ES2312228B1 - Epidermis cultivada secretora de factores terapeuticos producida por celulas madre de pelo y metodo de obtencion. - Google Patents
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Abstract
Epidermis cultivada secretora de factores
terapéuticos
producida por células madre de pelo y método de obtención.
producida por células madre de pelo y método de obtención.
Resulta de la producción de una epidermis
cultivada a través del cultivo de pelo arrancado de un paciente
afecto de una determinada enfermedad caracterizada por la ausencia
de un factor preferiblemente una hormona, factor de coagulación o
enzima. En el momento del cultivo se modifican genéticamente las
células de la vaina externa del pelo de manera que estas produzcan
al medio de cultivo la proteína deficitaria.
El método de obtención comprende las etapas
de:
Microdisección del pelo arrancado para exponer
la zona del engrosamiento de la vaina externa del pelo.
Cultivo del fragmento microdiseccionado sobre
placas de cultivo recubiertas de proteínas de membrana basal
epidérmica.
Modificación genética de las células de la vaina
externa mediante vectores oncoretrovirales o lentivirales
conteniendo el gen de un factor deficitario. Expansión de las
células de la vaina externa hasta alcanzar la confluencia.
Description
Epidermis cultivada secretora de factores
terapéuticos producida por células madre de pelo y método de
obten-
ción.
ción.
La presente invención hace referencia al
tratamiento de enfermedades producidas por ausencia de un
determinado factor (ejemplo. Hemofilia B factor de coagulación
FIX).
Existen numerosas enfermedades causadas por la
ausencia de factor presente en la sangre. Estas deficiencias pueden
ser causadas por motivos genéticos o adquiridos. El tratamiento de
este tipo de enfermedades es la administración permanente de dicho
factor, lo que resulta oneroso para los sistemas de asistencia
sanitaria, ya que dichos factores se suelen obtener de suero o
plasma de donantes o bien mediante tecnología de ADN
recombinante.
Ejemplos típicos de estas enfermedades son las
hemofilias. Estas enfermedades están causadas por mutaciones o
defecciones que afectan a los genes de coagulación FVIII y FLX
(Wacey AI, Kemball-Cook G, Kazazian HH, Antonarakis
SE, Schwaab R, Lindley P, Tuddenham EG. The haemophilia A mutation
search test and resource site, home page of the factor VIII
mutation database: HAMSTeRS Nucleic Acids Res. 1996 Jan 1:
24(1): 100-102)). Los sujetos afectos
manifiestan una tendencia excesiva al sangrado a partir de los 6
meses de edad. Aparte del sangrado traumático o producido por
cortes, estos pacientes presentan hemorragias espontáneas
frecuentemente durante el periodo de crecimiento debido a
microtraumatismos. Este sangrado suele afectar a músculos y
articulaciones. La repetición de episodios hemorrágicos sobre la
misma articulación ocasiona la aparición de artropatías
degenerativas que producen inmovilidad articular y minusvalía.
inicialmente el tratamiento de la hemofilia se basaba en el aporte
de factor a través de plasma de donante sano. Sin embargo el alto
número de transfusiones necesarias para alcanzar niveles
hemostáticos propiciaba la aparición de enfermedades infecciosas
transmisibles como hepatitis y sida. (Posthouwer D, Wolters VM,
Fischer K, Houwen RH, van den Berg HM,
Mauser-Bunschoten EP. Hepatitis C infection in
children with haemophilia: a pilot study. Haemophilia. 2004 Nov;
10(6):722-6).
Posteriormente la obtención de factores
recombinantes por tecnología de ADN y la aparición de métodos de
pasteurización de plasma ha posibilitado la reducción de la
patología infecciosa en estos pacientes. Sin embargo la aparición de
esta nueva fuente de factores no ha solucionado las necesidades de
estos enfermos. Así el FVIII y el FIX tienen una vida media en
plasma que se mide en horas por o cual los pacientes precisan
infusiones frecuentes dos o tres veces por semana para mantener un
nivel de profilaxis que evite el sangrado espontáneo. Es práctica
habitual administrar este factor de manera profiláctica durante el
periodo de crecimiento hasta la adolescencia, lo que ocasiona un
gran gasto farmacéutico. (Blanchette P, Rivard G, Israels S,
Robinson S, Ali K, Walker I, Stain AM, Blanchette V; Association of
Hemophilia Clinic Directors of Canada and Canadian Association of
Nurses in Hemophilia Care. A survey of factor prophylaxis in the
Canadian haemophilia A population. Haemophilia. 2004 Nov;
10(6):679-83).
Existen un gran número de enfermedades cuya
fisiopatología es similar a la de la hemofilia. Así existen casos
de enanismo infantil causados por ausencia de hormona de
crecimiento, bien por una mutación en el gen de la hormona de
crecimiento o por destrucción o atrofia de la glándula pituitaria
que la produce. Otro ejemplo, es la ausencia de eritropoyetina que
presentan los enfermos afectos de insuficiencia renal lo que
condiciona una anemia severa que solo se puede tratar mediante
administración de eritropoyetina humana. (Rao M, Muirhead N,
Buoncristiani U. Management of anemia. Contrib Nephrol. 2004;
145:69-74).
Otra patología prevalente es la diabetes
mellitus en la que es necesario administrar de manera crónica
insulina. Existen diversas enfermedades por depósito cuyo
tratamiento ese realiza con un enzima que degrada el metabolito que
se acumula. Ciertas enfermedades por inflamación crónica podrían
responder ante la administración del receptor soluble de la
interleuquina 1 o del antagonista del receptor de
IL-1. (Wilson HL, Francis SE, Dower SK, Crossman
DC. Secretion of intracellular IL-I receptor
antagonist (type 1) is dependent on P2X7 receptor activation. J
Immunol. 2004 Jul 15; 173(2):1202-8).
Una alternativa la tratamiento crónico con el
factor deficitario es la terapia génica. En este caso se intenta
administrar el factor mediante la administración del ADN del gen
deficitario. Existen numerosas estrategias para la administración de
terapia génica. En la terapia génica "in vivo" se
administra el ADN directamente al individuo, acomplejado con
substancias que permiten su toma por células y su incorporación en
la cromatina del paciente o bien mediante virus modificados
genéticamente para impedir su replicación y la producción de
enfermedad. Un ejemplo de este último caso lo constituyen la
utilización de virus asociados al adenovirus (AAV) en los cuales se
han deleccionado los genes responsables de la replicación viral y
se ha introducido el factor de coagulación FIX. Al administrar este
tipo de virus mediante inyecciones repetidas a la masa muscular de
pacientes hemofílicos se ha conseguido restaurar transitoriamente la
capacidad de coagulación. (Chao H, Walsh CE.AAV vectors for
hemophilia B gene therapy. Mt Sinai J Med. 2004 Oct;
71(5):305-13).
Un segundo abordaje lo constituye la terapia
"ex vivo" mediante la cual se extrae del sujeto un
órgano o tejido que después se cultiva. Durante este proceso se
realiza la modificación genética para restaurar el gen dañando.
Ejemplos de este tipo de abordaje lo constituye el tratamiento de
inmunodeficiencias infantiles severas mediante la modificación con
vectores oncoretrovirales portadores del gen de la cadena gamma
común del receptor de interleuquina 2 que es deficitario en estos
pacientes. (Cavazzana-Calvo M, Fischer A. Efficacy
of gene therapy for SCID is being confirmed. Lancet. 2004 Dec 18;
364(9452):2155-6).
En general este tipo de abordaje "ex
vivo" se realiza sobre tejidos organizados jerárquicamente,
es decir que tiene una estructura piramidal donde la mayoría de las
células maduras son resultado de la diferenciación y multiplicación
de una pocas células madre. Los tejidos jerarquizados "bona
fide" son el tejido hematopoyético y la epidermis.
La epidermis se ha descrito como un sistema apto
para la modificación genética (Taichman L.B. Systemic delivery of
secreted protein by grafts of epidermal keratinocytes: prospects
for keratinocyte gene therapy. Hum Gene Ther. 1994 Oct;
5(l0):1241-8.) debido a esta estructura
jerárquica que posibilita que a través de la modificación genética
de unas pocas células madre de la capa basal se obtenga un órgano
completo transgénico. El documento de patente ES 2184623A1 describe
la modificación genética de células queratinocíticas de la piel
obtenidas a través de biopsias de piel para la administración de
leptina. La posterior producción in vitro de una piel
autóloga compuesta de estos queratinocitos secretores de leptina
junto con una dermis artificial serviría para la administración
tónica de leptina.
Sin embargo el método descrito en la patente
citada presenta varios inconvenientes, por ejemplo es necesario
obtener una biopsia del paciente y realizar una dermis artificial
para luego coser con suturas esta piel artificial sobre una zona de
exéresis quirúrgica. Estas técnicas que se han usado sabre
pacientes quemados presentan el inconveniente de ocasionar
importantes cicatrices y retracciones. Asimismo, el aspecto de estas
pieles artificiales no es del todo natural lo que no es
estéticamente aceptable para pacientes que tienen otras
alternativas de tratamiento como la administración de factores
recombinantes, sobre todo en patologías cuyas deficiencias de factor
presentan importantes cantidades plasmáticas en el orden de
microgramos/ml como es el caso de los factores de coagulación. Por
lo tanto es deseable un método de obtención de epidermis modificada
genéticamente que no fuera invasivo y no dejara cicatrices o
precisara biopsias.
Existe evidencia de que las células madre
comunes a epidermis y pelo residen en una zona del bulbo piloso
llamada engrosamiento o "bulge" (en ingles) de la vaina externa
del pelo. Esta zona del pelo contiene células madre con capacidad
de diferenciarse en células del pelo o células de la capa
epidérmica de la piel. Asimismo, empleando diferentes técnicas de
cultivo se ha conseguido obtener células de los anejos del pelo.
Este engrosamiento está presente en la zona alta de los pelos
arrancados. Empleando técnicas de cultivo que favorecen la
diferenciación hacia queratinocitos epidérmicos se consigue la
formación de monocapas de queratinocitos que se pueden despegar y
transplantar para el tratamiento de úlceras y quemados. (Navsaria
HA, Ojeh NO, Moiemen N, Griffiths MA, Frame 3D. Reepithelialization
of a full-thickness burn from stem cells of hair
follicles micrografted into a tissue-engineered
dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 2004 Mar;
113(3):978-81).
Para la administración de terapia génica desde
la piel cultivada pueden utilizarse epidermis generadas a través de
pelo de pacientes y modificadas genéticamente para incorporar
factores terapéuticos. No es necesaria la producción de dermis
artificiales para soportar las células epidérmicas ya que las
células madre de pelo se caracterizan por una gran capacidad de
división y automantenimiento y pueden ser transplantadas
directamente sobre áreas desepitelizadas por diversos métodos como
la radiofrecuencia. Por lo tanto este tipo de transplante no
dejaría cicatriz y sería cosméticamente aceptable. Por lo tanto la
presente invención tiene coma objetivo la obtención de manera no
invasiva de láminas epidérmicas secretoras de factores terapéuticos
a través del cultivo del pelo del paciente y su posterior
modificación genética. El transplante de estas láminas sobre áreas
desepitelizadas produciría que estos parches epidérmicos funcionen
como bombas secretoras del factor deficitario, restaurando la
homeostasis del individuo.
La epidermis se obtendrá mediante el cultivo de
pelos arrancados del paciente. En el momento del cultivo se
modificaran genéticamente las células del engrosamiento del la raíz
del pelo que contiene las células madre mediante cocultivo con
vectores onco o lentivirales portadores del gen del factor
codificante. Así, en el caso de un paciente hemofílico se obtendrán
varios pelos occipitales que se microdiseccionarán para exponer la
vaina externa y la zona del engrosamiento. Estos pelos se cultivaran
en un sobrenadante de cultivo celular que favorezca la
diferenciación hacia células epidérmicas. Asimismo, este medio de
cultivo contendrá vectores oncoretrovirales o lentivirales
portadores del factor de coagulacion FVIII en el caso de la
hemofilia A y de FIX en el caso de la hemofilia B. Las láminas
epidérmicas así generadas secretarán factores de coagulación al
sobrenadante y servirán para ser transplantadas sobre zonas
desepitelizadas de pacientes hemofílicos funcionando como un parche
secretor del factor que corrija la hemofilia.
Para completar la descripción anterior y para
ayudar a la compresión de la presente invención se acompaña de una
descripción detallada de una invención preferida en base a
ilustraciones en donde con carácter meramente orientativo y no
limitativo se ha representado lo siguiente.
Figura 1: Muestra el proceso de generación de
fina epidermis modificada genéticamente a través del cultivo de
pelo.
a) Muestra un corte histológico de un pelo
humano donde se observa el pelo envuelto en una vaina que es la
vaina epidérmica externa continuación de la capa epidérmica.
b) Muestra un pelo arrancado donde se observa la
vaina externa y la zona del engrosamiento en el sitio de inserción
del músculo "arrectoris pili".
c) Muestra la generación de lámina epidérmicas a
partir de pelo cultivado en condiciones que favorecen la producción
de laminas epidérmicas desde la vaina externa del pelo. Al inicio
del cultivo se añade vector retroviral concentrado, representado por
el dibujo de un virus, que codifica para el gen que se quiere
expresar.
d) Muestra una lámina epidérmica producida a
través de pelo en la que se ha introducido un gen.
La realización que se describe se refiere al
desarrollo de un método para el tratamiento de enfermedades
producidas por al ausencia de un factor de manera congénita o
adquirida.
La administración continuada de este factor
tiene propiedades terapéuticas sobre la enfermedad. El método
consiste en el transplante de una epidermis secretora del factor
deficitario obtenidas a través del cultivo de la zona del pelo del
paciente que contiene las células madre y su posterior modificación
genética para introducir el gen del factor. Estas láminas
epidérmicas pueden ser transplantadas sobre zonas desepitelizadas
del paciente por varios métodos como la radiofrecuencia y entonces
funcionar como una parche secretor del factor terapéutico.
Preferiblemente este factor es el factor de
coagulación FIX ausente en los enfermos afectos de hemofilia B, lo
que condiciona una tendencia al sangrado excesivo. La obtención de
las láminas epidérmicas procedentes de pelo del propio paciente se
modifican genéticamente como se describe a continuación.
El pelo se obtiene a través de pelo occipital
arrancado con pinzas de depilar. En manos expertas el pelo
arrancado en estas condiciones contiene la vaina externa de la raíz
pilosa. En la zona superior de esta vaina en la zona de unión con el
músculo "arrectoris pili" se observa un engrosamiento que se
microdisecciona con lupa. Estos fragmentos microdiseccionados se
depositan en pocillos de placas de cultivo de plástico recubiertos
de proteínas de la membrana basal. Este recubrimiento actúa sobre
las células madre del pelo produciendo una señal que induce la
diferenciación hacia el epitelio de la piel. Asimismo, es posible
no incluir este recubrimiento de laminina aunque la eficacia del
sembrado es mas baja. Asimismo, el fragmento de pelo se cultiva en
medio de crecimiento de células epiteliales como preferiblemente el
DMEN/F12 2/1 con 10% de suero bovino fetal y en presencia de
adenosina, hormona tiroidea, toxina colérica y factor de
crecimiento epidérmico. En estas condiciones y tras un periodo de
cultivo de dos semanas se producen láminas epidérmicas de unos 3
cm^{2} que se pueden subcultivar y expandir a su vez.
Preferiblemente, el pelo proviene de un paciente hemofilico afecto
de hemofilia B.
Modificación genética: En el momento del inicio
del cultivo del pelo se añaden sobrenadantes de vectores
retrovirales producidos mediante métodos habituales para los
conocedores de la técnica. Estos vectores retrovirales pueden ser
preferiblemente de tipo oncoretroviral procedentes de virus murinos
como el virus de la leucemia de moloney (MoLv) o lentivirus de
primates con el HIV-1 (Lv). Ambos han sido
modificados genéticamente para impedir la replicación y permitir el
acomodo de insertos de genes terapéuticos. Preferiblemente este gen
es el gen del factor de coagulación FIX. Preferiblemente estos
vectores son de la familia de los oncoretrovirales tipo
(PLZR-IRES-X) o lentivirales
(PRRL-IRES-X). La utilización de
técnicas de concentrado de virus por ultracentrifugación habituales
entre los conocedores del campo como la centrifugación a 35.000 x g
durante dos horas y cuarto permite la obtención de altos títulos
(>10^{6}) unidades infecciosas/ml y la transferencia génica
sobre la practica totalidad de la células madre del
engrosamiento.
Cuando se produce el crecimiento de una lámina
epidérmica a partir de pelo del paciente, esta lámina es
transgénica para el factor que incorporaba el vector. Así, en el
caso más preferido del pelo del paciente afecto de hemofilia B, el
pelo así tratado produce una lámina epidérmica que contiene y
expresa el factor de coagulación FIX.
Esta lámina epidérmica se puede bien despegar
del plástico de cultivo con el enzima dispasa o bien se puede
disociar en células aisladas que se pueden subcultivar y expandir
resultando en la generación de nuevas láminas epidérmicas secretoras
del factor, de manera que con una solo pelo es posible recubrir
áreas de varias decenas de centímetros cuadrados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la realización de la presente invención se
obtuvo pelo occipital de varones afectos de hemofilia B que
mediante consentimiento informado accedieron a donar una docena de
pelos occipitales. Estos pelos se microdiseccionaron bajo lupa
aislándose la zona del engrosamiento que contiene las células madre
epidérmicas como se muestra en la figura 1. Posteriormente, se
realizó el cultivo individual de cada pelo en pocillos de la placa
de cultivo recubiertos de la proteína de membrana basal laminina en
presencia de un vector retroviral codificante del factor de
coagulación FIX, mas un gen marcador que produce fluorescencia
verde en las células que incorporan el vector en su genoma. Tras dos
semanas de cultivo se analizó la presencia del FIX en el
sobrenadante del medio de cultivo detectándose niveles similares
(100 ng/ml) a los producidos por las células hepatocitarias que son
las que normalmente producen el FIX.
Claims (4)
1. Método de obtención de láminas epidérmicas
secretoras de factores terapéuticos a partir de células madre de
pelo y caracterizado por comprender las siguientes
etapas:
- Obtención de pelo de paciente arrancado con
pinzas y microdiseccionado para exponer la zona del
engrosamiento.
- Cultivo individualizado de cada pelo en placas
de cultivo recubiertas de laminina.
- Cultivo individual de cada pelo en medio que
favorece la diferenciación de células epiteliales.
- Modificación genética de las células madre del
pelo para introducir el gen terapéutico del factor que precisa el
paciente.
- Cultivo de la lámina epidérmica procedente del
pelo y secretora del factor así generado.
- Subcultivo de la lamina epidérmica procedente
del pelo y secretora del factor terapéutico.
2. Método de obtención de láminas epidérmicas
secretoras de factores terapéuticos a partir de células madre de
pelo, de acuerdo con reivindicación 1, caracterizado porque
comprende una modificación genética de las células madre del pelo
según el siguiente protocolo:
Cada pelo se microdisecciona para exponer la
zona del engrosamiento y se cultiva en pocillos de placa de cultivo
celular recubiertos de laminina.
El medio de cultivo es preferentemente DMEN/F12
2/1 con 10% de suero de ternera fetal y como aditivos contiene,
adenosina, hormona tiroidea, toxina colérica y factor de
crecimiento epidérmico.
En el momento del inicio del cultivo se añade
vector retroviral concentrado mediante ultracentrifugación a
títulos superiores a 106 Unidades Infecciosas/ml en el caso de
oncoretrovirus y a 107 Unidades Infecciosas/ml en el caso de
vectores de lentivirus de primates.
Preferentemente estos vectores serán el
oncoretrovirus plrz-ires-x o el
lentivirus prrl-ires-x.
3. Lamina epidérmica secretora de factores
terapéuticos realizada a partir de células madre de pelo
caracterizada por incorporar células madre modificadas
genéticamente para expresar el gen de un factor terapéutico.
4. Lámina epidérmica secretora de factores
terapéuticos realizada a partir de células madre de pelo,
caracterizada por incorporar células madre modificadas
genéticamente para expresar el gen de un factor terapéutico cuando
este factor es una hormona, factor de coagulación, factor de
crecimiento hematopoyético, enzima, componente del suero o
fragmento soluble de receptor celular.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200500088A ES2312228B1 (es) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Epidermis cultivada secretora de factores terapeuticos producida por celulas madre de pelo y metodo de obtencion. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200500088A ES2312228B1 (es) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Epidermis cultivada secretora de factores terapeuticos producida por celulas madre de pelo y metodo de obtencion. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2312228A1 ES2312228A1 (es) | 2009-02-16 |
| ES2312228B1 true ES2312228B1 (es) | 2009-12-22 |
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ID=40339446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200500088A Withdrawn - After Issue ES2312228B1 (es) | 2005-01-18 | 2005-01-18 | Epidermis cultivada secretora de factores terapeuticos producida por celulas madre de pelo y metodo de obtencion. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2312228B1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109929800A (zh) * | 2019-03-09 | 2019-06-25 | 和携科技(北京)有限公司 | 一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6927060B2 (en) * | 2000-03-28 | 2005-08-09 | University Of Iowa Research Foundation | Methods to prepare and use epidermal stem cells |
-
2005
- 2005-01-18 ES ES200500088A patent/ES2312228B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DELLAMBRA E. et al. "{}Toward epidermal stem cell-mediated ex vivo gene therapy of junctional epidermolysis bullosa"{}. Hum Gene Ther. 01.11.2000. Vol. 11, N$^{o}$. 16, páginas 2283-2287. * |
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| GHAZIZADEH S. et al. "{}Lentivirus-mediated gene transfer to human epidermis"{}. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. Sep. 2004; Vol. 9, N$^{o}$. 3, páginas 269-275. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2312228A1 (es) | 2009-02-16 |
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