷性(TLR9KO)小鼠分离的新鲜骨髓细胞，或使用Lipofectamine 2000，用50nM的未缀合saRNA转染。分别使用qPCR(图2A-2B)和蛋白质印迹(图2C-2D)测量C/EBPα的mRNA和蛋白质水平。
图3显示柱状图，其显示CpG-CEBPA saRNA触发靶标人癌细胞中C/EBPα的转录活性。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育表达C/EBPα特异性启动子-荧光素酶构建体的人DU145前列腺癌细胞，或如所指示使用Lipofectamine 2000，用50nM的未缀合saRNA转染；具有匹配萤火虫荧光素酶的序列的CpG-FLUC-RNA缀合物用作阴性对照。72小时后，使细胞溶解，并且使用Cignal C/EBP报道体测定试剂盒(Qiagen)分析水平。
图4A和4B分别显示人DU145前列腺癌细胞和MOLM13白血病细胞在以下测定的情况下的柱状图，所述测定用以显示CpG-CEBPA saRNA对人细胞和小鼠细胞中的C/EBPαmRNA和蛋白质水平的TLR9依赖性影响。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育人DU145前列腺癌细胞(图4A)和MOLM13白血病细胞(图4B)，或使用Lipofectamine 2000，用50nM的未缀合saRNA转染；具有匹配萤火虫荧光素酶的序列的CpG-FLUC-RNA缀合物用作阴性对照。72小时后，使细胞溶解以获得经分离RNA来使用实时定量PCR(qPCR)分析CEBPA mRNA水平。
图5A-5C是在体外持续48小时与500nM CpG-CEBPA saRNA一起孵育或用单独CEBPsaRNA转染的人MV4-11AML细胞的流式细胞术图谱。使用流式细胞术评估HLADR和共刺激分子CD86和CD40的表达。数据显示(CD86(图5A)、CD40(图5B)和HLADR(图5C))CpG-CEBPAsaRNA在体内具有免疫刺激作用。
图6A-6B显示CpG-CEBPA saRNA对小鼠中同基因白血病细胞的剂量依赖性影响的线形图和流式细胞术数据。在建立Cbfb/MYH11/Mpl白血病(血液中的AML细胞>1％，在1-5％的范围内)之后，每隔一天使用各种剂量的CpG-CEBPA saRNA注射C57BL/6小鼠两次，并且在末次治疗之后一天使其安乐死。图6A显示在治疗之前和之后使用流式细胞术评估的外周血液中AML细胞的百分比的线形图。图6B显示流式细胞术图谱，其显示CpG-CEBPA saRNA治疗以剂量依赖性方式使骨髓和脾中AML细胞的百分比降低。显示的是对各种器官中GFP+c-Kit+AML细胞的流式细胞术分析的代表性结果。
图7A-7B显示静脉内注射诱导骨髓中AML细胞中的靶标基因表达的CpG-CEBPAsaRNA的流式细胞术和直方图数据。每隔一天使用1mg/kg的CpG-CEBPA saRNA注射建立有Cbfb/MYH11/Mpl白血病的小鼠三次，并且在末次治疗之后一天使其安乐死。图7A显示流式细胞术的代表性结果；图7B显示使用实时qPCR测量的从骨髓富集的c-Kit+AML细胞中的CEBPA mRNA水平的柱状图。
图8A-8B显示静脉内注射诱导骨髓中AML细胞中的靶标基因表达的CpG-CEBPAsaRNA的线形图和流式细胞术数据。每隔一天使用5mg/kg的CpG-CEBPA saRNA注射建立有Cbfb/MYH11/Mpl白血病的小鼠四次，并且在末次治疗之后一天(第20天)使其安乐死。图8A显示在治疗之前、期间和之后使用流式细胞术评估的外周血液中AML细胞的百分比的线形图。图8B显示在实验结束时对外周血液、骨髓和脾中AML百分比的流式细胞术分析。
图9A-9C显示CpG-STAT3 ASO缀合物的示例性序列设计和PAGE凝胶数据。单链CpG-STAT3 ASO设计的一实例显示于图9A中。对硫代磷酸化核苷酸加下划线；碳接头的(CH2)3单元用蓝色表示；STAT3ASO2的间隔聚体(gapmer)序列中的2’OMe修饰的核苷酸用红色表示。在37℃下在50％人血清中孵育CpG-STAT3ASO2(图9B)和CpG-STAT3ASO4(图9C)缀合物多达5天。接着在7.5M尿素/20％PAGE凝胶上解析样品，并且使用溴化乙锭染色；显示代表性凝胶图像；M指示DNA标记的位置。
图10A-10B显示就体外人免疫和前列腺癌细胞来说的CpG-STAT3 ASOCy3的流式细胞术数据。使人前列腺癌细胞(图10A)和脾细胞(图10B)与指示浓度的经荧光标记的CpG-STAT3 ASOCy3一起在无任何转染试剂下孵育1小时。使用流式细胞术评估由癌细胞、树突细胞(DC；CD11c)、巨噬细胞(MAC；F4/80+Gr1-)、B细胞(B220+CD11c-)和T细胞(CD3+)达成的寡核苷酸摄取。CpG-STAT3 ASOCy3由小鼠免疫和前列腺癌细胞在体外快速内化。
图11A-11B显示就体外小鼠免疫和前列腺癌细胞来说的CpG-STAT3 ASOCy3的流式细胞术数据。使小鼠前列腺癌细胞(图11A)和脾细胞(图11B)与指示浓度的经荧光标记的CpG-STAT3 ASOCy3一起在无任何转染试剂下孵育1小时。使用流式细胞术评估由癌细胞、树突细胞(DC；CD11c)、巨噬细胞(MAC；F4/80+Gr1-)、B细胞(B220+CD11c-)和T细胞(CD3+)达成的寡核苷酸摄取。CpG-STAT3 ASOCy3由小鼠免疫和前列腺癌细胞在体外快速内化。
图12A-12D显示共焦显微术图像，其显示在由前列腺癌细胞在体外摄取之后CpG-STAT3 ASOCy3的细胞内定位。使DU-145前列腺癌细胞与500nM经荧光标记的CpG-STAT3ASOCy3一起以如所指示的不同时间(15分钟(图12A)、1小时(图12B)、2小时(图12C)和4小时(图12D))进行孵育。在用
Figure BDA0001577668900000061
进行核染色之后使用共焦显微术评估缀合物的细胞内定位。显示来自两个独立实验中的一者的代表性图像。
图13A-13D是柱状图和表达数据，其显示CpG-STAT3 ASOCy3诱导雄激素非依赖性DU-145(图13A)和LNCaP-S17(图13B)前列腺癌细胞中的强力STAT3敲低。使DU-145(图13A)和LNCaP-S17(图13B)前列腺癌细胞与500nM的各种CpG/GpC-STAT3ASO、未缀合STAT3ASO或非靶向CpG-搅乱(scrambled)ODN一起在体外孵育24小时。使用定量实时PCR(Taqman；qPCR)测量STAT3mRNA的表达；结果来自一式三份进行的两个独立实验中的一者；平均值+/-SD。图13C显示相较于未缀合STAT3ASO，CpG-STAT3ASO对前列腺癌细胞的剂量依赖性影响。使用不同浓度的STAT3 ASO(左图)或CpG-STAT3ASO(右图)处理DU145细胞，随后使用qPCR测定分析STAT3 mRNA水平。图13D显示相比于单独STAT3 ASO，CpG-STAT3ASO诱导更快STAT3敲低。用500nM的CpG-STAT3ASO、未缀合STAT3ASO或阴性对照CpG-STAT3SSO处理细胞24或48小时，如所指示。使用蛋白质印迹评估STAT3的活化和蛋白质水平；β-肌动蛋白用作上样对照。
图14A-14B是流式细胞术数据，其显示相比于单独STAT3ASO，CpG-STAT3ASO缀合物更有效在体外诱导前列腺癌细胞凋亡。使细胞(DU-145(图14A)和LNCaP S17(图14B))与500nM的CpG-STAT3 ASO缀合物、单独STAT3ASO或对照非靶向缀合物CpG-搅乱ODN(CpG-scbODN)一起孵育24小时。在用7AAD和膜联蛋白V染色之后使用流式细胞术测量凋亡细胞的百分比。
图15A-15C显示全身性注射的CpG-STAT3ASOCy3的体内生物分布的流式细胞术数据。使用5mg/kg的经Cy3标记的CpG-STAT3 ASOCy3静脉内注射C57BL/6小鼠，并且3小时后使其安乐死。代表性等高线图(图15A中描绘骨髓；并且图15B中描绘淋巴结)显示对由骨髓和外周淋巴结获得的单细胞混悬液使用流式细胞术，寡核苷酸由CD11b+骨髓细胞或CD11c+树突细胞(DC)内化；(n＝4)。图15C显示使用2.5mg/kg的经Cy3标记的CpG-STAT3 ASOCy3静脉内注射建立有RM9前列腺肿瘤的C57BL/6小鼠，并且3小时后使其安乐死。对由如所指示的各种器官获得的单细胞混悬液使用流式细胞术来评估由树突细胞(DC)(CD11c+)、巨噬细胞(CD11b+F4/80+)、B细胞(CD19+)、T细胞(CD3+)或NK细胞(CD49b+)对寡核苷酸的内化；平均值±SEM(n＝4)。
图16A-16C是流式细胞术数据和柱状图，其显示CpG-STAT3 ASO缀合物有效靶向STAT3，并且降低TLR+B细胞淋巴瘤的活力。图16A显示与500nM的经荧光标记的CpG-STAT3ASOCy3一起在无任何转染试剂下孵育1小时的非霍奇金氏淋巴瘤B细胞的流式细胞术数据。使用流式细胞术测量寡核苷酸摄取。图16B是柱状图，其显示使用定量实时PCR(Taqman)测量的STAT3 mRNA的表达。使OCI-Ly3细胞与500nM的指示寡核苷酸一起孵育24小时。图16C是柱状图，其显示持续3天每日用500nM的CpG-STAT3ASO处理的OCI-Ly3细胞的结果。使用XTT(第二代四唑鎓染料；(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺))测定测量它们的活力；显示来自一式三份进行的两个独立实验中的一者的结果；平均值+/-SEM。
图17A-17C是流式细胞术数据和柱状图，其显示小神经胶质细胞和神经胶质瘤细胞特异性摄取和由CpG-STAT3ASO达成的STAT3抑制。小鼠TLR9+BV2和K-luc细胞(图17A)和人原代神经胶质瘤干样细胞(图17B)在体外快速内化CpG-STAT3ASO，并且在较小程度上内化未缀合STAT3ASO(250nM/1小时)。使细胞与250nM CpG-STAT3ASOAlexa488或未缀合STAT3ASOAlexa488一起孵育指示时间，并且使用流式细胞术测量Alexa488阳性细胞的百分比。图17C显示CpG-STAT3ASO诱导原代人神经胶质瘤干样细胞中STAT3在mRNA和蛋白质水平上强力和快速敲低。显示的是STAT3 mRNA水平的代表性实时qPCR结果。
图18A-18C是柱状图和流式细胞术数据，其显示在使用各种递送途径进行施用之后CpG-STAT3抑制剂在携带神经胶质瘤的小鼠中的生物分布。图18A显示经荧光标记的CSI的生物分布研究证明由TLR9+GL261神经胶质瘤和骨髓细胞(CD11b+F4/80LO小神经胶质细胞和CD11b+Gr1+MDSC)而非由非恶性脑实质达成细胞选择性寡核苷酸摄取。在使用指示的经荧光标记的试剂和施用途径进行注射(单次注射或每6小时进行的3次重复静脉内注射)之后3小时使建立有原位肿瘤的小鼠安乐死。使用流式细胞术分析由肿瘤和脑组织获得的单细胞混悬液中荧光细胞的百分比；显示的是平均值±SEM(n＝4)。图18B显示代表性点图，其显示门控策略和从经静脉内注射动物分离的各种测试细胞群体中荧光信号的水平。图18C显示颅内/肿瘤内注射CpG-STAT3ASO在体内诱导GL261肿瘤中STAT3敲低。用单次剂量的CpG-STAT3ASO(5mg/kg)注射小鼠。21小时后收获肿瘤以使用实时qPCR进行基因表达分析，其中相对于GAPDH表达进行标准化；平均值±SEM(n＝4)。
图19A-19E显示局部施用CpG-STAT3ASO使远端位置中的肿瘤生长降低，并且抑制PD-L1免疫检查点调控。图19A显示相比于单独STAT3ASO，CpGSTAT3ASO缀合物在体内的抗肿瘤作用更显著。使用2x105个小鼠前列腺癌RM9细胞在两个位置中对C57/BL6小鼠进行皮下注射。在肿瘤明确建立(如由箭头所示)之后，每隔一天使用肿瘤内(IT)注射指示缀合物，即5mg/kg的CpG-STAT3ASO、单独STAT3ASO、CpGSTAT3SSO或PBS来治疗一个肿瘤。在指示时间点测量肿瘤生长；平均值±SEM(n＝6)。图19B显示CpG-STAT3ASO而非STAT3ASO抑制远端未治疗部位中的STAT3表达。使用qPCR评估从差异性治疗小鼠收获的整个RM9肿瘤中STAT3 mRNA的水平。图19C-19D显示CpG-STAT3ASO使肿瘤浸润性骨髓源性抑制细胞(MDSC)的STAT3活化(图19C)和PD-L1免疫检查点表达(图19D)降低。通过流式细胞术来评估在如所指示的治疗之后从RM9肿瘤分离的MDSC(CD11b+Gr1+)中pSTAT3(右图)和PD-L1表面表达(左图)的水平。显示的是概述来自各组小鼠的结果的代表性直方图叠加和柱状图；平均值±SEM(n＝6)。图19E显示CpG-STAT3ASO而非STAT3ASO抑制远端未治疗部位中的STAT3表达。使用qPCR评估从差异性治疗小鼠收获的整个RM9肿瘤中STAT3 mRNA的水平。
图20A-20B是图像(图20A)和流式细胞术数据(图20B)，其显示静脉内施用CpG-STAT3ASO导致实验性骨转移性RM9前列腺癌模型完全消退。在C57BL/6小鼠中在胫骨内注射RM9前列腺癌细胞。使用每日静脉内注射5mg/kg的CpG-STAT3 ASO缀合物、单独STAT3 ASO或CpG-搅乱ASO治疗建立有肿瘤的动物多达15天。分别使用在AmiX(Spectral)成像系统上进行的生物发光成像(BLI)或身体状况评分(BCS)来监测肿瘤负荷和小鼠状况(图20A)。图解显示在实验结束时或在必须使小鼠安乐死(BCS<2)时，使用流式细胞术评估的骨髓中RM9mcherry+细胞的百分比(图20B)；平均值±SEM(n＝6)。
图21显示CpG-STAT3ASO抑制剂的双向作用可加强人癌症免疫疗法的治疗功效。TLR9不仅由肿瘤相关骨髓细胞(巨噬细胞、小神经胶质细胞和G-MDSC)，而且也由某些癌细胞(肿瘤增殖细胞)表达。治疗诱导的癌细胞死亡(例如在CAR T细胞治疗或放射疗法之后)导致释放TLR9配体，其间接活化肿瘤微环境中的STAT3。TLR9/STAT3信号传导抑制巨噬细胞/小神经胶质细胞分化，同时刺激血管生成和抑制免疫应答。此外，肿瘤增殖细胞中的STAT3活化支持癌自我更新和对疗法的抗性。CSI允许靶向两个TLR9+细胞区室中的STAT3，由此增强总体治疗功效。
公开详述
本文尤其提供一种经分离化合物，其包括靶向部分和反义寡核苷酸。经分离化合物包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)核酸序列缀合于短活化RNA(saRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。saRNA和/或ASO可用2’OMe、锁定核酸修饰。本文也提供本文公开的化合物的组合物和用所公开化合物或组合物治疗有此需要的受试者的疾病的方法。
定义
以下定义出于了解本发明主题和构建随附专利权利要求的目的来包括。本文所用的缩写具有它们在化学和生物领域内的常规含义。
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见例如Singleton等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。类似或等效于本文所述的那些方法、装置和材料的任何方法、装置和材料都可用于实施本公开。提供以下定义以有助于理解本文频繁使用的某些术语，并且不意图限制本公开的范围。
如本文所用，术语“短活化RNA(saRNA)”根据它的平常和普通含义使用，并且是指能够活化或诱导基因表达的RNA。基因特异性saRNA靶向靶标基因的启动子中的序列，并且诱导所述基因的表达。在各实施方案中，saRNA寡聚物可为具有15–30个碱基的双链寡聚物。saRNA寡聚物可为部分双链，具有单链突出部分(参见例如图1A-1F)。双链包括引导链(反义，AS)和过客链(有义链，SS)。在各实施方案中，saRNA可靶向相对于靶标基因的转录起始位点在核苷酸-75至+25之间的区域。在各实施方案中，寡聚物可具有2’化学修饰。在各实施方案中，寡聚物可具有血清稳定性增强性化学修饰，例如硫代膦酸酯(phosphothioate)核苷酸间键联、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’氟核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、通用碱基核苷酸、5-C甲基核苷酸、反向脱氧无碱基(deoxybasic)残基并入、或锁定核酸。
如本文所用，反义寡核苷酸(ASO)根据它的平常和普通含义使用，并且是指靶向基因的转录物以降低基因产物的表达的寡核苷酸。在各实施方案中，反义寡核苷酸是抗基因X反义寡核苷酸序列。举例来说，STAT的ASO可被称为“抗STAT反义寡核苷酸序列”。抗STAT1寡核苷酸是降低或抑制在人中由STAT1基因编码的信号转导子和转录活化子1(STAT1)转录因子的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。它是STAT蛋白质家族的成员。抗STAT2寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子2(STAT2)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。抗STAT3寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子3(STAT3)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。抗STAT4寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子4(STAT4)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。抗STAT5A寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子5A(STAT5A)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。抗STAT5B寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子5B(STAT5B)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。抗STAT6寡核苷酸是降低或抑制信号转导子和转录活化子6(STAT6)的信使RNA(mRNA)的翻译水平的寡核苷酸。
在各实施方案中，寡聚物可具有2’化学修饰。在各实施方案中，寡聚物可具有血清稳定性增强性化学修饰，例如硫代膦酸酯核苷酸间键联、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’氟核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、通用碱基核苷酸、5-C甲基核苷酸、反向脱氧无碱基残基并入、或锁定核酸(LNA)。
如本文所用，术语“硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(“ODN”)”是指其中一些或所有核苷酸间键联构成硫代磷酸酯键联的核酸序列，例如“CpG核酸序列”、“GpC核酸序列”或“PS(硫代磷酸化)核酸序列”。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)具有15至30个碱基的长度，单链，和/或部分或完全硫代磷酸化。部分硫代磷酸化ODN可为其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸间键联构成硫代磷酸酯键联的ODN。在序列内，硫代磷酸化可以2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或所有核苷酸串起。在各实施方案中，一些寡脱氧核苷酸未被硫代磷酸化。
如本文所用，术语“CpG核酸序列”是指包括CpG基序的核酸，其中5’C核苷酸通过磷酸二酯核苷酸间键联或磷酸二酯衍生物核苷酸间键联来连接于3’G核苷酸。在各实施方案中，CpG基序包括磷酸二酯核苷酸间键联。在各实施方案中，CpG基序包括磷酸二酯衍生物核苷酸间键联。在各实施方案中，CpG基序包括硫代磷酸酯键联。
如本文所用，术语“GpC核酸序列”是指包括GpC基序的核酸，其中5’G核苷酸通过磷酸二酯核苷酸间键联或磷酸二酯衍生物核苷酸间键联来连接于3’C核苷酸。在各实施方案中，GpC基序包括磷酸二酯核苷酸间键联。在各实施方案中，GpC基序包括磷酸二酯衍生物核苷酸间键联。在各实施方案中，GpC基序包括硫代磷酸酯键联。
如本文所用，术语“完全硫代磷酸化ODN”是指其中所有核苷酸间键联都是硫代磷酸酯键联的寡核苷酸(例如CpG-ODN或GpC-ODN)。
如本文所用，术语“A类(Class A/A-class)CpG ODN”或“D型CpG ODN”或“A类CpGDNA序列”根据它在生物和化学科学中的普通含义使用，并且是指包括CpG基序的寡脱氧核苷酸，其在5’末端、3’末端或两个末端具有一个或多个多聚G序列；具有包括CpG基序的内部回文序列；具有一个或多个连接脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在各实施方案中，A类CpGODN包括在5’末端、3’末端或两个末端的多聚G序列；包括CpG基序的内部回文序列；和一个或多个连接脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在各实施方案中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。A类CpG ODN的实例包括ODN D19、ODN 1585、ODN 2216和ODN 2336。
如本文所用，术语“B类(Class B/B-class)CpG ODN”或“K型CpG ODN”或“B类CpGDNA序列”根据它在生物和化学科学中的普通含义使用，并且是指包括CpG基序的寡脱氧核苷酸，其包括一个或多个包括CpG基序的6聚体基序；连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在各实施方案中，B类CpG ODN包括一个或多个拷贝的包括CpG基序的6聚体基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在各实施方案中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。在各实施方案中，B类CpG ODN包括一个包括CpG基序的6聚体基序。在各实施方案中，B类CpG ODN包括两个拷贝的包括CpG基序的6聚体基序。在各实施方案中，B类CpG ODN包括三个拷贝的包括CpG基序的6聚体基序。在各实施方案中，B类CpG ODN包括四个拷贝的包括CpG基序的6聚体基序。B类CpG ODN的实例包括ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006和ODN 2007。
如本文所用，术语“C类(Class C/C-class)CpG ODN”或“C型CpG DNA序列”根据它在生物和化学科学中的普通含义使用，并且是指包括回文序列(其包括CpG基序)和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物(硫代磷酸酯)的寡脱氧核苷酸。C类CpG ODN的实例包括ODN 2395和ODN M362。
本文所用的缩写具有它们在化学和生物领域内的常规含义。本文阐述的化学结构和化学式根据化学领域中已知的标准化合价规则构建。
当取代基团由它们的从左至右加以书写的常规化学式指定时，它们同等涵盖将由从右至左书写结构所产生的化学相同取代基，例如-CH2O-等同于-OCH2-。
除非另外陈述，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“烷基”意指直链(即未分支)或支链非环状碳链(或碳)或其组合，其可为完全饱和的，单不饱和的或多不饱和的，并且可包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即C1-C10意指1至10个碳)。饱和烃基团的实例包括但不限于诸如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2、4-戊二烯基、3-(1、4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。烷氧基是通过氧接头(-O-)连接于分子的其余部分的烷基。
除非另外陈述，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烷基”意指由烷基衍生的二价基团，如由-CH2CH2CH2-所例示，而非由其所限制。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。除非另外陈述，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烯基”意指由烯衍生的二价基团。
除非另外陈述，否则单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”意指稳定非环状直链或支链或其组合，包括至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子，并且其中氮和硫原子可任选被氧化，并且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N、P、S和Si可被放置在杂烷基的任何内部位置处或烷基连接于分子的其余部分所处的位置处。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。多达两个或三个杂原子可为连续的，诸如像-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。
类似地，除非另外陈述，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烷基”意指由杂烷基衍生的二价基团，如由-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示，而非由其所限制。对于亚杂烷基，杂原子也可占据链末端中的任一者或两者(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团的定向不由书写连接基团的化学式所采用的方向所暗示。举例来说，式-C(O)2R'-代表-C(O)2R'-与-R'C(O)2-两者。如上所述，如本文所用的杂烷基包括通过杂原子连接于分子的其余部分的那些基团，诸如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R”、-OR'、-SR'和/或-SO2R'。当叙述“杂烷基”，继之以叙述特定杂烷基诸如-NR'R”等时，应了解术语杂烷基和-NR'R”不是冗余的或互相排斥的。更确切来说，叙述特定杂烷基以增添明晰性。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除特定杂烷基，诸如-NR'R”等。
除非另外陈述，否则单独或与其它术语组合的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别意指环状非芳族形式的“烷基”和“杂烷基”，其中组成一个或多个环的碳由于所有碳化合价都参与和非氢原子的键合而未必需要键合于氢。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接于分子的其余部分所处的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。单独或作为另一取代基的一部分的“亚环烷基”和“亚杂环烷基”分别意指由环烷基和杂环烷基衍生的二价基团。
除非另外陈述，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“卤代基”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”的术语意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。举例来说，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另外陈述，否则术语“酰基”意指-C(O)R，其中R是取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
除非另外陈述，否则术语“芳基”意指多不饱和芳族烃取代基，其可为单环或稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接(例如联苯)的多环(优选是1至3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多环，其中至少一个稠环是芳基环。术语“杂芳基”是指含有至少一个诸如N、O或S的杂原子的芳基(或芳基环)，其中氮和硫原子任选被氧化，并且氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多环，其中至少一个稠环是杂芳族环)。5,6稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有5个成员，而另一环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样，6,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6个成员，而另一环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。并且6,5-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6个成员，而另一环具有5个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可通过碳或杂原子连接于分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上指示的芳基和杂芳基环系统各自的取代基选自下述可接受的取代基的组。单独或作为另一取代基的一部分的“亚芳基”和“亚杂芳基”分别意指由芳基和杂芳基衍生的二价基团。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、苯硫基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、苯并噁二唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二噁烷基、硫杂萘烷基、吡咯并吡啶基、吲唑基、喹啉基、喹喔啉基、吡啶并吡嗪基、喹唑啉酮基、苯并异噁唑基、咪唑并吡啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并苯硫基、苯基、萘基、联苯、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、嘌呤基、苯并咪唑基、异喹啉基、噻二唑基、噁二唑基、吡咯基、二唑基、三唑基、四唑基、苯并噻二唑基、异噻唑基、吡唑并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、苯并三唑基、苯并噁唑基或喹啉基。以上实例可为取代或未取代的，并且以上各杂芳基实例的二价基团是亚杂芳基的非限制性实例。
稠环杂环烷基-芳基是稠合于杂环烷基的芳基。稠环杂环烷基-杂芳基是稠合于杂环烷基的杂芳基。稠环杂环烷基-环烷基是稠合于环烷基的杂环烷基。稠环杂环烷基-杂环烷基是稠合于另一杂环烷基的杂环烷基。稠环杂环烷基-芳基、稠环杂环烷基-杂芳基、稠环杂环烷基-环烷基或稠环杂环烷基-杂环烷基可各自独立地未被取代或被一个或多个本文所述的取代基取代。
如本文所用的术语“氧代基”意指双重键合于碳原子的氧。
如本文所用的术语“烷基磺酰基”意指具有式-S(O2)-R'的部分，其中R'是如上定义的取代或未取代的烷基。R'可具有指定数目的碳(例如“C1-C4烷基磺酰基”)。
以上术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自包括指示的基团的取代形式与未取代形式两者。以下提供各类型的基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括常被称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自但不限于以下的多种基团中的一者或多者：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、
Figure BDA0001577668900000181
Figure BDA0001577668900000182
-CN、-NO2，数目在0至(2m'+1)的范围内，其中m'是所述基团中的碳原子总数。R、R'、R”、R”'和R””各自优选独立地指代氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明化合物包括超过一个例如R基团时，独立地选择各R基团，当存在超过一个各R'、R”、R”'和R””基团时，也是独立地选择这些基团。当R'和R"连接于同一氮原子时，它们可与氮原子组合以形成4、5、6或7元环。举例来说，-NR'R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据以上对取代基的讨论，本领域技术人员将了解术语“烷基”意图包括以下基团：所述基团包括结合于除氢基团以外的基团的碳原子，诸如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于对于烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基是变化的，并且选自例如：-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、
Figure BDA0001577668900000191
Figure BDA0001577668900000192
-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目在0至芳族环系统上开放化合价的总数的范围内；并且其中R'、R”、R”'和R””优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明化合物包括超过一个例如R基团时，独立地选择各R基团，当存在超过一个各R'、R”、R”'和R””基团时，也是独立地选择这些基团。
两个或更多个取代基可任选接合以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。尽管未必，但所述所谓成环取代基通常见于与环状基础结构连接。在一个实施方案中，成环取代基连接于基础结构的邻近成员。举例来说，两个成环取代基连接于环状基础结构的邻近成员产生稠环结构。在另一实施方案中，成环取代基连接于基础结构的单一成员。举例来说，两个成环取代基连接于环状基础结构的单一成员产生螺环结构。在另一实施方案中，成环取代基连接于基础结构的非邻近成员。
芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选形成具有式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR'-或单键，并且q是0至3的整数。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被具有式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地是-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的一个单键可任选被双键替换。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被具有式-(CRR')s-X'-(C”R”R”')d-的取代基替换，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X'是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。取代基R、R'、R”和R”'优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。
如本文所用，术语“杂原子”或“环杂原子”意图包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
如本文所用的“取代基团”意指选自以下部分的基团：
(A)氧代基、卤素、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、
Figure BDA0001577668900000201
Figure BDA0001577668900000202
-NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、
Figure BDA0001577668900000203
-N3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(B)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：
(i)氧代基、卤素、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、
Figure BDA0001577668900000204
Figure BDA0001577668900000205
-NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、
Figure BDA0001577668900000206
-N3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(ii)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：
(a)氧代基、卤素、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、
Figure BDA0001577668900000207
Figure BDA0001577668900000211
-NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、
Figure BDA0001577668900000212
-N3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、
Figure BDA0001577668900000213
-NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、
Figure BDA0001577668900000214
-N3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基。
如本文所用的“尺寸受限制的取代基”或“尺寸受限制的取代基团”意指选自以上对于“取代基团”所述的所有取代基的基团，其中各取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C20烷基，各取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至20元杂烷基，各取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，各取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至8元杂环烷基，各取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且各取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至10元杂芳基。
如本文所用的“低级取代基”或“低级取代基团”意指选自以上对于“取代基团”所述的所有取代基的基团，其中各取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至7元杂环烷基，各取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且各取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至9元杂芳基。
在一些实施方案中，本文化合物中所述的各取代的基团被至少一个取代基团取代。更具体来说，在一些实施方案中，本文化合物中所述的各取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的亚杂烷基、取代的亚环烷基、取代的亚杂环烷基、取代的亚芳基和/或取代的亚杂芳基被至少一个取代基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一者或全部被至少一个尺寸受限制的取代基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一者或全部被至少一个低级取代基团取代。
在本文化合物的其它实施方案中，各取代或未取代的烷基可为取代或未取代的C1-C20烷基，各取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至20元杂烷基，各取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，各取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至8元杂环烷基，各取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至10元杂芳基。在本文化合物的一些实施方案中，各取代或未取代的亚烷基是取代或未取代的C1-C20亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基是取代或未取代的2至20元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C8亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3至8元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基是取代或未取代的5至10元亚杂芳基。
在一些实施方案中，各取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至7元杂环烷基，各取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至9元杂芳基。在一些实施方案中，各取代或未取代的亚烷基是取代或未取代的C1-C8亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基是取代或未取代的2至8元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C7亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3至7元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基是取代或未取代的5至9元亚杂芳基。在一些实施方案中，化合物是以下实施例章节中阐述的化学物质。
如本文所用，术语“缀合”在涉及两个部分时意指两个部分被键合，其中一个或多个连接两个部分的键可为共价的或非共价的。在各实施方案中，两个部分共价键合于彼此(例如直接或通过共价键合的中间物)。在各实施方案中，两个部分被非共价键合(例如通过离子键、范德华氏键(van der waal’s bond)/相互作用、氢键、极性键或其组合或混合)。
此外，本领域普通技术人员应了解如本文所述的合成方法利用多种保护基。如本文所用，术语“经保护反应性基团”是指暂时封阻以使反应可在多官能化合物中的另一反应性位点处选择性进行的特定官能部分(例如氧、硫、氮和碳)。可在合成化合物期间在适当阶段时使用为本领域普通技术人员所知的方法引入和移除保护基。根据如文献中所述的标准有机合成方法来应用保护基(参见例如：Theodora W.Green和Peter G.M.Wuts(2007)Protecting Groups in Organic Synthesis,第4版,John Wiley and Sons；R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；以及L.Paquette编,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wileyand Sons(1995)；其各自关于保护基以引用的方式并入本文)。本文详述某些示例性保护基，然而，应了解本发明不意图限于这些保护基；更确切来说，可根据为本领域技术人员所知的方法利用多种额外等效保护基。
示例性醇保护基包括但不限于甲基醚、取代的甲基醚(例如MOM(甲氧基甲基醚)、MTM(甲基硫基甲基醚)、BOM(苯甲基氧基甲基醚)、PMBM(对甲氧基苯甲基氧基甲基醚)、任选取代的乙基醚、任选取代的苯甲基醚、甲硅烷基醚(例如TMS(三甲基甲硅烷基醚)、TES(三乙基甲硅烷基醚)、TIPS(三异丙基甲硅烷基醚)、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基醚)、三苯甲基甲硅烷基醚、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基醚)、酯(例如甲酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯(Bz)、三氟乙酸酯、二氯乙酸酯)、碳酸酯、环状缩醛和缩酮。在各实施方案中，羟基可被保护为醚(—OR*)或酯(-OC(═O)R*)，其中R*是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)或取代或未取代的杂芳基。示例性经保护羟基包括保护为以下的羟基：叔丁基醚；苯甲基、二苯甲基(二苯基甲基)或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰基酯(-OC(═O)CH3或-OAc)。
示例性氨基保护基包括但不限于氨基甲酸酯(包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、取代的氨基甲酸乙酯(例如Troc)、氨基甲酸叔丁酯(Boc)和氨基甲酸苯甲酯(Cbz))、酰胺、环状亚胺衍生物、N-烷基胺和N-芳基胺、亚胺衍生物、烯胺衍生物等。举例来说，经保护氨基包括保护为以下的氮基团：酰胺(—NR*C(═O)R*)或氨基甲酸酯(-NR*C(═O)OR*)，其中各R*独立地是氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)或取代或未取代的杂芳基。在各实施方案中，经保护氨基是例如：甲基酰胺(—NHC(═O)CH3)；氨基甲酸苯甲酯(—NHC(═O)OCH2C6H5)；呈氨基甲酸叔丁酯(—NHC(═O)OC(CH3)3)形式；9-芴基甲氧基酰胺(—NHFmoc)，呈6-硝基藜芦基氧基酰胺(—NHNvoc)形式，呈2-三甲基甲硅烷基乙基氧基酰胺(—NHTeoc)形式，呈2,2,2-三氯乙基氧基酰胺(—NHTroc)形式，呈烯丙基氧基酰胺(—NHAlloc)形式，呈2-(苯基磺酰基)乙基氧基酰胺(—NHPsec)形式；或在适合情况(例如环胺)下，呈氮氧自由基形式。
示例性巯基保护基包括但不限于硫醚(-SR*)，其中R*是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)或取代或未取代的杂芳基。在各实施方案中，经保护巯基是例如：取代或未取代的苯甲基硫醚、叔丁基硫醚、4-甲基苯甲基硫醚、三苯甲基硫醚、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TMSE)硫醚、2-氰基乙基硫醚、9-芴基甲基(Fmoc)硫醚、或乙酰胺基甲基醚(—SCH2NHC(═O)CH3)。
在各实施方案中，点击化学反应性基团是或包括叠氮基团、烯基团、氨基、N-羟基丁二酰亚胺基团、巯基、二乙烯基砜衍生物或顺丁烯二酰亚胺基衍生物。因此，在各实施方案中，接头被反应性基团(例如点击化学反应性基团)或经保护反应性基团取代，所述基团包括例如经保护氨基或N-羟基丁二酰亚胺基团，其适于通过N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学来进行缀合；可与二乙烯基砜缀合的巯基；可与1-烷基-3-甲基丙烯酰(丙烯酰)氯或丙烯酰基衍生物缀合的经保护巯基；可与顺丁烯二酰亚胺基衍生物缀合的经保护巯基。
“标记”或“可检测部分”是可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其它物理手段来检测的组合物。举例来说，适用可检测部分包括32P、荧光染料、电子密集试剂、酶(例如如通常在ELISA中所用)、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米粒子、超小超顺磁性氧化铁(“USPIO”)纳米粒子、USPIO纳米粒子聚集体、超顺磁性氧化铁(“SPIO”)纳米粒子、SPIO纳米粒子聚集体、单晶SPIO、单晶SPIO聚集体、单晶氧化铁纳米粒子、单晶氧化铁、其它纳米粒子造影剂、含有钆螯合物(“Gd螯合物”)分子的脂质体或其它递送载体、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如经氟-18标记)、任何γ射线发射性放射性核素、正电子发射性放射性核素、经放射性标记葡萄糖、经放射性标记水、经放射性标记氨、生物胶体、微泡(例如包括微泡壳体，其包括白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物；微泡气体核心，其包括空气、重质气体、全氟化碳、氮气、八氟丙烷、全氟己烷(perflexane)脂质微球体、全氟丙烷(perflutren)等)、碘化造影剂(例如碘海醇(iohexol)、碘克沙醇(iodixanol)、碘佛醇(ioversol)、碘帕醇(iopamidol)、碘昔兰(ioxilan)、碘普罗胺(iopromide)、泛影酸盐(diatrizoate)、甲基泛影酸盐(metrizoate)、碘克沙酸盐(ioxaglate))、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记并入与靶标肽具有特异性反应性的肽或抗体中来使得可检测的其它实体。可检测部分也包括囊封在纳米粒子、粒子、聚集体中，用额外组合物涂布，经衍生以结合靶向剂(例如本文所述的化合物)的任何以上组合物。可采用本领域中已知的用于使寡核苷酸或蛋白质缀合于标记的任何方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中所述的方法。
如本文所用的术语“细胞”也指个别细胞、细胞系或由所述细胞获得的培养物。“培养物”是指包含相同或不同类型的经分离细胞的组合物。
术语“同一”或“同一性”百分比在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即当历经比较窗或指定区域比较并比对以达成最大对应性时，历经规定区域具有约60％同一性、优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法在下述缺省参数下所测量，或通过手动比对和目视检查所测量(参见例如NCBI网站等)。所述序列于是被称为“基本上同一”。这个定义也涉及或可应用于测试序列的互补序列。所述定义也包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。如下所述，优选算法可虑及空位等。优选地，历经长度是至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域，或更优选地，历经长度是10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域存在同一性。如本文所用，氨基酸序列同一性百分比(％)定义为在比对序列以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参照序列中的氨基酸同一的氨基酸的百分比。出于确定序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的电脑软体，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可通过已知方法来确定适于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。优选地，可使用缺省程序参数，或可指定替代性参数。序列比较算法接着基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
“患者”、“受试者”、“有此需要的患者”和“有此需要的受试者”在本文中可互换使用，并且是指罹患或易患可通过使用本文提供的方法和组合物进行施用来治疗的疾病或病状的活生物体。非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿和其它非哺乳动物动物。在一些实施方案中，患者是人。也涵盖生物实体的在体外获得或在体外培养的组织、细胞和它们的子代。
如本文所用，术语“施用”意指口服施用，以栓剂形式施用，局部接触，静脉内、胃肠外、腹膜内、肌肉内、病变内、鞘内、鼻内或皮下施用，或向受试者中植入缓慢释放装置例如小型渗透泵。施用通过任何途径来达成，包括胃肠外和经粘膜(例如经颊、舌下、经腭、经齿龈、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)。胃肠外施用包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、室内和颅内。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴片等。
如本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”和其它语法同义语包括缓和、减弱、改善或预防疾病、病状或症状，预防额外症状，改善或预防症状的潜伏代谢原因，抑制疾病或病状，例如遏止疾病或病状的发展，缓解疾病或病状，导致疾病或病状的消退，缓解由疾病或病状引起的病状，或终止疾病或病状的症状，并且意图包括防治。所述术语还包括实现治疗益处和/或防治益处。就治疗益处来说，其意指根除或改善所治疗的潜伏病症。此外，以根除或改善一种或多种与潜伏病症相关的生理症状以使在患者中观察到改进来实现治疗益处，纵使患者可仍然受潜伏病症折磨。
如本文所用的术语“预防(prevent/preventing/prevention)”和其它语法同义语包括避开显现、出现疾病或病状症状，阻碍或避免疾病或病状症状，以及使症状的出现减少。预防可为完全的(即无可检测症状)或部分的，以致观察到的症状少于将可能在不存在治疗下出现的症状。所述术语还包括防治益处。对于待预防的疾病或病状，可向处于显现特定疾病的风险下的患者，或向尽管可尚未对疾病进行诊断，但报告这个疾病的一种或多种生理症状的患者施用组合物。
术语“抑制”也意指相对于在不存在本公开的化合物或组合物下的状态，使效应(疾病状态或基因/蛋白质/mRNA的表达水平)降低。
如本文所用的“测试化合物”是指在筛选过程中用于鉴定对特定化生物靶标或路径的活性、非活性或其它调节作用的实验化合物。
“对照”或“对照实验”根据它的平常普通含义使用，并且是指以下实验：其中如同在平行实验中一样处理所述实验的受试者或试剂，例外之处是省略所述实验的程序、试剂或变量。在一些情况下，对照作为比较标准用于评估实验效应。在一些实施方案中，对照是在不存在如本文(包括实施方案和实施例)所述的化合物下测量蛋白质的活性。
“疾病”或“病状”是指能够用本文提供的化合物或方法治疗的患者或受试者的存在状态或健康状况。在一些情况下，“疾病”或“病状”是指“癌症”。
如本文所用，术语“癌症”是指见于哺乳动物中的所有类型的癌症、赘瘤、恶性或良性肿瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性癌症包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌和胰腺癌。额外实例包括白血病(例如急性骨髓性白血病(“AML”)或慢性骨髓源性白血病(“CML”))、脑癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肉瘤和前列腺癌、子宫颈癌、胃癌、头颈部癌、子宫癌、间皮瘤、转移性骨癌、神经管母细胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血病、原发性脑肿瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘瘤。
“接触”根据它的平常普通含义使用，并且是指使至少两种不同物质(例如包括生物分子的化合物或细胞)变得足够邻近以进行反应、相互作用或物理触碰的过程。然而，应了解所得反应产物可直接由添加试剂之间的反应产生，或由从一种或多种添加试剂获得的可在反应混合物中产生的中间体产生。在一些实施方案中，接触包括使本文所述的化合物与蛋白质或酶相互作用。
如本文所用的术语“表型(phenotype)”和“表型性(phenotypic)”是指生物体的可观察特征，诸如疾病症状的发作或进展、生物化学性质或生理性质。
如本文关于DNA核酸序列(例如基因)所用的措辞“表达”或“经表达”意指那个序列的转录和/或翻译产物。可基于存在于细胞内的相应mRNA的量或由所述细胞产生的由DNA编码的蛋白质的量来测定所述细胞中那个DNA分子的表达水平(Sambrook等,1989MolecularCloning:A Laboratory Manual,18.7-18.88)。当关于多肽使用时，表达包括多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可使用用于检测蛋白质的常规技术(例如ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学分析等)检测表达。
术语“基因”意指涉及产生蛋白质的DNA区段；它包括在编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)以及在个别编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。前导序列、尾随序列以及内含子包括在基因的转录和翻译期间所必要的调控元件。此外，“蛋白质基因产物”是从特定基因表达的蛋白质。
关于多核苷酸或多肽的术语“…的量”是指检测到组分或要素所处的量。量可针对对照来测量，例如其中相对于对照，特定多核苷酸或多肽的水平增加证明富含所述多核苷酸或多肽。因此，在各实施方案中，量增加指示本文所述的HSPC向宿主(例如小鼠)中的移植水平或效率较高。所述术语涉及定量测量富集以及定性测量相对于对照的增加或降低。
在本说明书的整个描述和权利要求中，措辞“包含(包括)(comprise)”和所述措辞的其它形式诸如“包含(包括)(comprising/comprises)”意指包括但不限于，并且不意图排除例如其它组分。
“类似物(Analog/analogue)”或“衍生物”根据它在化学和生物学内的平常普通含义使用，并且是指在结构上类似于另一试剂(即所谓“参照”剂)，但在组成方面不同的化学剂，例如一个原子被不同元素的原子替换，或存在特定官能团，或一个官能团被另一官能团替换，或在参照剂的手性中心的绝对立体化学方面不同。在一些实施方案中，衍生物可为与药学上可接受的试剂例如磷酸酯或膦酸酯的缀合物。
如本文所用，术语“盐”是指本文所用的试剂的酸盐或碱盐。可接受的盐的说明性但非限制性实例是矿物酸(盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐和季铵(碘代甲烷、碘代乙烷等)盐。
术语“药学上可接受的盐”意图包括活性化合物的视见于本文所述的化合物上的特定取代基而定，用相对无毒酸或碱制备的盐。当本公开化合物含有相对酸性官能基时，可通过使所述化合物的中性形式与足量的纯的或于适合惰性溶剂中的所需碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似盐。当本公开化合物含有相对碱性官能基时，可通过使所述化合物的中性形式与足量的纯的或于适合惰性溶剂中的所需酸接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括由无机酸，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等获得的那些，以及由相对无毒有机酸，如乙酸、丙酸、异丁酸、顺丁烯二酸、丙二酸、苯甲酸、丁二酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、杏仁酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯基磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲烷磺酸等获得的盐。也包括氨基酸的盐诸如精氨酸盐等，以及如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的有机酸的盐(参见例如Berge等,Journal of PharmaceuticalScience 66:1-19(1977))。本公开的某些特定化合物含有允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐的碱性官能基与酸性官能基两者。为本领域技术人员所知的其它药学上可接受的载体适于本公开。盐倾向于比相应游离碱形式更可溶于水性或其它质子性溶剂中。在其它情况下，制剂可为在1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露糖醇中，在4.5至5.5的pH范围下冻干的粉末，其在使用之前与缓冲液组合。
因此，本公开化合物可以诸如与药学上可接受的酸的盐形式存在。本公开包括所述盐。所述盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、硝酸盐、顺丁烯二酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、丁二酸盐、苯甲酸盐和与诸如谷氨酸的氨基酸的盐。这些盐可通过为本领域技术人员所知的方法来制备。
“佐剂”(来自拉丁语adiuvare：表示用以辅助的意思)是改进其它试剂的作用的药理学和/或免疫学试剂。
“稀释剂(diluent)”(也被称为填充剂、稀释剂(dilutant)或稀释剂(thinner))是稀释试剂。某些流体太粘稠以致不能轻易泵送，或太致密以致不能从一个特定点流动至另一特定点。这可成问题，因为以这个状态运输所述流体可能在经济上不可行。为使这个受限运动容易，添加稀释剂。这使流体的粘度降低，由此也使泵送/运输成本降低。
术语“施用(administration/administering)”是指向需要治疗的个体提供本发明实施方案的药剂或包括本发明实施方案的药剂的药物组合物的举动。
就“共同施用”来说，其意指在施用额外疗法的同时，就在此举之前或就在此举之后施用本文所述的组合物。本公开的化合物或组合物可向患者单独施用，或可向患者共同施用。共同施用意图包括个别地或以组合形式(超过一种化合物或药剂)同时或依序施用化合物。当需要时，也可使制剂与其它活性物质组合(例如以使代谢降解降低)。
如本文所用，“依序施用”包括两种药剂(例如本文所述的化合物或组合物)的施用在同一天分开发生，或不在同一天发生(例如在连续日发生)。
如本文所用，“并行施用”包括在持续时间方面至少部分重叠。举例来说，当并行施用两种药剂(例如本文所述的具有生物活性的任何药剂或任何类别的药剂)时，它们的施用在某一所需时间内发生。药剂的施用可在同一天开始和结束。一种药剂的施用也可在第二药剂的施用之前一天或多天，只要两种药剂至少一次在同一天服用即可。类似地，一种药剂的施用可延伸超出第二药剂的施用，只要两种药剂至少一次在同一天服用即可。生物活性剂/药剂不必每天同时服用以包括并行施用。
如本文所用，“间歇施用”包括持续一段时期(其可被视为“第一施用时期”)施用药剂，继之以不服用所述药剂或在较低维持剂量下服用所述药剂所处的时间(其可被视为“断开时期”)，随后是再次施用所述药剂所处的时期(其可被视为“第二施用时期”)。通常，在第二施用期期间，药剂的剂量水平将匹配在第一施用时期期间施用的剂量水平，但可根据医学需要进行增加或降低。
如本文所用，术语“施用”意指口服施用，以栓剂形式施用，局部接触，静脉内、胃肠外、腹膜内、肌肉内、病变内、鞘内、鼻内或皮下施用，或向受试者中植入缓慢释放装置例如小型渗透泵。施用通过任何途径来达成，包括胃肠外和经粘膜(例如经颊、舌下、经腭、经齿龈、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)。胃肠外施用包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴片等。
本文公开的组合物可配制成涂敷棒、溶液、混悬液、乳液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、胶状物、涂剂、粉剂和气雾剂，通过局部途径来经皮递送。口服制剂包括适于由患者摄取的片剂、丸剂、粉剂、糖衣片、胶囊、液体、糖锭、扁囊剂、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬液等。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。液体形式制剂包括溶液、混悬液和乳液，例如水溶液或水/丙二醇溶液。本公开的组合物可另外包括用以提供持续释放和/或舒适性的组分。所述组分包括高分子量阴离子拟粘液(mucomimetic)聚合物、胶凝性多糖和精细分散的药物载体基质。这些组分更加详细讨论于美国专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中。这些专利的整个内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本文公开的组合物也可以微球体形式递送以达成在身体内缓慢释放。举例来说，微球体可通过真皮内注射在皮下缓慢释放的含有药物的微球体(参见Rao,J.Bioniater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；以可生物降解和可注射的凝胶制剂形式(参见例如Gao Phann.Res.12:857-863,1995)；或以用于口服施用的微球体形式(参见例如Eyles,J.Phann.Pharmacol.49:669-674,1997)来施用。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是足以实现所需生物作用诸如有益结果(包括临床结果)的那个量。因此，“有效量”取决于它被施加所处的情形。有效量可根据本领域中已知的因素诸如所治疗的个体的疾病状态、年龄、性别和重量而变化。可每日施用若干分次剂量，或可如由治疗情况的紧急性所指示，按比例降低剂量。另外，本公开的组合物/制剂可根据需要频繁施用以达到治疗量。
药物组合物可包括其中以治疗有效量，即以有效实现它的预定目的的量含有治疗性药物(例如包括实施方案或实施例的本文所述的药剂)的组合物。有效用于特定应用的实际量将尤其取决于所治疗的病状。当在用以治疗疾病的方法中施用时，所述组合物将含有有效实现所需结果的量的治疗性药物，所述结果例如是调节靶标分子的活性，和/或降低、消除或减缓疾病症状的进展。
向哺乳动物施用的剂量和频率(单次或多次剂量)可视多种因素而变化，例如所述哺乳动物是否罹患另一疾病以及它的施用途径；接受者的身材、年龄、性别、健康状况、体重、身体质量指数和膳食；所治疗的疾病的症状的性质和程度、并行治疗的种类、由所治疗的疾病所致的并发症或其它健康相关问题。其它治疗方案或药剂可与本公开的方法和药剂联合使用。调整和操作所确定剂量(例如频率和持续时间)完全属于本领域技术人员的能力。
对于任何本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可最初由细胞培养测定加以确定。目标浓度将为治疗性药物的能够实现本文所述的方法的那些浓度，如使用本文所述或本领域中已知的方法所测量。
如本领域中所熟知，用于人中的治疗有效量也可由动物模型确定。举例来说，可配制用于人的剂量以实现已被发现在动物中有效的浓度。如上所述，可通过监测药剂的有效性以及向上或向下调整剂量来调整人中的剂量。基于上述方法和其它方法调整剂量以在人中实现最大功效完全属于普通熟练技术人员的能力。
剂量可视患者的需求和所采用的治疗性药物而变化。向患者施用的剂量应足以随时间在患者中实现有益治疗响应。剂量的大小也将由任何不利副作用的存在性、性质和程度决定。确定适于特定情况的剂量属于从业者的技能。通常，治疗以小于药剂的最优剂量的较小剂量启动。此后，以小增量增加剂量直至达到在各情况下的最优效应。剂量和间隔可个别地加以调整以提供施用药剂的对所治疗的特定临床适应症有效的水平。这将提供与个体的疾病状态的严重性相称的治疗方案。
除非相反地明确陈述，否则组分的重量百分比基于其中包括所述组分的制剂或组合物的总重量。
“赋形剂”在本文中用于包括可含于所公开药剂中或与所公开药剂组合的任何其它试剂，其中赋形剂不是治疗或生物活性剂/药剂。因此，赋形剂应是药学上或生物学上可接受的或相关的(例如赋形剂应大体上对个体无毒)。“赋形剂”包括单一所述试剂，并且也意图包括多种赋形剂。出于本公开的目的，术语“赋形剂”和“载体”在本公开的一些实施方案中可互换使用，并且所述术语在本文中定义为“用于实施对安全和有效的药物组合物的配制的成分”。
术语“约”是指在药剂的浓度或量方面的不改变所述药剂制备制剂和治疗疾病或病症的功效的任何最小改变。关于本公开的药剂(例如治疗剂/活性剂)的浓度范围的术语“约”也指陈述量或范围的将为有效量或范围的任何变化形式。
范围在本文中可被表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表示这种范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当值通过使用先行词“约”来被表示为近似值时，应了解特定值形成另一方面。应进一步了解各范围的端点关于另一端点以及独立于另一端点均是有意义的。也应了解存在本文公开的许多值，并且各值除所述值自身之外在本文中也被公开为“约”那个特定值。也应了解在整篇本申请中，数据以许多不同格式提供，并且这个数据代表终点和起始点以及任何数据点组合的范围。举例来说，如果公开特定数据点“10”和特定数据点“15”，那么应了解大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15被视为加以公开，以及在10与15之间也被视为加以公开。也应了解也公开两个特定单元之间的各单元。举例来说，如果公开10和15，那么也公开11、12、13和14。
化合物
在一个方面，本公开包括一种经分离化合物，其包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于目标基因的反义核酸序列或短活化RNA(saRNA)。在各实施方案中，硫代磷酸化ODN是长度为15至30个碱基的单链部分或完全硫代磷酸化寡脱氧核苷酸。在各实施方案中，经分离化合物具有式：PODN-L-ANA(I)或PODN-L-saRNA(II)。在式(I)和(II)中，PODN是硫代磷酸化ODN，并且L是接头诸如共价接头。在式(I)中，ANA是反义核酸序列。在式(II)中，saRNA是短活化RNA。
在各实施方案中，经分离化合物包括与缀合于反义寡核苷酸(ASO)的具有序列SEQID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者的连续15核苷碱基序列具有约80％–100％序列同一性的核酸序列。在各实施方案中，本公开提供一种经分离化合物，其包括与缀合于saRNA的具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者的连续15核苷碱基序列具有约80％–100％序列同一性的核酸序列。在各实施方案中，与具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者的连续15核苷碱基序列具有约80％–100％序列同一性的核酸序列包括缀合于saRNA或ASO的长度是15至30个碱基的单链部分或完全硫代磷酸化寡核苷酸。在各实施方案中，反义寡核苷酸是STAT(STAT1–STAT6)反义寡核苷酸。在各实施方案中，反义寡核苷酸是STAT-3反义寡核苷酸。在各实施方案中，saRNA是CEBP/α、p21或p53的saRNA。
在各实施方案中，本公开的经分离化合物包括与缀合于saRNA或反义寡核苷酸(ASO)的具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者的连续15核苷碱基序列具有约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95％-100％序列同一性的核酸序列。在各实施方案中，与具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者的连续15核苷碱基序列具有约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95％-100％序列同一性的核酸序列包括缀合于saRNA或反义寡核苷酸(ASO)的长度是15至30个碱基的单链部分或完全硫代磷酸化寡核苷酸。
本公开提供一种经分离化合物，其包括具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于短活化RNA(saRNA)或ASO。在各实施方案中，本公开包括一种具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)，其缀合于能够活化CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)的短活化RNA(saRNA)。
在各实施方案中，本公开提供一种具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)，其以在所述具有序列SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)与saRNA或ASO之间接头缀合于所述saRNA或所述ASO。接头可为共价接头。在各实施方案中，接头是或包括取代或未取代的亚烷基或亚杂烷基接头。在各实施方案中，缀合于saRNA的核酸包括超过一个取代或未取代的亚杂烷基接头。接头可在合成期间添加在序列中。在各实施方案中，亚杂烷基接头以间插磷酸酯键连接于彼此。
在各实施方案中，接头是取代或未取代的亚杂烷基或取代或未取代的环-亚杂烷基。如本文所用的“环-亚杂烷基”是在亚杂烷基链内具有一个或多个二价环状部分的亚杂烷基。环状部分可为取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。在各实施方案中，环状部分是取代或未取代的核糖(例如核苷)。在各实施方案中，环状部分充当接头的分支点，由此形成分支接头。环状部分分支点可用于使额外官能部分连接于本文提供的缀合物，所述官能部分诸如是可检测部分、药物部分或生物分子。如以下更详细说明，可使用如本领域中已知的点击化学技术连接额外官能部分。
在各实施方案中，接头(例如式(I)和(II)中的L)是或含有具有下式的部分：
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n-。
在上式中，符号n是整数1至5(例如3)，并且符号z是整数0至50(例如0至25、0至10、或0至5)。在各实施方案中，n是3，并且z是0至5或1至5。在各实施方案中，n是3，并且z是0至4或1至4。在各实施方案中，n是3，并且z是0至3或1至3。在各实施方案中，n是3，并且z是3。
在各实施方案中，接头(例如式(I)和(II)中的L)是或含有具有下式的部分：
-(CH2)n1-PO4-[(CH2)n2-PO4]z-(CH2)n3 -。
在上式中，符号n1、n2和n3独立地是整数1至5(例如3)，并且符号z是整数0至50(例如0至25、0至10、或0至5)。在各实施方案中，n1、n2和n3是3，并且z是0至5或1至5。在各实施方案中，n1、n2和n3是3，并且z是0至4或1至4。在各实施方案中，n1、n2和n3是3，并且z是0至3或1至3。在各实施方案中，n1、n2和n3是3，并且z是3。
举例来说，接头可具有以下结构，其中接头在一端与鸟嘌呤的3’磷酸连接，并且在另一端与胸苷的5’磷酸连接：
Figure BDA0001577668900000391
本领域普通技术人员将立刻了解以上结构中的鸟嘌呤和胸苷可用任何核酸单体/核苷碱基替换。
在各实施方案中，接头包含具有3个碳的亚杂烷基(-OCH2CH2CH2O-)缀合于磷酸部分。亚杂烷基部分可变化(例如接头可包含具有2、4、5、6、7或8个碳的亚杂烷基)。
在各实施方案中，使以上鸟苷连接于ODN核酸序列，并且使胸苷连接于短活化RNA(saRNA)或ASO。
在各实施方案中，接头(例如接头可为亚杂烷基接头)可被反应性基团(例如点击化学反应性基团)或经保护反应性基团取代。反应性基团可用于使硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO化合物缀合于如本文所述的额外官能部分，诸如可检测部分或生物分子(例如靶向部分)。
因此，亚杂烷基接头可包括额外部分的进一步修饰、缀合或连接。
用于使硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO化合物缀合于额外官能部分的反应性基团可为适用于生物缀合化学中的任何可应用反应性基团。参见Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego。
在各实施方案中，反应性基团是点击化学反应性基团。点击化学是指一组快速，简单使用，易于纯化，具有多用途、具有区域特异性，并且给与较高产物产率的反应。在各实施方案中，4种不同点击反应是可能的：(1)环化加成–这些主要是指1,3-偶极环化加成，但也包括杂-狄尔斯-阿德耳环化加成(hetero-Diels-Alder cycloaddition)；(2)亲核开环–这些是指使应变杂环亲电子试剂诸如氮丙啶、环氧化物、环状硫酸酯、氮丙啶
Figure BDA0001577668900000401
离子、表硫
Figure BDA0001577668900000402
离子打开；(3)非醛醇型羰基化学–实例包括形成脲、硫脲、腙、肟醚、酰胺、芳族杂环；(4)碳-碳多重键的加成–实例包括环氧化、氮丙啶化、二羟基化、亚磺酰卤加成、亚硝酰卤加成和某些迈克尔加成(Michael addition)。在各实施方案中，使用的点击反应可为叠氮化物或末端炔的经CuI催化的胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环化加成(HDC)以形成1,2,3-三唑。在各实施方案中，点击反应可为无铜反应。
在各实施方案中，点击化学反应性基团是或包括叠氮基团、烯基团、氨基、N-羟基丁二酰亚胺基团、巯基、二乙烯基砜衍生物或顺丁烯二酰亚胺基衍生物。因此，在各实施方案中，接头被反应性基团(例如点击化学反应性基团)或经保护反应性基团取代，所述基团包括例如经保护氨基或N-羟基丁二酰亚胺基团，其适于通过N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学来进行缀合；可与二乙烯基砜缀合的巯基；可与1-烷基-3-甲基丙烯酰(丙烯酰)氯或丙烯酰基衍生物缀合的经保护巯基；可与顺丁烯二酰亚胺基衍生物缀合的经保护巯基。
以下提供环-亚杂烷基分支接头的一结构实例：
Figure BDA0001577668900000411
如上所示，环-亚杂烷基分支接头在一端与鸟嘌呤的3’磷酸连接，并且在另一端与胸苷的5’磷酸连接。环-亚杂烷基分支接头的部分是分支点，并且是5-取代的胸苷。胸苷在位置5中被含有NHS部分的反应性基团取代，所述反应性基团可充当用以连接于额外官能部分的反应性基团。
以下提供可用于充当含有反应性官能团和经保护反应性官能团的部分分支点的化合物的额外实例。
Fmoc氨基修饰剂C6DT。
Figure BDA0001577668900000421
S-Bz硫醇修饰剂C6-dT。
Figure BDA0001577668900000422
DBCO-dT
Figure BDA0001577668900000431
DBCO-磺基-NHS酯
Figure BDA0001577668900000432
在各实施方案中，接头分支点可为非环状分支点。以下提供可用于充当接头内含有反应性官能团和经保护反应性官能团的非环状部分分支点的化合物的一实例。
Figure BDA0001577668900000433
如上所阐述，反应性基团可用于使硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO化合物缀合于额外官能部分诸如可检测部分、治疗性部分(例如药物部分)、靶向部分或生物分子。额外官能部分包括荧光标记、靶向化合物(骨靶向双膦酸盐)、药物或抗体。在各实施方案中，额外部分是化学反应性部分、可检测部分、治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)、核酸序列、DNA序列或核酸类似物。在各实施方案中，可检测部分是荧光染料、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米粒子、造影剂、磁共振造影剂、X射线造影剂、钆、放射性同位素、放射性核素、氟脱氧葡萄糖、γ射线发射性放射性核素、正电子发射性放射性核素、生物胶体、微泡、碘化造影剂、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、半抗原、蛋白质或荧光部分。在各实施方案中，额外部分是治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)。
在各实施方案中，额外官能部分是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在各实施方案中，额外部分是取代或未取代的C1-C40烷基、取代或未取代的2至40元杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的3至8元杂环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基或取代或未取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，额外部分是取代的C1-C40烷基、取代的2至40元杂烷基、取代的C3-C8环烷基、取代的3至8元杂环烷基、取代的C6-C10芳基或取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，额外官能部分是R1取代的C1-C40烷基、R1取代的2至40元杂烷基、R1取代的C3-C8环烷基、R1取代的3至8元杂环烷基、R1取代的C6-C10芳基或R1取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，额外官能部分是R1取代的C1-C40烷基。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的C1-C40亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C1-C40亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的C3-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的C3-C18亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C3-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C6-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C9-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C9-C18亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C9-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C12-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C12亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C13亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C14亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的直链C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是R1取代的2至40元杂烷基。在各实施方案中，额外官能部分是-(未取代的2至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的直链2至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的5至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的10至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的15至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的20至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的30至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至35元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至30元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至25元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至20元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至10元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至50元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是-(取代的2至60元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，额外官能部分是取代的2至40元杂烷基。在各实施方案中，额外官能部分是取代的10至50元杂烷基。在各实施方案中，额外官能部分是取代的20至40元杂烷基。在各实施方案中，额外官能部分是取代的25至40元杂烷基。在各实施方案中，额外官能部分是取代的30至40元杂烷基。
在各实施方案中，额外官能部分中的R1是可检测部分或治疗性部分。在各实施方案中，额外官能部分中的R1是可检测部分。在各实施方案中，可检测部分是荧光染料、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米粒子、造影剂、磁共振造影剂、X射线造影剂、钆、放射性同位素、放射性核素、氟脱氧葡萄糖、γ射线发射性放射性核素、正电子发射性放射性核素、生物胶体、微泡、碘化造影剂、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、半抗原、蛋白质或荧光部分。在各实施方案中，额外官能部分中的R1是治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)。在各实施方案中，额外官能部分中的R1是H。在各实施方案中，额外官能部分是氧代基。在各实施方案中，额外官能部分是氧。在各实施方案中，额外官能部分是硫。在各实施方案中，额外官能部分是＝S。
在各实施方案中，其它连接取代基包括取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。其它连接取代基可包括连接于反应性基团或额外部分的PEG部分。
在各实施方案中，接头包括未取代的C3亚烷基(例如如上所述，由磷酸二酯连接基团分隔)。在各实施方案中，接头可为未取代的C15亚烷基。在各实施方案中，接头包括未取代的C6至C16亚烷基。在各实施方案中，接头可为取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。在各实施方案中，接头可为取代或未取代的C1-C40亚烷基、取代或未取代的2至40元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3至8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或取代或未取代的5至10元亚杂芳基。在各实施方案中，接头可为未取代的C1-C40亚烷基、未取代的2至40元亚杂烷基、未取代的C3-C8亚环烷基、未取代的3至8元亚杂环烷基、未取代的C6-C10亚芳基或未取代的5至10元亚杂芳基。在各实施方案中，接头可为取代的2至40元亚杂烷基。
接头可为键、核酸序列、两个核酸序列、DNA序列、两个DNA序列、核酸类似物序列、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。
在各实施方案中，接头是或含有取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基(例如通过磷酸二酯连接基团连接的取代或未取代的亚烷基)、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。在各实施方案中，接头是取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2至20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3至8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或取代或未取代的5至10元亚杂芳基。在各实施方案中，接头是未取代的C1-C20亚烷基、未取代的2至20元亚杂烷基、未取代的C3-C8亚环烷基、未取代的3至8元亚杂环烷基、未取代的C6-C10亚芳基或未取代的5至10元亚杂芳基。在各实施方案中，接头是未取代的C1-C20亚烷基。在各实施方案中，接头是取代或未取代的C1-C40亚烷基、取代或未取代的2至40元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3至8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或取代或未取代的5至10元亚杂芳基。在各实施方案中，接头是取代或未取代的C1-C40亚烷基。在各实施方案中，接头是取代或未取代的2至40元亚杂烷基。在各实施方案中，接头是取代的2至40元亚杂烷基。在各实施方案中，接头包括磷酸烷酯(例如磷酸丙酯)。在各实施方案中，接头由在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯(例如磷酸丙酯)组成。在各实施方案中，接头由1-5个在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯(例如磷酸丙酯)组成。在各实施方案中，接头由1-4个在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯(例如磷酸丙酯)组成。在各实施方案中，接头由4个在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯(例如磷酸丙酯)组成。本领域普通技术人员将认识到由在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯组成的接头具有的磷酸酯将比亚烷基多1个(例如由4个在两端通过磷酸酯键合于化合物的其余部分的磷酸烷酯组成的接头将具有5个磷酸酯基和4个烷基，其中磷酸酯基和烷基交替)。
在各实施方案中，saRNA可包括修饰，诸如2’O-甲基、2’-脱氧-2’氟、2’-脱氧、通用碱基、5-C-甲基、反向脱氧无碱基残基并入、或锁定核酸或其任何组合。在各实施方案中，saRNA可具有位于saRNA的末端核苷碱基处的修饰。在各实施方案中，saRNA可不具有位于saRNA的末端核苷碱基处的修饰。在各实施方案中，saRNA的修饰保护化合物免遭血清源性核酸酶。
在各实施方案中，saRNA包括引导链(反义或AS)序列5’GACCAGUGACAAUGACCGCUU3’[SEQ ID NO:1]或与SEQ ID NO:1具有90％–99％同源性的序列，以及过客链(有义链或SS)序列3’UUCUGGUCACUGUUACUGGCG 5’[SEQ ID NO:2]或与SEQ ID NO:2具有90％–99％同源性的序列。SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有90％–99％同源性的序列，以及SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有90％–99％同源性的序列，一起形成用于达成CEBPA启动子活化的saRNA。在一些实施方案中，本公开的saRNA可包括引导链(AS)序列5’UACUUGGAGAAUGAGUUGG3’[SEQ ID NO:3]或与SEQ ID NO:3具有90％–99％同源性的序列，以及过客链(SS)序列3’AUGAACCUCUUACUCAACC 5’[SEQ ID NO:4]或与SEQ ID NO:4具有90％–99％同源性的序列。SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有90％–99％同源性的序列，以及SEQ ID NO:4或与SEQ IDNO:4具有90％–99％同源性的序列，一起形成用于达成p21启动子活化的saRNA。
在一些实施方案中，saRNA包括引导链(AS)序列5’UUAGGAAGGCUUUCCGUAA 3’[SEQID NO:5]或与SEQ ID NO:5具有90％–99％同源性的序列，以及过客链(SS)序列3’AAUCCUUCCGAAAGGCAUU 5’[SEQ ID NO:6]或与SEQ ID NO:6具有90％–99％同源性的序列。SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有90％–99％同源性的序列，以及6或与SEQ ID NO:6具有90％–99％同源性的序列，一起形成用于达成p53启动子活化的saRNA。
在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物具有末端部分。末端部分是化学反应性部分、可检测部分、治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)、核酸序列、DNA序列、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在各实施方案中，末端部分是化学反应性部分、可检测部分、治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)、核酸序列、DNA序列、核酸类似物、R1取代或未取代的烷基、R1取代或未取代的杂烷基、R1取代或未取代的环烷基、R1取代或未取代的杂环烷基、R1取代或未取代的芳基或R1取代或未取代的杂芳基。
在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是可检测部分。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端可检测部分，诸如荧光染料、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米粒子、造影剂、磁共振造影剂、X射线造影剂、钆、放射性同位素、放射性核素、氟脱氧葡萄糖、γ射线发射性放射性核素、正电子发射性放射性核素、生物胶体、微泡、碘化造影剂、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、半抗原、蛋白质或荧光部分。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)。
在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代或未取代的C1-C40烷基、取代或未取代的2至40元杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的3至8元杂环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基或取代或未取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的C1-C40烷基、取代的2至40元杂烷基、取代的C3-C8环烷基、取代的3至8元杂环烷基、取代的C6-C10芳基或取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，末端部分是R1取代的C1-C40烷基、R1取代的2至40元杂烷基、R1取代的C3-C8环烷基、R1取代的3至8元杂环烷基、R1取代的C6-C10芳基或R1取代的5至10元杂芳基。在各实施方案中，末端部分是R1取代的C1-C40烷基。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的C1-C40亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C1-C40亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的C3-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的C3-C18亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C3-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C6-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C9-C21亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C9-C18亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C9-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C12-C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C12亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C13亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C14亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的直链C15亚烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是R1取代的2至40元杂烷基。在各实施方案中，末端部分是-(未取代的2至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的直链2至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的5至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的10至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的15至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的20至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的30至40元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至35元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至30元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至25元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至20元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至10元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至50元亚杂烷基)-R1。在各实施方案中，末端部分是-(取代的2至60元亚杂烷基)-R1。
在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的2至40元杂烷基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的10至50元杂烷基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的20至40元杂烷基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的25至40元杂烷基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括末端部分，其是取代的30至40元杂烷基。
在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物包括具有R1基团的末端部分，其中R1是可检测部分或治疗性部分。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是可检测部分。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物中的R1是可检测部分，其是荧光染料、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米粒子、造影剂、磁共振造影剂、X射线造影剂、钆、放射性同位素、放射性核素、氟脱氧葡萄糖、γ射线发射性放射性核素、正电子发射性放射性核素、生物胶体、微泡、碘化造影剂、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、半抗原、蛋白质或荧光部分。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是治疗性部分(例如抗癌剂或抗病毒剂)。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是H。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是氧代基。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是氧。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是硫。在各实施方案中，硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)-saRNA/ASO缀合物末端部分中的R1是＝S。
在各实施方案中，化合物的ODN核酸序列包括未甲基化CpG或GpC基序。在各实施方案中，CpG核酸序列包括A类CpG核酸序列、B类CpG核酸序列或C类CpG核酸序列。在各实施方案中，GpC核酸序列包括A类GpC核酸序列、B类GpC核酸序列或C类GpC核酸序列。
在各实施方案中，化合物包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)，其中C和G(CpG或GpC)是通过磷酸二酯核苷酸间键联连接的核苷酸。在各实施方案中，化合物包括CpG或GpC，其中C和G是通过磷酸二酯衍生物核苷酸间键联连接的核苷酸。
在各实施方案中，Toll样受体(TLR)结合DNA取代基是A类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是B类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基(例如TLR9结合DNA取代基)由具有A、G、C或T碱基和磷酸二酯键联和/或磷酸二酯衍生物键联(例如硫代磷酸酯键联)的脱氧核糖核酸组成。
表1.化合物的部分序列
Figure BDA0001577668900000531
Figure BDA0001577668900000541
*加下划线：硫代磷酸化(3’邻近磷酸上的一个非桥接氧被硫替换)核苷酸(例如在5’-G*G*TGCATCGATGCAG
Figure BDA0001577668900000542
G-3’中，GGGGGG是GG*G*G*G*G，其中星号(*)放置在碱基之间(更准确来说，放置在核苷之间)，并且硫代磷酸化磷酸也放置在碱基之间)；粗体：2’OMe(2’-O-甲基核苷；2’位中的羟基被2’-O甲基替换)核苷酸；斜体：LNA修饰的核苷酸；粗体：2’OMe(2’-O-甲基核苷；2’位中的羟基被2’-O甲基替换)核苷酸；斜体：LNA修饰的核苷酸。
在各实施方案中，本公开化合物包括具有SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者与CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ IDNO:3-4)或p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)的由如本公开中所述的接头接合的组合。在各实施方案中，本公开化合物包括具有SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者与SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的由如本公开中所述的接头接合的组合。化合物的组合的实例列于表2-4中。
在各实施方案中，化合物结合内体TLR。在各实施方案中，化合物对内体TLR的结合优先于对其它TLR的结合。在各实施方案中，化合物特异性结合内体TLR。在各实施方案中，化合物结合TLR3。在各实施方案中，化合物对TLR3的结合优先于对其它TLR的结合。在各实施方案中，化合物特异性结合TLR3。在各实施方案中，化合物结合TLR7。在各实施方案中，化合物对TLR7的结合优先于对其它TLR的结合。在各实施方案中，化合物特异性结合TLR7。在各实施方案中，化合物结合TLR8。在各实施方案中，化合物对TLR8的结合优先于对其它TLR的结合。在各实施方案中，化合物特异性结合TLR8。在各实施方案中，化合物结合TLR9。在各实施方案中，化合物对TLR9的结合优先于对其它TLR的结合。在各实施方案中，化合物特异性结合TLR9。在各实施方案中，化合物包括CpG，其中C和G是通过磷酸二酯核苷酸间键联或磷酸二酯衍生物核苷酸间键联连接的核苷酸。
在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是A类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是B类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是ODN 1585、ODN 2216、ODN D19或ODN 2336。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006或ODN 2007。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是ODN 2395或ODN M362。在各实施方案中，TLR结合DNA取代基是ODN 1585、ODN 2216、ODN D19、ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN2006、ODN 2007、ODN 2395或ODN M362的衍生物。在各实施方案中，ODN 1585、ODN 2216、ODND19、ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395或ODN M362的衍生物包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸取代(例如A、C、G或T被不同核苷酸取代)。在各实施方案中，ODN 1585、ODN 2216、ODN D19、ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN2006、ODN 2007、ODN 2395或ODN M362的衍生物包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联替换(例如磷酸二酯被磷酸二酯衍生物替换，或磷酸二酯衍生物被磷酸二酯替换)。在各实施方案中，ODN 1585、ODN 2216、ODN D19、ODN 2336、ODN 1668、ODN1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395或ODN M362的衍生物包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个)核苷酸缺失。在各实施方案中，ODN 1585、ODN 2216、ODN D19、ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN2007、ODN 2395或ODN M362的衍生物包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸添加。
在各实施方案中，化合物包括磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联)。在各实施方案中，化合物包括多个磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联或其组合)。在各实施方案中，化合物在TLR9结合DNA取代基中包括磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联)。在各实施方案中，化合物在TLR结合核酸(例如内体TLR-、TLR3-、TLR7-、TLR8-或TLR9-结合核酸)取代基中包括磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联)。
在各实施方案中，CpG核酸序列中的磷酸二酯衍生物键联可为氨基磷酸酯键联、二氨基磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、二硫代磷酸酯键联、膦酰基羧酸键联、膦酰基羧酸酯键联、膦酰基乙酸键联、膦酰基甲酸键联、膦酸甲酯键联、硼膦酸酯键联或O-甲基亚磷酰胺键联。
在各实施方案中，化合物中的一个或多个核酸核苷酸间键联是磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联)，(例如化合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或所有核苷酸间键联是磷酸二酯衍生物键联(例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联或其组合))。
在各实施方案中，本公开包括CpG连接于靶向CEBPA的反义寡核苷酸的化合物。在各实施方案中，OND-saRNA存在于细胞质中(以及细胞核中)。在各实施方案中，由于RNA酶H(RNaseH)介导的对反义寡核苷酸的影响，所以ODN-反义寡核苷酸缀合物的核递送会影响基因表达。
在各实施方案中，本公开包括OND连接于靶向STAT的反义寡核苷酸的化合物。举例来说，本公开包括ODN-STAT3-ASO(反义)化合物，如表2、3和/或4中所列。
组合物
在一个方面，本公开提供包括药学上可接受的赋形剂和本文公开的化合物的药物组合物。在各实施方案中，组合物包括第二治疗剂。在各实施方案中，第二治疗剂是抗癌剂。在各实施方案中，第二治疗剂可为同一单位剂量的一部分或单独单位剂量的一部分。第二治疗剂不是表1-4中所列的化合物或其衍生物中的一者。
在各实施方案中，本公开包括本公开的化合物与一种或多种额外抗癌疗法例如抗VEGF抗体或抗STAT剂的组合的组合物。抗癌疗法的额外实例包括不限于手术、放射疗法(radiation therapy)(放射疗法(radiotherapy))、生物疗法、免疫疗法、化学疗法(例如替莫唑胺(temozolomide))或这些疗法的组合。另外，细胞毒性剂、抗血管生成剂和抗增生剂可与包括本公开的化合物的组合物组合使用。
在任何方法和用途的某些方面，本公开包括通过向被诊断有癌症的受试者施用有效量的本公开的化合物和化学治疗剂来治疗癌症。多种化学治疗剂可用于本公开的组合治疗方法和用途中。在各实施方案中，化学治疗剂可为替莫唑胺。在各实施方案中，化学治疗剂可与放射疗法相伴施用。
在一个实例中，组合治疗可涉及包括使用单独制剂或单一药物制剂进行同时施用，以及以任一顺序进行连续施用的施用，在连续施用中，可存在两种(或所有)活性剂同时施加它们的生物活性的时期。可根据制造商说明书或如由熟练从业者凭经验所确定来使用所述化学治疗剂的制剂和给药时程。化学疗法的制剂和给药时程也描述于ChemotherapyService,M.C.Perry编,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.(1992)中。化学治疗剂可在施用本公开的化合物或组合物之前或之后，或可与其同时给与。
在任何方法和用途的一些其它方面，适用于与本公开的化合物的组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括肿瘤生长中涉及的其它因子诸如VEGF、EGFR、ErbB3、ErbB4、STAT或TNF的拮抗剂。有时，可有益的是也向受试者施用一种或多种细胞因子。在各实施方案中，本公开的化合物或组合物与生长抑制剂共同施用。举例来说，可首先施用生长抑制剂，随后施用本公开的化合物或组合物。然而，同时施用或首先施用本公开的化合物或组合物可为可能的。生长抑制剂的适合剂量是目前使用的那些，并且可由于生长抑制剂和本公开的化合物的组合作用(协同作用)而降低。
当为所治疗的特定适应症所必需时，本文制剂也可含有超过一种活性化合物，例如具有不不利影响彼此的补充活性的那些。举例来说，可合乎需要的是进一步在一种制剂中提供结合EGFR、VEGF(例如结合VEGF上的不同表位或相同表位的抗体)、VEGFR或ErbB2的药剂。或者，或此外，组合物可包括化学治疗剂或细胞毒性剂。所述分子可适合地以有效达成预定目的的量存在于组合中。
在任何方法和用途的某些方面，适用于与本公开的化合物或组合物的组合癌症疗法的其它治疗剂包括其它抗血管生成剂。许多抗血管生成剂已被鉴定，并且在本领域中是已知的，包括由Carmeliet和Jain(2000)列出的那些。在各实施方案中，本公开的化合物或组合物与另一CEBPA拮抗剂、中和抗CEBPA抗体、CEBPA的低分子量抑制剂及其任何组合加以组合使用。
在各实施方案中，本公开包括一种包括CpG核酸序列缀合于短活化RNA(saRNA)的组合物和一种包括TLR结合核酸取代基缀合于STAT结合DNA取代基的化合物。在各实施方案中，STAT是人STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B或STAT6。在各实施方案中，TLR9结合DNA取代基缀合于STAT3结合DNA取代基。在各实施方案中，TLR9结合DNA取代基包括CpG基序。在各实施方案中，TLR9结合DNA取代基包括未甲基化CpG基序。在各实施方案中，TLR9结合DNA取代基包括能够形成G四链体的DNA序列。在各实施方案中，TLR9结合DNA取代基包括A类CpG DNA序列、B类CpG DNA序列或C型CpG DNA序列。在各实施方案中，STAT3结合DNA取代基包括第一STAT3结合DNA序列由接头共价结合于第二STAT3结合DNA序列。
在各实施方案中，本公开包括CpG连接于靶向CEBPA的反义寡核苷酸的组合物。在各实施方案中，ODN-saRNA存在于细胞质中(以及细胞核中)。在各实施方案中，由于RNA酶H介导的对反义寡核苷酸的影响，所以ODN-反义寡核苷酸缀合物的核递送会影响基因表达。
在各实施方案中，本公开包括ODN连接于靶向STAT的反义寡核苷酸的组合物。举例来说，3种ODN-STAT3-ASO(反义)缀合物(CpG-ODN和STAT3-ASO缀合物)列于表2中。
表2
Figure BDA0001577668900000601
Figure BDA0001577668900000611
表2中由“x”表示的接头是-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n，其中符号n是整数1至5(例如3)，并且符号z是整数0至50(例如0至25、0至10或0至5)。在各实施方案中，n是3，并且z是0至5或1至5。在各实施方案中，n是3，并且z是0至4或1至4。在各实施方案中，n是3，并且z是0至3或1至3。在各实施方案中，n是3，并且z是3。2’OMe(2’-O-甲基核苷；2’位中的羟基被2’-O甲基替换)；PS是硫代磷酸化。一个非桥接氧被硫替换；PS+3代表经修饰序列中的3个磷酸酯有一个非桥接氧被硫替换；PS+5代表经修饰序列中的5个磷酸酯有一个非桥接氧被硫替换。
举例来说，如下所示，在各实施方案中，CpG序列中的核苷碱基可包括硫代磷酸酯核苷酸间键联。
Figure BDA0001577668900000621
以上显示CpG核酸序列的具有硫代磷酸酯核苷酸间键联的部分。
接头可具有以下结构，其中接头在一端与鸟嘌呤的3’磷酸连接，并且在另一端与胸苷的5’磷酸连接，并且反义部分中的核苷碱基可用2’OMe修饰。
Figure BDA0001577668900000631
上式代表CpG核酸的在3’-OH末端用(CH2)3接头连接的部分，所述接头连接于反义RNA的5’-磷酸。
接头是取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。在各实施方案中，接头连接TLR9结合DNA取代基和STAT3结合DNA取代基。在各实施方案中，接头是取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。
在各实施方案中，本公开包括表3中所列的包括CpG核酸序列缀合于短活化RNA(saRNA)的组合物和化合物。
表3：化合物和组分序列。
Figure BDA0001577668900000641
Figure BDA0001577668900000651
表4：ASO化合物的实例
Figure BDA0001577668900000652
Figure BDA0001577668900000661
Figure BDA0001577668900000671
Figure BDA0001577668900000681
Figure BDA0001577668900000691
Figure BDA0001577668900000701
*加下划线：硫代磷酸化(3’邻近磷酸上的一个非桥接氧被硫替换)核苷酸(例如在5’-G*G*TGCATCGATGCAG
Figure BDA0001577668900000702
G-3’中，GGGGGG是GG*G*G*G*G，其中星号(*)放置在碱基之间(更准确来说，放置在核苷之间)，并且硫代磷酸化磷酸也放置在碱基之间)；粗体：2’OMe(2’-O-甲基核苷；2’位中的羟基被2’-O甲基替换)核苷酸；斜体：LNA修饰的核苷酸；粗体：2’OMe(2’-O-甲基核苷；2’位中的羟基被2’-O甲基替换)核苷酸；斜体：LNA修饰的核苷酸。
表3中和表4中由“x”表示的接头是-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n，其中符号n是整数1至5(例如3)，并且符号z是整数0至50(例如0至25、0至10、或0至5)。在各实施方案中，n是3，并且z是0至5或1至5。在各实施方案中，n是3，并且z是0至4或1至4。在各实施方案中，n是3，并且z是0至3或1至3。在各实施方案中，n是3，并且z是3。接头“x”可连续存在多次(例如1、2、3、4、5或甚至6次)，其中n和z对于接头“x”的各次出现是独立的。
本公开包括具有有效剂量的本公开的化合物的组合物。有效剂量可在约0.001mg/kg至约100mg/kg的药剂之间。
本公开的化合物的用于治疗癌症，增强细胞中的C/EBPA表达，抑制细胞生长，和/或降低STAT转录因子活性的有效剂量可在约0.001mg/kg至约0.01mg/kg的所述化合物之间，在约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的所述化合物之间，在约0.1mg/kg至约1.0mg/kg的所述化合物之间，在约1.0mg/kg至约5.0mg/kg的所述化合物之间，在约5.0mg/kg至约10mg/kg的所述化合物之间，在约10mg/kg至约15mg/kg的所述化合物之间，在约15mg/kg至约20mg/kg的所述化合物之间，在约20mg/kg至约25mg/kg的所述化合物之间，在约25mg/kg至约30mg/kg的所述化合物之间，在约30mg/kg至约35mg/kg的所述化合物之间，在约35mg/kg至约40mg/kg的所述化合物之间，在约40mg/kg至约45mg/kg的所述化合物之间，在约45mg/kg至约50mg/kg的所述化合物之间，在约50mg/kg至约55mg/kg的所述化合物之间，在约55mg/kg至约60mg/kg的所述化合物之间，在约60mg/kg至约65mg/kg的所述化合物之间，在约65mg/kg至约70mg/kg的所述化合物之间，在约70mg/kg至约75mg/kg的所述化合物之间，在约75mg/kg至约80mg/kg的所述化合物之间，在约80mg/kg至约85mg/kg的所述化合物之间，在约85mg/kg至约90mg/kg的所述化合物之间，在约90mg/kg至约95mg/kg的所述化合物之间，或在约95mg/kg至约100mg/kg的所述化合物之间。
在一些方面，本公开包括具有有效剂量的本公开的化合物的组合物，其中所述化合物可在组合物的约0.1％至约20％w/v之间。
举例来说，本文公开的化合物的有效剂量可在组合物的约0.001％-约0.01％之间，约0.01％-约0.1％之间，约0.1％-约1.0％之间，约1.0％-约2.0％之间，约2.0％-约3.0％之间，约3.0％-约4.0％之间，约4.0％-约5.0％之间，约5.0％-约6.0％之间，约6.0％-约7.0％之间，约7.0％-约8.0％之间，约8.0％-约9.0％之间，约9.0％-约10％之间，约10％-约11％之间，约11％-约12％之间，约12％-约13％之间，约13％-约14％之间，约14％-约15％之间，约15％-约16％之间，约16％-约17％之间，约17％-约18％之间，约18％-约19％之间，或约19％-约20％w/v之间。
增强或抑制基因表达的方法和/或用途
增强基因表达和刺激免疫应答
在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物和/或组合物增强基因表达和刺激免疫应答的方法。在各实施方案中，用与具有CpG序列的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合的saRNA实现增强基因的表达和刺激免疫应答。在各实施方案中，分别用C/EBPA、p21和p53的与硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列(例如SEQ ID NO:7-18中的一者)缀合的saRNA增强C/EBPA、p21和p53的表达，并且刺激免疫应答。
增强基因表达和刺激免疫应答
在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物和/或组合物增强基因表达而不刺激免疫应答的方法。在各实施方案中，用与本公开的具有GpC或PS序列的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合的saRNA实现增强基因的表达，而不刺激免疫应答。在各实施方案中，分别用C/EBPA、p21和p53的与硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列(例如SEQ ID NO:29-30中的一者)缀合的saRNA增强C/EBPA、p21和p53的表达，而不刺激免疫应答。
抑制基因表达和刺激免疫应答
在一个方面，本公开包括一种用化合物和/或组合物抑制基因，同时诱导免疫原性作用的方法。在各实施方案中，本公开提供一种用具有SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物抑制例如STAT的基因的方法。举例来说，用具有SEQ ID NO:43-60的化合物实现抑制STAT基因(STAT1-STAT5中的一者)的方法。这些化合物允许由靶标TLR9+细胞诸如哺乳动物(例如人)免疫细胞、前列腺癌细胞在孵育1小时内快速内化。化合物的摄取可在低浓度(例如50nM)下检测。这些序列具有核酸酶抗性，并且允许全身性施用和靶向远端器官诸如脾或骨髓中的TLR9+细胞(图15A–15B)。静脉内(IV)注射化合物可将化合物递送至骨髓中大多数骨髓细胞以及外周淋巴结中显著比例的骨髓细胞(包括DC)中(图15A–15B)。在各实施方案中，在恶性细胞和/或肿瘤相关免疫细胞例如骨髓源性抑制细胞(MDSC)中，抑制STAT表达，同时刺激免疫应答。MDSC是在前列腺癌进展和不良患者存活期方面起关键作用的不成熟和潜在免疫抑制性骨髓细胞的异质群体。在各实施方案中，在激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC)中，抑制STAT表达，同时刺激免疫应答。
抑制基因表达而不刺激免疫应答
在一个方面，本公开包括一种用化合物和/或组合物抑制基因，而不诱导免疫原性作用的方法。在各实施方案中，本公开提供一种用例如具有SEQ ID NO:29-30的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物抑制例如STAT(STAT1–STAT5中的一者)的基因的方法。举例来说，用具有SEQ ID NO:61-95的化合物实现对STAT1-STAT5的抑制，而不刺激免疫原性作用。具有SEQ ID NO:78-95的化合物相较于具有SEQ ID NO:61-77的化合物具有更高稳定性。在各实施方案中，在恶性细胞和/或肿瘤相关免疫细胞例如骨髓源性抑制细胞(MDSC)中，抑制STAT表达，而不刺激免疫应答。在各实施方案中，在激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC)中，抑制STAT表达，而不刺激免疫应答。
抑制基因表达和诱导凋亡的方法
在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物和/或组合物抑制基因，同时诱导凋亡的方法。在各实施方案中，本公开提供一种用例如具有SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物抑制例如STAT(STAT1–STAT5)的基因的方法。举例来说，用具有例如SEQ ID NO:43-60的化合物实现抑制STAT1–STAT5的方法，同时诱导靶标细胞的凋亡。
抑制基因表达而不诱导凋亡的方法
在一个方面，本公开包括一种用化合物和/或组合物抑制基因，而不诱导凋亡的方法。在各实施方案中，本公开提供一种用例如具有SEQ ID NO:29-30的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物抑制例如STAT(STAT1–STAT5)的基因，而不诱导凋亡的方法。举例来说，用具有例如SEQ ID NO:61-95的化合物实现抑制STAT1–STAT5的方法，而不诱导靶标细胞的凋亡。
治疗癌症的方法
在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物和/或组合物治疗癌症和/或肿瘤，同时诱导免疫原性作用的方法。在一个方面，方法包括用本公开的化合物和/或组合物治疗癌症和/或肿瘤，而不诱导免疫原性作用。
在各实施方案中，癌症可为造血细胞癌症。在各实施方案中，癌症不是造血细胞癌症。在各实施方案中，癌症是骨髓瘤或急性骨髓性白血病。在各实施方案中，癌症是前列腺癌(例如激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC))、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、食道癌、皮肤癌、黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在各实施方案中，通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向受试者施用化合物或组合物。在各实施方案中，治疗依赖于化合物或组合物的剂量。在各实施方案中，向受试者施用约0.001mg/kg至约100mg/kg的化合物。也暗示在这个范围内的所有数字和各种范围。
治疗癌症和诱导免疫应答
在各实施方案中，本公开提供一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的化合物或包括化合物的药物组合物。本公开提供一种在有此需要的受试者中治疗癌症和刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物或包括化合物的药物组合物，所述化合物是具有例如SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于例如CEBPA saRNA(SEQ IDNO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)、p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)中的一者，或具有例如SEQID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。
在各实施方案中，治疗癌症的方法包括向有此需要的受试者施用化合物或化合物的组合物，所述化合物是具有例如SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者与CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)或p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)的由如本公开中所述的接头接合的组合。在各实施方案中，治疗癌症的方法包括向有此需要的受试者施用化合物或化合物的组合物，所述化合物是具有例如SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者与例如SEQID NO:31-42和110-113中的一者的由如本公开中所述的接头接合的组合。
在各实施方案中，刺激免疫应答包括使天然杀伤细胞、T细胞、B细胞或骨髓细胞成熟、分化或增殖。在各实施方案中，刺激免疫应答包括使TH1型免疫应答增加。在各实施方案中，刺激免疫应答可使树突细胞和CD8+T细胞募集至受试者的某一器官中。在各实施方案中，刺激免疫应答使受试者中抗原递呈细胞的群体扩大。在各实施方案中，刺激免疫应答会抑制受试者中癌细胞的增殖。在各实施方案中，通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向受试者施用化合物或组合物以刺激免疫应答。
本公开提供一种增强细胞中C/EBPα、p21和/或p53表达，以及同时诱导免疫原性作用的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的化合物或化合物的药物组合物接触，所述化合物是具有例如SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者分别连接于CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)和p53saRNA(SEQ IDNO:5-6)中的一者的化合物。本公开提供一种抑制细胞生长的方法，其包括使所述细胞与有效量的化合物或化合物的药物组合物接触，所述化合物是具有例如SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者分别连接于CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)和p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)中的一者的化合物。本公开提供一种降低细胞中STAT转录因子的活性的方法，其包括使所述细胞与有效量的具有例如SEQ IDNO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物或药物组合物接触。
在各实施方案中，细胞是癌细胞。在各实施方案中，细胞是急性骨髓性淋巴(AML)细胞或前列腺癌细胞。在各实施方案中，AML细胞来自骨髓。在各实施方案中，细胞是体外培养的细胞，细胞处于宿主中原位，细胞处于离体培养的组织中。在各实施方案中，接触步骤无病毒转导。在各实施方案中，接触步骤无病毒转导，并且使细胞与本公开的化合物或包括本公开的化合物的药物组合物接触。在各实施方案中，使细胞与约1纳摩尔浓度至约100纳摩尔浓度的化合物接触。也暗示在这个范围内的所有数字和各种范围。
静脉内注射CpG-CEBPA saRNA诱导C/EBPα蛋白的表达，并且导致血液中和各种器官中的白血病细胞的百分比以剂量依赖性方式降低。在2.5mg/kg和高于2.5mg/kg下，重复注射CpG-CEBPA saRNA导致完全根除AML。这个策略的抗肿瘤功效似乎由组合TLR9触发和C/EBPα上调的免疫刺激作用而进一步增强。在Cbfb/MYH11/Mpl1白血病模型中，静脉内注射CpG-CEBPA saRNA导致树突细胞和CD8+T细胞向各种器官中募集。因此，CpG-CEBPA saRNA策略可提供一种用于AML和潜在前列腺癌的治疗的新型和细胞选择性策略。由于C/EBPα在骨髓细胞分化中的已知作用，CpG-CEBPA saRNA可允许扩大癌症患者中抗原递呈细胞的群体，同时抑制癌细胞的增殖。
缀合物的硫代磷酸化和单链CpG ODN部分触发由靶标细胞达成的内化。对CpGCEBPA saRNA的内体摄取通过清道夫受体来介导，并且导致与TLR9的相互作用。TLR9活化产生免疫刺激性信号(信号1)，同时也使得能够将缀合物释放至细胞质中。CpG-CEBPAsaRNA最终达到核，从而与基因表达机构相互作用，并且由此导致靶标基因的表达。C/EBPα蛋白充当细胞分化的转录活化子(信号2)。免疫刺激信号与分化信号两者的组合使抗原递呈增强，并且产生强力抗肿瘤免疫应答。
STAT3活性常常由应答于应激和炎症释放的细胞因子触发，处于Toll样受体(TLR)和NF-κB信号传导的下游。TLR9/NF-κB/STAT3信号传导轴在前列腺癌细胞自我更新、肿瘤发生潜力和治疗抗性方面具有作用。作为炎症性信号传导和肿瘤发生信号传导的独特交汇点，STAT3在恶性细胞与肿瘤相关免疫细胞诸如骨髓源性抑制细胞(MDSC)两者中均被活化。MDSC是在前列腺癌进展和不良患者存活期方面起关键作用的不成熟和强力免疫抑制性骨髓细胞的异质群体。TLR9+粒细胞性MDSC(G-MDSC；Lin–HLA-DR–CD14–CD15HICD33LO)是具有高度活化的STAT3的细胞群体，所述STAT3在疾病从局部化进展成转移性/去势抗性前列腺癌(mCRPC)期间积累在前列腺癌患者的血液中。在各实施方案中，策略用于例如在肿瘤微环境中的TLR9+细胞诸如骨髓性免疫细胞和B淋巴细胞中达成靶向基因抑制。在各实施方案中，治疗TLR9阳性血液学恶性肿瘤以及实体肿瘤诸如前列腺癌和胶质母细胞瘤中的干样癌细胞。在各实施方案中，在恶性细胞和/或肿瘤相关免疫细胞例如骨髓源性抑制细胞(MDSC)中，抑制STAT表达，而不刺激免疫应答。在各实施方案中，在激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC)中，抑制STAT表达，同时刺激免疫应答，由此治疗CRPC。
治疗癌症而不刺激免疫应答
本公开提供一种在有此需要的受试者中治疗癌症而不刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物或包括化合物的药物组合物，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ IDNO:3-4)、p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)中的一者，或具有例如SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。
在各实施方案中，通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向受试者施用化合物或包括化合物的组合物以治疗癌症，而不刺激免疫应答，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30连接于CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)、p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)中的一者，或例如具有SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。
本公开提供一种增强细胞中C/EBPα、p21和/或p53表达，而不同时诱导免疫原性作用的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的化合物或化合物的药物组合物接触，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30中的一者分别连接于CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)和p53saRNA(SEQ ID NO:5-6)中的一者的化合物。本公开提供一种抑制不受控制的细胞生长和/或增殖，而不同时诱导免疫应答的方法，其包括使细胞与有效量的化合物或化合物的药物组合物接触，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30中的一者分别连接于CEBPA saRNA(SEQ ID NO:1-2)、p21saRNA(SEQ ID NO:3-4)和p53saRNA(SEQ IDNO:5-6)中的一者，或具有例如SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。本公开提供一种降低细胞中STAT转录因子的活性，而不同时诱导免疫应答的方法，其包括使所述细胞与有效量的例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物或药物组合物接触。在各实施方案中，本公开提供一种用例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物治疗癌症，抑制不受控制的细胞生长和/或增殖，和/或降低细胞中STAT转录因子例如STAT的活性，而不诱导免疫应答的方法。举例来说，方法包括施用具有例如不诱导免疫应答的SEQ IDNO:61-95的化合物。在各实施方案中，在激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC)中，抑制STAT表达，而不刺激免疫应答，由此治疗CRPC。
破坏肿瘤微环境内的信号传导交叉对话
在各实施方案中，产生作为合成TLR9配体的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与各种经化学修饰和核酸酶抗性STAT ASO序列的缀合物，例如CpG/GpC-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-95)(表1、2和4；以及图9A)。在各实施方案中，向TLR9+细胞施用作为合成TLR9配体的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与各种经化学修饰和核酸酶抗性STAT ASO序列的缀合物，例如CpG/GpC-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-95)。在各实施方案中，向受试者施用作为合成TLR9配体的CpG/GpC寡脱氧核苷酸(ODN)与各种经化学修饰和核酸酶抗性STAT ASO序列的缀合物，例如CpG/GpC-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-95)。在各实施方案中，CpG ODN连接于STAT ASO，例如CpG/GpC-ODN-STAT3 ASO，允许由靶标TLR9+细胞快速内化。在各实施方案中，CpG ODN连接于STAT ASO，例如CpG-ODN-STAT3 ASO，允许由靶标TLR9+细胞在孵育1小时或更短(例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟)内快速内化。TLR9+细胞包括人和小鼠免疫细胞以及前列腺癌细胞(图10A-10B和图11A-11B)。在各实施方案中，由人和小鼠骨髓性免疫细胞对CpG-STAT ASO例如CpG-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-60)的摄取可在50nM或更小(例如1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nm或50nM)的浓度下检测(图10A-10B和图11A-11B)。在各实施方案中，使用共焦显微术验证CpG-STAT ASO例如CpG/GpC-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-95)的细胞内摄取。在各实施方案中，可在将缀合物添加至培养基中之后15分钟内(例如30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、12分钟或15分钟)在靶标细胞的细胞质中检测到它(图12A-12B)。对这些缀合物的高效摄取对应于在孵育24小时内，DU145和LNCaP-S17细胞中STAT3敲低功效改进，此常常超过相应单独ASO的作用(图13A-13B)。在各实施方案中，ASO与不使TLR9活化的GpC ODN的缀合物(GpC-STAT3 ASO；例如SEQ ID NO:61-77)也强烈抑制STAT3表达(图13A-13B)。在各实施方案中，相较于未缀合STAT3ASO，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60)显示在mRNA(图13C)与蛋白质(图13D)两种水平上，均更快速诱导STAT3敲低。在各实施方案中，在神经胶质瘤细胞和小神经胶质细胞中，CpG-STATASO例如CpG-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)内化和靶标敲低类似有效(图17A-17C)。在各实施方案中，CpG-STAT ASO缀合物例如CpG-ODN-STAT3 ASO(例如SEQ ID NO:43-60)而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN在细胞中诱导细胞死亡(图14A-14B)。在各实施方案中，CpG-STAT3 ASO缀合物(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN在培养24小时内(例如30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时)在细胞中诱导细胞死亡。在各实施方案中，CpG-STAT3 ASO缀合物(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN在寡核苷酸存在下在培养24小时内在细胞中诱导细胞死亡。在各实施方案中，CpG-STAT3 ASO缀合物(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN在1-1000nM(例如500nM)浓度的寡核苷酸存在下在培养24小时内在细胞中诱导细胞死亡。在各实施方案中，CpG-STAT3 ASO缀合物(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN在500nM的寡核苷酸存在下在培养24小时内在DU145和LNCaP-S17细胞中诱导细胞死亡。
在各实施方案中，CpG-ASO(例如SEQ ID NO:61-95)的改进的核酸酶抗性允许全身性施用和靶向TLR9+细胞(图15A-15C和图18A-18C)。在各实施方案中，CpG-ASO(例如SEQ IDNO:43-60、78-86)的改进的核酸酶抗性允许全身性施用和靶向远端器官(例如脾或骨髓)中的TLR9+细胞。在各实施方案中，单次静脉内(IV)注射经荧光标记的CpG-STAT3ASO(例如SEQID NO:43-60、78-86)足以将缀合物递送至大多数骨髓细胞中(图15A-15C)。在各实施方案中，单次静脉内(IV)注射经荧光标记的CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)足以向骨髓中50％或更多(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多)的骨髓细胞中进行递送。在各实施方案中，单次静脉内(IV)注射经荧光标记的CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)足以向外周淋巴结中显著比例的骨髓细胞(例如25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多)(包括树突细胞)中进行递送。在各实施方案中，重复(例如超过1次)施用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)的静脉内注射液允许对脑定位神经胶质瘤肿瘤中显著部分的骨髓细胞(例如20％、25％或30％的MDSC)进行渗透(图18A-18C)。在各实施方案中，单次施用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)的局部静脉内注射液允许对肿瘤微环境进行几乎完全渗透(例如75％、80％、85％、90％、95％、99.5)。在各实施方案中，施用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)用于针对TLR9+恶性肿瘤。在各实施方案中，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)使靶标基因敲低和细胞毒性增强(图16A-16C)。在各实施方案中，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)使远端未治疗位置中的肿瘤尺寸降低(图19A)。在各实施方案中，远端部位中STAT3表达降低与从注射部位释放的CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)的全身作用相关联(图19B和图19E)。在各实施方案中，使用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)进行治疗使STAT3和PD-L1免疫检查点分子的表达降低(图19C-19D)。在各实施方案中，使用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)进行治疗使在远端肿瘤部位处的骨髓源性抑制细胞(MDSC)中的STAT3和PD-L1免疫检查点分子的表达降低。在各实施方案中，全身性施用CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)(图20A-20B)。在各实施方案中，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)的施用途径可为IP(腹膜内)；PO(口服)；或IV(静脉内)。在各实施方案中，施用途径是经皮、皮下、肌肉内、鞘内、眼内、鼻内、经粘膜、唇下、吹入、经肠、栓剂、动脉内、关节内、脑内、颅内、玻璃体内或胫骨内。在各实施方案中，使用每日静脉内注射0.5mg/kg至5mg/kg的CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)来治疗受试者。在各实施方案中，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:43-60、78-86)治疗诱导肿瘤完全消退。在各实施方案中，CpG-STAT3ASO(例如SEQ ID NO:61-95)治疗诱导局部化肿瘤(例如骨、脾、膀胱、胰腺、睾丸、卵巢、前列腺、子宫、结肠、淋巴结、肺、脑、肾、肝、胃、大肠、小肠、食道、脊柱、头部、颈部、皮肤或心脏肿瘤)完全消退。在各实施方案中，核酸酶抗性CpG-STAT3 ASO抑制剂允许同时靶向散播TLR9+细胞中以及致耐受性肿瘤相关细胞中的STAT3信号传导(图21)。在各实施方案中，核酸酶抗性CpG-STAT3 ASO抑制剂允许同时靶向散播TLR9+前列腺癌细胞中以及致耐受性肿瘤相关免疫细胞(例如巨噬细胞、小神经胶质细胞、T细胞、B细胞或MDSC)中的STAT3信号传导。在各实施方案中，破坏肿瘤微环境内的信号传导交叉对话有效治疗癌症。
治疗自体免疫疾病和/或病症的方法
在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物和/或组合物治疗自体免疫疾病和/或病症，而不诱导免疫原性作用的方法。在各实施方案中，方法包括用本公开的化合物和/或组合物抑制骨髓细胞中的基因，而不诱导免疫原性作用。在各实施方案中，骨髓细胞在肿瘤微环境中，涉及于自体免疫疾病和/或病症中，或在癌(例如前列腺癌)中。
在各实施方案中，方法包括用本公开的化合物和/或组合物治疗自体免疫疾病和/或病症(例如类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE))，而不诱导免疫原性作用。在各实施方案中，方法包括用本公开的化合物和/或组合物抑制骨髓细胞中的基因，而不诱导免疫原性作用。
本公开提供一种在有此需要的受试者中治疗自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE))，而不刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物或包括化合物的药物组合物，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如具有SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。
本公开提供一种治疗自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE))，而不同时诱导免疫应答的方法，其包括使细胞与有效量的例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物或药物组合物接触。在各实施方案中，本公开提供一种用例如SEQ IDNO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物治疗自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE))，抑制不受控制的细胞生长和/或增殖，和/或降低细胞中STAT转录因子例如STAT1–STAT5的活性，而不诱导免疫应答的方法。举例来说，方法包括施用具有例如不诱导免疫应答的SEQ ID NO:61-95的化合物。
在各实施方案中，本公开提供一种治疗克罗恩氏病，而不同时诱导免疫应答的方法，其包括使细胞与有效量的例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物或药物组合物接触。在各实施方案中，本公开提供一种用例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物治疗克罗恩氏病，而不诱导免疫应答的方法。举例来说，方法包括施用具有例如不诱导免疫应答的SEQ ID NO:61-95的化合物。
治疗截瘫的方法
在一个方面，本公开包括一种通过施用本公开的化合物和/或组合物，伴有或不伴有诱导免疫原性作用来治疗有此需要的受试者的截瘫的方法。在各实施方案中，方法包括用本公开的化合物和/或组合物抑制间质干细胞(MSC)中的基因，伴有或不伴有诱导免疫原性作用。
本公开提供一种在有此需要的受试者中治疗截瘫，而不刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的化合物或包括化合物的药物组合物，所述化合物是例如SEQ ID NO:29-30中的一者连接于例如具有SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者的化合物。
本公开提供一种用有效量的具有例如SEQ ID NO:7-18和98-101中的一者的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)连接于例如SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者的化合物或药物组合物治疗截瘫，同时诱导免疫应答的方法。
合成方法和接头修饰
在各实施方案中，可使用包括4个步骤的循环合成CpG-CEBPA saRNA(SS，有义链)和CEBPA saRNA(AS，反义链)。在CpG-CE BPA saRNA(SS)和CEBPA saRNA(AS)的完全合成、脱保护、纯化和脱盐之后，可使两种组分退火以产生本公开的化合物CpG-CEB PA saRNA(SS/AS)。
合成的起始点可为经保护核苷通过它的3’-氧连接于基于聚苯乙烯的固体载体。核苷亚磷酰胺化学可用于这个合成。合成循环可包括以下4个步骤：
(1)对5’-羟基脱保护(脱三苯甲基)，
(2)使核苷酸亚磷酰胺偶联于5’-羟基，
(3)对未反应5’-羟基进行加帽
(4)氧化*
*步骤(4)可用用于合成硫代磷酸化寡核苷酸的硫化步骤替代。
可按以上顺序重复这4个步骤直至添加所有核苷组分。
合成路径可如以下流程1中所示：
Figure BDA0001577668900000861
流程1.
合成方法的额外细节描述于本公开的实施例2中。
在各实施方案中，亚杂烷基接头允许在合成完成之后以及寡核苷酸仍然连接于载体时用额外部分进一步修饰、缀合或连接。
在各实施方案中，本公开包括用取代的亚杂烷基接头缀合于saRNA的CpG核酸序列，所述接头可允许在合成期间以及寡核苷酸连接于载体时进行进一步修饰、缀合或连接。
在各实施方案中，取代的亚杂烷基接头被修饰、缀合或连接于取代基。修饰可包括使原始取代基转化成不同取代基。举例来说，可使溴-烷烃取代基转化成叠氮基-烷烃。缀合可导致两个大型部分键合在一起。举例来说，可使NHS衍生物与PEG-NH2缀合。也可使肽与寡核苷酸缀合，或可使抗体缀合于寡核苷酸。连接可导致小分子键合于大分子。举例来说，可使生物素的NHS酯连接于寡聚物的氨基衍生物。
在各实施方案中，本公开包括用选自以下组的接头，即多个不同接头、多个相同接头、或接头的取代形式缀合于saRNA的CpG核酸序列：
Fmoc氨基修饰剂C6dT(引入氨基)，其可通过与NHS酯以及二乙烯基砜和它的类似物反应来进一步用于官能化。
Figure BDA0001577668900000871
S-Bz硫醇修饰剂C6-dT(引入巯基)，其可通过与二乙烯基砜和丙烯酸类似物反应来进一步用于官能化。
Figure BDA0001577668900000872
氨基修饰剂丝氨醇亚磷酰胺(引入氨基)，其可通过与NHS酯以及二乙烯基砜和它的类似物反应来进一步用于官能化。
Figure BDA0001577668900000881
DBCO-dT(引入炔，无铜点击化学)，其可进一步用于用叠氮基反应物进行官能化
Figure BDA0001577668900000882
DBCO-磺基-NHS酯(引入炔，无铜点击化学，通过与氨基反应)
Figure BDA0001577668900000883
实施例
实施例1：材料和方法
CpG-CEBPα-saRNA摄取。使1×105个细胞与指示的saRNA(500μM，最终浓度)一起在500μl培养基中孵育。3小时后，用PBS洗涤细胞两次。用抗CD14抗体和抗CD19抗体染色PBMC以评估由不同细胞类型达成的摄取。通过流式细胞术来分析Cy3摄取水平。
CpG-saRNA(-Cy3)在DU145中的定位。将1×105个DU145细胞于盖玻片上涂铺在24孔板中。当细胞达到约60％汇合时，将经Cy3标记的CpG-saRNA缀合物在最终浓度500μM下添加至培养物中。转染后2小时或24小时，细胞用具有1mM MgCl2和0.1mM CaCl2的PBS温和洗涤两次，并且用0.25ml 2％多聚甲醛在室温下固定20分钟。细胞接着用具有1mM MgCl2和0.1mM CaCl2的PBS洗涤一次，并且在0.1％曲通(Triton)X-100内在室温下进行可渗透化处理10分钟。细胞接着用PBS洗涤，使用500ng/ml Hoechst33342染色，并且封固在10μlVECTASHIELD中。通过共焦显微术来评估CpG-saRNA的定位。
通过定量实时PCR来评估CEBPa诱导。将1×105个细胞于500μl培养基中涂铺在24孔板中，并且除非另外指示，否则每24小时用指示的RNA寡聚物在500μM的最终浓度下转染。对于非CpG缀合寡聚物的转染，使含50nM saRNA的Opti-MEM与Lipofectamine 2000(1:100稀释)(Life Technologies，11668-027)一起在室温下孵育20分钟，并且添加100μl脂质-saRNA复合物。在转染之后72小时，根据制造商说明书用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化来自细胞的总RNA。iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)用于逆转录。SsoAdvancedTM通用探针超级混合物(Biorad)用于Taqman定量实时PCR，并且用CFX96实时PCR检测系统(BioRad)定量结果。CEBPA的mRNA表达水平相对于TBP表达加以标准化。用于人CEBPA的引物序列是：
(正向引物)5’–gacatcagcgcctacatcg-3’；(反向引物)5’-ggctgtgctggaa caggt-3’。
CEBP报道体测定。根据制造商方案(Qiagen CCS-001L)进行CEBP报道体测定。简要来说，将4×104个DU145细胞/孔在150μl体积的仅补充有2.5％FCS的RPMI下接种于96孔板中。加入0.6μlLipofectamine 2000、1μl荧光素酶或对照质粒和含非CpG缀合saRNA(最终浓度50μM)的50μl OptiMem培养基(LifeTechnologies)。荧光素酶或对照质粒仅转染一次。每24小时将CpG缀合的saRNA于50μl RPMI培养基中在最终浓度500μM下直接添加至孔中。3天后，细胞用PBS温和洗涤，并且将50μl被动溶解缓冲液(Promega E194A)直接添加至各孔中。接着将溶解产物转移至白色96孔Optiplates(Perkin Elmer)中以用50μl荧光素酶测定试剂II(Promega E1910)进行海肾/萤火虫双重荧光素酶测定。接着依次测量板的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。数值相对于未处理样品中的活性加以标准化。一式三份进行实验。
MV4；11成熟。每24小时用指示的saRNA(最终浓度500μM)转染1×105个MV4-11细胞，例外之处是使用Lipofectamine 2000仅转染一次的SS/AS。96小时后，收获细胞，用FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS)洗涤两次，并且用对hCD86(FITC)、hCD40(PE)、HLADR(APC)具有特异性的抗体和7-AAD(作为活力标志)染色。通过流式细胞术来测量表达水平。
Cbfb/MYH11/Mpl诱发的小鼠白血病模型的产生。使Cbfb1/56M/Mx-Cre1小鼠与野生型C57BL/6小鼠回交>10代以产生同基因AML模型。在聚肌苷酸-聚胞苷酸诱导(Invivogen)核心结合因子β-平滑肌肌球蛋白重链表达之后2周，用逆转录病毒MIG-Mpl载体编码血小板生成素受体和GFP基因转导来自Cbfb1/56M/Mx-Cre1小鼠的骨髓细胞以产生可移植Cbfb/MYH11/Mpl1小鼠AML。
体内实验。C57BL/6小鼠(6至8周龄)来自国立癌症研究所(National CancerInstitute，Frederick,MD)。根据由机构动物护理和使用委员会(COH)建立的机构指导和核准的方案进行动物护理/程序。通过眶后注射来注射含1×106个Cbfb/MYH11/Mpl1AML细胞的磷酸盐缓冲盐水。
对于剂量测试，当血液中的AML细胞水平超过1％(此对应于10％至20％的骨髓驻留AML细胞)时，通过眶后注射以及每隔一天来施用各种剂量(1、2.5或5mg/kg)的CpG-CEBPA-saRNA或CpG-FLUC-RNA，并且在注射之后从尾部抽取血液以监测循环c-Kit+/GFP+(每组3-4只小鼠)。在第3次治疗之后1天使小鼠安乐死，并且通过流式细胞术来分析脾和骨髓中的c-Kit+/GFP+％。
为测试CpG-C/EBPa-saRNA的抗肿瘤效率，当PBL中的GFP+AML％达到1-5％时，每隔一天通过眶后注射来注射PBS(200μl)、CpG-FLUC RNA(5mg/kg于200μl中)或CpG-CEBPAsaRNA(5mg/kg于200μl中)5次(6-8只小鼠/组)。在治疗的过程期间，每隔一天通过尾部放血来获得PBL，并且通过流式细胞术来分析AML负荷(GFP和7AAD)。在第5次治疗之后1天使小鼠安乐死，并且收获脾和骨髓以进行随后分析。
CpG-STAT3 ASO设计和合成。在DNA/RNA合成核心研究室(COH)，如先前(Kortylewski等Nat.Biotech.2009)所述类似地通过使CpG(D19)-ODN连接于Stat3或搅乱ASO来合成CpG-ASO。
细胞 健康PBMC以IRB#13378从在CoH的供者单独采集中心(Donor AphaeresisCenter)源于匿名供者。样品获取由CoH机构审查委员会根据赫尔辛基宣言(Declarationof Helsinki)核准。人PC3和DU-145前列腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)。
流式细胞术 对于癌细胞系和免疫细胞的细胞外染色，使单细胞混悬液与FcγIII/IIR特异性抗体一起孵育以阻断非特异性结合，接着用经荧光染料标记的针对CD1c、CD3、CD19、CD303a、F4/80、GR1、B220和CD11c的抗体(eBiosciences)的不同组合染色。通过膜联蛋白V测定来测定凋亡细胞死亡。在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)上收集荧光数据，并且使用FlowJo软件(Tree Star)分析。
生物分布 C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自NCI(Frederick,MD)。C57BL/6小鼠用5mg/Kg CpG-STAT3Cy3静脉内注射，并且3小时后使其安乐死。收获淋巴结和骨髓。如所述(Kortylewski等Nat.Med 2005)通过机械组织破坏和胶原酶D/DNA酶I处理来制备单细胞混悬液，并且使用CD11b、CD3、B220、CD11c和F4/80抗体染色。通过流式细胞术来获取由不同群体达成的摄取。
定量实时PCR 使用
Figure BDA0001577668900000922
系统RNA纯化试剂盒(Promega)从培养或体内生长的肿瘤细胞提取总RNA，接着使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)使其转录成cDNA。使用通用探针文库(UPL，Roche)和利用ProbeFinder软件(Roche)设计的对于STAT3具有特异性的引物对(正向5’-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3’和反向5’-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3’)分析基因表达，并且使用Roche的参照基因测定分析TBP的基因表达。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)上分析序列特异性扩增。数据相对于TBP水平加以标准化，并且使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。
共焦显微术 使用500nM CpG–STAT3 ASO(经Cy3标记)处理DU-145细胞持续不同时间点。细胞用2％多聚甲醛固定20分钟，于含有0.1％曲通X-100的PBS中进行可渗透化处理，并且使用
Figure BDA0001577668900000921
对核染色5分钟。将载片于封固介质(Vector Labs,Burlingame,CA)中封固。使用C-Apochromat 40×/1.2水浸渍物镜在cLSM510-Meta倒置共焦显微镜(Zeiss,Thornwood,NY)上进行共焦成像。LSM软件v.4.2SP1用于图像获取，并且LSM图像浏览器v.4,2,0,121用于获取后分析(Zeiss)。
统计 未配对t检验用于计算双尾P值以估计两个治疗组之间的差异的统计显著性。单因素或两因素ANOVA加邦费罗尼(Bonfeerroni)事后检验分别用于评估多组之间或肿瘤生长动力学实验中的差异。统计显著P值在图中如下指示：***，P<0.001；**，P<0.01，以及*，P<0.05。使用Prism软件v.6.01(GraphPad)分析数据。
实施例2：CpG-saRNA合成物的制造方法
使用如以下章节中所述的由4个步骤组成的循环合成CpG-CEBPA saRNA(SS，有义链)和CEBPA saRNA(AS，反义链)。在CpG-CEBPA saRNA(SS)和CEBPA saRNA(AS)的完全合成、脱保护、纯化和脱盐之后，使两种组分退火以产生药物产品CpG-CEBPA saRNA(SS/AS)。
合成的起始点是经保护核苷通过它的3’-氧连接于基于聚苯乙烯的固体载体。核苷亚磷酰胺化学用于这个合成。合成循环由以下4个步骤组成：
(1)对5’-羟基脱保护(脱三苯甲基)，
(2)使核苷酸亚磷酰胺偶联于5’-羟基，
(3)对未反应5’-羟基进行加帽
(4)氧化*
*步骤(4)可用用于合成硫代磷酸化寡核苷酸的硫化步骤替代。
按以上顺序重复这4个步骤直至添加所有核苷组分。
合成路径显示于本公开的流程1(参见上文)中。
使用来自GE(800Centennial Avenue,Piscataway,NJ 08855-1327)的OligoPilot100和AktaPurifier进行第一阶段制造(直至脱保护和HPLC纯化)。
脱三苯甲基
在合成循环的第一步骤中，用5％二氯乙酸(DCA)的甲苯溶液移除载体结合的单体的酸不稳定性二甲氧基三苯甲基(DMT)。对所得DMT阳离子发色团进行定量以测定合成循环的偶联效率。由裂解的DMT碳阳离子产生橙色，所述碳阳离子在495nm下在可见光谱区中进行吸光。这个吸光强度用于测定偶联效率。大多数可商购获得的DNA合成仪具有用以测量和记录各循环的脱三苯甲基产率以便可实时监测合成效率的硬件。因为DNA碱基是酸不稳定的，所以脱三苯甲基步骤必须仅长达为确保完全脱三苯甲基所必需的时间。
CpG-CEBPA saRNA(SS)的合成始于已连接于固体载体的第一3’末端核苷，即2’-O-甲基尿苷。用于合成的固体载体是来自Prime Synthesis的LCAA-CPG载体。第一核苷通过3碳接头和丁二酸酯键联来连接于载体。在0.75mmol规模上的合成需要在92mL规格柱中放置19.00g载体。由这个反应获得的产物应具有13g的质量增加。
用于合成CEBPA saRNA(AS)的固体载体是来自Prime Synthesis的LCAA-CPG。在0.75mmol的规模上合成CEBPA saRNA(AS)需要在46mL规格柱中放置9.5g载体。由这个反应获得的产物应具有11g的质量增加。
偶联
在脱三苯甲基之后，将下一经保护亚磷酰胺递送至反应柱中。乙基硫基四唑用于使亚磷酰胺活化。就在向反应柱中递送之前混合两种试剂。乙基硫基四唑作为一种弱酸使亚磷酰胺的叔氮基团质子化，并且二异丙胺部分变为良好离去基团。
偶联机理是由游离5’-羟基对进入的活化单体的3’-O-磷进行亲核攻击。出于这个原因，重要的是在柱中具有完全无羟基环境。为确保这个，无水乙腈用作一般性溶剂，并且所有试剂和溶剂都以无水状态维持。在这些条件下，偶联效率极高，由此容许合成长的寡核苷酸。
偶联条件
亚磷酰胺溶解于无水乙腈ACN(0.175M)中，活化剂乙基硫基四唑ETT(0.6M于无水ACN中)。使用2.5当量(eq)的脱氧亚磷酰胺、2.5当量的丙二醇接头亚磷酰胺和3.0当量的核糖亚磷酰胺。DNA和丙二醇的再循环时间是3.5分钟，RNA的再循环时间是12.50分钟，并且核糖鸟苷的再循环时间是12.00分钟。活化剂:亚磷酰胺v/v比率是3:2。在室温(22-24℃)下进行偶联。
加帽
尽管采用这些效率措施，但仍有小百分比的载体结合的核苷的5′羟基不偶联于进入的活化的单体。使它们不活化以使缺失产物最小化，并且使纯化过程简化。通常，溶解于吡啶和四氢呋喃(THF)或ACN中的乙酸酐和1-甲基-咪唑起产生“加帽”未延伸5’-羟基的酰化剂的作用。5’-乙酰基酯帽在所有随后循环中都不反应，并且在最终氨脱保护步骤期间移除。在加帽之后的额外ACN洗涤使合成产率增加。
加帽条件
CAP A是20％1-甲基-咪唑的无水ACN溶液，CAP B通过在使用之前使相等体积的CAP B1和CAP B2混合来产生，其中CAP B1是40％乙酸酐的无水ACN溶液，并且CAP B2是60％2,6-二甲基吡啶的无水ACN溶液。
氧化
在偶联和加帽之后，核苷酸间键联是不稳定且必须被氧化成磷酸三酯的三价亚磷酸三酯。这个步骤可用用于合成硫代磷酸化寡核苷酸的硫化步骤替代。
氧化条件
用0.05M碘的9:1吡啶:水溶液进行氧化。在0.3M苍耳烷氢化物的无水吡啶溶液中进行氧化性硫化。
最终脱三苯甲基
在合成仪上通过用5％DCA的甲苯溶液洗涤来进行最终脱三苯甲基。
从载体移除和脱保护
在已装配指定序列之后，寡核苷酸必须从载体移除(裂解)，并且在使用之前完全脱保护。在合成之后；树脂用20％二乙胺(DEA)的ACN溶液处理以通过氰基乙基的β消除来将磷脱保护。用600mL甲胺-氢氧化铵混合物(AMA)进行的60分钟55℃处理用于从载体裂解寡核苷酸以及移除环外氨基的保护基。使所得混合物在冰中快速冷却，过滤，并且用200mL 1:1乙醇:水洗涤聚合物残余物两次。将所得溶液合并，放置在容量瓶中，并且获取代表性样品以通过在258nm下测量吸光度来估计产率。接着使溶液在减压下快速蒸发至干燥，并且称重。
在用AMA进行的这个裂解和脱保护之后，所得粗混合物含有仍然在核糖残基上携带2’-TBDMS保护的全长寡核苷酸、具有5’-羟基末端的截短失效序列和脱保护副产物(苯甲酰胺、异丁酰胺、丙烯腈和乙酰胺)。TBDMS保护基在最终脱保护步骤时通过碱性氟离子来移除。通过用700mL 10:2:1三乙胺三氢氟酸盐/三乙胺/DMSO的混合物在60℃下处理1.5小时来进行脱保护。接着使反应冷却至环境温度，与3L丙酮混合，留置在环境温度下过夜，并且离心。分离上清液，获取上清液的代表性样品(5x 20mL)，在减压下蒸发至干燥，再溶解，并且在258nm下测量吸光。如果大量产物仍然存在于上清液中，那么再添加1,000mL丙酮，并且使混合物在室温下再保持2小时。在最终离心之后，丢弃上清液，并且使集结块在室温下保持在真空下直至干燥。
RNA合成
RNA化学合成与用于DNA的化学合成相同，例外之处是在核糖的2′-羟基处需要额外保护基。这个位置通常用在整个合成中都是稳定的叔丁基二甲基甲硅烷基保护。它们在最终脱保护步骤时通过碱性氟离子来移除。糖与碱基两者上的其余位置均以与用于DNA相同的方式加以保护。通过调整DNA合成方案中的若干参数—包括偶联时间、单体递送速率、洗涤步骤的频率-获得多达99％的逐步偶联效率。
退火
许多方法可用于使互补核酸链退火。在各情况下，目标在于使互补链变性以移除任何二级结构，接着使各链杂交。影响寡核苷酸杂交效率的两个因素是盐浓度和温度降低速率。退火最高效发生在变性之后温度缓慢降低时，尤其在寡核苷酸具有高GC含量或形成发夹结构时。使互补核酸链退火包括以下4个步骤：
1.在1,000mL梨形圆底烧瓶中以1:1摩尔比使浓缩互补寡核苷酸混合在一起。
2.在水中将寡核苷酸混合物稀释至最终浓度
3.使用水浴使寡核苷酸退火。
●在85℃水中孵育具有寡核苷酸的1,000mL圆底烧瓶3.0分钟。
●将烧瓶转移至37℃水浴中，孵育30分钟。
4.倾入适当托盘中。将托盘放置在冻干器内部。使托盘冷冻，并且继之以冻干。
过程控制
在使用之前验证试剂的身份，并且在启动合成之前验证合成参数。通过对在去封阻步骤之后获得的流出物进行的DMT阳离子测定来监测偶联效率。DMT基团是在寡核苷酸的5′末端的羟基保护基。DMT测定适用于对自动DNA合成仪的性能进行即时反馈。DMT阳离子在合成循环中的各脱三苯甲基步骤时释放，并且如通过UV吸光度测量所定量。也实时监测其它合成参数诸如压力、电导率、温度、试剂流动、试剂与载体的接触时间。监测结果被包括在由OligoPilot100上的Unicorn软件创建和储存的合成评估文件中。
实施例3：靶向CpG-STAT3ASO作为肿瘤发生和免疫抑制性信号传导的抑制剂用于转移性前列腺癌免疫疗法
靶向STAT3的癌症免疫疗法
STAT3转录因子是一种多层面致癌基因，以及是一种通常在人癌症中活化的主要免疫抑制调控子。广泛证据表明诸如晚期前列腺癌的肿瘤极其依赖于STAT3来达成它们的存活、血管化和转移，而正常细胞并非如此(Mora,L.B.等Cancer Res 62,6659-66(2002)，Dhir,R.等Prostate 51,241-6(2002)，Lee,S.O.等Prostate 60,303-9(2004)，以及Hedvat,M.等Cancer Cell 16,487-97(2009))。在前列腺癌中，STAT3活化导致肿瘤朝向激素难治性/去势抗性前列腺癌(CRPC)表型进展以及患者的存活期不良。STAT3活性常常由应答于应激和炎症释放的细胞因子触发，处于Toll样受体(TLR)和NF-κB信号传导的下游。
TLR9/NF-κB/STAT3信号传导轴在前列腺癌细胞自我更新、肿瘤发生潜力和治疗抗性方面起作用。作为炎症性信号传导和肿瘤发生信号传导的独特交汇点，STAT3在恶性细胞与肿瘤相关免疫细胞诸如骨髓源性抑制细胞(MDSC)两者中均被活化。MDSC是在前列腺癌进展和不良患者存活期方面起关键作用的不成熟和强力免疫抑制性骨髓细胞的异质群体。
TLR9+粒细胞性MDSC(G-MDSC；Lin–HLA-DR–CD14–CD15HICD33LO)的群体具有高度活化的STAT3，所述STAT3在疾病从局部化进展成转移性/去势抗性前列腺癌(mCRPC)期间积累在前列腺癌患者的血液中。这些G-MDSC对T细胞增殖的抑制作用依赖于STA T3介导的精氨酸酶-1(ARG-1)表达，由此强力抑制T细胞增殖和活性。
CpG ODN缀合物快速内化在免疫和前列腺癌细胞中
产生作为合成TLR9配体的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与各种经化学修饰和核酸酶抗性STAT3 ASO序列的缀合物(表1-4以及图9A-9C)。CpG ODN连接于STAT3 ASO允许由靶标TLR9+细胞诸如人和小鼠免疫细胞以及前列腺癌细胞在孵育1小时内快速内化(分别地，图10A-10B(人)以及图11A-11B(小鼠))。由骨髓性免疫细胞对CpG-STAT3 ASO的摄取可甚至在最低50nM浓度下检测(图10A-10B以及图11A-11B)。
高效CpG-STAT3 ASO摄取
使用共焦显微术验证CpG-STAT3 ASO的细胞内摄取。如图12A-12D中所示，可在将缀合物添加至培养基中之后15分钟内在靶标细胞的细胞质中检测到它。对这些缀合物的高效摄取对应于在孵育24小时内，DU145和LNCaP-S17细胞中STAT3敲低功效改进，此常常超过相应单独ASO的作用(图13A-13D)。ASO与不使TLR9活化的GpC ODN的缀合物(GpC-STAT3ASO)也强烈抑制STAT3表达(图13A-13D)。重要的是，仅CpG-STAT3 ASO缀合物而非单独STAT3 ASO与对照CpG-搅乱ODN两者能够在500nM的寡核苷酸存在下在培养24小时内在DU145和LNCaP-S17细胞中诱导细胞死亡(图14A-14B)。
CpG-ASO的核酸酶抗性允许全身性施用和靶向远端器官中的TLR9+细胞
CpG-ASO的改进的核酸酶抗性允许全身性施用和靶向远端器官诸如脾或骨髓中的TLR9+细胞(图15A-15B)。单次静脉内(IV)注射经荧光标记的CpG-STAT3ASO将缀合物递送至骨髓中大多数骨髓细胞以及外周淋巴结中显著比例的骨髓细胞(包括DC)中(图15A-15B)。用人B细胞淋巴瘤细胞进行的实验表明CpG-STAT3ASO策略可用于针对其它TLR9+恶性肿瘤，从而使靶标基因敲低和细胞毒性增强(图16A-16C)。总之，这些结果指示新型核酸酶抗性CpG-STAT3 ASO抑制剂允许同时靶向散播TLR9+前列腺癌细胞中以及致耐受性肿瘤相关免疫细胞诸如MDSC中的STAT3信号传导。如果所述双向策略在体内有效，那么其提供一种用以进行靶向癌症治疗的范式转变性免疫治疗方法，其集中于破坏肿瘤微环境内的信号传导交叉对话。
实施例4：
CpG-STAT3 ASO设计和合成
在DNA/RNA合成核心研究室(COH)，如先前(Kortylewski等Nat.Biotech.2009)所述类似地通过使CpG(D19)-ODN连接于Stat3或搅乱ASO来合成CpG-ASO。
健康PBMC以IRB#13378从在CoH的供者单独采集中心源于匿名供者。样品获取由机构审查委员会根据赫尔辛基宣言核准。人PC3和DU-145前列腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心，而稳定表达IL-6的LnCaP S17来自佛罗里达疫苗和基因研究所(Vaccine andGene Institute,FL)。小鼠Myc-CaP细胞、RM1和RM9从相应原始来源获得。人LNCaP、DU145、PC3前列腺癌细胞最初由ATCC获得，并且加以认证。人OCI-Ly3、RL、Jecko1和REC1B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞从City of Hope获得。
流式细胞术
对于癌细胞系和免疫细胞的细胞外染色，使单细胞混悬液与FcγIII/IIR特异性抗体一起孵育以阻断非特异性结合，接着用经荧光染料标记的针对CD1c、CD3、CD19、CD303a、F4/80、GR1、B220和CD11c的抗体(eBiosciences)的不同组合染色。通过膜联蛋白V测定来测定凋亡细胞死亡。在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)上收集荧光数据，并且使用FlowJo软件(Tree Star)分析。
总细胞溶解产物如先前所报道31来制备，并且使用酪氨酸磷酸化STAT3特异性抗体(Cell Signaling)、总STAT3特异性抗体(Santa Cruz)和β-肌动蛋白特异性抗体(Sigma)加以分析。
体内实验
C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自NCI(Frederick,MD)。根据由IACUC(COH)建立的机构指导和核准的方案进行动物护理/程序。用2×105个RM9细胞在两个部位中对小鼠进行皮下注射。使用测径规评估肿瘤生长。使用每天用各种CpG缀合物(5mg/kg)进行的肿瘤内注射来治疗建立有肿瘤的小鼠，并且在末次治疗之后一天使其安乐死。对于实验性转移性小鼠模型，用含2×105个RM9mcherry/荧光素酶细胞的PBS胫骨内注射C57BL/6小鼠。每天用CpG缀合物(5mg/kg)静脉内注射建立有肿瘤的小鼠，并且基于遵循机构指导准则获得的身体评分或在末次治疗之后那天使其安乐死。使用利用AmiX(Spectral)成像系统测量的生物发光成像(BLI)来监测肿瘤负荷。
生物分布
C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自NCI(Frederick,MD)。根据由IACUC(COH)建立的机构指导和核准的方案进行动物护理/程序。建立有或未建立有肿瘤的C57BL/6小鼠用5mg/kgCpG-STAT3Cy3静脉内注射，并且在3小时后使其安乐死。收获肿瘤、淋巴结、骨髓、脾和脑。如所述(Kortylewski等Nat.Med 2005)通过机械组织破坏和胶原酶D/DNA酶I处理来制备单细胞混悬液，并且使用CD11b、CD3、B220、CD19、CD56、CD11c和F4/80抗体染色。通过流式细胞术来获取由不同群体达成的摄取。
定量实时PCR
使用
Figure BDA0001577668900001021
系统RNA纯化试剂盒(Promega)从培养或体内生长的肿瘤细胞提取总RNA，接着使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)使其转录成cDNA。使用通用探针文库(UPL，Roche)和利用Pro beFinder软件(Roche)设计的对于STAT3具有特异性的引物对(正向5’-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3’[SEQ ID NO:96]和反向5’-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3’[SEQ ID NO:97])分析基因表达，并且使用Roche的参照基因测定分析TBP的基因表达。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)上分析序列特异性扩增。数据相对于TB P水平加以标准化，并且使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。
共焦显微术
使用500nM CpG–STAT3 ASO(经Cy3标记)处理DU-145细胞持续不同时间点。细胞用2％多聚甲醛固定20分钟，于含有0.1％曲通X-100的PBS中进行可渗透化处理，并且使用
Figure BDA0001577668900001022
对核染色5分钟。将载片于封固介质(Vector Labs,Burlingame,CA)中封固。使用C-Apochromat 40×/1.2水浸渍物镜在cLSM510-Meta倒置共焦显微镜(Zeiss,Thornwood,NY)上进行共焦成像。LSM软件v.4.2SP1用于图像获取，并且LSM图像浏览器v.4,2,0,121用于获取后分析(Zeiss)。
未配对t检验用于计算双尾P值以估计两个治疗组之间的差异的统计显著性。单因素或两因素ANOVA加邦费罗尼事后检验分别用于评估多组之间或肿瘤生长动力学实验中的差异。统计显著P值在图中如下指示：***，P<0.001；**，P<0.01，以及*，P<0.05。使用Prism软件v.6.01(GraphPad)分析数据。
产生作为合成TLR9配体的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与各种经化学修饰和核酸酶抗性STAT3 ASO序列的缀合物(表1、2和4；以及图9A)。CpG ODN连接于STAT3 ASO允许由靶标TLR9+细胞诸如人和小鼠免疫细胞以及前列腺癌细胞在孵育1小时内快速内化(图10A-10B以及图11A-11B)。由人和小鼠骨髓性免疫细胞对CpG-STAT3 ASO的摄取可甚至在最低50nM浓度下检测(图10A-10B以及图11A-11B)。使用共焦显微术验证CpG-STAT3 ASO的细胞内摄取。如图12A-12D中所示，可在将缀合物添加至培养基中之后15分钟内在靶标细胞的细胞质中检测到它。对这些缀合物的高效摄取对应于在孵育24小时内，DU145和LNCaP-S17细胞中STAT3敲低功效改进，此常常超过相应单独ASO的作用(图13A-13B)。ASO与不使TLR9活化的GpC ODN的缀合物(GpC-STAT3 ASO)也强烈抑制STAT3表达(图13A-13B)。相较于未缀合STAT3ASO，CpG-STAT3ASO显示在mRNA(图13C)与蛋白质(图13D)两种水平上，均更快速诱导STAT3敲低。也验证的是在神经胶质瘤细胞和小神经胶质细胞中，CpG-STAT3ASO内化和靶标敲低也类似有效(图17A-17C)。重要的是，仅CpG-STAT3 ASO缀合物而非单独STAT3 ASO或对照CpG-搅乱ODN能够在500nM的寡核苷酸存在下在培养24小时内在DU145和LNCaP-S17细胞中诱导细胞死亡(图14A-14B)。
CpG-ASO的改进的核酸酶抗性允许全身性施用和靶向远端器官诸如脾或骨髓中的TLR9+细胞(图15A-15C以及图18A-18C)。单次静脉内(IV)注射经荧光标记的CpG-STAT3ASO足以将缀合物递送至骨髓中大多数骨髓细胞以及外周淋巴结中显著比例的骨髓细胞(包括DC)中(图15A-15C)。重复静脉内注射允许CpG-STAT3ASO对脑定位神经胶质瘤肿瘤中显著部分的骨髓细胞(例如30％的MDSC)进行渗透，而在单次局部注射这个寡核苷酸之后实现对肿瘤微环境的几乎完全渗透(图18A-18C)。用人B细胞淋巴瘤细胞进行的实验表明CpG-STAT3ASO策略可用于针对其它TLR9+恶性肿瘤，从而使靶标基因敲低和细胞毒性增强(图16A-16C)。为测试CpG-STAT3ASO的体内功效，我们选择侵袭性同基因前列腺癌(Ras/Myc驱动和激素非依赖性RM9肿瘤)的模型。在初始实验中，用RM9肿瘤在两个位置中对小鼠进行皮下移入，并且使用CpG-STAT3ASO、STAT3ASO或对照寡核苷酸的肿瘤内注射液治疗一个部位中的肿瘤(图19A-19D)。尽管CpG-STAT3ASO与STAT3ASO两者均初始抑制治疗部位中的肿瘤生长，但仅CpG-STAT3ASO也使远端未治疗位置中的肿瘤尺寸降低(图19A)。这些作用与远端部位中的STAT3表达降低相关联，从而可能指示从注射部位释放的CpG-STAT3ASO具有全身作用(图19B和图19E)。此外，使用CpG-STAT3ASO而非STAT3ASO进行治疗使在远端肿瘤部位处的骨髓源性抑制细胞(MDSC)中的STAT3和PD-L1免疫检查点分子的表达降低(图19C-19D)。为验证全身性施用的CpG-STAT3ASO的抗肿瘤作用，在胫骨内植入骨转移性前列腺肿瘤的实验性模型(图20A-20B)。在建立肿瘤之后，使用每日静脉内注射5mg/kg的CpG-STAT3ASO、STAT3ASO、对照CpG-scrODN或仅PBS来治疗小鼠。如图20A-20B中所示，相较于STAT3ASO和对照CpG-scrODN的有限作用，仅CpG-STAT3ASO治疗诱导骨定位RM9肿瘤的完全消退。因此，新型核酸酶抗性CpG-STAT3 ASO抑制剂允许同时靶向散播TLR9+前列腺癌细胞中以及致耐受性肿瘤相关免疫细胞诸如巨噬细胞/小神经胶质细胞/MDSC中的STAT3信号传导(图21)。结果证明集中于破坏肿瘤微环境内的信号传导交叉对话的用以进行靶向癌症治疗的免疫治疗方法可有效治疗癌症。
本公开的众多实施方案是：
一种经分离化合物，其包含硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合于短活化RNA(saRNA)或反义寡核苷酸(ASO)序列。
所述化合物，其中所述短活化RNA(saRNA)是CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)的saRNA。
所述化合物，其中所述ASO是信号转导子和转录活化子(STAT)的ASO。
所述化合物，其中所述反义序列是抗STAT1、抗STAT2、抗STAT3、抗STAT4、抗STAT5A、抗STAT5B或抗STAT6寡核苷酸序列。
所述化合物，其进一步在所述ODN序列与所述短活化RNA(saRNA)或所述ASO之间包含接头。
所述化合物，其中所述接头包括取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的亚杂烷基。
所述化合物，其中所述取代的亚烷基或取代的亚杂烷基被叠氮基团、经保护氨基、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)基团和经保护巯基取代。
所述化合物，其中使所述具有经保护巯基的取代的亚烷基或亚杂烷基缀合于选自由以下组成的组的部分：二乙烯基砜、丙烯酰基和顺丁烯二酰亚胺基。
所述化合物，其中丙烯酰基衍生物是丙烯酰氯。
所述化合物，其中所述接头包含取代的亚烷基或亚杂烷基的重复单元缀合于聚乙二醇(PEG)或双膦酸盐部分。
所述化合物，其中所述接头包括未取代的具有3个碳的亚杂烷基。
所述化合物，其中所述接头包括未取代的具有6至12个碳的亚杂烷基。
所述化合物，其中所述接头是取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。
所述化合物，其中所述接头是取代或未取代的C1-C40亚烷基、取代或未取代的2至40元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3至8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或取代或未取代的5至10元亚杂芳基。
所述化合物，其中所述接头是未取代的C1-C40亚烷基、未取代的2至40元亚杂烷基、未取代的C3-C8亚环烷基、未取代的3至8元亚杂环烷基、未取代的C6-C10亚芳基或未取代的5至10元亚杂芳基。
所述化合物，其中所述接头是取代的2至40元亚杂烷基。
所述化合物，其中所述saRNA或所述ASO经化学修饰。
所述化合物，其中所述saRNA或所述ASO包含选自由以下组成的组的化学修饰：2’O-甲基、2’-脱氧-2’氟、2’-脱氧、通用碱基、5-C-甲基、反向脱氧无碱基残基并入和锁定核酸。
所述化合物，其中所述修饰分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。
所述化合物，其中所述修饰不分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。
所述化合物，其中所述修饰保护免受血清源性核酸酶。
所述化合物，其中所述ODN序列包含磷酸二酯衍生物键联。
所述化合物，其中所述ODN核酸序列中的所述磷酸二酯衍生物键联选自由以下组成的组：氨基磷酸酯键联、二氨基磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、二硫代磷酸酯键联、膦酰基羧酸键联、膦酰基羧酸酯键联、膦酰基乙酸键联、膦酰基甲酸键联、膦酸甲酯键联、硼膦酸酯键联和O-甲基亚磷酰胺键联。
所述化合物，其中所述磷酸二酯衍生物键联是硫代磷酸酯键联。
一种药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和如一项权利要求所述的化合物。
所述药物组合物，其还包含第二治疗剂。
所述药物组合物，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：抗肿瘤剂或抗癌剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂、消炎剂、止痛剂、抗感染剂、生长抑制剂、免疫原性剂、免疫调节剂和趋化因子。
所述药物组合物，其中所述抗癌剂是细胞死亡促进剂。
所述药物组合物，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：放线菌素D/更生霉素(Actinomycin D/Dactinomycin)、博莱霉素(Bleo mycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星(聚乙二醇化脂质体)、表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、依托泊苷(Etoposi de)、多西他赛(Docetaxel)、伊立替康(Irinotecan)、太平洋紫杉醇(Pac litaxel)、拓扑替康(Topotecan)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vi ncristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、卡铂(Carboplatin)、顺铂(Cisplanti n)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、阿仑单抗(Alemtuzamab)、BCG、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、地诺单抗(Denosumab)、埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、干扰素(Interferon)、伊匹单抗(Ipilimumab)、拉帕替尼(Lapatinib)、单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E)(MMEA)、莫坦辛(Mertansine)(DM1)、利妥昔单抗(Rituximab)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、坦罗莫司(Temsirolimus)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)或其任何组合。
一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-24中一项所述的化合物或如一项权利要求所述的药物组合物。
所述治疗癌症的方法，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、食道癌、皮肤癌、黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
所述治疗癌症的方法，其中治疗所述受试者的所述癌症，同时刺激免疫应答。
所述治疗癌症的方法，其中所述化合物包含：(i)CEBPA、p21或p53的saRNA缀合于具有SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者，或(ii)具有SEQID NO:31-42和110-113的STAT ASO缀合于具有序列SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)。
所述治疗癌症的方法，其中治疗所述受试者的所述癌症，而不同时刺激免疫应答。
所述治疗癌症的方法，其中所述化合物包含CEBPA、p21或p53的saRNA或具有SEQID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者缀合于SEQ ID NO:29-30中的一者。
一种治疗有此需要的受试者的自体免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-24中一项所述的化合物或如一项权利要求所述的药物组合物。
所述治疗自体免疫疾病的方法，其中所述自体免疫疾病和/或病症是类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、牛皮癣或全身性红斑狼疮(SLE)。
所述治疗自体免疫疾病的方法，其中治疗所述受试者的所述自体免疫疾病，而不同时刺激免疫应答。
所述治疗自体免疫疾病的方法，其中所述化合物包含具有SEQ ID NO:31-42和110-113的STAT ASO中的一者缀合于SEQ ID NO:29-30中的一者。
所述治疗自体免疫疾病的方法，其中通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向所述受试者施用所述化合物或所述组合物。
所述治疗癌症或自体免疫疾病的方法，其中所述治疗依赖于所述化合物或组合物的剂量。
所述治疗癌症或自体免疫疾病的方法，其中向所述受试者施用约0.001mg/kg至约100mg/kg的所述化合物。
一种刺激有此需要的受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含具有SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于(i)CEBP、p21或p53的saRNA或(ii)具有SEQ ID NO:31-42和110-113的ASO的化合物；或包含以下化合物的药物组合物，所述化合物包含具有SEQ ID NO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于(i)CEBP、p21或p53的saRNA或(ii)具有SEQ ID NO:31-42和110-113的ASO。
所述刺激免疫应答的方法，其中所述刺激包括使天然杀伤细胞、T细胞、B细胞或骨髓细胞成熟、分化或增殖。
所述刺激免疫应答的方法，其中所述刺激包括使TH1型免疫应答增加。
所述刺激免疫应答的方法，其中所述刺激免疫应答使树突细胞和CD8+T细胞募集至所述受试者的某一器官中。
所述刺激免疫应答的方法，其中所述刺激免疫应答使所述受试者中抗原递呈细胞的群体扩大。
所述刺激免疫应答的方法，其中所述刺激免疫应答抑制所述受试者中癌细胞的增殖。
所述刺激免疫应答的方法，其中通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向所述受试者施用所述化合物或所述组合物。
一种增强细胞中的C/EBPα表达的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的包含具有SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于CEBP的saRNA的化合物，或包含以下化合物的药物组合物接触，所述化合物包含具有SEQID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于CEBP的saRNA。
一种抑制细胞生长的方法，其包括使所述细胞与有效量的如一项权利要求所述的化合物或如一项权利要求所述的药物组合物接触。
一种降低细胞中STAT转录因子的活性的方法，其包括使所述细胞与有效量的具有SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于具有SEQ ID NO:31-42和110-113的ASO的化合物，或包含以下化合物的药物组合物接触，所述化合物包含具有SEQ ID NO:7-18、29-30和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列中的一者缀合于具有SEQ ID NO:31-42和110-113的ASO。
如一项权利要求所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
所述方法，其中所述细胞是急性骨髓性淋巴(AML)细胞或前列腺癌细胞。
所述方法，其中所述AML细胞来自骨髓。
所述方法，其中所述细胞是体外培养的细胞。
所述方法，其中所述细胞处于宿主中原位。
所述方法，其中所述细胞处于离体培养的组织中。
所述方法，其中所述接触步骤无病毒转导。
所述方法，其中所述接触步骤无病毒转导，并且使所述细胞与所述化合物或所述药物组合物接触。
所述方法，其中使细胞与约1–100纳摩尔浓度的所述化合物接触。
其它实施方案
应了解尽管本公开已与其详细描述联合加以描述，但先前描述意图说明而非限制由随附权利要求的范围限定的本公开的范围。其它方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 希望之城
M·T·科尔蒂莱夫斯基
P·M·希维德尔斯基
<120> 包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法
<130> 48440-570001WO
<150> US 62/264,026
<151> 2015-12-07
<150> US62/187,878
<151> 2015-07-02
<160> 113
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
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<212> RNA
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<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
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<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 19
ggtgcatcga tgcagggggg ctatttggat gtcagc 36
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(35)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(40)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 20
ggtgcatcga tgcagggggg cagcagatca agtccaggga 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(35)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(40)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 21
ggtgcatcga tgcagggggg ttttgcatga tgtaaccact 40
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 22
ggtgcatcga tgcagggggg catttcccgt aaatcgattt acgggaaatg 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 23
ggtgcatgca tgcagggggg catttcccgt aaatcgattt acgggaaatg 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 24
ggtgcatcga tgcagggggg actcttgcca attacgtaat tggcaagagt 50
<210> 25
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(53)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 25
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttcatttc ccgtaaatcg atttacggga aatg 54
<210> 26
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(53)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 26
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttcatttc ccttaaatcg atttaaggga aatg 54
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(53)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 27
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttactctt gccaattacg taattggcaa gagt 54
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Residue modified at 5'-terminal with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Residue modified with up to 4 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<400> 28
catttcccgt aaatcgattt acgggaaatg 30
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<400> 29
ggtgcatgca tgcagggggg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Sequence is cg or gc
<400> 30
ggtgcatssa tgcagggggg 20
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(13)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 31
ctatttggat gtcagc 16
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 32
cagcagatca agtccaggga 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 33
ttttgcatga tgtaaccact 20
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 34
ctatttggat gtcagc 16
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 35
cagcagatca agtccaggga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 36
ttttgcatga tgtaaccact 20
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<400> 37
atcaaagtca tcctggag 18
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue is LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue is LNA
<400> 38
gcaacctgac tttagt 16
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue is LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue is LNA
<400> 39
gattctgcta atgacg 16
<210> 40
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue is LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue is LNA
<400> 40
tgacgggtct gaagtt 16
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue is LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue is LNA
<400> 41
agatagcaga agtagg 16
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue is LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue is LNA
<400> 42
gtcaatgcac acttta 16
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(35)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 43
ggtgcatcga tgcagggggg ctatttggat gtcagc 36
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothionate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothionate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(39)
<223> Residue modified with phosphorothionate
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(40)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 44
ggtgcatcga tgcagggggg cagcagatca agtccaggga 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(39)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(40)
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ggtgcatgca tgcagggggg ttttgcatga tgtaaccact 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
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-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(37)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
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<400> 90
ggtgcatgca tgcagggggg atcaaagtca tcctggag 38
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with up to 5 repetitions of
-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(35)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> Residue is LNA
<400> 91
ggtgcatgca tgcagggggg gcaacctgac tttagt 36
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<220>
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<220>
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<220>
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5 and z is independently 0 to 50
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<220>
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-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
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ggtgcatgca tgcagggggg tgacgggtct gaagtt 36
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-(CH2)n-PO4-[(CH2)n-PO4]z-(CH2)n wherein n is independently 1 to
5 and z is independently 0 to 50
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ggtgcatgca tgcagggggg gtcaatgcac acttta 36
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<212> DNA
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<220>
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tcctcgtttt gtcgttttgt cctt 24
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<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<400> 101
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<400> 102
ggtgcatcga tgcagggggg 20
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
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<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
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<220>
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ggtgcatcga tgcagggggg gaccagugac aaugaccgcu u 41
<210> 104
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (31)..(31)
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<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
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<220>
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<222> (35)..(35)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 104
ggtgcatcga tgcagggggg gcggucauug ucacuggucu u 41
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
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<222> (20)..(21)
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<400> 105
gaccagugac aaugaccgcu u 21
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
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<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 106
ggtgcatcga tgcagggggg ugaccaguga caaugaccgu u 41
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 107
cggucauugu cacuggucau u 21
<210> 108
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Residue modified with 5 repetitions of C3 linker [-(CH2)3-]
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 108
ggtgcatcga tgcagggggg cggucauugu cacuggucau u 41
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 109
ugaccaguga caaugaccgu u 21
<210> 110
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 110
ctatttggat gtcagc 16
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 111
cagcagatca agtccaggga 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
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<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 112
aaaaagtgcc cagattgccc 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Residue modified with phosphorothioate
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(20)
<223> Residue modified with 2'-O-methyl
<400> 113
actcaaactg ccctcctgct 20

Claims (25)

1.一种用于调节靶标基因表达的经分离化合物，其包含硫代磷酸化CpG寡脱氧核苷酸(ODN)序列，所述序列缀合于(i)或(ii)，其中所述CPG ODN为SEQ ID NO:8-18和98-101中的一者，所述(i)为CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)、p21或p53的短活化RNA(saRNA)，其中所述saRNA是双链的，且其中所述CpG ODN缀合于所述saRNA的仅一条链，所述saRNA为SEQID NO:1-6，并且在所述硫代磷酸化CpG ODN序列与所述短活化RNA(saRNA)之间包含接头；所述(ii)为信号转导子和转录活化子(STAT)的反义寡核苷酸(ASO)序列，所述STAT ASO为SEQ ID NO:31-42和110-113中的一者，其中所述ASO包含单链DNA取代基，并且在所述硫代磷酸化CpG ODN序列与所述ASO之间包含接头。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述反义寡核苷酸序列是抗STAT1寡核苷酸序列、抗STAT2寡核苷酸序列、抗STAT3寡核苷酸序列、抗STAT4寡核苷酸序列、抗STAT5A寡核苷酸序列、抗STAT5B寡核苷酸序列或抗STAT6寡核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述接头是取代或未取代的亚烷基或亚杂烷基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中所述接头是亚烷基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基。
5.如权利要求1所述的化合物，其中所述接头是C1-C40亚烷基、2至40元亚杂烷基、C3-C8亚环烷基、3至8元亚杂环烷基、C6-C10亚芳基或5至10元亚杂芳基。
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述接头是未取代的C1-C40亚烷基、未取代的2至40元亚杂烷基、未取代的C3-C8亚环烷基、未取代的3至8元亚杂环烷基、未取代的C6-C10亚芳基或未取代的5至10元亚杂芳基。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述接头是取代的2至40元亚杂烷基。
8.如权利要求1所述的化合物，其中所述saRNA或所述ASO包含选自由以下组成的组的化学修饰：2’O-甲基、2’-脱氧-2’氟、2’-脱氧、通用碱基、5-C-甲基、反向脱氧无碱基残基并入和锁定核酸。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。
10.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰不分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。
11.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰保护免受血清源性核酸酶。
12.一种药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和如权利要求1-11中任一项所述的化合物。
13.如权利要求1-11中任一项所述的化合物在制备用于治疗有此需要的受试者的癌症的药物中的用途，其中所述癌症是前列腺癌或骨髓瘤。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述药物用于治疗所述受试者的所述癌症，且用于同时刺激免疫应答或不同时刺激免疫应答。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述药物被制备为通过胃肠外或口服施用来向所述受试者施用。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述胃肠外施用为静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内或气雾剂施用。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述治疗依赖于所述化合物的剂量。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述药物被制备为以0.001mg/kg至100mg/kg的所述化合物的剂量施用。
19.如权利要求14所述的用途，其中所述刺激包括使天然杀伤细胞、T细胞、B细胞或骨髓细胞成熟、分化或增殖。
20.如权利要求14所述的用途，其中所述刺激包括使TH1型免疫应答增加。
21.如权利要求14所述的用途，其中所述刺激免疫应答使树突细胞和CD8+T细胞募集至所述受试者的某一器官中。
22.如权利要求14所述的用途，其中所述刺激免疫应答使所述受试者中抗原递呈细胞的群体扩大。
23.如权利要求14所述的用途，其中所述刺激免疫应答抑制所述受试者中癌细胞的增殖。
24.如权利要求13所述的用途，其中所述化合物用于增强癌细胞中的C/EBPα表达，其中所述癌细胞为前列腺癌细胞或骨髓瘤细胞。
25.如权利要求13所述的用途，其中所述化合物用于降低癌细胞中STAT转录因子的活性，其中所述癌细胞为前列腺癌细胞或骨髓瘤细胞。
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