ES2307570T3 - Laminas de epitelio corneal humano reconstituidas in vitro y procedimiento para su produccion. - Google Patents
Laminas de epitelio corneal humano reconstituidas in vitro y procedimiento para su produccion. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la producción in vitro de láminas de epitelio corneal humano, caracterizado por las siguientes etapas: a) identificar células madre limbares de una biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos de las células madre limbares, b) seleccionar dichas células madre limbares identificadas mediante un análisis clonal; c) confirmar la selección de las células madre limbares mediante marcadores específicos de las células madre limbares; d) cultivar dichas células madre limbares seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo entre 2 y 5 OIU/ml, trombina y fibrinógeno en una solución de cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml una concentración de cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y aplicar dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma que las células no interaccionen con la superficie de dicho soporte.
Description
Láminas de epitelio corneal humano
reconstituidas in vitro y procedimiento para su
producción.
La presente invención se refiere a un implante
oftálmico y, más particularmente, a la producción in vitro de
láminas de epitelio corneal humano que contienen células madre
procedentes de células madre limbares cultivadas, destinadas a
injertarse directamente en los pacientes.
Como es sabido, en el epitelio corneal, las
células madre se encuentran confinadas en la capa que se encuentra
entre la córnea y la conjuntiva, el denominado limbo, y permiten
que las capas superiores se renueven continuamente.
En las quemaduras oculares graves, la pérdida de
tejido corneal y la eliminación total o subtotal de las células
limbares induce la substitución del epitelio perdido por células
conjuntivales, que forman de modo natural una capa opaca que
provoca la pérdida de visión.
Los injertos de láminas de tejido que contienen
células limbares permiten recuperar las funciones de la córnea,
superar la ceguera debida a la lesión destructiva del epitelio
limbar-corneal y realizar con éxito una
queratoplastia perforante, incluso en los casos más complejos que
arrojan un número extremadamente pequeño de resultados
satisfactorio al utilizar los procedimientos conocidos.
Es bien sabido que resulta tan difícil cultivar
y mantener in vitro las células epiteliales, dado que son
frágiles y difíciles de manejar, que los procedimientos utilizados
hasta la fecha para la producción de tejidos in vitro son
poco eficaces.
La presente invención pretende seleccionar de
forma eficaz las células limbares para su cultivo in vitro y
mejorar el procedimiento de cultivo de las mismas sobre un sustrato
de fibrina modificado de forma adecuada, a fin de obtener láminas
reconstituidas de epitelio corneal listas para su utilización en
injertos. Más particularmente, se ha mejorado el protocolo de
reconstrucción in vitro a fin de garantizar la
reproducibilidad y extremada simplicidad de uso de la córnea
reconstituida conseguida mediante dicho protocolo.
La superficie ocular anterior humana está
cubierta por dos estructuras altamente especializadas: la
conjuntiva y la córnea. La córnea refracta la luz y la dirige hacia
la región de percepción visual de la retina, que es responsable de
focalizar las imágenes junto con el cristalino. La conjuntiva cubre
la parte restante del globo ocular y realiza una función importante
al mantener la homeostasis normal de la superficie ocular. Aunque
los tejidos conjuntivos y limbar-corneal presentan
las características típicas del epitelio, están formadas por dos
tipos de células genotípicamente diferente, denominados en lo
sucesivo queratinocitos conjuntivales y queratinocitos
limbar-corneales, respectivamente. En particular,
el epitelio corneal se renueva de forma constante y continua,
debido a las células madre confinadas en la capa de transición más
profunda situada entre la córnea la conjuntiva, denominada limbo,
en la que se originan las células de amplificación transitorias
(células TA) que forman el epitelio corneal. El epitelio corneal se
renueva completamente cada 9-12 meses.
En la bibliografía existen amplios informes que
respaldan la reconstitución in vitro de tejidos epiteliales
destinada a reparar y/o reemplazar los naturales, por ejemplo, como
resultado de quemaduras graves. Las células se cultivan in
vitro sobre sustratos biológicamente adecuados, lo que
contribuye a la adherencia y proliferación celular, al tiempo que
permite obtener la arquitectura correcta del tejido epitelial. Uno
de los sustratos más utilizados es la fibrina, que está disponible
incluso en formas comerciales como TISSUCOL (fabricado por
Baxter-Immuno, Viena, Austria), como solución de
dos componentes: fibrinógeno y trombina. No obstante, dicha
composición preparada según el protocolo facilitado por el
fabricante, no resulta adecuada para su utilización en cultivos de
queratinocitos limbar-corneales, debido a que no
presenta la transparencia y elasticidad adecuadas.
Los protocolos de cultivo celular in
vitro utilizados normalmente suponen que la propagación se
produzca dentro de los matraces, pocillos, placas Petri u otros
recipientes estériles de vidrio o plástico, tales como
poliestireno. Dado que estas superficies no presentan una
adhesividad suficiente para las células, los recipientes
disponibles en el mercado se someten a un tratamiento químico
previo o se irradian, de forma que se aumenten las cargas positivas
sobre sus superficies y puedan interaccionar con las membranas
celulares cargadas negativamente, lo que se traduce en un
incremento de la adherencia celular.
La presente invención resuelve los problemas
relacionados con la preparación de células madre corneales
cultivadas homogéneas y regulares. Dichas células cultivadas sobre
un sustrato de fibrina modificado de forma adecuada dan lugar a
láminas in vitro de epitelio corneal que presentan todas las
características de la córnea humana, tales como su tamaño, grosor y
transparencia. Además, este procedimiento permite que las láminas
elásticas de epitelio corneal se adhieran perfectamente a la
superficie ocular sin necesidad de conseguir que se curven durante
su desarrollo in vitro (según lo descrito por el mismo
inventor en su Patente italiana n° 1255657). Finalmente, la
preparación de dichas láminas de epitelio corneal humano sobre un
sustrato de fibrina modificado se lleva a cabo obligatoriamente
sobre placas y/o recipientes no tratados, de modo que los cultivos
celulares den lugar a un producto final que presente las
características de grosor, densidad y capacidad de transferencia
deseadas. Por consiguiente, las láminas de epitelio corneal humano,
producidas in vitro según la presente invención, están
listas para su uso y adaptadas a cualquier paciente. La presente
invención se refiere a un procedimiento mediante el cual es posible
preparar en el laboratorio láminas de epitelio corneal humano que
pueden utilizarse en injertos. Dicho método precisa una serie de
etapas a fin de conseguir cultivos celulares homogéneos con células
madre que sean capaces de formar fácilmente láminas de epitelio
corneal humano in vitro listas para usar, gracias al
sustrato de fibrina modificado.
Es un objetivo de la invención dar a conocer un
procedimiento para la producción in vitro de láminas de
epitelio corneal humano, caracterizado por las siguientes
etapas:
a) identificar células madre limbares de una
biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos
de las células madre limbares;
b) seleccionar dichas células madre limbares
identificadas mediante un análisis clonal;
c) confirmar la selección de las células madre
limbares mediante marcadores específicos de las células madre
limbares;
d) cultivar dichas células madre limbares
seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo
entre 2 y 5 OIU/ml de trombina y fibrinógeno en una solución de
cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio
comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml y una concentración
de cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y
aplicar dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma
que las células no interaccionen con la superficie de dicho
soporte.
Preferentemente, los marcadores específicos se
incluyen en el grupo de queratina 19, queratina 12, queratina 3 y
proteína p63.
Preferentemente, las láminas de epitelio corneal
humano presentan unas características de tamaño, densidad,
transparencia, elasticidad y grosor tales que pueden insertarse de
forma inmediata y el sustrato de fibrina modificado se puede
reabsorber tras el injerto.
Preferentemente, el sustrato de fibrina
modificado presenta un grosor comprendido entre 50 y 300
micrómetros, más preferentemente de 100 micrómetros. Según un
aspecto preferente, el soporte sólido no tratado es un anillo, más
preferentemente, el anillo presenta un tamaño compatible con la
córnea humana, y lo más preferentemente, presenta un diámetro
comprendido entre 15 y 40 mm y una altura comprendida entre 3 y 8
mm.
En una realización específica, el diámetro es de
33 mm.
Otras características y ventajas de la presente
invención resultarán más evidentes a partir de la descripción
detallada de una realización con referencia a los dibujos adjuntos.
En los dibujos:
La figura 1 muestra una sección histológica de
una capa de células tomadas de la región limbar, fijada y coloreada
con los anticuerpos específicos K3 y K19.
La figura 2 muestra una sección histológica de
una capa de células conjuntivales, fijada y coloreada con los
anticuerpos específicos K3 y K19.
La figura 3 muestra clones obtenidos mediante
muestras de biopsias de la región limbar.
La figura 4 muestra el aspecto morfológico de un
holoclón.
La figura 5 muestra láminas de epitelio corneal
obtenidas in vitro.
Según lo descrito anteriormente, las células
responsables de la renovación continua del epitelio corneal son las
células de la capa limbar. La capa limbar también contiene células
madre y, por esta razón, es capaz de regenerar de nuevo la
totalidad del epitelio. El objetivo de la invención es un nuevo
protocolo para la preparación in vitro de células madre
limbares cultivadas, que comprende los siguientes pasos:
Se toman muestras celulares de la región ocular
limbar mediante una biopsia. Según lo mencionado anteriormente, el
limbo es la capa de transición que se encuentra entre el epitelio
conjuntivo y el epitelio corneal. Por esta razón, para conseguir
cultivos celulares formados principalmente por células corneales,
es necesario distinguir claramente entre dos tipos de células. Los
marcadores específicos permiten distinguir genotípicamente las
células corneales de las células conjuntivas subyacentes. Es bien
sabido que el epitelio conjuntivo produce citoqueratina 19,
mientras que el epitelio corneal produce específicamente
citoqueratina 3 y 12.
Por consiguiente, los cultivos celulares
procedentes de material biopsiado se detectan mediante un
inmunoanálisis con anticuerpos específicos para la citoqueratina 3
y la citoqueratina 19, mediante una técnica conocida.
En las figuras 1 y 2 se muestra cómo distintas
preparaciones celulares reaccionan con los anticuerpos específicos.
En particular, la figura 1 muestra las células corneales que
expresan el fenotipo K3+/K19-, mientras que la figura 2 muestra las
células conjuntivales con el fenotipo K3-/K19+. De esta forma, sólo
se pueden seleccionar cultivos celulares que contengan células
conjuntivales en una proporción inferior al 50%. Como resultado,
los cultivos celulares obtenidos con células corneales que expresen
el fenotipo K3+ y negativas para el marcador específico K19,
contienen células madre corneales.
Así pues, tras la obtención de preparaciones
celulares de células corneales y limbares en una proporción
superior al 50%, es necesario identificar las células madre
corneales.
Según lo descrito anteriormente, las células
madre limbares dan lugar a células de amplificación transitoria
(TA) que se diferencian de forma definitiva tras varias divisiones
celulares.
El análisis clonal permite seleccionar las
células madre al objeto de analizar su capacidad de propagación en
un cultivo. Por consiguiente, las células se clasifican como
holoclones, meroclones y paraclones mediante esta técnica.
Los holoclones están formados por células que
pertenecen a la capa del limbo basal que muestran una alta capacidad
proliferativa (son capaces de sufrir 100 divisiones), son capaces
de generar in vivo un epitelio maduro y diferenciarse en
linajes celulares distintos. Los holoclones se generan a partir de
las células madre del limbo [Pellegrini, G. et al., 1999, J.
Cell Biol., 145, 769-782].
Los paraclones están formados por células TA que
se dividen 15 veces como máximo y dan lugar a colonias formadas por
células en la etapa terminal de diferenciación.
Los meroclones están formados por células TA
jóvenes que tienen una capacidad proliferativa mayor que la de los
paraclones. La conversión de holoclones a meroclones y paraclones
es irreversible.
Según se muestra en las figuras 3 y 4,
únicamente las células procedentes de la región limbar dan lugar a
colonias grandes y lisas, los holoclones y pueden cultivarse hasta
14 pasos (2-3 meses) y sufrir
80-100 divisiones celulares antes de la
senescencia.
Según la presente invención, los resultados
obtenidos mediante el análisis clonal deben confirmarse de forma
unívoca mediante análisis adicionales con marcadores específicos
para las células limbares.
La proteína p63, un factor de la transcripción
de la misma familia que las proteínas p53 y p73, se utiliza como
marcador específico [Pellegrini, G. et al., 2001, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3156-3161]. Como es
sabido, p53 desempeña una función importante en la inhibición
tumoral, mientras que p63 y p73 están implicadas en la
diferenciación celular.
Los resultados apuntan a que la expresión de p63
en las células holoclones, es decir, en las células madre, es 200
veces mayor que en las células paraclones.
La expresión específica de p63 en células madre
también se confirma comparando su expresión con la expresión del
PCNA (antígeno nuclear de las células proliferativas), que es una
característica de las células proliferativa se activas. Los
resultados muestran que p63 se expresa en las células madre,
independientemente de su estado proliferativo, pero no en las
células en fase de multiplicación.
Como resultado del proceso de selección descrito
anteriormente, se obtienen cultivos celulares compuestos
principalmente por células madre y capaces de regenerar el tejido
corneal in vitro. Además, se demuestra que dicho tejido
corneal es positivamente capaz de mantener sus funciones
fisiológicas durante un período mínimo de 5 años tras un injerto en
un paciente.
Es bien sabido que la fibrina es el producto de
la reacción de polimerización del fibrinógeno inducida por la
trombina. Esta sustancia actúa como sellante que contribuye a que
las células formen capas continuas y homogéneas. Los componentes se
conocen bajo el nombre comercial TISSUCOL
(Baxter-Immuno, Viena, Austria). Tal y como ya se
ha mencionado, el protocolo de preparación del producto comercial
no resulta adecuado para la reconstitución in vitro de
láminas de epitelio corneal humano debido a que no es lo
suficientemente transparente y elástico.
Con el objetivo de solucionar este problema, se
ha modificado adecuadamente el protocolo de preparación a fin de
obtener soluciones de trombina y fibrina que, una vez mezcladas,
den lugar a un gel de fibrina que presente las características
necesarias de flexibilidad y transparencia.
Esto se consigue modificando la fuerza iónica de
dichas soluciones añadiendo sales tales como cloruro de sodio y
cloruro de calcio, y modulando consecuentemente la reacción de
polimerización. Siguiendo este protocolo, es posible conseguir un
producto final que presente unas características químicas y físicas
precisas. En particular, el gel de fibrina obtenido mediante dicho
procedimiento contiene sodio en una concentración comprendida entre
0,5 y 0,001 milimoles y cloro en una concentración comprendida
entre 0,2 y 0,003 milimoles.
A continuación, se preparan tanto las soluciones
para la disolución de trombina y para la disolución de fibrina
mezclando NaCl, CaCl_{2} y H_{2}O destilada.
Los paquetes de trombina y fibrinógeno de la
forma comercial TISSUCOL (Baxter-Immuno, Viena,
Austria) se descongelan en un baño termostatizado a 37ºC. A
continuación, se transfiere una cantidad de la solución de trombina
desde el paquete al tubo de ensayo y se diluye con la solución para
la disolución de la trombina previamente preparada hasta que se
obtenga una concentración de trombina comprendida entre 2 y 5
OIU/ml. Del mismo modo, se transfiere una cantidad de fibrina a una
placa Petri y se mezclan con la solución para la disolución de
fibrina previamente preparada.
En este momento, las soluciones preparadas
mediante este procedimiento se aplican, en condiciones de
esterilidad, sobre una placa para bacteriología, en la que la forma
circular se obtiene confinando el sustrato de fibrina dentro de un
anillo con un diámetro ligeramente mayor que el de la córnea humana
a fin de conseguir láminas del epitelio corneal humano capaces de
adaptarse exactamente a la superficie ocular y capaces de mantener
el tamaño adecuado tras su injerto y posterior reabsorción del
sustrato de capa de fibrina. La utilización de placas y/o
recipientes para cultivos celulares no tratados resulta fundamental
para la consecución de láminas de epitelio corneal que presenten
las características específicas de grosor, densidad y capacidad de
transferencia necesarias en el ámbito quirúrgico.
El anillo se prepara cortando el extremo
superior de un tubo de ensayo de 50 ml con un diámetro comprendido
entre 20 y 40 mm a una altura comprendida entre 3 y 8,0 mm mediante
un alambre de wolframio calentado al blanco. A continuación, el
objeto obtenido se esteriliza en un autoclave.
Tras una agitación suave hasta distribuir el gel
de forma uniforme, se mantiene la placa, en condiciones de
esterilidad, hasta la polimerización completa y se conserva a 4ºC
durante un tiempo comprendido entre 1 hora y un máximo de 1 mes.
El gel de fibrina formado como resultado de la
reacción de polimerización presenta las características
fisicoquímicas deseadas y se caracteriza porque contiene sodio en
una concentración comprendida entre 0,5 y 0,001 milimoles y cloro
en una concentración comprendida entre 0,2 y 0,003 milimoles en una
cantidad final gel de 0,6 ml.
La capa de fibrina en forma de gel obtenida
mediante este procedimiento presenta un grosor comprendido entre 50
y 300 micrómetros y un diámetro comprendido entre 15 y 40 mm, y es
elástica y transparente.
Se procede a tratar cultivos de queratinocitos
limbares, obtenidos según lo descrito anteriormente, con tripsina y
se colocan sobre una placa dentro del anillo de fibrina (densidad
celular comprendida entre 2,5x10^{4} células/cm^{2} y 1x10^{5}
células/cm^{2}) en presencia de una capa nutritiva de células
3T3-J2 sometidas a irradiación letal (fibroblastos
embrionales murinos) que presentan las características descritas
anteriormente. Una vez alcanzada la confluencia, las capas
epiteliales obtenidas sobre el sustrato de fibrina modificado se
lavan con medio Eagle modificado (Dulbecco Modified Eagle's Medium,
DMEM) que incluye glutamina, penicilina y estreptomicina y se
almacenan en un recipiente para lentes de contacto (Bausch and
Lomb) en presencia de DMEM, según se ilustra en la figura 5. Las
láminas de epitelio limbar-corneal humano obtenidas
mediante este procedimiento están listas para su utilización
terapéutica.
Ejemplo
En el momento de confluencia, se retiran de los
matraces de cultivo las células cultivadas obtenidas a partir de
biopsias con Dispase II (Green, H., et al., 1979, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5665-5668), se fijan en
formaldehido (4% en PBS) durante 12 horas a 4ºC y se incluyen en
parafina. Los cortes se tiñen con
hematoxilina-eosina o con anticuerpos monoclonales
específicos para citoqueratina 3 (AE5 mAB; DAKO) y citoqueratina 19
(RCK108 mAB; DAKO). Se lleva a cabo el mismo protocolo de
coloración transcurridas 24 horas de la recogida de la muestra de
células de un cultivo no confluente, se realiza una
citocentrifugación en un portaobjetos de vidrio y se procede al
secado.
El anticuerpo específico de citoqueratina 3
unido al sustrato se identifica mediante el complejo antirratón
HRP-dextrano (sistema EnVision Plus/HPR de DAKO) y
tetraclorato de 3,3'-diaminobenzidina (FAST DAB;
Sigma Chemical Co.) como cromógeno.
El anticuerpo específico de citoqueratina 19
unido al sustrato se identifica mediante el complejo antirratón de
dextrano conjugado con fosfatasa alcalina (sistema EnVision
Plus/HPR de DAKO) y Fast rED TR/Naphtol AS-MX (FAST
Red; Sigma Chemical Co.) como cromógeno.
La presencia de células madre corneales se
detecta mediante un análisis clonal. Las células sencillas aisladas
mediante microscopía se inoculan en pocillos que contienen una capa
nutritiva de células 3T3-J2 (fibroblastos
embrionales murinos) (Rochat, A. et al., 1994, Cell, 76,
1063-1073) cultivados hasta el décimo paso y
amplificarse para obtener una tasa máxima de 1: 10 Tras 7 días, los
clones se identifican mediante microscopía, se mide su tamaño y se
transfieren a una placa que contiene una capa de células
3T3-J2. Transcurridos 12 días, el contenido de la
placa se fija mediante rodamina B.
El tipo clonal se determina midiendo la
proporción de colonias inviables (Barrandon, Y. and Green, H.,
1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
2302-2306).
Los resultados obtenidos mediante el análisis
clonal se confirman mediante el análisis realizado utilizando la
proteína p63.
Los cultivos celulares, tanto de las biopsias
confluentes como de los clones previamente identificados, se
retiran de los matraces de cultivo con Dispase II (Green, H., et
al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,
5665-5668), se fijan en formaldehido (4% en PBS)
durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incluyen en
parafina.
Las células tratadas, o una cantidad de las
mismas retiradas de un cultivo no confluente, citocentrifugado en
un portaobjetos de vidrio y fijado tras 24 horas con una mezcla de
peróxido de oxígeno y metanol durante 5 minutos a 20ºC, se tiñen
con anticuerpos monoclonales específicos para p63 (suministrados
por Frank Kckeon) y un anticuerpo específico para el PCNA (antígeno
nuclear de las células proliferativas) (Santa Cruz Biotechnology)
según técnicas conocidas (Yang, A. et al., 1999, Nature, 398,
714-718; Parsa, R. et al., 1999, J. Invest.
Dermatol., 113, 1099-1105; Bravo, R. et al.,
1987, Nature, 326, 515-517). Las células se extraen
para realizar una transferencia con tampón RIPA (0,15 mM NaCl/0,05
mM Tris HCl, pH 7,2/1% Triton X- 100/1% desoxicolato de sodio/0,1%
SDS), según ya ha descrito el mismo inventor (Dellambra, E. et.
al., 2000, J. Cel. Biol., 149, 117-1129). Se
analizan muestras análogas mediante electroforesis sobre gel de
poliacrilamida/SDS y se transfieren a filtros de difluoruro de
polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P, Millipore). Las
reacciones inmunológicas se llevan a cabo según lo descrito
anteriormente y los anticuerpos unidos al filtro se detectan
mediante quimioluminiscencia con ECL (Amersham Pharmacia).
Según lo descrito anteriormente, los cultivos
celulares obtenidos mediante el proceso anterior están formados por
un 95% de células madre corneales.
La solución para la disolución de la trombina se
prepara mezclando 11 ml de NaCl al 10% con 1 ml de CaCl_{2} 100
mM en 88 ml de H_{2}O destilada. De igual modo, la solución para
la disolución de la fibrina se prepara mezclando 1038 microlitros
de NaCl al 10%, 1,74 ml de NaCl al 0,9%, y 108 microlitros de
CaCl_{2} 100 mM en 2914 microlitros de H_{2}O destilada. Los
paquetes de trombina y fibrinógeno se mantienen en un baño
termostatizado a 37ºC hasta que estén completamente descongelados.
A continuación, se transfieren 0,5 ml de la solución de trombina
desde el paquete hasta un tubo de ensayo y se diluyen con 4,5 ml de
la solución previamente preparada para la disolución de trombina,
tras lo cual se diluyen otros 1,5 ml de dicha solución con 25 ml de
la solución para la disolución de trombina para obtener una
concentración de trombina de 3 OIU/ml. Del mismo modo, se
transfieren 5 ml de fibrina a una placa Petri y se mezclan con 5,8
ml de la solución para la disolución de fibrina previamente
preparada.
Seguidamente, se distribuyen 0,3 ml de cada una
de las soluciones anteriores, en condiciones de esterilidad, sobre
una placa para bacteriología, sobre la que se ha dispuesto el
anillo preparado cortando el extremo superior de un tubo de ensayo
de 50 ml con un diámetro de 30 mm a una altura de 8,0 mm mediante
un alambre de wolframio calentado al blanco.
Tras una agitación suave hasta distribuir el gel
de forma uniforme, se mantiene la placa, en condiciones de
esterilidad, hasta la polimerización completa y se conserva a 4ºC
durante un tiempo comprendido entre 1 hora y un máximo de 1 mes.
El gel de fibrina formado como resultado de la
reacción de polimerización se caracteriza porque incluye sodio en
una concentración comprendida entre 0,08 y 0,16 milimoles y una
cantidad óptima de cloro en una concentración comprendida entre
0,03 y 0,01 milimoles. La proporción exacta entre los cloruros de
sodio y calcio aporta a dicho gel las características
fisicoquímicas deseadas.
La capa de gel de fibrina obtenida mediante este
procedimiento presenta un grosor de 100 micrómetros y un diámetro
de 33 mm, y es elástica y transparente. Finalmente, las láminas de
epitelio corneal listas para su utilización en injertos se obtienen
tratando con tripsina los cultivos de queratinocitos limbares,
preparados según lo descrito anteriormente con Dispase II y
colocándolo sobre una placa dentro del anillo de fibrina con una
densidad celular comprendida entre 2,5x10^{4} células/cm^{2} y
1x10^{5} células/cm^{2} en presencia de una capa nutritiva de
células 3T3-J2. Una vez alcanzada la confluencia,
las capas epiteliales sobre el sustrato de fibrina se lavan con
medio Eagle modificado (Dulbecco Modified Eagle's Medium, DMEM) que
incluye 4 mM de glutamina, 50 IU/ml de penicilina y 50 \mug/ml de
estreptomicina y se almacenan en un recipiente para lentes de
contacto (Bausch and Lomb) en presencia de DMEM.
Las láminas de epitelio corneal humano
reconstituidas mediante este procedimiento se han analizado
clínicamente en 18 pacientes afectados por pérdida de visión debida
a quemaduras graves provocadas por agentes químicos, 11 de los
cuales sufrían una pérdida total del limbo y 3 pacientes afectados
por pérdidas graves de la región limbar. La implantación de la
córnea reconstituida in vitro consiguió resultados positivos
en 14 de 18 pacientes. Más exactamente, el epitelio corneal se
recupera completamente tras unos 7 días, todos los síntomas
relacionados con los procesos inflamatorios y de vascularización
remiten tras 3-4 semanas y la superficie de la
córnea tiene aspecto recuperado caracterizado por un epitelio liso
y transparente tras un mes. Finalmente, el epitelio corneal
recupera completamente sus características naturales tras
12-24 meses y la agudeza visual de los pacientes
vuelve a ser normal en el caso de las lesiones no graves, mientras
que dicho procedimiento permite realizar con éxito la denominada
queratoplastia perforante, que consigue la recuperación de la
visión en los casos de lesiones graves. Además, dicho procedimiento
previene el rechazo de los injertos como consecuencia de los
trasplantes procedentes de donantes heterólogos, en los casos en
los que el paciente haya conservado 1 mm de región limbar como
mínimo en uno de sus ojos.
En conclusión, la presente invención permite
fácilmente obtener láminas de epitelio corneal humano in
vitro que pueden utilizarse en injertos con un tamaño y
transparencia similares a las humanas. Además, el sustrato de
fibrina preparado mediante este procedimiento contribuye a la
adherencia celular tras el injerto debido a que se reabsorbe con
prontitud sin producir ninguna reacción alérgica en el paciente.
Asimismo, la utilización de placas y/o recipientes para cultivos
celulares de plástico o vidrio no tratados permite obtener un
producto final que presente unas características óptimas de grosor,
densidad y capacidad de transferencia para su utilización en
intervenciones quirúrgicas. Finalmente, según lo mencionado
anteriormente, dicho tejido corneal es capaz de mantener sus
funciones fisiológicas durante un período mínimo de 5 años tras un
injerto en los pacientes.
Claims (9)
1. Procedimiento para la producción in
vitro de láminas de epitelio corneal humano,
caracterizado por las siguientes etapas:
a) identificar células madre limbares de una
biopsia de la región ocular limbar mediante marcadores específicos
de las células madre limbares,
b) seleccionar dichas células madre limbares
identificadas mediante un análisis clonal;
c) confirmar la selección de las células madre
limbares mediante marcadores específicos de las células madre
limbares;
d) cultivar dichas células madre limbares
seleccionadas sobre un sustrato de fibrina obtenido disolviendo
entre 2 y 5 OIU/ml, trombina y fibrinógeno en una solución de
cloruro de sodio y de calcio con una concentración de sodio
comprendida entre 0,001 y 0,5 milimoles/0,6 ml una concentración de
cloruro comprendida entre 0,003 y 0,2 milimoles/0,6 ml, y aplicar
dicho sustrato sobre un soporte sólido no tratado, de forma que las
células no interaccionen con la superficie de dicho soporte.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que dichos marcadores específicos se incluyen en el grupo de
queratina 19, queratina 12, queratina 3 y proteína p63.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que dichas láminas de epitelio corneal humano presentan unas
características de tamaño, densidad, transparencia, elasticidad y
grosor tales que pueden insertarse de forma inmediata y el sustrato
de fibrina modificado se puede reabsorber tras el injerto.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato de fibrina
modificado presenta un grosor comprendido entre 50 y 300
micrómetros.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en
el que el grosor es de 100 micrómetros.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en
el que el soporte sólido no tratado tiene forma de anillo.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que el anillo presenta un tamaño compatible con la córnea
humana.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en
el que el anillo tiene un diámetro comprendido entre 15 y 40 mm y
una altura comprendida entre 3 y 8 mm.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en
el que el diámetro es de 33 mm.
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