ES2307570T3 - Laminas de epitelio corneal humano reconstituidas in vitro y procedimiento para su produccion. - Google Patents

Laminas de epitelio corneal humano reconstituidas in vitro y procedimiento para su produccion. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la producción in vitro de láminas de epitelio corneal humano, caracterizado por las siguientes etapas: a) identificar células madre limbares de una biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos de las células madre limbares, b) seleccionar dichas células madre limbares identificadas mediante un análisis clonal; c) confirmar la selección de las células madre limbares mediante marcadores específicos de las células madre limbares; d) cultivar dichas células madre limbares seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo entre 2 y 5 OIU/ml, trombina y fibrinógeno en una solución de cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml una concentración de cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y aplicar dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma que las células no interaccionen con la superficie de dicho soporte.

Description

Láminas de epitelio corneal humano reconstituidas in vitro y procedimiento para su producción.
La presente invención se refiere a un implante oftálmico y, más particularmente, a la producción in vitro de láminas de epitelio corneal humano que contienen células madre procedentes de células madre limbares cultivadas, destinadas a injertarse directamente en los pacientes.
Como es sabido, en el epitelio corneal, las células madre se encuentran confinadas en la capa que se encuentra entre la córnea y la conjuntiva, el denominado limbo, y permiten que las capas superiores se renueven continuamente.
En las quemaduras oculares graves, la pérdida de tejido corneal y la eliminación total o subtotal de las células limbares induce la substitución del epitelio perdido por células conjuntivales, que forman de modo natural una capa opaca que provoca la pérdida de visión.
Los injertos de láminas de tejido que contienen células limbares permiten recuperar las funciones de la córnea, superar la ceguera debida a la lesión destructiva del epitelio limbar-corneal y realizar con éxito una queratoplastia perforante, incluso en los casos más complejos que arrojan un número extremadamente pequeño de resultados satisfactorio al utilizar los procedimientos conocidos.
Es bien sabido que resulta tan difícil cultivar y mantener in vitro las células epiteliales, dado que son frágiles y difíciles de manejar, que los procedimientos utilizados hasta la fecha para la producción de tejidos in vitro son poco eficaces.
La presente invención pretende seleccionar de forma eficaz las células limbares para su cultivo in vitro y mejorar el procedimiento de cultivo de las mismas sobre un sustrato de fibrina modificado de forma adecuada, a fin de obtener láminas reconstituidas de epitelio corneal listas para su utilización en injertos. Más particularmente, se ha mejorado el protocolo de reconstrucción in vitro a fin de garantizar la reproducibilidad y extremada simplicidad de uso de la córnea reconstituida conseguida mediante dicho protocolo.
La superficie ocular anterior humana está cubierta por dos estructuras altamente especializadas: la conjuntiva y la córnea. La córnea refracta la luz y la dirige hacia la región de percepción visual de la retina, que es responsable de focalizar las imágenes junto con el cristalino. La conjuntiva cubre la parte restante del globo ocular y realiza una función importante al mantener la homeostasis normal de la superficie ocular. Aunque los tejidos conjuntivos y limbar-corneal presentan las características típicas del epitelio, están formadas por dos tipos de células genotípicamente diferente, denominados en lo sucesivo queratinocitos conjuntivales y queratinocitos limbar-corneales, respectivamente. En particular, el epitelio corneal se renueva de forma constante y continua, debido a las células madre confinadas en la capa de transición más profunda situada entre la córnea la conjuntiva, denominada limbo, en la que se originan las células de amplificación transitorias (células TA) que forman el epitelio corneal. El epitelio corneal se renueva completamente cada 9-12 meses.
En la bibliografía existen amplios informes que respaldan la reconstitución in vitro de tejidos epiteliales destinada a reparar y/o reemplazar los naturales, por ejemplo, como resultado de quemaduras graves. Las células se cultivan in vitro sobre sustratos biológicamente adecuados, lo que contribuye a la adherencia y proliferación celular, al tiempo que permite obtener la arquitectura correcta del tejido epitelial. Uno de los sustratos más utilizados es la fibrina, que está disponible incluso en formas comerciales como TISSUCOL (fabricado por Baxter-Immuno, Viena, Austria), como solución de dos componentes: fibrinógeno y trombina. No obstante, dicha composición preparada según el protocolo facilitado por el fabricante, no resulta adecuada para su utilización en cultivos de queratinocitos limbar-corneales, debido a que no presenta la transparencia y elasticidad adecuadas.
Los protocolos de cultivo celular in vitro utilizados normalmente suponen que la propagación se produzca dentro de los matraces, pocillos, placas Petri u otros recipientes estériles de vidrio o plástico, tales como poliestireno. Dado que estas superficies no presentan una adhesividad suficiente para las células, los recipientes disponibles en el mercado se someten a un tratamiento químico previo o se irradian, de forma que se aumenten las cargas positivas sobre sus superficies y puedan interaccionar con las membranas celulares cargadas negativamente, lo que se traduce en un incremento de la adherencia celular.
La presente invención resuelve los problemas relacionados con la preparación de células madre corneales cultivadas homogéneas y regulares. Dichas células cultivadas sobre un sustrato de fibrina modificado de forma adecuada dan lugar a láminas in vitro de epitelio corneal que presentan todas las características de la córnea humana, tales como su tamaño, grosor y transparencia. Además, este procedimiento permite que las láminas elásticas de epitelio corneal se adhieran perfectamente a la superficie ocular sin necesidad de conseguir que se curven durante su desarrollo in vitro (según lo descrito por el mismo inventor en su Patente italiana n° 1255657). Finalmente, la preparación de dichas láminas de epitelio corneal humano sobre un sustrato de fibrina modificado se lleva a cabo obligatoriamente sobre placas y/o recipientes no tratados, de modo que los cultivos celulares den lugar a un producto final que presente las características de grosor, densidad y capacidad de transferencia deseadas. Por consiguiente, las láminas de epitelio corneal humano, producidas in vitro según la presente invención, están listas para su uso y adaptadas a cualquier paciente. La presente invención se refiere a un procedimiento mediante el cual es posible preparar en el laboratorio láminas de epitelio corneal humano que pueden utilizarse en injertos. Dicho método precisa una serie de etapas a fin de conseguir cultivos celulares homogéneos con células madre que sean capaces de formar fácilmente láminas de epitelio corneal humano in vitro listas para usar, gracias al sustrato de fibrina modificado.
Es un objetivo de la invención dar a conocer un procedimiento para la producción in vitro de láminas de epitelio corneal humano, caracterizado por las siguientes etapas:
a) identificar células madre limbares de una biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos de las células madre limbares;
b) seleccionar dichas células madre limbares identificadas mediante un análisis clonal;
c) confirmar la selección de las células madre limbares mediante marcadores específicos de las células madre limbares;
d) cultivar dichas células madre limbares seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo entre 2 y 5 OIU/ml de trombina y fibrinógeno en una solución de cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml y una concentración de cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y aplicar dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma que las células no interaccionen con la superficie de dicho soporte.
Preferentemente, los marcadores específicos se incluyen en el grupo de queratina 19, queratina 12, queratina 3 y proteína p63.
Preferentemente, las láminas de epitelio corneal humano presentan unas características de tamaño, densidad, transparencia, elasticidad y grosor tales que pueden insertarse de forma inmediata y el sustrato de fibrina modificado se puede reabsorber tras el injerto.
Preferentemente, el sustrato de fibrina modificado presenta un grosor comprendido entre 50 y 300 micrómetros, más preferentemente de 100 micrómetros. Según un aspecto preferente, el soporte sólido no tratado es un anillo, más preferentemente, el anillo presenta un tamaño compatible con la córnea humana, y lo más preferentemente, presenta un diámetro comprendido entre 15 y 40 mm y una altura comprendida entre 3 y 8 mm.
En una realización específica, el diámetro es de 33 mm.
Otras características y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la descripción detallada de una realización con referencia a los dibujos adjuntos. En los dibujos:
La figura 1 muestra una sección histológica de una capa de células tomadas de la región limbar, fijada y coloreada con los anticuerpos específicos K3 y K19.
La figura 2 muestra una sección histológica de una capa de células conjuntivales, fijada y coloreada con los anticuerpos específicos K3 y K19.
La figura 3 muestra clones obtenidos mediante muestras de biopsias de la región limbar.
La figura 4 muestra el aspecto morfológico de un holoclón.
La figura 5 muestra láminas de epitelio corneal obtenidas in vitro.
Preparación de los cultivos celulares
Según lo descrito anteriormente, las células responsables de la renovación continua del epitelio corneal son las células de la capa limbar. La capa limbar también contiene células madre y, por esta razón, es capaz de regenerar de nuevo la totalidad del epitelio. El objetivo de la invención es un nuevo protocolo para la preparación in vitro de células madre limbares cultivadas, que comprende los siguientes pasos:
1. Selección de células extraídas del limbo
Se toman muestras celulares de la región ocular limbar mediante una biopsia. Según lo mencionado anteriormente, el limbo es la capa de transición que se encuentra entre el epitelio conjuntivo y el epitelio corneal. Por esta razón, para conseguir cultivos celulares formados principalmente por células corneales, es necesario distinguir claramente entre dos tipos de células. Los marcadores específicos permiten distinguir genotípicamente las células corneales de las células conjuntivas subyacentes. Es bien sabido que el epitelio conjuntivo produce citoqueratina 19, mientras que el epitelio corneal produce específicamente citoqueratina 3 y 12.
Por consiguiente, los cultivos celulares procedentes de material biopsiado se detectan mediante un inmunoanálisis con anticuerpos específicos para la citoqueratina 3 y la citoqueratina 19, mediante una técnica conocida.
En las figuras 1 y 2 se muestra cómo distintas preparaciones celulares reaccionan con los anticuerpos específicos. En particular, la figura 1 muestra las células corneales que expresan el fenotipo K3+/K19-, mientras que la figura 2 muestra las células conjuntivales con el fenotipo K3-/K19+. De esta forma, sólo se pueden seleccionar cultivos celulares que contengan células conjuntivales en una proporción inferior al 50%. Como resultado, los cultivos celulares obtenidos con células corneales que expresen el fenotipo K3+ y negativas para el marcador específico K19, contienen células madre corneales.
Así pues, tras la obtención de preparaciones celulares de células corneales y limbares en una proporción superior al 50%, es necesario identificar las células madre corneales.
2. Selección de células limbares mediante análisis clonal
Según lo descrito anteriormente, las células madre limbares dan lugar a células de amplificación transitoria (TA) que se diferencian de forma definitiva tras varias divisiones celulares.
El análisis clonal permite seleccionar las células madre al objeto de analizar su capacidad de propagación en un cultivo. Por consiguiente, las células se clasifican como holoclones, meroclones y paraclones mediante esta técnica.
Los holoclones están formados por células que pertenecen a la capa del limbo basal que muestran una alta capacidad proliferativa (son capaces de sufrir 100 divisiones), son capaces de generar in vivo un epitelio maduro y diferenciarse en linajes celulares distintos. Los holoclones se generan a partir de las células madre del limbo [Pellegrini, G. et al., 1999, J. Cell Biol., 145, 769-782].
Los paraclones están formados por células TA que se dividen 15 veces como máximo y dan lugar a colonias formadas por células en la etapa terminal de diferenciación.
Los meroclones están formados por células TA jóvenes que tienen una capacidad proliferativa mayor que la de los paraclones. La conversión de holoclones a meroclones y paraclones es irreversible.
Según se muestra en las figuras 3 y 4, únicamente las células procedentes de la región limbar dan lugar a colonias grandes y lisas, los holoclones y pueden cultivarse hasta 14 pasos (2-3 meses) y sufrir 80-100 divisiones celulares antes de la senescencia.
3. Selección de células madre limbares utilizando marcadores específicos para las células limbares
Según la presente invención, los resultados obtenidos mediante el análisis clonal deben confirmarse de forma unívoca mediante análisis adicionales con marcadores específicos para las células limbares.
La proteína p63, un factor de la transcripción de la misma familia que las proteínas p53 y p73, se utiliza como marcador específico [Pellegrini, G. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3156-3161]. Como es sabido, p53 desempeña una función importante en la inhibición tumoral, mientras que p63 y p73 están implicadas en la diferenciación celular.
Los resultados apuntan a que la expresión de p63 en las células holoclones, es decir, en las células madre, es 200 veces mayor que en las células paraclones.
La expresión específica de p63 en células madre también se confirma comparando su expresión con la expresión del PCNA (antígeno nuclear de las células proliferativas), que es una característica de las células proliferativa se activas. Los resultados muestran que p63 se expresa en las células madre, independientemente de su estado proliferativo, pero no en las células en fase de multiplicación.
Como resultado del proceso de selección descrito anteriormente, se obtienen cultivos celulares compuestos principalmente por células madre y capaces de regenerar el tejido corneal in vitro. Además, se demuestra que dicho tejido corneal es positivamente capaz de mantener sus funciones fisiológicas durante un período mínimo de 5 años tras un injerto en un paciente.
Modificación del sustrato de fibrina
Es bien sabido que la fibrina es el producto de la reacción de polimerización del fibrinógeno inducida por la trombina. Esta sustancia actúa como sellante que contribuye a que las células formen capas continuas y homogéneas. Los componentes se conocen bajo el nombre comercial TISSUCOL (Baxter-Immuno, Viena, Austria). Tal y como ya se ha mencionado, el protocolo de preparación del producto comercial no resulta adecuado para la reconstitución in vitro de láminas de epitelio corneal humano debido a que no es lo suficientemente transparente y elástico.
Con el objetivo de solucionar este problema, se ha modificado adecuadamente el protocolo de preparación a fin de obtener soluciones de trombina y fibrina que, una vez mezcladas, den lugar a un gel de fibrina que presente las características necesarias de flexibilidad y transparencia.
Esto se consigue modificando la fuerza iónica de dichas soluciones añadiendo sales tales como cloruro de sodio y cloruro de calcio, y modulando consecuentemente la reacción de polimerización. Siguiendo este protocolo, es posible conseguir un producto final que presente unas características químicas y físicas precisas. En particular, el gel de fibrina obtenido mediante dicho procedimiento contiene sodio en una concentración comprendida entre 0,5 y 0,001 milimoles y cloro en una concentración comprendida entre 0,2 y 0,003 milimoles.
A continuación, se preparan tanto las soluciones para la disolución de trombina y para la disolución de fibrina mezclando NaCl, CaCl_{2} y H_{2}O destilada.
Los paquetes de trombina y fibrinógeno de la forma comercial TISSUCOL (Baxter-Immuno, Viena, Austria) se descongelan en un baño termostatizado a 37ºC. A continuación, se transfiere una cantidad de la solución de trombina desde el paquete al tubo de ensayo y se diluye con la solución para la disolución de la trombina previamente preparada hasta que se obtenga una concentración de trombina comprendida entre 2 y 5 OIU/ml. Del mismo modo, se transfiere una cantidad de fibrina a una placa Petri y se mezclan con la solución para la disolución de fibrina previamente preparada.
En este momento, las soluciones preparadas mediante este procedimiento se aplican, en condiciones de esterilidad, sobre una placa para bacteriología, en la que la forma circular se obtiene confinando el sustrato de fibrina dentro de un anillo con un diámetro ligeramente mayor que el de la córnea humana a fin de conseguir láminas del epitelio corneal humano capaces de adaptarse exactamente a la superficie ocular y capaces de mantener el tamaño adecuado tras su injerto y posterior reabsorción del sustrato de capa de fibrina. La utilización de placas y/o recipientes para cultivos celulares no tratados resulta fundamental para la consecución de láminas de epitelio corneal que presenten las características específicas de grosor, densidad y capacidad de transferencia necesarias en el ámbito quirúrgico.
El anillo se prepara cortando el extremo superior de un tubo de ensayo de 50 ml con un diámetro comprendido entre 20 y 40 mm a una altura comprendida entre 3 y 8,0 mm mediante un alambre de wolframio calentado al blanco. A continuación, el objeto obtenido se esteriliza en un autoclave.
Tras una agitación suave hasta distribuir el gel de forma uniforme, se mantiene la placa, en condiciones de esterilidad, hasta la polimerización completa y se conserva a 4ºC durante un tiempo comprendido entre 1 hora y un máximo de 1 mes.
El gel de fibrina formado como resultado de la reacción de polimerización presenta las características fisicoquímicas deseadas y se caracteriza porque contiene sodio en una concentración comprendida entre 0,5 y 0,001 milimoles y cloro en una concentración comprendida entre 0,2 y 0,003 milimoles en una cantidad final gel de 0,6 ml.
La capa de fibrina en forma de gel obtenida mediante este procedimiento presenta un grosor comprendido entre 50 y 300 micrómetros y un diámetro comprendido entre 15 y 40 mm, y es elástica y transparente.
Reconstitución in vitro de láminas de epitelio corneal
Se procede a tratar cultivos de queratinocitos limbares, obtenidos según lo descrito anteriormente, con tripsina y se colocan sobre una placa dentro del anillo de fibrina (densidad celular comprendida entre 2,5x10^{4} células/cm^{2} y 1x10^{5} células/cm^{2}) en presencia de una capa nutritiva de células 3T3-J2 sometidas a irradiación letal (fibroblastos embrionales murinos) que presentan las características descritas anteriormente. Una vez alcanzada la confluencia, las capas epiteliales obtenidas sobre el sustrato de fibrina modificado se lavan con medio Eagle modificado (Dulbecco Modified Eagle's Medium, DMEM) que incluye glutamina, penicilina y estreptomicina y se almacenan en un recipiente para lentes de contacto (Bausch and Lomb) en presencia de DMEM, según se ilustra en la figura 5. Las láminas de epitelio limbar-corneal humano obtenidas mediante este procedimiento están listas para su utilización terapéutica.
Ejemplo
En el momento de confluencia, se retiran de los matraces de cultivo las células cultivadas obtenidas a partir de biopsias con Dispase II (Green, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5665-5668), se fijan en formaldehido (4% en PBS) durante 12 horas a 4ºC y se incluyen en parafina. Los cortes se tiñen con hematoxilina-eosina o con anticuerpos monoclonales específicos para citoqueratina 3 (AE5 mAB; DAKO) y citoqueratina 19 (RCK108 mAB; DAKO). Se lleva a cabo el mismo protocolo de coloración transcurridas 24 horas de la recogida de la muestra de células de un cultivo no confluente, se realiza una citocentrifugación en un portaobjetos de vidrio y se procede al secado.
El anticuerpo específico de citoqueratina 3 unido al sustrato se identifica mediante el complejo antirratón HRP-dextrano (sistema EnVision Plus/HPR de DAKO) y tetraclorato de 3,3'-diaminobenzidina (FAST DAB; Sigma Chemical Co.) como cromógeno.
El anticuerpo específico de citoqueratina 19 unido al sustrato se identifica mediante el complejo antirratón de dextrano conjugado con fosfatasa alcalina (sistema EnVision Plus/HPR de DAKO) y Fast rED TR/Naphtol AS-MX (FAST Red; Sigma Chemical Co.) como cromógeno.
La presencia de células madre corneales se detecta mediante un análisis clonal. Las células sencillas aisladas mediante microscopía se inoculan en pocillos que contienen una capa nutritiva de células 3T3-J2 (fibroblastos embrionales murinos) (Rochat, A. et al., 1994, Cell, 76, 1063-1073) cultivados hasta el décimo paso y amplificarse para obtener una tasa máxima de 1: 10 Tras 7 días, los clones se identifican mediante microscopía, se mide su tamaño y se transfieren a una placa que contiene una capa de células 3T3-J2. Transcurridos 12 días, el contenido de la placa se fija mediante rodamina B.
El tipo clonal se determina midiendo la proporción de colonias inviables (Barrandon, Y. and Green, H., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2302-2306).
Los resultados obtenidos mediante el análisis clonal se confirman mediante el análisis realizado utilizando la proteína p63.
Los cultivos celulares, tanto de las biopsias confluentes como de los clones previamente identificados, se retiran de los matraces de cultivo con Dispase II (Green, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5665-5668), se fijan en formaldehido (4% en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incluyen en parafina.
Las células tratadas, o una cantidad de las mismas retiradas de un cultivo no confluente, citocentrifugado en un portaobjetos de vidrio y fijado tras 24 horas con una mezcla de peróxido de oxígeno y metanol durante 5 minutos a 20ºC, se tiñen con anticuerpos monoclonales específicos para p63 (suministrados por Frank Kckeon) y un anticuerpo específico para el PCNA (antígeno nuclear de las células proliferativas) (Santa Cruz Biotechnology) según técnicas conocidas (Yang, A. et al., 1999, Nature, 398, 714-718; Parsa, R. et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 113, 1099-1105; Bravo, R. et al., 1987, Nature, 326, 515-517). Las células se extraen para realizar una transferencia con tampón RIPA (0,15 mM NaCl/0,05 mM Tris HCl, pH 7,2/1% Triton X- 100/1% desoxicolato de sodio/0,1% SDS), según ya ha descrito el mismo inventor (Dellambra, E. et. al., 2000, J. Cel. Biol., 149, 117-1129). Se analizan muestras análogas mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida/SDS y se transfieren a filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P, Millipore). Las reacciones inmunológicas se llevan a cabo según lo descrito anteriormente y los anticuerpos unidos al filtro se detectan mediante quimioluminiscencia con ECL (Amersham Pharmacia).
Según lo descrito anteriormente, los cultivos celulares obtenidos mediante el proceso anterior están formados por un 95% de células madre corneales.
La solución para la disolución de la trombina se prepara mezclando 11 ml de NaCl al 10% con 1 ml de CaCl_{2} 100 mM en 88 ml de H_{2}O destilada. De igual modo, la solución para la disolución de la fibrina se prepara mezclando 1038 microlitros de NaCl al 10%, 1,74 ml de NaCl al 0,9%, y 108 microlitros de CaCl_{2} 100 mM en 2914 microlitros de H_{2}O destilada. Los paquetes de trombina y fibrinógeno se mantienen en un baño termostatizado a 37ºC hasta que estén completamente descongelados. A continuación, se transfieren 0,5 ml de la solución de trombina desde el paquete hasta un tubo de ensayo y se diluyen con 4,5 ml de la solución previamente preparada para la disolución de trombina, tras lo cual se diluyen otros 1,5 ml de dicha solución con 25 ml de la solución para la disolución de trombina para obtener una concentración de trombina de 3 OIU/ml. Del mismo modo, se transfieren 5 ml de fibrina a una placa Petri y se mezclan con 5,8 ml de la solución para la disolución de fibrina previamente preparada.
Seguidamente, se distribuyen 0,3 ml de cada una de las soluciones anteriores, en condiciones de esterilidad, sobre una placa para bacteriología, sobre la que se ha dispuesto el anillo preparado cortando el extremo superior de un tubo de ensayo de 50 ml con un diámetro de 30 mm a una altura de 8,0 mm mediante un alambre de wolframio calentado al blanco.
Tras una agitación suave hasta distribuir el gel de forma uniforme, se mantiene la placa, en condiciones de esterilidad, hasta la polimerización completa y se conserva a 4ºC durante un tiempo comprendido entre 1 hora y un máximo de 1 mes.
El gel de fibrina formado como resultado de la reacción de polimerización se caracteriza porque incluye sodio en una concentración comprendida entre 0,08 y 0,16 milimoles y una cantidad óptima de cloro en una concentración comprendida entre 0,03 y 0,01 milimoles. La proporción exacta entre los cloruros de sodio y calcio aporta a dicho gel las características fisicoquímicas deseadas.
La capa de gel de fibrina obtenida mediante este procedimiento presenta un grosor de 100 micrómetros y un diámetro de 33 mm, y es elástica y transparente. Finalmente, las láminas de epitelio corneal listas para su utilización en injertos se obtienen tratando con tripsina los cultivos de queratinocitos limbares, preparados según lo descrito anteriormente con Dispase II y colocándolo sobre una placa dentro del anillo de fibrina con una densidad celular comprendida entre 2,5x10^{4} células/cm^{2} y 1x10^{5} células/cm^{2} en presencia de una capa nutritiva de células 3T3-J2. Una vez alcanzada la confluencia, las capas epiteliales sobre el sustrato de fibrina se lavan con medio Eagle modificado (Dulbecco Modified Eagle's Medium, DMEM) que incluye 4 mM de glutamina, 50 IU/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina y se almacenan en un recipiente para lentes de contacto (Bausch and Lomb) en presencia de DMEM.
Las láminas de epitelio corneal humano reconstituidas mediante este procedimiento se han analizado clínicamente en 18 pacientes afectados por pérdida de visión debida a quemaduras graves provocadas por agentes químicos, 11 de los cuales sufrían una pérdida total del limbo y 3 pacientes afectados por pérdidas graves de la región limbar. La implantación de la córnea reconstituida in vitro consiguió resultados positivos en 14 de 18 pacientes. Más exactamente, el epitelio corneal se recupera completamente tras unos 7 días, todos los síntomas relacionados con los procesos inflamatorios y de vascularización remiten tras 3-4 semanas y la superficie de la córnea tiene aspecto recuperado caracterizado por un epitelio liso y transparente tras un mes. Finalmente, el epitelio corneal recupera completamente sus características naturales tras 12-24 meses y la agudeza visual de los pacientes vuelve a ser normal en el caso de las lesiones no graves, mientras que dicho procedimiento permite realizar con éxito la denominada queratoplastia perforante, que consigue la recuperación de la visión en los casos de lesiones graves. Además, dicho procedimiento previene el rechazo de los injertos como consecuencia de los trasplantes procedentes de donantes heterólogos, en los casos en los que el paciente haya conservado 1 mm de región limbar como mínimo en uno de sus ojos.
En conclusión, la presente invención permite fácilmente obtener láminas de epitelio corneal humano in vitro que pueden utilizarse en injertos con un tamaño y transparencia similares a las humanas. Además, el sustrato de fibrina preparado mediante este procedimiento contribuye a la adherencia celular tras el injerto debido a que se reabsorbe con prontitud sin producir ninguna reacción alérgica en el paciente. Asimismo, la utilización de placas y/o recipientes para cultivos celulares de plástico o vidrio no tratados permite obtener un producto final que presente unas características óptimas de grosor, densidad y capacidad de transferencia para su utilización en intervenciones quirúrgicas. Finalmente, según lo mencionado anteriormente, dicho tejido corneal es capaz de mantener sus funciones fisiológicas durante un período mínimo de 5 años tras un injerto en los pacientes.

Claims (9)

1. Procedimiento para la producción in vitro de láminas de epitelio corneal humano, caracterizado por las siguientes etapas:
a) identificar células madre limbares de una biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos de las células madre limbares,
b) seleccionar dichas células madre limbares identificadas mediante un análisis clonal;
c) confirmar la selección de las células madre limbares mediante marcadores específicos de las células madre limbares;
d) cultivar dichas células madre limbares seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo entre 2 y 5 OIU/ml, trombina y fibrinógeno en una solución de cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml una concentración de cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y aplicar dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma que las células no interaccionen con la superficie de dicho soporte.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores específicos se incluyen en el grupo de queratina 19, queratina 12, queratina 3 y proteína p63.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichas láminas de epitelio corneal humano presentan unas características de tamaño, densidad, transparencia, elasticidad y grosor tales que pueden insertarse de forma inmediata y el sustrato de fibrina modificado se puede reabsorber tras el injerto.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato de fibrina modificado presenta un grosor comprendido entre 50 y 300 micrómetros.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que el grosor es de 100 micrómetros.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que el soporte sólido no tratado tiene forma de anillo.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el anillo presenta un tamaño compatible con la córnea humana.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que el anillo tiene un diámetro comprendido entre 15 y 40 mm y una altura comprendida entre 3 y 8 mm.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que el diámetro es de 33 mm.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050186672A1 (en) * 2004-01-27 2005-08-25 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Tissue system with undifferentiated stem cells derived from corneal limbus
US8187875B2 (en) * 2004-02-26 2012-05-29 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Dopaminergic neurons derived from corneal limbus, methods of isolation and uses thereof
US20060216821A1 (en) * 2004-02-26 2006-09-28 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Pluripotent embryonic-like stem cells derived from corneal limbus, methods of isolation and uses thereof
WO2005084119A2 (en) * 2004-02-26 2005-09-15 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Pluripotent embryonic-like stem cells derived from corneal limbus, methods of isolation and uses thereof
ITRM20040273A1 (it) * 2004-06-03 2004-09-03 Farmigea Spa Metodo per l'isolamento e l'espansione ex vivo di cellule staminali corneali umane e loro relativi usi.
NZ570746A (en) * 2006-02-24 2012-02-24 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Conjunctival tissue system
WO2011040888A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Singapore Health Services Pte Ltd A biodegradable composition or combination and uses thereof
RU2505303C2 (ru) * 2011-09-13 2014-01-27 Общество с ограниченной ответственностью "Офтальмологические биотехнологии" Способ получения биотрансплантата для роговицы
FR2993282B1 (fr) 2012-07-13 2017-11-10 Expanscience Lab Procede d'identification de marqueurs moleculaires de la peau d'enfant
FR3011008B1 (fr) 2013-09-24 2017-12-29 Expanscience Lab Procedes d'evaluation des effets deleteres des uv sur la peau d'enfant
FR3016373B1 (fr) 2014-01-10 2018-01-19 Laboratoires Expanscience Modele de peau de mammelon reconstitue
FR3019186B1 (fr) 2014-03-31 2019-06-07 Laboratoires Expanscience Procedes d'evaluation des effets deleteres de l'urine sur la peau d'enfant
FR3045669B1 (fr) 2015-12-16 2019-04-05 Laboratoires Expanscience Procedes d'evaluation des effets de la deshydratation sur la peau d'enfant
FR3053053B1 (fr) 2016-06-23 2018-07-13 Laboratoires Expanscience Modeles de la dermatite atopique juvenile
FR3068045B1 (fr) 2017-06-22 2021-06-04 Expanscience Lab Modeles de peau sensible reconstituee
FR3133198A1 (fr) 2022-03-04 2023-09-08 Pierre Fabre Dermo-Cosmetique Modele de peau reconstituee
FR3138149A1 (fr) 2022-07-25 2024-01-26 Pierre Fabre Dermo-Cosmetique Méthode d’évaluation in vitro de l’activité photoprotectrice d’un actif

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1255657B (it) 1992-05-29 1995-11-09 Colture di tessuto di mucosa congiuntivale differenziata, procedimentoper la loro preparazione e supporti per il loro uso.
US5827641A (en) 1992-11-13 1998-10-27 Parenteau; Nancy L. In vitro cornea equivalent model
CA2227827A1 (en) 1998-01-23 1999-07-23 Unknown In vitro artificial cornea and sclera

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FR15C0055I2 (fr) 2016-06-24

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