ES2311553T3 - Gen que codifica la acetolactato sintasa. - Google Patents

Abstract

Gen que codifica la proteína siguiente (a) o (b): (a) una proteína acetolactato sintasa que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:1; (b) una proteína acetolactato sintasa que comprende la secuencia aminoacídica derivada de la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:1 por sustitución, deleción o adición de al menos uno o más aminoácidos, que tiene resistencia a un herbicida de pirimidinil carboxi y tiene actividad acetolactato sintasa, en donde comparada con la proteína acetolactato sintasa de arroz de tipo silvestre que se muestra en la Fig.1, la serina en posición 627 se reemplaza por la isoleucina, y el triptófano en posición 548 por la leucina.

Description

Gen que codifica la acetolactato sintasa.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a un gen que codifica la acetolactato sintasa, enzima determinante de la velocidad en la vía de biosíntesis de aminoácidos de cadenas laterales.

Antecedentes de la invención

La sintasa acetolactato (referida aquí como "ALS") es una enzima determinante de la velocidad de la vía biosintética de aminoácidos con cadenas laterales, como la leucina, la valina y la isoleucina, y es conocida como una enzima esencial para el crecimiento de las plantas. La ALS también se halla presente en una gran variedad de plantes superiores. Además, la ALS se halla en diversos microorganismos como las levaduras (Saccharomyces cerevisiae), Escherichia coli y Salmonella typhymurium.

Tres tipos de isoenzimas de ALS se hallan en Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Cada una de estas isoenzimas es un hetero-oligómero que consiste en subunidades catalíticas de peso molecular elevado que dirigen la actividad catalítica de la enzima y en subunidades reguladoras con un peso molecular pequeño que funcionan como proteínas reguladoras al unirse a los aminoácidos de cadenas laterales (Chipman y col., Biochem. Biophys. Acta. 1385, 401-419, 1998). Las subunidades catalíticas se localizan en los operones IIv IH, IIv GM y IIv BN, respectivamente. Por otra parte, la ALS en levaduras es una enzima de una única enzima que comprende una subunidad catalítica y una subunidad reguladora, como es el caso de las bacterias (Pang y col., Biochemistry, 38, 5222-5231). La subunidad proteica catalítica se localiza en el locus ILV2.

En las plantas, la ALS comprende subunidad(es) catalítica(s) y subunidad(es) reguladora(s) como en el caso de los microorganismos anteriores (Hershey y col., Plant Molecular Biology, 40, 795-806, 1999). Por ejemplo, la subunidad catalítica de la ALS en el tabaco (dicotiledónea) está codificada por dos loci génicos, SuRA y SuRB (Lee y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988); y en el maíz está codificada también por dos loci génicos, als 1 y als 2 (Burr y col., Trends in Genetics 7, 55-61, 1991; Lawrence y col., Plant Mol.Biol. 18, 1185-1187, 1992). Las secuencias nucleotídicas de los genes que codifican una subunidad catalítica se han determinado completamente para las plantas dicotiledóneas incluyendo el tabaco, Arabidopsis, la colza, el algodón, Xanthium, Amaranthus y Kochia (véase Chipman y col., Biochem. Biophys. Acta. 1385, 401-419, 1998 y la re-publicación doméstica de patente internacional para la solicitud de patente internacional WO97/08327). Sin embargo, el maíz es la única monocotiledónea cuya secuencia nucleotídica se ha completado.

Los herbicidas, como por ejemplo, los herbicidas de sulfonilurea, imidazolinon, triazolopirimidina y pirimidil carboxi (referidos aquí como "herbicidas de PC") se sabe que suprimen el crecimiento de una planta mediante la inhibición de ALS (Ray, Plant Physiolo. 75, 827-831, 1984; Shaner y col., Plant Physiol. 76, 545-546, 1984; Subramanin y col., Plant Physiol. 96, 310-313, 1991; Shimizu y col., J. Pestic. Sci. 19, 59-67,1994).

La patente internacional WO 00127182 describe líneas de arroz resistentes a los herbicidas que interfieren normalmente con la enzima acetohidroxiácido sintasa (AHAS), obtenidas mediante mutación y procedimientos de cri-
bado.

Las plantas que presentan resistencia a estos herbicidas contienen un gen que codifica la ALS que incluye la sustitución de uno o dos nucleótidos, lo cual induce la sustitución de uno o dos aminoácidos en una región conservada entre especies distintas. Ejemplos de tal gen incluyen un gen que codifica la ALS y que tiene resistencia específica contra los herbicidas sulfonilurea (véase Kathleen y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988; Mourad y col., Planta, 188, 491-497, 1992; Guttieri y col., Weed Sci. 43, 175-178, 1995; Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995 y la solicitud de patente japonesa todavía abierta (kokai) nº 63-71184); un gen que codifica la ALS con resistencia específica a los herbicidas de imizadolinon (Mourad y col., Planta, 188, 491-497, 1992; Lee y col., FEBS Lett., 452, 341-345, 1999 y la solicitud de patente japonesa todavía abierta (kokai) nº 5-227964), y un gen que codifica la ALS con resistencia a los herbicidas de sulfonilurea y de imidazolinon (véase Kathleen y col., EMBO J., 7, 1241-1248, 1988; Bernsconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995; Hattori y col., Mol. Gen. Genet. 246, 419-425, 1995; Alison y col., Plant Physiol. 111, 1353, 1996; Rajasekarau y col., Plant Sci. 119, 115-124, 1996, solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº 63-71184, solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº 4-311392 y Bernasconi y col., patente americana US 5633437, 1997). Véase también Duggleby y Fang (2000) Journal of Biochemistry and Molecular Biology 33:1, 1-36. La ALS que presenta resistencia a los herbicidas de sulfonilurea como a los de imidazolinon también muestra resistencia cruzada contra los herbicidas de PC y de triazolopirimidina (Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995). Además, se ha intentado la producción de una planta que muestre resistencia a los herbicidas de sulfonilurea e imidazolinon mediante cruzamiento de una planta con ALS que presenta resistencia a los herbicidas de sulfonilurea con una planta que tenga ALS y resistencia a los herbicidas de imidazolinon (Mourad y col., Mol. Gen. Genet, 243, 178-184, 1994). Además, se ha intentado la conversión artificial de un gen que codifica la ALS en un gen de resistencia al herbicida (Ott y col., J. Mol. Biol. 263, 359-368, 1996, solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº. 63-71184, solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº 5-227964, solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº 11-504213) de modo que se hallado que una deleción de un sólo aminoácido causa que la ALS muestre resistencia a los herbicidas de sulfonilurea e imidazolinon (véase la solicitud de patente japonesa todavía pendiente (kokai) nº 5-227964).

Tal como se describió anteriormente, la ALSs con resistencia a los herbicidas y los genes que la codifican han sido estudiados intensamente. Sin embargo, no existen evidencias sobre la resistencia a los herbicidas de PC ni tampoco respecto a un gen de ALS mutante que tenga resistencia específica a un herbicida de PC.

Resumen de la invención

El propósito de la presente invención es proporcionar un gen que codifique una proteína ALS que muestre una resistencia extremadamente elevada a los herbicidas de PC, la proteína ALS codificada por el gen, un procedimiento para el cultivo de la planta y un procedimiento para seleccionar una célula transformante mediante la utilización de un marcador de selección.

Como resultado de los estudios dedicados a lograr el anterior propósito, se ha completado la presente invención al hallar que una ALS mutante, derivada de una ALS de tipo silvestre por sustitución de un residuo aminoacídico de la ALS de tipo silvestre por otro aminoácido, muestra una resistencia extremadamente elevada contra los herbicidas de PC.

(1) La presente invención es un gen que se define en las reivindicaciones.

(2) Además, la presente invención es una proteína acetolactato sintasa que está codificada por el gen (1).

(4) Además, la presente invención es un transformante que tiene el vector recombinante de (3).

(5) Además, la presente invención es una planta que tiene el gen de (1) y tiene la resistencia a los herbicidas de pirimidinil carboxi.

(6) La presente invención es un procedimiento para el cultivo de la planta de (5) que comprende el cultivo de la planta en presencia de un herbicida de pirimidinil carboxi.

(7) La presente invención es un procedimiento para seleccionar una célula transformante que tiene el gen de (1) mediante la utilización de este gen como un marcador seleccionable.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación entre la secuencia aminoacídica de una proteína ALS mutante con una proteína ALS de tipo silvestre.

La Figura 2 muestra una comparación entre la secuencia nucleotídica de un gen ALS mutante y el de un gen ALS de tipo silvestre.

La Figura 3 es una figura característica que muestra la sensibilidad del mutante resistente a bispiribac-sodio.

La Figura 4 es una figura característica que muestra la sensibilidad del tipo silvestre a bispiribac-sodio.

La Figura 5 es una figura característica que muestra la sensibilidad del tipo silvestre al clorsulfuron.

La Figura 6 es una figura característica que muestra la sensibilidad del mutante resistente al clorsulfurón.

La Figura 7 es una figura característica que muestra el cromatograma de intercambio iónico de la proteína ALS extraída del tipo silvestre.

La Figura 8 es una figura característica que muestra la sensibilidad de la proteína ALS de tipo silvestre y de la proteína mutante al bispiribac-sodio.

La Figura 9 es una figura característica de la sensibilidad de la proteína de tipo silvestre y de la proteína mutante al clorsulfuron.

La Figura 10 es una figura característica que muestra la sensibilidad de la proteína ALS de tipo silvestre y de la proteína mutante al imazaquin.

La Figura 11 muestra una comparación de secuencias nucleotídicas entre EST de Nippon-bare y el gen de la ALS del maíz.

La Figura 12 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el bispiribac-sodio.

La Figura 13 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el clorsulfurón.

La Figura 14 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el piritiobac-sodio.

La Figura 15 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el piriminobac.

La Figura 16 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el bensulfuron-metil.

La Figura 17 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el pirazosulfuron-etil.

La Figura 18 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el imazosulfurón.

La Figura 19 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el imazaquin.

La Figura 20 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 4 con el imazapir.

La Figura 21 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS de tipo silvestre, GST-ALS de tipo silvestre purificada y ALS sin GST de tipo silvestre obtenida en el Ejemplo 4 con el bispiribac-sodio.

La Figura 22 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS mutante y GST-ALS mutante purificada obtenida en el Ejemplo 4 con el bispiribac-sodio.

La Figura 23 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por el extracto crudo de ALS mutante y GST-ALS mutante purificada obtenida en el Ejemplo 4 con el clorsulfurón.

La Figura 24 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por extracto crudo de ALS mutante y GST-ALS mutante purificada obtenida en el Ejemplo 4 con el imazaquin.

La Figura 25 muestra el esquema de generación de un gen ALS que tenga únicamente la mutación W548L.

La Figura 26 es la continuación de la Figura 25 y muestra el concepto de generación del gen ALS con sólo la mutación W548L.

La Figura 27 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 6 (2) con el bispiribac-sodio.

La Figura 28 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por por extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 6 (2) con el clorsulfurón.

La Figura 29 es una figura característica que muestra la sensibilidad observada por por extracto crudo de ALS obtenido en el Ejemplo 6 (2) con el imazaquin.

La Figura 30 muestra el esquema de construcción de un vector binario construido en el Ejemplo 7.

La Figura 31 es una fotografía de una electroforesis mediante la cual se confirmó la presencia del inserto del gen ALS en el plásmido aislado de una colonia de E. coli (JM109), en donde el carril 1 corresponde al marcador de DNA de 100 pb de \lambdaHindIII, el carril 2 corresponde a un plásmido derivado de una E. coli que se ha transformado con pMLH7133 y que contiene el gen mutante de ALS, el carril 3 corresponde a un plásmido derivado de E. coli que se ha transformado con pMHL7133 y que retiene el gen ALS de tipo silvestre, el carril 4 corresponde a un pHHL7133 que contiene un gen GUS (grupo control), y las flechas indican el inserto de ADN.

La Figura 32 es una fotografía de electroforesis que muestra el resultado de la PCR utilizando ADNs de plásmidos como molde, en donde el carril 1 corresponde al marcador de ADN \lambdaHindIII/100 pb, los carriles 2 y 5 corresponden a un plásmido pBI 121 (grupo control) que contiene el gen ALS de tipo silvestre, los carriles 3 y 6 corresponden a pMLH7133 que contiene el gen ALS mutante, los carriles 4 y 7 corresponden a pHLH7133 que contiene un gen ALS de tipo silvestre, y las flechas indican los productos de PCR.

La Figura 33 es una fotografía de electroforesis que muestra el resultado de la verificación de la orientación de la inserción del gen ALS, en donde el carril 1 corresponde al marcador de DNA \lambdaHindIII/100 pb, el carril 2 corresponde a pMLH7133 que contiene un gen ALS mutante, el carril 3 corresponde a pMLH7133 que contiene un gen ALS de tipo silvestre, el carril 4 corresponde a pMLH7133 (grupo control) que contiene un gen GUS, y las flechas señalan los productos de PCR.

La Figura 34 es un diagrama de flujo que muestra que el procedimiento de transformación de las plantas de arroz (Nippon-bare) con Agrobacterium.

La Figura 35 es una fotografía que muestra las plantas de arroz (Nippon-bare) en proceso de rediferenciación a partir de los callos.

La Figura 36 es una fotografía que muestra la sensibilidad al bispiribac-sodio de los callos de una planta de arroz (Nippon-bare) transformada con un gen ALS mutante.

La Figura 37 es una figura característica que muestra la sensibilidad al bispiribac-sodio de los callos de la planta de arroz de tipo silvestre (Nippon-bare).

La Figura 38 es una fotografía de una electroforesis que muestra los resultados de la PCR realizada con el ADN preparado a partir de un callo transformante, en donde el carril 1 corresponde al marcador de DNA \lambdaHindIII/100 pb, los carriles 2 a 7 corresponden respectivamente a los resultados de la PCR utilizando ADNs genómicos de callos distintos y la flecha indica los productos de PCR.

La Figura 39 es una figura característica que muestra el resultado de la secuenciación del producto de PCR, obtenido mediante PCR realizada con el ADN genómico preparado a partir del callo transformante como molde, en donde A corresponde al resultado del análisis de la periferia del residuo aminoacídico 548 con un cebador sentido de transcripción 5' (3-1-4), B corresponde al resultado del análisis de la periferia de un residuo aminoacídico 548 con un cebador sentido de transcripción 3' (ALS-Rsp2), C muestra el resultado del análisis de la periferia de un residuo aminoacídico 627 utilizando un cebador sentido de transcripción 5' (3-1-4), y D corresponde al resultado del análisis de la periferia de un residuo aminoacídico 627 utilizando un cebador sentido de transcripción 3'(ALS-Rsp2).

La Figura 40 es una fotografía que muestra el resultado de cuantificar la sensibilidad de bispiribac-sodio de una planta de arroz (Nippon-bare) transformada con el gen mutante ALS, en donde A muestra una planta de arroz transformada con el gen ALS mutante, y B muestra una planta de arroz transformada con el gen ALS de tipo silvestre.

Descripción detallada de la invención

A continuación se proporciona una descripción más detallada de la presente invención.

La proteína acetalactato sintasa de la presente invención (denominada de aquí en adelante como "proteína ALS mutante") puede obtenerse mediante mutación de determinados sitios en una proteína ALS de tipo silvestre expresada en una planta de arroz. La secuencia aminoacídica de la proteína ALS mutante de la presente invención se representa por la SEC ID NO: 1. La secuencia nucleotídica del gen que codifica la proteína ALS de la presente invención se representa por la SEC ID NO:2.

La proteína ALS mutante se deriva de una proteína ALS de tipo silvestre por sustitución del triptófano 548 por la leucina y por la sustitución de la serina 627 por isoleucina. La Figura 1 muestra el resultado de la comparación de la secuencia aminoacídica de la proteína ALS mutante y de la proteína ALS de tipo silvestre. En la Figura 1, la secuencia aminoacídica se muestra en la primera fila para la proteína ALS mutante y en la segunda fila para la proteína ALS de tipo silvestre.

Comparado con un gen que codifica la proteína ALS de tipo silvestre, un gen (SEC ID NO:2) que codifica la proteína ALS mutante contiene la sustitución de un codón que codifica el triptófano 548 por un codón que codifica la leucina y la sustitución de un codón que codifica una serina 627 por una isoleucina. En la Figura 2, se muestra el resultado de la comparación de la secuencia nucleotídica del gen que codifica la proteína mutante ALS y el que codifica la proteína ALS de tipo silvestre. En la Figura 2, la secuencia nucleotídica se muestra en la primera fila para la proteína ALS mutante y en la segunda fila para la proteína ALS de tipo silvestre.

La presente invención también incluye un gen que codifica una proteína acetolactato sintasa que comprende una secuencia aminoacídica derivada de la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:1 por sustitución, deleción o adición de al menos uno o más aminoácidos, la cual tiene resistencia a un herbicida de pirimidinil carboxi y presenta actividad acetolactato sintasa, en donde comparada con la proteína ALS de arroz de tipo silvestre que se muestra en la Fig. 1, la serina en posición 627 se reemplaza por isoleucina y el triptófano en posición 548 por leucina. La presente invención también incluye una proteína que está codificada por el mencionado gen.

Un gen que codifica la proteína ALS mutante puede obtenerse mediante introducción de una mutación, tal como se describió anteriormente, en un gen que codifica una proteína ALS de tipo silvestre. Dicho gen está presente en el ADN genómico de la variedad de arroz japonesa, Kinmaze. Para introducir las mutaciones es posible utilizar técnicas estándares, como por ejemplo, la mutagénesis dirigida. La mutagénesis dirigida puede realizarse utilizando un equipo comercial, por ejemplo Mutan-K (Takara Shuzo), Gene Editor (Promega) o Exsite (Stratagene).

Además, un gen que codifica la proteína ALS mutante puede obtenerse mediante el cultivo de las células de tipo silvestre sensibles al herbicida en presencia de un herbicida de PC, y a continuación la selección de las células mutantes que emerjan del cultivo y muestren resistencia al herbicida de PC.

En primer lugar, se prepara el mRNA de las células en cultivo, mutantes y resistentes al herbicida de PC, se sintetizan los ADNcs y luego se genera una librería de ADNcs (que tenga heterocigosidad para la propiedad de resistencia), en el fago \lambdagt11. A continuación, se criba la librería utilizando una sonda de ácido nucleico [EST (Expression Sequence Tag, Genbank, acceso por DDBJ y EMBL No. C72411) obtenida de la variedad de arroz de tipo japonés, Nippon-bare] que contiene parte de un gen que codifica la proteína ALS de tipo silvestre. A continuación, el inserto de ADN del clon positivo resultante se subclona en pBluescript II SK^{+}, para determinar su secuencia nucleotídica. La selección de un clon que tenga el inserto de ADN que codifique la secuencia aminoacídica SEC ID NO:1 permite la obtención de un gen que codifica la proteína ALS mutante. Además, un plásmido compuesto de pBluescript II SK+ en el cual un gen que codifica una proteína ALS mutante se ha incorporado se ha depositado en el Centro de Patentes y Bio-facilidades, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas (Cho-6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) como el ADNc de la ALS mutante en pBluescript II SK+ (FERM BP-7348) el 2 de Noviembre de 2000 según el Tratado de Budapest.

En comparación con la proteína ALS de tipo silvestre, la proteína ALS mutante posee una buena resistencia no sólo a herbicidas de PC, sino también a herbicidas de sulfonilurea e imidazolinon. En particular, la proteína ALS mutante posee un nivel elevado de resistencia a un herbicida de PC. Puede determinarse mediante la incorporación de un gen que codifica una proteína ALS mutante en un vector de expresión como por ejemplo E. coli y el examen de la sensibilidad al herbicida de las E. coli transformadas con el vector de expresión.

Ejemplos de un herbicida PC incluyen el bispiribac-sodio, el piritiobac-sodio y el piriminobac representados por las fórmulas químicas siguientes.

\vskip1.000000\baselineskip

1

Ejemplos de un herbicidad de sulfonilurea incluyen el clorsulfurón, el bensulfurón-metil, el pirazosulfurón-etil y el azosulfurón tal como se representa por la fórmula química 2 siguiente.

2

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3

\newpage

Ejemplos de un herbicida de imidazolinon incluyen el imazaquin y el imazapir tal como se representa por la fórmula química 3 siguiente.

4

La transformación de una planta diana mediante la utilización de un gen que codifica una proteína ALS mutante puede conferir la resistencia a herbicidas de PC a la planta. Es posible utilizar técnicas estándares conocidas para la transformación de una planta. Por ejemplo, un gen foráneo puede introducirse en una célula vegetal diana mediante la utilización de Agrobacterium tumefaciens.

Más específicamente, un gen que codifica la proteína ALS mutante se inserta en un vector binario que contiene la secuencia T-ADN de un plásmido Ti de Agrobacterium. El plásmido Ti se transforma en E. coli y similares. A continuación, los vectores binarios que contienen el gen que codifica la proteína ALS mutante replicada por E. coli se transforman en Agrobacterium que a su vez contiene plásmidos auxiliares. Las plantas diana se infectan con Agrobacterium, y a continuación se identifican las transformadas. Cuando la planta transformada identificada corresponde a células en cultivo, éstas pueden regenerarse en una planta completa mediante técnicas estándares conocidas.

Para transformar una planta diana con un gen que codifique la proteína ALS mutante, es posible introducir directamente el gen utilizando técnicas estándares conocidas. Ejemplos procedimientos de transformación con un vector de expresión que contenga un gen que codifica la proteína ALS mutante incluyen el procedimiento del polietilén glicol, la electroporación y el procedimiento de la pistola de inyección de partículas.

Un gen que codifica la proteína ALS mutante puede transfectarse en cualquier tipo de plantas, como las monocotiledóneas y las dicotiledóneas. Ejemplos de una cultivo diana que se transforman con un gen que codifica la proteína ALS mutante incluyen el arroz, el maíz, el trigo, la cebada, la soja, el algodón, la colza, la remolacha azucarera y el tabaco. Además, el césped de turba, los árboles, y similares pueden transformarse mediante la introducción de un gen que codifica la proteína AlS mutante.

En cualquiera de los casos anteriores, la transformación de una planta que utiliza un gen que codifica la proteína ALS mutante puede implicar la adquisición de resistencia a herbicidas de PC, herbicidas de sulfonilurea y herbicidas de imidazolinon por la planta.

Además, un gen que codifica la proteína ALS mutante también utilizarse como un marcador de selección en un experimento para la transformación de una planta. Por ejemplo, para la transformación de una célula vegetal mediante la utilización de un gen de interés, un vector que contiene un gen que codifica la proteína ALS mutante y un gen de interés se introducen en la célula vegetal, seguido del cultivo de dichas células en presencia del herbicida de PC. En consecuencia, una célula vegetal que sobreviva en presencia del herbicida de PC será indicativo de que contiene un gen que codifica la proteína ALS mutante y el gen de interés que se ha introducido.

Además, cuando un gen de interés y un gen que codifica la proteína ALS mutante se incorporan en el cromosoma de una célula vegetal, el fenotipo de la planta se puede verificar y examinar luego la presencia de estos genes en el genoma mediante hibridación de Southern o por PCR.

Ejemplos

De aquí en adelante, la presente invención se describe mediante diversos ejemplos, sin que ello limite el ámbito técnico de la invención.

Ejemplo 1 Producción de células de arroz (Kinmaze) resistentes a un herbicida de PC

Se eliminó la paja de las semillas de arroz (variedad; Kinmaze, nombre científico: Oryza sativa var. Kinmaze). Las semillas se sumergieron en etanol al 70% durante 5 minutos y luego en aproximadamente 5% de antiespumante durante 20 min, seguido varios lavados con agua destilada. A continuación, las semillas se cultivaron de forma estática en un medio con la composición que se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

5

En la composición del medio anterior, se sintetizó 2,4-D auxina. Para preparar el medio, se colocó en primer lugar el medio con la composición anterior en un vaso de precipitado de 1l y se añadió agua destilada hasta 1000 ml. A continuación, la solución se ajustó a pH 7,5 y se suplemento con 3 g de Gelrite. El Gelrite se disolvió mediante calentamiento con un microondas y luego se añadió la mezcla, 30 ml cada vez con ayuda de una pipeta, a los frascos de cultivo. Los frascos se recubrieron con tres láminas de aluminio, se esterilizaron por calor en una autoclave a 121ºC durante 15 min a 20 min. Por último, la solución se enfrió a temperatura ambiente para preparar el medio de cultivo estático de las semillas.

A continuación, se extrajeron las porciones de endospermo de los callos inducidos con el medio y se realizaron los subcultivos. Parte de los callos obtenidos se subcultivaron, se cultivaron sucesivamente una vez cada dos semanas en un medio líquido (la composición es la misma que la que se muestra en la Tabla 1), pero sin suplementarse con Gelrite) suplementado con bispiribac-sodio 1 \muM (uno de los herbicidas de PC). De 2 a 6 semanas más tarde, las células en cultivo empezaron a marchitarse. Dos meses más tarde, diversas masas celulares no descoloridas que se dividían se obtuvieron de las poblaciones celulares en cultivo, muchas de ellas murieron y se volvieron de un color marrón descolorido. Estas masas celulares se aislaron y cultivaron, para obtener diversas líneas celulares que podían proliferar en presencia de bispiribac-sodio 2 \muM.

De este modo, se cultivaron líneas celulares mientras que se aumentaba la concentración de bispiribac-sodio de forma consensuada. Como resultado, se obtuvieron líneas celulares que pueden proliferar en presencia de bispiribac-sodio 100 \muM. Las células en cultivo resistentes al bispiribac-sodio (referidas aquí como mutantes resistentes) se subcultivaron en medio sólido MS-2,4-D suplementado con bispiribac-sodio 100 \muM. Parte del cultivo mutante resistente se subcultivó, se añadió medio líquido MS-2,4-D no suplementado con bispiribac-sodio y luego se sometió a un cultivo de células en suspensión a un ciclo de 8 a 10 días.

Aproximadamente, se trasplantaron 1,5 g (peso seco) del mutante resistente a un frasco Erlenmeyer de 200 ml suplementado con 50 ml de un medio líquido MS-2,4-D y bispiribac-sodio a una concentración adecuada, seguido del cultivo a aproximadamente 27ºC durante un periodo adecuado. El peso seco de los callos se cuantificó periódicamente. La cantidad relativa de incremento se determinó basándose en el peso seco del mutante resistente trasplantado. Además, el experimento se realizó tres veces con concentraciones distintas de bispiribac-sodio, y se calculó el error estándar. La Figura 3 muestra la relación de los cambios en la concentración de bispiribac-sodio y el peso relativo a día 8 en el mutante resistente. Como control, se realizó un experimento similar utilizando el tipo silvestre (Kinmaze). La Figura 4 muestra el resultado de cuantificar la relación de bispiribac-sodio y el peso relativo el día 8.

Tal como se muestra en la Fig. 4, el crecimiento del tipo silvestre no se inhibió en un grupo suplementado con bispiribac-sodio 1 nM, pero sí se inhibió en un grupo suplementado con bispiribac-sodio 10 nM. Sin embargo, tal como se muestra en la Fig. 3, casi ninguno de los mutantes resistentes se vieron afectados, incluso en un grupo suplementado con bispiribac-sodio 10 \muM.

Las tasas de crecimiento del tipo silvestre y del mutante resistente se cuantificaron tal como se describió anteriormente excepto para el uso del clorsulfuron en lugar del bispirac-sodio. La Figura 5 muestra la relación de los cambios en la concentración de clorsulfurón y del peso relativo el día 9 en el tipo silvestre. La Figura 6 muestra la relación de los cambios en la concentración de clorsulfurón y del peso relativo el día 9 en el mutante resistente.

Tal como se muestra en la Fig. 5, el crecimiento del tipo silvestre se inhibió por adición de clorsulfurón 1 nM, mostrando que el tipo silvestre tenía una sensibilidad más elevada que el bispirac-sodio. Sin embargo, tal como se muestra en la Fig. 6, el crecimiento del mutante resistente se inhibió fuertemente por adición de clorsulfurón 1 \muM. La sensibilidad al bispirac-sodio y al clorsulfurón permaneció inalterable tanto en el tipo silvestre como en el mutante resistente, incluso con una duración del cultivo más prolongada. La tasa de crecimiento fue casi la misma en el de tipo silvestre y en el mutante resistente.

Estos resultados demostraron que el mutante resistente posee una resistencia específica al bispirac-sodio. Además, el mutante resistente presentó una mejor resistencia al clorsulfurón comparado con el tipo silvestre.

Ejemplo 2 Sensibilidad al herbicida de la enzima ALS purificada parcialmente a partir del mutante resistente

En este ejemplo, la proteína ALS mutante se purificó parcialmente a partir del mutante resistente obtenido en el Ejemplo 1 y luego se examinó la sensibilidad al herbicida de la proteína ALS mutante. Dicha proteína se purificó tal como se describe a continuación.

En primer lugar, se prepararon 200 g o más del mutante resistente mediante el procedimiento del cultivo líquido (sin suplementación con bispirac-sodio), el cultivo tenía la composición que se muestra en la Tabla 1 pero sin Gelrite. A continuación, 150 g aproximadamente del mutante resistente se homogeneizaron con Hiscotron en un volumen de tampón-1 [tampón fosfato potásico 100 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20% (v/v), pirosfosfato de tiamina 0,5 mM (TPP), flavin adenina dinucleótido (FAD) 10 \muM, MgCl_{2} 0,5 mM, y un volumen de polivinil polipirrolidona equivalente a 1/10 del volumen tisular] 3-veces superior al volumen del tejido. El homogenado se filtró a través de una gasa de nylon y luego se centrifugó a 15.000xg durante 20 minutos. Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante centrifugado al 50% de saturación y luego se dejó en hielo durante aproximadamente 1 hora. La mezcla se centrifugó de nuevo a 15.000xg durante 20 min, y luego la fracción precipitada se disolvió en aproximadamente 30 ml de tampón-2 [tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) con glicerol al 20% (v/v), TPP 0,5 mM y MgCl_{2} 0,5 mM]. La mezcla se centrifugó de nuevo a 15.000xg durante 20 min y luego la fracción del sobrenadante se aplicó a un gel de Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotec). Aproximadamente 40 ml de la fracción que había pasado por la columna se recogió como un extracto crudo de la enzima.

A continuación, se cuantificó la concentración proteica del extracto crudo de enzima por el procedimiento de Bradford de acuerdo con el manual de Bio-Rad Protein Assay. El extracto crudo de enzima se filtró a continuación a través de un filtro Whatman (Whatman), y luego el extracto crudo de enzima de una cantidad adecuada de proteína (10 a 15 ml) se aplicó a tres columnas HiTrap conectadas verticalmente (Amersham Pharmacia Biotec) utilizando un dispositivo FPLC (Amersham Pharmacia Biotec). Después de que el componente de la proteína fuera adsorbido con HiTrap Q, las fracciones no adsorbidas se eliminaron mediante lavados con el tampón-2 con un volumen de 3 a 5 veces superior al volumen del lecho. A continuación, el componente de la proteína adsorbida se eluyó con un eluyente que tenía un volumen 10 veces superior al del volumen del lecho (150 ml). Aquí, el eluyente se preparó disolviendo KCl con un gradiente de concentración lineal (de 0 a 0,4 M) en tampón-2. El eluído que contenía el componente de la proteína eluida se distribuyó en porciones, de 5 ml de cada, en diversos tubos de ensayo. Para estabilizar la enzima ALS contenida en el componente de proteína eluida, los tubos de ensayo contenían 0,5 ml de tampón-2 con piruvato sódico 20 mM.

La actividad ALS resultante de la proteína ALS mutante contenida en las fracciones eluidas y distribuidas en porciones en cada tubo de ensayo se cuantificaron de la manera siguiente. Se preparó una solución de reacción a utilizar para la reacción de cuantificación mediante mezcla de una fracción eluida a cuantificar con una solución que contenía piruvato sódico 20 mM, TPP 0,5 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, FAD 10 \muM y tampón fosfato sódico 20 mM (pH 7,5). Se utilizó 1 ml de esta solución de reacción. Después de cuantificar la fracción eluida, la reacción de cuantificación se realizó a 30ºC durante 40 a 60 min. A continuación, la reacción se paró por adición de 0,1 ml de ácido sulfúrico 6N (o hidróxido sódico 0,25 N).

Una vez que la reacción se ha parado, la solución de reacción se incubó a 60ºC durante 10 min, convirtiendo así el acetolactato contenido en la solución de reacción en acetoína.

A continuación, para cuantificar la acetoína contenida en la solución de reacción, se añadieron 1 ml de creatina al 0,5% (p/v) y 1 ml de \alpha-naftol al 5% (p/v) disuelto en hidróxido sódico 2,5 N a la solución de reacción, seguido de una incubación a 37ºC durante 10 min. La acetoína se cuantificó mediante comparación del color de la absorbancia (a 525 nm) de la solución de reacción, y de esta forma se evaluó la actividad ALS. Además, la solución de reacción contenía una pequeña cantidad de piruvato sódico, el tiempo de reacción 0 se utilizó como control.

Como resultado, la absorbancia a DO_{525} nm fue tan alta como 7 para 0,2 ml de solución de reacción. Sin embargo, cuando la anterior reacción de cuantificación cesó con hidróxido de sodio, y se examinó la actividad de generación de acetoína debido a la actividad distinta a la actividad ALS, cerca del 80% de la actividad aparente de ALS resultó de la generación directa de acetoína y no de la actividad de la proteína ALS mutante. Según ello, la proteína ALS mutante y las otras proteínas se separaron por su actividad de generación de acetoína mediante FPLC utilizando una resina de intercambio iónico. Como resultado, se detectaron dos picos de actividad tal como se muestra en la Fig. 7.

Para determinar cual de los dos picos de actividad correspondía con la proteína ALS mutante, la actividad de generación de acetoína se examinó para los dos picos. Por ello, se halló que una fracción correspondiente al pico incial era la proteína ALS mutante.

Utilizando la solución de enzima que contenía la proteína ALS mutante, se examinó la sensibilidad de la proteína ALS mutante con el bispiribac-sodio, clorsulfurón e imazaquin. La sensibilidad para cada uno de los herbicidas se evaluó mediante cuantificación de la actividad ALS de la misma manera que en la reacción de cuantificación anterior, excepto que se añadió un herbicida a una cierta concentración antes de la adición de la solución de enzima. En comparación, la proteína ALS de tipo silvestre se separó y purificó de la misma manera y se utilizó para el experimento. Además, se preparó bispiribac-sodio como una solución acuosa, se prepararon el clorsulfuron y el imazaquin como soluciones de acetona. La concentración final de acetona en la mezcla de reacción fue del 1%.

La Figura 8 muestra la relación de la tasa de inhibición de la actividad ALS y de la concentración de bispiribac-sodio. La Figura 9 muestra la relación de la tasa de inhibición de la actividad ALS y de la concentración de clorsulfurón. La Figura 10 muestra la relación de la tasa de inhibición de la actividad de ALS y de la concentración de imazaquin. Una línea que conecta los cuadrados blancos corresponde con la proteína ALS de tipo silvestre, una línea que conecta los cuadrados negros corresponde con la proteína ALS mutante en las Figs. 8 a 10.

De acuerdo con el análisis probabilístico, se calculó una concentración de herbicida que inhibe el 50% de la actividad de ALS (I_{50}), es decir calculando la proporción de I_{50} para la proteína ALS mutante vs. I_{50} para la proteína ALS de tipo silvestre. La Tabla 2 muestra los resultados.

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Tal como se muestra en las Figs. 8 a 10 y la Tabla 2, la proteína ALS mutante mostró una actividad ALS relativamente elevada incluso en presencia del herbicida, cuando se comparó con la proteína ALS de tipo silvestre. En particular, la diferencia más significativa entre el mutante y la proteína ALS de tipo silvestre fue la sensibilidad con el herbicida bispiribac-sodio. Es decir, la proteína ALS mutante posee una buena resistencia al bispiribac-sodio.

Ejemplo 3 Clonaje del gen ALS mutante

Las sondas utilizadas para el clonaje de un gen (gen ALS mutante) que codifica la proteína ALS mutante del mutante resistente se prepararon de la manera siguiente. Se utilizó el ADNc parcial del arroz (Nippon-bare) como sonda en este ejemplo, y mostró una homología elevada con el gen ALS de maíz.

(1) La determinación de la secuencia nucleotídica de un ADNc parcial derivado del arroz (Nippon-bare) mostró una homología elevada con el gen ALS del maíz

Como parte del Proyecto Genómico conducido por la Sociedad para la Innovación Técnica en la Agricultura, Silviculturea y Pesca y el Instituto Nacional de Ciencias Agrobiológicas, las secuencias nucleotídicas parciales de los ADNcs de arroz (Nippon-bare) se determinaron y se estableció una base de datos nucleotídica parcial de los ADNcs. Un clon de ADNc (número de acceso C72411) conocido como una secuencia nucleotídica de aproximadamente 350 pb contenido en esta base de datos mostró una homología elevada con el gen ALS de maíz. El gen ALS de maíz se ha secuenciado completamente.

Este clon de ADNc (número de acceso C72411) se obtuvo del Instituto Nacional de Ciencias Agrobiológicas y la secuencia nucleotídica se determinó de la manera siguiente. Aquí, el clon de ADNc contenía un gen ALS homólogo insertado dentro del pBluescript II SK+, y fue capaz de replicarse de forma autónoma en E. coli.

En primer lugar, el vector plasmídico con homología ALS se transformó en E. coli (DH5\alpha). Se obtuvieron colonias blancas a partir de una placa y se cultivaron en medio líquido y a continuación se extrajeron los plásmidos de las células mediante técnicas estándares. Ya que el inserto de ADN se había insertado entre SalI y NotI (enzimas de restricción de dianas de multiclonaje en el vector plasmídico), el vector se digirió con las dos enzimas. La presencia del inserto se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. Luego, el vector plasmídico con homología ALS se purificó mediante técnicas estándares utilizando por ejemplo, RNasaA, PEG y LiCl seguido de una reacción de secuenciación con cebadores y un equipo de secuenciación por PCR ABI BigDye. Las condiciones de la PCR fueron las suministradas por el fabricante. Los cebadores utilizados aquí fueron de M13 y cebadores sintetizados diseñados a partir de la secuencia nucleotídica determinada. El producto de PCR resultante se purificó mediante precipitación con etanol y luego la secuencia nucleotídica se determinó con un secuenciador ABI PRISM 310.

El vector plasmídico con homología ALS se sabe que contiene un inserto de ADN de una longitud de 1,6 Kb. Dicho vector plasmídico se digirió con las enzimas de restricción SalI y NotI y luego se sometió a electroforesis. En consecuencia, se detectaron una banda de aproximadamente 3 Kb correspondiente a pBluescript II SK+ y una banda de aproximadamente 1,6 Kb correspondiente al fragmento del inserto de ADN (resultados no mostrados). La secuencia nucleotídica completa del inserto de ADN se determinó y se buscó su homología con la secuencia nucleotídica de maíz. Tal como se muestra en la Fig. 11, se halló una homología del 84,7%. Ya que la homología con ALS se correspondía con un cDNA parcial del gen de ALS de la var. Nippon-bare, se utilizó como sonda el inserto de ADN digerido con SalI y NotI. Además, en la Fig. 11, la primera fila es una secuencia del ADNc parcial del gen ALS de la var. Nippon-bare; la segunda fila corresponde al gen ALS de maíz.

(2) Preparación del ARNm del mutante resistente

En primer lugar, el mutante resistente congelado en nitrógeno líquido se pulverizó con un mortero y una mano de mortero y luego más finamente con un mezclador durante 30 s. El polvo obtenido se resuspendió en un tampón de extracción [(Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, NaCl 100 mM, SDS al 1%, EDTA 5 mM): (\beta-mercaptoetanol): (fenol saturado con Tris)=15:3:20], y luego se mezcló. Esta solución se centrifugó a 12.000xg durante 15 min, y luego se recolectó el sobrenadante. Se añadieron 200 ml de PCI [(fenol saturado con Tris):(cloroformo):(alcohol isoamílico)=25:24:1] al sobrenadante, se agitó a 4ºC durante 10 min, se centrifugó a 12.000xg durante 15 min, y luego se recogió el sobrenadante. El procedimiento se repitió dos veces. Se añadió 1/20 de volumen de NaCl 5 mM y se añadieron 2,2 volúmenes de etanol al sobrenadante obtenido, luego se dejó la mezcla a -80ºC durante 30 min. El precipitado se recogió mediante centrifugación a 12.000xg durante 5 min. El precipitado se lavó con etanol al 70%, se secó y luego se resuspendió en una solución de \beta-mercaptoetanol 10 mM. A continuación, la solución se centrifugó a 27.000xg durante 10 min para eliminar la fracción soluble. Se añadió ¼ del volumen de LiCl 10 M a la solución, y se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Posteriormente, se centrifugó la solución a 27.000xg durante 10 min para recoger el precipitado, se disolvió en 4 ml de H_{2}O y se cuantificó la absorbancia a 260 nm para hallar la concentración de ARN. Se añadió 1/20 volumen de NaCl 5 M y 2,2 volúmenes de etanol a la solución, y se dejó reposar a -80ºC durante 30 min. A continuación se centrifugó a 27.000xg durante 10 min para recoger el precipitado, seguido de un lavado con etanol al 70%, y un secado. El producto resultante se disolvió en una cantidad adecuada de H_{2}O para obtener una solución de RNA total. En este momento se realizó una centrifugación a 4ºC.

El ARNm se preparó y purificó a partir del RNA total mediante el procedimiento siguiente. Se añadió tampón de unión 2X (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, NaCl 1 M) en un volumen equivalente al de la solución de TRNA total extraído a dicho RNA. Una columna con 0,1 g de oligo dT celulosa (Amersham Pharmacia Biotec) se lavó ocn tampón de unión 1X y luego la solución de RNA total se aplicó a la columna. Después de que la columna se lavara con 1x tampón de unión, se aplicó un tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM a pH 7,5) y se recogió el eluido de fracciones de 0,5 ml. Las fracciones que habían pasado por la columna se aplicaron a otra columna de celulosa oligo dT (Amersham Pharmacia Biotec) y se trataron de igual forma. Después de calcular la concentración del arn eluIdo según la absorbancia de cada fracción, se añadió 1/10 volumen de LiCl 10 M y 2,5 volúmenes de etanol a los productos, y la mezcla se dejó a -80ºC durante 30 min. A continuación, las mezclas se centrifugaron y las fracciones precipitadas se secaron y disolvieron en 100 \mul de H_{2}O. El ARN obtenido se sometió a fraccionamiento por tamaño mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa.

El ARNm separado y purificado se aplicó a un tubo de centrífuga con un gradiente de densidad de una solución de sacarosa del 25% al 5%. A continuación se centrifugó con una ultracentrífuga a 27.000 rpm durante 15 horas a 4ºC utilizando un rotor basculante. Después de la centrifugación, se recogieron fracciones de 0,5 ml cada una según el gradiente de densidad. Se cuantificó la absorbancia de cada fracción, se calculó la concentración de ARNm y la presencia del ARNm de ALS se confirmó mediante hibridación con un equipo ECL (marcaje directo de ácidos nucleicos y sistema de detección ECL, Amersham Pharmacia Biotec). La hibridación se realizó utilizando una sonda preparada en (1) a aproximadamente a 42ºC durante 16 horas. Después de la hibridación, se realizaron dos lavados a 42ºC durante 5 min primero con un primer tampón proporcionado por el equipo, y luego otro lavado a 42ºC durante 5 min con 2xSC. El filtro lavado se envolvió con un film transparente de plástico para mantenerlo sumergido con un reactivo luminoso proporcionado por el equipo y luego se expuso a una película de rayos-X.

Aproximadamente 35 mg del ARN total se extrajeron a partir del mutante resistente y aproximadamente 4 mg de ARNm pudieron extraerse mediante los procedimientos anteriores. Posteriormente y después de una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, se obtuvo un positivo de hibridación para una fracción esperada como positiva.

Cuando se utilizó el tipo silvestre, se extrajeron aproximadamente 95 mg de ARN total además de aproximadamente 7 mg de ARNm. Cuando se extrajo el ARNm del tipo silvestre, se aplicó el anterior procedimiento excepto que se utilizó el de tipo silvestre en lugar del mutante resistente.

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(3) Construcción de la librería de ADNc a partir del mutante resistente

Utilizando 2 \mug de ARNm purificado en (2) y un equipo de síntesis de ADNc (Amersham Pharmacia Biotec), se sintetizó el ADNc, de modo que se obtuvo una librería de ADNcs derivada del mutante resistente.

En primer lugar, se utilizó una RTasa proporcionada por el equipo para la reacción de transcripción inversa; la T4 DNA polimerasa proporcionada por el equipo se utilizó para una reacción de elongación de cadena complementaria. Después de la reacción de elongación de cadena complementaria, se añadió P^{32}-dCTP para calcular el rendimiento de la síntesis de ADNc. Después de añadir un adaptador, el ADNc sintetizado se incorporó en el fago \lambda mediante un procedimiento de empaquetamiento in vitro.

El adaptador añadido al ADNc fue un adaptador EcoRI-NotI-Bam HI (Takara Shuzo). Los adaptadores a una concentración molar de 50 veces superior al ADNc se añadieron a una solución que contenía el ADNc. A continuación, se añadió la T4 ADN ligasa (Pharmacia) a la mezcla seguido de una reacción de ligación a 4ºC durante toda la noche. La solución de reacción se aplicó a una columna AsahiPak GS 710 de HPLC (Asahi Chemical Industry Co., Ltd), seguido de la monitorización del eluido con rayos ultravioleta a 260 nm. El eluido se fraccionó en 25 fracciones de 0,5 ml cada una. Cada fracción se cuantificó con un contador Cerenkov, y se recogieron de 3 a 4 fracciones con un contaje elevado. El extremo 5' del adaptador contenido en la fracción se fosforiló utilizando la T4 polinucleótido quinasa (Takara Shuzo), y entonces se añadió \lambdagt 11 con un extremo cortado con EcoRI para realizar la ligación. Se añadió GigaPack Gold III (Stratagene) a la solución, y la ligación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la reacción, 200 \mul de un tampón SM y 8 \mul de cloroformo se añadieron a la solución de reacción, preparando así una solución de fagos. Esta solución de fagos se diluyó 10 veces. Un \mul de la solución de diluida se infectó con E. coli (Y-1088), al que se había añadido top-agar al 0,7% y luego la solución se inoculó sobre una placa de LB. Se contaron a continuación el número de calvas que emergieron sobre la placa 4 a 8 horas más tarde para determinar el título de fagos.

La síntesis de aproximadamente 74 ng de ADNc derivado del mutante resistente se confirmó mediante el resultado de papel DE 81 y contaje con Cerentov. El resultado de dicho contaje después de la ligación de un vector con un adaptador añadido puso de manifiesto que aproximadamente 22 ng de ADN\lambda con el inserto se obtuvieron para el mutante resistente. El ADN\lambda se empaquetó en los fagos, preparándose de esta manera una librería de ADNc deirvada de las células del mutante resistente. El título de la librería fue de 16.600 pfu/\mul.

Cuando se preparó una librería de ADNc utilizando un ARNm extraído del tipo silvestre según el procedimiento mencionado anteriormente, aproximadamente se sintetizaron 38 ng de ADNc derivado del tipo silvestre. Posteriormente, se obtuvieron 5 ng de \lambdaDNA con el inserto para el tipo silvestre. El título de la librería de ADNc derivada del tipo silvestre fue de 18.160 ufc/\mul.

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(4) Cribado de ADNc que contenía el gen ALS

Para formar aproximadamente 20.000 calvas sobre las placas, la librería preparada en (3) se diluyó y a continuación los fagos derivados del tipo silvestre y los del mutante resistente se inocularon separadamente sobre 10 placas. Las calvas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Shleicher & Schnell, PROTORAN BA85, tamaño del poro 0,45 \mum). La membrana de nitrocelulosa se sumergió en una solución de desnaturalización (NaCl 0,5 M, NaCl 1,5 M) y luego en una solución de neutralización (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M pH 7,5, EDTA 1 mM) durante aproximadamente 20s. Se eliminó el exceso de agua con un papel de filtro de la membrana de nitrocelulosa, y luego la membrana se horneó a 80ºC durante 2 horas. La etapa de horneado se omitió cuando se utilizó Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotec) en lugar de una membrana de nitrocelulosa y se realizó la inmovilización con NaOH 0,4 M durante
20 min.

El inserto de ADN preparado en (1) se marcó por dos tipos de procedimiento, RI y no-RI, y luego se utilizó como una sonda de ADN. El marcaje con RI e hibridación se realizaron mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se desnaturalizaron térmicamente de 200 a 500 ng de la sonda de ADN y luego se marcaron con un equipo de marcaje BcaBEST DNA (Takara Shuzo Co. Ltd.). Después de esta reacción de marcaje, se añadieron cebadores aleatorios y dCTP-P^{32} proporcionados por el equipo. Después se añadió BcaBEST, seguido de una incubación a 65ºC durante 30 min. A continuación, se añadió el EDTA para parar la reacción. La solución de reacción se aplicó a una membrana de nitrocelulosa, de modo que 8 hojas de la membrana contenían aproximadamente 100 ng de de sondas. La hibridación se realizó a 42ºC durante la noche con agitación ligera. Después de la hibridación, las membranas se lavaron tres veces con solución de 2xSSC y SDS al 0,1%, seguido de una exposición durante aproximadamente 1 hora con una placa de imagen de un analizador BAS 2000 (Fuji Photo Film co., Ltd.). Después de la exposición, se detectaron los clones positivos con un analizador de imágenes.

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Se realizó un marcaje no radioactivo según el siguiente procedimiento. Después de la desnaturalización térmica de aproximadamente 200 a 500 ng de ADN, se añadió el reactivo de marcaje de ADN (peroxidasa) y el glutaraldehído proporcionado en un marcaje ADN/ARN directo de ECL y el sistema de detección (Amersham Pharmacia Biotech), seguido de la incubación a 37ºC. En este caso, el ADN de la sonda marcada se aplicó a la membrana de nitrocelulosa, de modo que 8 hojas de la membrana contenían aproximadamente 100 ng del ADN de la sonda marcado. La hibridación se realizó a 42ºC durante toda la noche con agitación ligera. Después de la hibridación, la membrana se lavó tres veces con un primer tampón de lavado a temperatura ambiente durante 10 min, y luego con 2XSSC a temperatura ambiente durante 10 min. La membrana se sumergió en una solución luminosa del equipo ECL y luego se expuso a una película de rayos X de 30 min a 3 horas.

Los fagos positivos obtenidos mediante hibridación (cribado secundario) se rascaron junto con el agar superior con un mondadientes y luego se resuspendieron en 200 \mul de tampón SM, obteniendo así una solución de fagos. Las soluciones de fagos de cada clon se diluyeron adecuadamente, se infectaron con la cepa E. coli Y-1088, y luego se inocularon en placas de LB. Utilizando estas placas recién preparadas, se realizó una segunda hibridación (cribado secundario) de modo similar. Los fagos positivos se resuspendieron en 200 \mul de un tampón SM, obteniendo en consecuencia fagos únicos. Si no consiguió aislarse fagos separadamente por el cribado secundario, se realizó otra dilución, seguido de una inoculación en placas de LB. Y a continuación se realizó una hibridación (tercer cribado) para obtener fagos aislados.

A continuación, se preparó ADN de \lambda a partir de los fagos aislados por los siguientes procedimientos. Los fagos \lambda se recogieron con un palillo o un mondadientes de las placas de clones positivos, se inocularon en 200 \mul de medio 2xYT (que contenía MgCl_{2} 10 mM y maltosa al 0,2%) que contenía 5 \mul de una suspensión de huésped E. coli recién preparada (Y1088). El producto se dejó reposar y se incubó a 42ºC durante la noche. A continuación, se inoculó el medio en 1 ml de medio 2xYT (que contenía MgCl_{2} 10 mM y maltosa al 0,2%) con 25 \mul de una suspensión de huésped E. coli (Y1088), y luego se cultivó en agitación durante toda la noche (estas etapas corresponden a un proceso de pre-cultivo). La solución pre-cultivada (10 a 50 \mul) se inoculó en 12 ml de medio 2xYT que contenía MgCl_{2} 10 mM y 0,5 ml de una suspensión de E. coli Y1088. A continuación, la incubación se realizó a 42ºC durante toda la noche con agitación relativamente fuerte, hasta aumentar la turbidez después de la lisis. Después del cultivo, se añadieron 50 \mul de cloroformo y 1,2 ml de NaCl 5M, y luego se realizó la incubación a 42ºC durante 10 min mientras se agitaba. El producto se centrifugó a 27.000 xg durante 10 min y luego el sobrenadante se transfirió nuevamente a un tubo de centrífuga. Se añadieron 5 ml de PEG al 50% al sobrenadanete, y luego se incubaron en hielo durante 1 hora o más. El producto se centrifugó a 27.000xg durante 10 min, y luego se descartó el sobrenadante. A continuación, se realizó otra centrifugación a 27.000xg y se descartó la parte líquida producida. La fracción precipitada se resuspendió en 300 \mul de un tampón de ácido Tris-HCl 30 mM (pH 7,5) que contenía 4 \mug de DNasa I, 20 \mug de Rnasa A y MgCl_{2} 10 mM. La suspensión se transfirió a un tubo de 1,5 ml. Después de la incubación de la suspensión a 37ºC durante 30 min, se añadieron 7,5 \mul de SDS al 20%, 3 \mul de proteinasa K (10 mg/ml) y 12 \mul de EDTA 0,5 M a la suspensión, seguido por otra incubación a 55ºC durante 15 min. A continuación, se añadieron 150 \mul de fenol al producto, y luego se agitó vigorosamente. Luego, la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm durante 3 mim utilizando una Microcentrífuga TOMY MR-150 (TOMY DIGITAL BIOLOGY CO.; LTD.), y se recogió la fase acuosa. Se añadieron 800 \mul de etil éter (al que se había añadido agua destilada para eliminar el peróxido) a la fase acuosa recogida. La mezcla se agitó vigorosamente y luego se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 s y se eliminó la fase de éter. Después de repetir la etapa de extracción con éter, el éter que quedaba en la fase acuosa se eliminó con gas nitrógeno. Se añadieron 30 \mul de NaCl 5M y 875 \mul de etanol a la fase acuosa, de modo que el ADN de \lambda se precipitó y se recogió rápidamente. El ADN de \lambda se lavó con aproximadamente 1 ml de etanol al 70% y luego se secó en presión reducida durante aproximadamente 1 minuto, eliminando así el etanol. El producto se disolvió en 20 a 50 \mul de tampón TE (pH 8,0), obteniéndose así una solución de ADN de \lambda.

Se realizó el subclonaje y secuenciación del inserto de ADN en el ADN de \lambda obtenido mediante el siguiente procedimiento. La solución de ADN de \lambda (1 \mul) se digirió con NotI para poder excisar el inserto de ADN. La composición de una solución de reacción (para la reacción de corte) se realizó según las instrucciones del Manual de la enzima de restricción. Después de la reacción a 37ºC durante aproximadamente 2 horas, el tamaño del inserto se confirmó mediante electroforesis con un gel de agarosa al 1%. El AND de \lambda (10 \mul a 20 \mul) que contenía el ADN del inserto se digirió con NotI, para excisar el ADN del inserto. Dicho ADN se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, la banda correspondiente se recortó del gel y luego se purificó el ADN del inserto mediante técnicas estándares. El inserto de ADN se mezcló con un vector seguido de un tratamiento con BAP (desfosforilación con fosfatasa alcalina derivada de la gamba) a una concentración molar 1.1, seguido de ligación con T4 ADN ligasa a 16ºC durante 2 horas o más. En este momento, el ADN del inserto cortado con NotI se utilizó como material, se realizó un tratamiento con BAP para los vectores cortados con NotI. Después de la ligación, parte de la solución se mezcló con células competentes (DH5\alpha), y luego se permitió que permanecieran en hielo durante 30 min. A continuación, la mezcla se sometió a un choque térmico a 42ºC durante 30 segundos, y luego se dejó en hielo de nuevo durante 2 min. A continuación, se añadió SOC a la mezcla, se incubó a 37ºC durante 1 hora y se inoculó en una placa de LB sobre la cual se había añadido previamente de forma uniforme una mezcla de 100 \mul de 2xYT (con 50 \mug/ml de ampicilina), 30 \mul de X-Gal al 3% y 3 \mul de IPTG 1 M, y se cultivó a 37ºC durante 10 horas o más. Las colonias blancas transformadas se inocularon cada una con 2 ml de medio LB que contenía ampicilina o medio 2xYT, y luego se cultivaron a 37ºC durante toda la noche. A partir de la solución de cultivo, se prepararon plásmidos mediante técnicas estándares y se disolvieron en H_{2}O. La concentración de ADN se cuantificó. Se realizó una PCR con los plásmidos para su secuenciación, según los procedimientos descritos anteriormente.

A continuación, se obtuvo un ADNc de ALS con una longitud incompleta de aproximadamente 2,2 Kb por el procedimiento anterior. Ya que una diana SmaI se hallaba a una posición de aproximadamente 250 pb en 5' del ADN, se preparó una nueva sonda mediante el procedimiento siguiente. Se amplificó pBluescript II SK+ que contenía ls 2,2 Kb aproximadamente con el huésped E. coli JM109, y se extrajeron los plásmidos con un sistema de aislamiento automatizado (KURABO PI-100). El plásmido se digirió directamente con SmaI. El fragmento generado de aproximadamente 250 pb se separó y purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, luego se calculó la concentración se preparó una sonda. La librería se cribó de nuevo con dicha sonda mediante el procedimiento anterior utilizando Eco RI. Se preparó ADN de \lambda a partir de los fagos aislados, la solución de ADN de \lambda (1 \mul) se digirió con EcoRI y luego se confirmó el tamaño mediante electroforesis, seguido de una inmovilización en una membrana de nitrocelulosa. Después de la electroforesis, el gel se sumergió en una solución de NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M y luego se agitó ligeramente durante 15 min. El gel se lavó a continuación con agua, se sumergió en Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5) con NaCl 3 M y luego se neutralizó mientras se mantenía en agitación durante aproximadamente 15 min. Se apiló un grueso de papel de filtro industrial de aproximadamente grosor 5 para formar una base, ésta se colocó extendida sobre una bandeja de aluminio y se mojó en 20XSSC. A continuación, se colocó sobre la base el gel neutralizado, una membrana (cortada a un tamaño determinado, sumergida en agua destilada y luego en 20XSSC durante otros 10 min), después de asegurarse que no hubiera burbujas atrapadas entre el gel y la membrana, se colocaron dos papeles de filtro por encima, y sobre todo ello se dispuso papel secante de un grosor de 3 a 4 cm y por encima una placa de vidrio y un peso ligero, y se dejó transferir durante 10 min. A continuación, la membrana se sometió a un tratamiento con UV con un trans-iluminador y luego se horneó a 80ºC durante aproximadamente 15 min a 30 min. Después del horneado, se realizó la hibridación (composición del tampón de hibridación: 5XSSPE, 0,5% SDS, 5xDenhardts, DNA de esperma de salmón sonicado, 50% de formamida) con la anterior sonda de ADN de 250 pb marcada con P^{32}. La radiación de la banda hibridada se transfirió a una placa de imagen, y el resultado se analizó con BAS-200. Entre los insertos positivos en la hibridación, aquellos que mostraban un tamaño relativamente grande se prepararon en gran cantidad y luego se subclonaron (FERM BP-7348) en pBluescript II SK+ que había sido digerido con Eco RI y luego tratado con BAP por el procedimiento anterior. El producto se transformó en E. coli (JM 105). Los transformantes obtenidos se sometieron a un cultivo líquido, y luego los plásmidos se prepararon mediante técnicas estándares. Por ello, la secuencia nucleotídica se determinó por los procedimientos anteriores.

Como resultado, se pudo obtener el ADNc que contenía un gen ALS mutante de tamaño completo. La secuencia nucleotídica del ADNc se muestra en la SEC ID NO:2. Posteriormente, se pudo obtener un ADNc que contenía un gen ALS de tamaño completo a partir de una librería de ADNc derivada del tipo silvestre. La Figura 1 muestra el resultado de una comparación por homología entre el gen ALS mutante y el gen ALS de tipo silvestre.

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Ejemplo 4 Expresión de la proteína ALS mutante

El plásmido obtenido en el Ejemplo 3 (4) se digirió con Eco RI, y se cortaron el ADNc que contenía el gen ALS de tipo silvestre y el ADNc que contenía el gen ALS mutante, a continuación se incorporaron separadamente en un vector de expresión pGEX. El ADNc que contenía el gen ALS de tipo silvestre tenía una región 5' no traducida de 47 nucleótidos más allá del codón de inicio, y se incorporó en la diana EcoRI de pGEX-2T. Después, el ADNc que contenía el gen mutante ALS con una región 5' no traducida de 31 nucleótidos más allá del codón de inicio, se incorporó en la diana Eco RI de pGEX-4T-3.

Estos vectores se transformaron separadamente en E. coli (JM 105). Las colonias obtenidas mediante transformación se cultivaron en medio líquido, se extrajeron los plásmidos y se confirmó la orientación de la inserción del inserto de ADN mediante el patrón de corte con enzimas de restricción y secuenciación. Se seleccionaron los clones con la orientación esperada del inserto de ADN, se cultivaron en 2 ml de medio LB con ampicilina a 27ºC. Se utilizó 1 ml de dicho precultivo para inocular 50 ml o 250 ml de medio LB con ampicilina. Después del cultivo durante toda la noche, se añadió IPTG 1 mM y se indujo la expresión de la proteína GST durante 3 a 4 horas.

La Tabla 3 muestra los resultados de cuantificar la actividad ALS tras adición de IPTG seguido del cultivo durante 3-4 horas.

TABLA 3

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Tal como se muestra en la Tabla 3, E. coli con el gen ALS de tipo silvestre y E. coli con el gen ALS mutante mostraron una actividad específica de aproximadamente 3-4 veces superior a la del grupo control que no contenía plásmido. Los transformantes de E. coli se cultivaron durante 3-4 horas después de la adición de IPTG y se guardaron a -80ºC. A continuación se purificó la proteína de fusión GST-ALS a partir de dichos transformantes de E. coli.

La preparación y purificación de ALS a partir de E. coli se realizó según el procedimiento siguiente. En primer lugar, se resuspendió un sedimento de los transformantes de E. coli guardados a -80ºC en tampón de extracción ALS (tampón fosfato potásico, pH 7,5, con glicerol al 30% y MgCl_{2} 0,5 mM). Se añadieron 2,5 ml del tampón al sedimento obtenido a partir de los 50 ml de solución de cultivo. La solución se sometió a ultrasonicación (Heat Systems-Ultrasonics, Sonicator W-225R, microchip, control de salida 8, intervalo de aproximadamente 1 segundo, dos veces (40 s cada)) y se sometió a centrifugación a 15.000xg a 4ºC durante 20 min, obteniéndose el sobrenadante como una solución de extracto crudo de enzima.

La proteína de fusión ALS con GST (referida como GST-ALS) se purificó a partir del extracto crudo de la enzima por el siguiente procedimiento. La solución de extracto crudo de enzima 812,5 ml) que se había preparado a partir del sedimento (obtenido de 250 ml de solución de cultivo) se aplicó a una columna de glutatión Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotec, volumen del lecho de aproximadamente 1 ml, equilibrado previamente con 10 ml de 1xPBS (NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM, Na_{2}HP_{3} 10,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM, pH 7,3)). La columna se lavó con 10 ml de 1xPBS y luego se eluyó la GST-ALS (4 veces) con 2 ml de solución de glutatión 10 mM. La actividad GST y la actividad ALS de cada una de las fracciones se cuantificaron y a continuación se recogieron las fracciones de mayor actividad. Además, ya que la tasa de adsorción a la columna anterior fue pobre, se utilizó el tampón de extracción ALS, también se realizó un experimento con los extractos enzimáticos con 1xPBS que se dejó adsorber por la columna anterior. La cuantificación de la actividad ALS y de la proteína se realizó de acuerdo con el procedimiento anterior. La cuantificación de la actividad GST se realizó por un procedimiento utilizando el 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (nombre secundario: abreviado como 2,4-diclorobenceno (CDNB)) como sustrato. Se utilizaron 3 ml de la solución de reacción y una composición de la reacción (CDNB 1 mM, glutatión (reducido) 1 mM, solución de la enzima, tampón fosfato potásico 100 mM (pH 6,5)). Después de la adición de la solución de enzima, se realizó un ensayo de la actividad a 30ºC para una absorbancia aumentada a 340 nm. Se preparó CDNB como una solución en etanol 100 veces concentrada y se añadió a la solución de reacción.

Las actividades (actividad ALS y actividad GST) que no fueron adsorbidas por la columna de afinidad anterior se detectaron mejor. Sin embargo, se detectó la mayor parte de la actividad adsorbida en la columna de afinidad se detectó en fracciones eluidas con la primera y segunda elución de glutatión. Se combinaron aquellas fracciones de la primera y segunda elución para preparar GST-ALS eluida.

La ALS libre de la GST se obtuvo tras digestión de la GST-ALS durante la noche a 4ºC con proteasa de trombina (25 unidades). La Tabla 4 muestra la actividad ALS, la cantidad de proteína y la actividad específica después de la cromatografía con extracto crudo de enzima y la columna de afinidad anterior, y después del tratamiento con proteasa de trombina.

TABLA 4

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La enzima ALS preparada que presenta actividad ALS se derivó de E. coli. Sin embargo, tal como se muestra en la Tabla 5, ya que la actividad ALS derivada de E. coli resulta de la isozima I ALS, ésta puede inhibirse casi completamente por adición de valina 1 mM.

TABLA 5

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Ejemplo 5 Sensibilidad al herbicida de la proteína ALS mutante

La sensibilidad al herbicida de la proteína ALS mutante se examinó utilizando el extracto crudo de enzima obtenido en el Ejemplo 4. El ensayo de sensibilidad al herbicida se realizó de igual forma que en el Ejemplo 2. En el ensayo de sensibilidad al herbicida, se utilizaron tres herbicidas, bispiribac-sodio, piritiobac-sodio y piriminobac como herbicidas de PC; cuatro fármacos, clorsulfurón, bensulfurón-emtil, pirazosulfurón-etil e imazosulfurón como herbicidas de sulfonilurea; y dos fármacos, imazaquin a imazapir se utilizaron como herbicidas de imidazolinon.

Las soluciones que contenían estos herbicidas (bispiribac-sodio y piritiobac-sodio fueron soluciones acuosas, otras fueron soluciones de acetona) a determinadas concentraciones se añadieron a soluciones de reacción antes de la adición de la proteína mutante ALS. La concentración final de acetona fue del 1%. Además, ya que la proteína ALS del ADNc del arroz expresada en E. coli es susceptible a la valina (Kil y col., J. Biochem Mol Biol 31, 287-295, 1998), se realizó un ensayo de sensibilidad al herbicida en condiciones en las que la actividad de la ALS derivada de E. coli se inhibía con valina.

La Figura 12 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó bispiribac sodio. La Figura 13 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el clorsulfurón. Tal como se muestra en la Fig. 12, la actividad ALS de tipo silvestre se inhibió con bispiribac-sodio, mientras que la actividad ALS mutante no se inhibió. Para el clorsulfurón tal como se muestra en la Fig. 13, la proteína ALS mutante mantuvo su actividad a un nivel elevado hasta una cierta concentración comparada con la de la proteína ALS de tipo silvestre, sin embargo, cuando se comparó con el caso del bispiribac-sodio, la resistencia de la proteína ALS mutante fue moderada.

La Figura 14 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el piritiobac-sodio como herbicida; la Figura 15 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el piriminobac como herbicida; la Figura 16 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el bensulfurón-metil como herbicida; la Figura 17 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el pirazosulfurón-etil como herbicida; la Figura 18 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el imazosulfurón como herbicida; la Figura 19 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el imazaquin como herbicida; y la Figura 20 muestra la sensibilidad resultante cuando se utilizó el imazapir como herbicida. En los gráficos de las Figs. 12 a 20, las líneas que unen los triángulos negros corresponden al extracto crudo de enzima que contiene la proteína ALS de tipo silvestre, y las líneas que unen los cuadrados negros corresponden al extracto crudo de enzima que contiene la proteína ALS mutante.

Tal como se muestra en las Figs. 14 a 20, la proteína ALS mutante tiene una buena resistencia para cada uno de los herbicidas, superior al de la proteína ALS de tipo silvestre. En particular, la proteína ALS mutante tiene buena resistencia a los herbicidas de PC. Además, la comparación de las Figs. 12, 14 y 15 indica que la proteína ALS mutante tiene la mejor resistencia al bispiribac-sodio entre los herbicidas de PC.

Ya que estos resultados parecen correlacionarse con el resultado del Ejemplo 2, se sugirió que el factor que mejoraba la resistencia a los herbicidas de PC en el Ejemplo 2 era el gen ALS mutante.

Además, un ensayo de sensibilidad al herbicida se realizó utilizando la GST-ALS purificada y la ALS libre preparada en el Ejemplo 4. La Figura 21 muestra un resultado que indica la resistencia de la proteína ALS de tipo silvestre con el bispiribac-sodio. La Figura 22 muestra un resultado que indica la resistencia de la proteína ALS mutante con el bispiribac-sodi. Además, la Figura 23 muestra un resultado que es indicativo de la resistencia de la proteína ALS mutante al clorsulfurón. La Figura 24 muestra un resultado indicativo de la resistencia de la proteína ALS mutante al imazaquin. Los ensayos de sensibilidad a herbicidas cuyos resultados se muestran en las Figs. 21 a 24 se realizaron sin adición de valina. Además, en un gráfico de la Fig. 21, la línea que une los triángulos negros corresponde con el extracto crudo de enzima que contiene la proteína ALS de tipo silvestre; la línea que une los cuadrados negros corresponde con la GST-ALS de tipo silvestre; y la línea que une los círculos negros corresponde con la proteína libre. En los gráficos de las Figs. 22 a 24, las líneas que unen los triángulos negros corresponden con el extracto crudo de enzima que contiene la proteína ALS mutante y las líneas que unen los cuadrados negros corresponden con el mutante GST-ALS.

Tal como se muestra en las Figs. 21 a 24, la GST-ALS purificada también mostró una sensibilidad al herbicida similar a la obtenida con el extracto crudo de enzima.

Ejemplo 6 Relación entre la porción mutada en un gen ALS mutante y la sensibilidad al fármaco

Las mutaciones en el gen ALS mutante determinadas en el Ejemplo 3 (4) fueron la mutación W548L en la que el triptófano (W) en posición 548 de tipo silvestre se había mutado a leucina (L) y la mutación S627I en la que la serina (S) en posición 627 del tipo silvestre se había mutado a isoleucina (I) tal como se muestra en la Fig. 1. Para estudiar el efecto de estas mutaciones sobre la sensibilidad del herbicida, se preparó un gen ALS mutante que contiene únicamente una de las mutaciones W548L o S271I (fuera del ámbito de la invención) y se examinó la sensibilidad de una proteína ALS al herbicida con una u otra mutación.

(1) Preparación del gen mutante

Por ejemplo, un gen ALS mutante (referido de aquí en adelante como "gen ALS mutante W548L") con solamente la mutación W548L (fuera del ámbito de la invención) se preparó tal como se muestra en las Figs. 25 y 26. En primer lugar, se realizó una PCR con un cebador sentido de transcripción 5' denominado ALS-Rsp6 (5'-CATCACCAAC
CACCTCTT-3': SEC ID NO:3) y un cebador sentido de transcripción 3' denominado ALS-RspF (5'-acacggactgcaggaata-3': sec id no:4), y utilizando pBluescript II SK+ (FERM BP-7348) que contiene el gen ALS doble mutante doble como un molde, con ello se amplificó un fragmento de ADN con la mutación W548L pero sin la mutación S627I (Fig. 25). Mientras que se amplificó un fragmento de ADN que contiene una región que codifica la serina en posición 627 con un cebador denominado ALS-RspE (5'-TTACAAGGCGAATAGGGC-3':SEC ID NO:5) y un cebador sentido de transcripción 3' (5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3':SEC ID NO:6) y como molde el pBluescript II SK+ que contenía el gen ALS de tipo silvestre (Fig. 25).

A continuación, se obtuvo un fragmento grande de ADN uniendo los dos fragmentos de ADN según el procedimiento de SPR (procedimiento de preparación de genes: Self Polymerase Reaction, o reacción de la propia polimerasa en donde dos ADNs de cadena sencilla se unen por sus extremos, donde las secuencias corresponden unas con otras, y el ADN se replica por la ADN polimerasa utilizando el ADN como molde para cada uno para formar un ADN de cadena doble) (Fig. 26). El fragmento de ADN obtenido se digirió con Acc I y Eco RI, obteniéndose un fragmento Acc I-Eco RI. El plásmido PGEX-2T (pGEX-2T-wALS) que contenía un gen ALS de tipo silvestre se digirió con Acc I, y se realizó una digestión parcial con Eco RI a 37ºC durante 1 min, obteniéndose un fragmento parcial del plásmido pGEX-2T (Fig. 26). A continuación, la ligación del fragmento Acc I-Eco RI y el fragmento parcial del plásmido pGEX-2T dio como resultado un plásmido que contenía el gen ALS mutante W548L.

También se pudo obtener un gen ALS mutante con sólo la mutación S6271I (referido aquí como "gen ALS mutante S627I") según el procedimiento utilizado para obtener el gen ALS mutante W548L. Es decir, el gen ALS mutante S627I pudo obtenerse de la misma forma que la utilizada para el gen ALS mutante W548L excepto que se utilizaron como cebadores ALS-RspE y M13R en la PCR realizada con pBluescript II SK+ (FERM BP-7348) como molde, y se utilizaron como cebadores ALS-Rsp6 y ALS-RspF en la PCR realizada con el pBluescript II SK+ que contenía el gen ALS de tipo silvestre como molde.

Se transformaron separadamente un plásmido con el gen ALS mutante W548L y un plásmido con el gen ALS mutante S627I en la cepa JM109 de E. coli. Las colonias obtenidas de E. coli se secuenciaron para obtener la secuencia completa del gen ALS y confirmar la presencia de las mutaciones puntuales W548L y S627I.

(2) Resistencia al herbicida de las proteínas mutantes respectivas

Un plásmido con el gen ALS mutante W548L o un plásmido con el gen mutante ALS S627I se transformó en la cepa JM 109 de E. coli. Las colonias obtenidas de la transformación se cultivaron en medio líquido, se indujo la expresión de la proteína GST de la misma manera que en el Ejemplo 4 y 5, se preparó una extracto crudo de enzima y se examinó la sensibilidad al herbicida en presencia de valina 1 mM.

La Figura 27 muestra el resultado de la utilización de bispiribac-sodio. Las Figuras 28 y 29 muestran el resultado de la utilización de clorsulfurón e imazaquin. Tal como se muestra en la Fig. 27 para bispiribac-sodio, cada una de las mutaciones puntuales W548L y S627I confirieron resistencia al bispiribac-sodio, siendo el grado de resistencia superior en la mutación W548L.

Sin embargo, el grado de resistencia de estas mutaciones puntuales fue varias magnitudes inferior al del doble mutante del Ejemplo 5. En otras palabras, la coexistencia de las mutaciones W548L y S267I resultó en una mayor resistencia al bispiribac-sodio que la prevista conociendo el efecto de cada una de las mutaciones separadamente.

Cuando se utilizó el clorsulfurón (fig. 28), la mutación W548L sola confirió resistencia al clorsulfurón, pero la mutación S627I no confirió una resistencia obvia. Además, una comparación de los grados de resistencia al clorsulfurón entre la mutación W548L sola y las mutaciones W548L y la S627I juntas demostró que compartían el mismo grado de resistencia. Además, cuando se utilizó el imazaquin (Fig. 29) los resultados fueron similares para el bispiribac-sodio. Sin embargo, atendiendo al intervalo de concentración utilizado en este ejemplo, no pudo confirmarse un aumento de resistencia, como un efecto multiplicativo debido a la coexistencia de dos mutaciones.

Tal como se describió anteriormente, la mutación S627I nueva hallada aquí aumentaba drásticamente la resistencia al bispiribac-sodio debido a la presencia de la mutación W548L. En conclusión, el gen ALS con las mutaciones W548L y S627I es un gen que imparte una elevada resistencia específica al bispiribac-sodio.

Ejemplo 7 Producción de una plante transformada

Se transformó una planta de arroz (Nippon-bare) con el gen ALS mutante determinado en el Ejemplo 3(4), y luego se examinó la resistencia de la planta transformada al bispiribac-sodio.

(1) Construcción del vector binario con el gen ALS mutante incorporado

El gen ALS mutante obtenido en el Ejemplo 3(4) se incorporó en un vector binario, pMLH7133 (Mitsuhara y col., Plant Cell Physiol. 37:49-59, 1996), que se había desarrollado para la transformación de una planta de arroz.

En primer lugar, tal como se muestra en la Fig. 30, el gen ALS mutante incorporado en pBluescript II SK+ (FERM BP-7348) se cortó por el sitio de múltiples sitios de corte para clonaje y por la diana de corte de un adaptador (digestión con Sac I y digestión parcial con Bam HI). pMLH7133 se digirió con SacI y Bam HI. La región GUS en pMLH7133 se excisó y el pMLH7133 se linearizó. Un fragmento de ADN que contenía el gen ALS mutante y pMLH7133 linearizados se ligaron y se obtuvo de este modo pMLH7133-ALS.

El pMLH7133-ALS se transformó en la cepa JM 105 de E. coli. Las colonias resultantes aisladas se cultivaron en medio líquido y luego se preparó un plásmido. La presencia o ausencia del inserto se verificó mediante digestión del plásmido preparado con Sac I y Bam HI (Fig. 31), y a continuación se seleccionaron los clones con los genes ALS mutantes. Se realizó una PCR con los plásmidos que contenían el inserto como moldes y utilizando dos grupos de cebadores que permitían la amplificación específica de al menos una parte del gen ALS mutante. Los grupos de cebadores utilizados aquí fueron un grupo de un cebador sentido de transcripción 5' (5'-GVTCTGCTACAACAGAG
CACA-3':SEC ID NO:7) y un cebador de sentido de transcripción 3' 4-83-3 (5'-GCTTTGCCAACATACAG-3':SEC ID NO:8); y un grupo de un cebador 3-2-4 sentido de transcripción 5' (5-AGGTGTCACAGTTGTTG-3':sec id no:9) y un cebador 3-1-1 de sentido de transcripción 3' (5'-GCATCTTCTTGAATGGCG-3':SEC ID NO:10). De este modo se detectaron las bandas de los fragmentos específicos (Fig. 32), lo que sugiere que el gen mutante ALS obtenido en el Ejemplo 3(4) se había incorporado en el vector pMLH7133.

Además, la incorporación correcta del gen ALS mutante se confirmó por PCR para conocer la orientación de la inserción del inserto y determinar su secuencia. La orientación de la inserción del inserto se confirmó por PCR tal como se describe más adelante. El pMLH7133-ALS se digirió completamente con Eco RI, eliminando de este modo la porción TNOS y linearizándolo. La PCR se realizó con el producto como molde y con los grupos de cebadores anteriores ALS-Res1 y 4-83-3, y 3-1-4 y 3-1-1. Como resultado (Fig. 33), las bandas obtenidas de los productos de PCR confirmaron las posiciones predichas, lo que sugiere que el gen ALS mutante se insertó en la orientación correcta. Si se hubiera orientado en sentido contrario, no se habría detectado producto de PCR ya que la porción del gen ALS mutante se elimina del pMLH7133-ALS por la digestión con Eco RI y no se amplifica ningún fragmento de ADN.

Mientras tanto, se realizó la determinación de la secuencia con la utilización como molde del pMLH7133-ALS preparado para la región de unión con el extremo 5' de un gen ALS mutante y del pMLH7133. Además, ya que pMLH7133-ALS es un plásmido de número bajo de copias en E. coli, la preparación se realizó por el procedimiento SDS-alcalino a partir de un cultivo en un volumen 20 veces mayor que el volumen estándar (correspondiente a los 2 ml de cultivo x20). En consecuencia, los genes ALS mutantes mostraron que se habían insertado en la orientación correcta.

(2) Introducción de un vector binario en Agrobacterium

El vector binario (pMLH7133-ALS) obtenido en (1) anterior se introdujo en Agrobacterium de la manera siguiente. Las células competentes de Agrobacterium tumefaciens EHA 105 guardadas a -80ºC se descongelaron en hielo y se utilizaron a continuación. Se añadió pMLH7133-ALS a una solución que contenía las células competentes de Agrobacterium tumefaciens EHA 105, se dejaron en hielo durante 15 min, se realizó un choque térmico a 37ºC durante 5 min. Luego, la mezcla se dejó en hielo 2 min y se añadió 1 ml de medio líquido SOC, se prosiguió con una incubación a 28ºC en agitación durante 2 a 4 horas. A continuación, se realizó una centrifugación y se eliminó la mayor parte del sobrenadante. La suspensión se vertió sobre una placa de LB que contenía 50 ppm de kanamicina y de higromicina, y a continuación se incubó a 28ºC durante 2 a 3 días, obteniéndose colonias aisladas.

(3) Transformación de una planta de arroz con pMLH7133-ALS introducido con Agrobacterium

Media cucharada de Agrobacterium obtenido en (2) se obtuvo con una microespátula de forma estéril a una concentración de 10 mg/l tal como se muestra en la Tabla 6.

TABLA 6

11

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El pipeteo se realizó adecuadamente con una pipeta Pasteur para que no quedaran restos de la masa de Agrobacterium. La suspensión obtenida se colocó en una cubeta de 9 cm.

Los callos que habían sido inducidos a partir de las semillas (Nippon-bare) y precultivados en medio N6D tal como se muestra en la Fig. 7 se colocaron en una malla de acero inoxidable de acero (o colador de té). A continuación la malla que contenía los callos se mojó en la suspensión de Agrobacterium durante 1,5 a 2 min. Al cabo de dicho tiempo, la malla se sumergió de modo que los callos quedaron totalmente inmersos en la solución bacteriana y se agitó la solución suavemente con ayuda de una espátula. A continuación, la malla de acero inoxidable se colocó sobre un papel de filtro esterilizado para eliminar el exceso de solución bacteriana. Los callos tratados se colocaron en un medio sólido 2N6AS (10 mg/l de acetosiringona, 16 callos por placa de Petri) tal como se muestra en la Tabla 8, se taparon con una tapa quirúrgica y se cultivaron en la oscuridad a 28ºC durante 2a 3 días, hasta que los callos estuvieron cubiertos por una delgada capa de células (debido al crecimiento de las células).

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TABLA 7

12

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TABLA 8

14

Después de que los callos se hubieran recubierto con una fina capa de células como resultado del cocultivo durante 3 días, los callos se lavaron para eliminar el Agrobacterium por el procedimiento siguiente. Los callos tratados tal como se describió anteriormente se colocaron en una malla de acero inoxidable (o colador de té) y a continuación la malla que contenía los callos se sumergió en medio líquido N6D (que contenía 500 mg/l de carbenicilina). El intercambio de placas de Petri se continuó hasta que el medio dejó de ser turbio. Los Agrobacterium adosados a los callos se eliminaron mediante lavados con dicho tratamiento. A continuación, la malla se colocó sobre un papel de filtro esterilizado para eliminar el exceso de humedad. Los calos se colocaron en un medio sólido N6D (que contenía carbenicilina 500 mg/l e higromicina 50 mg/l) y luego se cultivaron en condiciones de luz a 28º durante 2-3 semanas. Además, si el Agrobacterium prolifera de nuevo después del tratamiento, se realizan nuevos lavados de igual manera y los callos se disponen en medio nuevo.

Después de la selección por el cultivo en condiciones de luz a 28ºC durante 2-3 semanas, los callos se trasplantaron, 9 callos por cada placa de Petri, en medio de rediferenciación (que contenía 250 mg/l de carbenicilina y 50 mg/l de higromicina) y se cultivaron de nuevo en condiciones de luz a 28ºC durante 2 a 3 semanas. Cuando se empezaron a diferenciar porciones de hojas, tallos y raíces de aproximadamente 1 cm o más, los callos se trasplantaron, 2 a 3 callos por placa de petri en medio sin hormonas (con 50 mg/l de higromicina). A continuación, cuando los cuerpos de las plantas obtenidos crecieron lo suficiente para propagarse a otra placa de petri, las plantas se dispusieron en cultivos de tierra en macetas (Bonsol) y se dejaron aclimatar. Después de la trasplantación, se eliminó el medio unido a las raíces mediante lavados con agua. La Figura 34 muestra la sucesión de los procesos anteriores.

Simultáneamente con el cultivo en maceta descrito anteriormente, parte de los callos que no se habían rediferenciado (9 callos) (Fig. 35) se subcultivó en medio sólido para la producción de callos resistentes a bispiribac-sodio utilizados en el Ejemplo 1. El medio sólido contenía bispiribac sodio 10 \muM. Así, 6 de los 9 callos crecieron normalmente. Uno de los 6 callos que creció normalmente y mostró resistencia a bispiribac-sodio se sometió al cultivo líquido y luego se examinó su resistencia a bispiribac sodio en detalle. En consecuencia, tal como se muestra en la Fig.36, los callos mostraron resistencia a bispiribac-sodio, al menos de forma idéntica a la línea Sr resistente al bispiribac-sodio, de la cual se había derivado el gen doble mutante. Además, tal como se muestra en la Fig. 37, los callos de la planta de arroz de tipo silvestre (Nippon-bare) mostraron sensibilidad por el bispiribac-sodio. Según ello, los 6 callos que crecían en un medio sólido que contenía bispiribac-sodio 10 \muM también presentaron una resistencia fuerte al bispiribac-sodio.

Se preparó ADN genómico a partir de estos callos resistentes al bispiribac-sodio utilizando un equipo DNeasy Plant (Qiagen). A continuación, se realizó una PCR con el ADN genómico como molde y los cebadores de sentido de transcripción 5' (3-1-4: SEC ID NO:9) y de sentido de transcripcion 3' (4-83-3:SEC ID NO:8) que flanquean la región con las dos mutaciones puntuales. Tal como se muestra en la Fig. 38, se amplificó un fragmento de ADN como se esperaba. El fragmento de ADN amplificado se purificó y a continuación se examinó la secuencia nucleotídica. Se utilizó un cebador (3-1-4:SEC ID NO:9) para leer la cadena sentido 5'; y el cebador ALS-Rsp2 (5'-AGTCCTGCCAT
CACCATCCAG-3':SEC ID NO:11) para leer la cadena de sentido 3'.

La Figura 39A y la 39B muestran los resultados del análisis de la secuencia nucleotídica a proximidad de los nucleótidos que codifican el aminoácido en posición 548 de la proteína ALS. La Figura 39C y la 39D muestran los resultados del análisis de la secuencia nucleotídica a proximidad de los nucleótidos que codifican el aminoácido en posición 627 de la proteína ALS. Tal como se muestra en la Fig. 39 A a D, se hallaron las secuencias heterólogas del tipo silvestre y del mutante para la doble mutación puntual de estas líneas. Se demostró que el gen ALS mutante se había incorporado en el genoma. Además, el hecho de que 3 de los 9 callos no crecieran bien en presencia de bispiribac-sodio 10 \muM podría ser debido a una expresión pobre del gen ALS introducido con dos mutaciones puntuales.

De las 80 plantas de arroz transformantes resistentes a higromicina cultivadas en tierra, 27 plantas a las que se había introducido el gen ALS mutante y 46 a las que se había introducido el gen ALS de tipo silvestre crecieron normalmente en el estadio 5 de hojas. Las plantas que contenían el gen ALS de tipo silvestre introducido presentaron la tendencia de crecer de forma más sana que las que tenían el gen ALS mutante. En dicha etapa, 4 plantas con el gen ALS mutante introducido y 5 plantas con el gen ALS de tipo silvestre se seleccionaron y se administró en forma de aerosol sobre sus hojas y tallos 1 kg de sal de bispiribac-sodio a.i./ha suplementado con tensoactivo K al 0,2%. Los resultados sobre el control del crecimiento al cabo de 40 días se muestran en la Fig. 40. En dicha figura, la longitud de la planta A fue de aproximadamente 90 cm.

Tal como se muestra en la Fig. 40, una planta que contenía el gen ALS mutante introducido creció casi normalmente (A), y además mostró resistencia al bispiribac-sodio. Se preparó ADN genómico de la planta de arroz resistente al bispiribac-sodio mediante la utilización del equipo DNeasy Plant (Qiagen). Se realizó una PCR con el ADN genómico y un grupo de cebadores, sentido 5' (3-1-4:SEC ID NO:9) y sentido 3' (4-83-3:SEC ID NO:8) que flanquean la región con las dos mutaciones puntuales. La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN resultante se examinó de igual manera a la realizada anteriormente con el callo. Se confirmó la presencia de las dos mutaciones puntuales en la planta de arroz transformada.

Efecto de la invención

Tal como se ha descrito detalladamente más arriba, la presente invención puede proporcionar un gen ALS que codifica una enzima ALS que tiene una buena resistencia a los herbicidas inhibidores de ALS y muestra un nivel extremadamente elevado de resistencia a los herbicidas de PC.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de la patente citados en la descripción

\bullet WO 9708327 A [0004]

\bullet WO 00127182 A [0006]

\bullet JP 63071184 A [0007] [0007] [0007]

\bullet JP 5227964 A [0007] [0007] [0007]

\bullet JP 4311392 A [0007]

\bullet US 5633437 A, Bernasconi [0007]

\bullet JP 11504213 B [0007]

\bullet JP 2000362630 A [0120]

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Literatura de la patente no citada en la descripción

\bulletCHIPMAN et al. Biochim. Biophys. Acta., 1998, vol. 1385, 401-419 [0003]

\bulletPANG et al. Biochemistry, 1999, vol. 38, 5222-5231 [0003]

\bulletHERSHEY et al. Plant Molecular Biology, 1999, vol. 40, 795-806 [0004]

\bulletLEE et al. EMBO J., 1988, vol. 7, 1241-1248 [0004]

\bulletBURR et al. Trendsin Genetics, vol. 7, 55-61 [0004]

\bulletLAWRENCE et al. Plant Mol. Biol., 1992, vol. 18, 1185-1187 [0004]

\bulletCHIPMAN et al. Biochim. Biophys. Acta, 1998, vol. 1385, 401-419 [0004]

\bulletRAY. Plant Physiol., 1984, vol. 75, 827-831 [0005]

\bulletSHANER et al. Plant Physiol., 1984, vol. 76, 545-546 [0005]

\bulletSUBRAMANIAN et al. Plant Physiol., 1991, vol. 96, 310-313 [0005]

\bulletSHIMIZU et al. J. Pestic. Sci., 1994, vol. 19, 59-67 [0005]

\bulletKATHLEEN et al. EMBO J., 1988, vol. 7, 1241-1248 [0007] [0007]

\bulletMOURAD et al. Planta, 1992, vol. 188, 491-497 [0007] [0007]

\bulletGUTTIERI et al. Weed Sci., 1995, vol. 43, 175-178 [0007]

\bulletBERNASCONI et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 17381-17385 [0007] [0007] [0007]

\bulletLEE et al. FEBS Lett., 1999, vol. 452, 341-345 [0007]

\bulletHATTORI et al. Mol. Gen. Genet., 1995, vol. 246, 419-425 [0007]

\bulletALISON et al. Plant Physiol., 1996, vol. 111, 1353 [0007]

\bulletRAJASEKARAU et al. Plant Sci., 1996, vol. 119, 115-124 [0007]

\bulletDUGGLEBY; FANG. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2000, vol. 33 (1), 1-36 [0007]

\bulletMOURAD et al. Mol. Gen. Genet, 1994, vol. 243, 178-184 [0007]

\bulletOTT et al. J. Mol. Biol., 1996, vol. 263, 359-368 [0007]

\bulletKIL et al. J. Biochem. Mol. Biol., 1998, vol. 31, 287-295 [0085]

\bulletMITSUHARA et al. Plant Cell Physiol., 1996, vol. 37, 49-59 [0103]

<110> KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD

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<120> Gen que codifica la aceto-lactato sintetasa

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<130> PH-1273PCT

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<150> JP 2000-362630

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<151> 2000-11-29

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 644

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<212> PRT

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<213> Oryza sativa var. Kinmaze

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<400> 1

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15

16

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18

19

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<210> 2

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<211> 2279

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<212> ADN

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<213> Oryza sativa var. Kinmaze

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<400> 2

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20

21

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<210> 3

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 3

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CATCACCAAC CACCTCTT

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18

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<210> 4

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 4

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ACACGGACTG CAGGAATA

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18

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 5

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TTACAAGGCG AATAGGGC

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18

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<210> 6

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 6

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GGAAACAGCT ATGACCATG

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19

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<210> 7

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 7

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GCTCTGCTAC AACAGAGCAC A

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<210> 8

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 8

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GCTTTGCCAA CATACAG

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<210> 9

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 9

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AGGTGTCACA GTTGTTG

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17

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<210> 10

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 10

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GCATCTTCTT GAATGGCG

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<210> 11

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 11

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AGTCCTGCCA TCACCATCCA G

\hfill

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Claims (7)

1. Gen que codifica la proteína siguiente (a) o (b):

(a) una proteína acetolactato sintasa que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:1;

(b) una proteína acetolactato sintasa que comprende la secuencia aminoacídica derivada de la secuencia aminoacídica de la SEC ID NO:1 por sustitución, deleción o adición de al menos uno o más aminoácidos, que tiene resistencia a un herbicida de pirimidinil carboxi y tiene actividad acetolactato sintasa, en donde comparada con la proteína acetolactato sintasa de arroz de tipo silvestre que se muestra en la Fig.1, la serina en posición 627 se reemplaza por la isoleucina, y el triptófano en posición 548 por la leucina.

2. Proteína acetolactato sintasa que está codificada por el gen de la reivindicación 1.

3. Vector recombinante que contiene el gen de la reivindicación 1.

4. Célula transformada con el vector recombinante de la reivindicación 3.

5. Planta recombinante para el gen de la reivindicación 1, que tiene resistencia a un herbicida de pirimidinil carboxi.

6. Procedimiento para cultivar la planta de la reivindicación 5, que comprende el cultivo de la planta en presencia de un herbicida de pirimidinil carboxi.

7. Procedimiento para seleccionar una célula transformada con el vector de la reivindicación 3, mediante la utilización del gen de la reivindicación 1 como un marcador de selección.