TWI280279B - Gene encoding acetolactic acid synthase gene - Google Patents

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AT ι_________ B7 五、( 1 ) "~"" - 技術領垃 本發明係關於一種編蝎乙醯乳酸生成酶之基因，其係為 一種於支鏈胺基酸生合成路徑令之速率決定酵素。 背景技街 已知乙醯乳酸生成酶（以下稱為rALS」）係白胺酸、纈胺 酸、異白胺酸等之支鏈胺基酸生成路徑中之速率決定酵素 ，並作為植物之生長所必須之酵素。目前已知ALS遍及高 等植物體而廣泛存在，亦可於如酵母菌（Sacchar0myces cerevisiae)、大腸桿菌（Escherichia coli)、傷寒沙門式菌 (Salmonella typhimurium)等之各種微生物中表現。 已知大腸桿菌及傷寒沙門式菌中存在3種ALS之同功酶 (isozyme)，此等同功酶係一種由大分子量之催化次單元及 小分子量之調節次單元所組成之雜募聚體 (heter〇-〇lig0mer)，該催化次單元可掌管酵素催化活性，該 調節次單元則具有經由與支鏈胺基酸結合以作為反饋抑制 劑（feedback inhibitor)之功能（Chipman et at，Bi〇chim

Biophys· Acta· 13 85, 401-419, 1998)。其中催化次單元分別 位於Ilv IH、Ilv GM、Ilv BN操縱子（operon)上。另一方面 ，在酵母菌中，雖ALS為單一酵素，但與細菌同樣的亦由 催化次單元及調節次單元（panget al.，Bi〇chemisiry，38, 5222-523 1，1 999)所組成’其催化蛋白質次單元則位於ilv] 的位置。 另一方面，於植物體内之ALS亦由與上述微生物相同之 催化次單元及調卽次单元組成（Hershey et al.，Plant -4 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（2 )

Molecular Biology· 40，795-806，1999)，例如，雙子葉植物 之煙草，其ALS之催化次單元藉由SuRA及SuRB 2種基因位 置被編碼（Lee et al.，EMBO 7，· 1241-124 8，198 8)，玉米的 ALS之催化次單元則於als 1及als 2二種基因位置所編碼 (Burr et al., Trendsin Genetics 7, 55-61, 199 1 ； Lawrence et al·，Plant Mol. Bioi. 1 8，1 1 85 - 1 1 87，1 992)。關於編碼催化 次單元之基因，雙子葉植物中不止煙草之鹼基序列已完全 被測定，另外還有Arabidopsis ^油菜籽、棉花、xanthium 、Amaranthus及Kochia之鹼基序列亦已完全被測定（參考 Chipman et al., Biochem. Biophys. Acta. 1385, 40 1-419, 1998及再公告專利 WO 97/08327)。然而，單子葉植物中僅 玉米孓鹼基序列已被完全測定。 另外，讀酿基尿素類（sulfonylurea)除草劑、α米σ圭琳嗣類 (imidazolinone)除草劑、三唑吡啶類（triazolopyridine)除草 劑及嘧啶基羧基類（pyri midinyl carboxy)除草劑（以下稱為 「PC類除草劑」）等之除草劑，已知其藉由抑制als可抑制 植物之成長（Ray，Plant Physiol· 75，827-83 1，1984; Shaner et al., Plant Physiol. 76, 545-546, 1984; Subramanian et al., Plant Physiol. 96, 3 10-3 13, 199 1; Shimizu et al., J. Pestic. Sci· 19, 59-67，1994) 〇 對於此等除草劑具有抵抗性之植物，已知編瑪ALS之基 因中，具有引起超過種所保存之保存區域中丨個或2個胺基 酸取代之1個或2個絵:基取代之物質，例如，編瑪對於續醒 基尿素類、除草劑具有特異抵抗性之ALS者（參考Kathleen et 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

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線

1280279 A7 B7 五、發明説明（3 ) al.5 EMBO J. 7,1241-1248, 1988; Mourad et al., Planta, 188, 491-497, 1992; Guttieri etal., Weed Sci. 43, 175- 178, 1995;

Bernasconi et al·，J· Biol· Chem· 270，1 73 8 1-Γ73 85，1995及 特開招63-7 1 1 84公報）、對於咪唑啉酮類除草劑具有特異抵 抗性之 ALS者（參考 Mourad et al·，Planta，188，491-497， 1992; Lee et al·，FEBS Lett· 452，341-345，1999及特開平 5-227964公報），或編碼對於磺醯基尿素類除草劑與咪唑啉 酮類除草劑兩者皆具有特異抵抗性之ALS者（參考Kathleen et al.5 EMBO J. 7, 1241-1248, 1988; Bernasconi et al., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995;" Hattori et al.,Mol.

Gen· Genet· 246，419-425，1995; Alison et al·，Plant Physiol. 111，1 353，1 996; Rajasekarau et al.，Plant Sci. 1 19, 1 15:124, 1996、特開昭 63-71 184 公報、特開平 4011392 公報及 Bernasconi et al.，US Patent 5633437，1997)。目前已 知對於磺醯基尿素類除草劑與咪唑啉酮類除草劑兩者皆具 有特異抵抗性之ALS對於PC除草劑或三唑吡啶類除草劑亦 顯示具有交叉抵抗性（Bernasconi et al.，J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995)。此外，亦有將具有對於磺醯基尿 素類除草劑顯示特異抵抗性之AL S個體與對於味。圭α林_類、 除草劑顯示特異抵抗性之ALS個體作相互組合，作出對於 兩者皆具抵抗性之植物體的嘗試（Mourad et al.，Mol. Gen Genet，243，178-184，1994)。另外，將編碼ALS枝基因人為 的變為除草劑抵抗性基因也正在進行中（參考〇tt et al.，j

Mol· Biol· 263, 3 59-3 6 8，1996、特開眧 63-7 1 1 84公報、特開 -6- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 χ 297公釐） '

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特表平u·5。4213公報)，也明瞭1個胺基 ::缺：顯示其對於續醒基尿素類除草劑與懷酮類除 早劑兩者之抵抗性（參考特-開平5、227964公報)_。 雖如同上述般關於對降策 T L早Μ具有抵抗性之ALS及編碼 ALS之基因有詳細精闢夕 介 關之研九，然關於以PC類除草劑抵抗 性作為指標，對PC類除草劑具有特異抵抗性之變異ALS基 因則目^為止無相關報導。 因此’本發明係以提供_種‘媽對PC類除草劑顯示具有 因…種經由該基因編碼之 ALS蛋白f、一種含有該基因之重組載體、一種含有該重 組載體之轉形體、-種含有該基因之植物、—種該植物之 育成方法、及選將該基因作為選擇標記使用之轉形 細胞的方法為目的。 發明之揭示 為達成上述之目的，發明者頃力研究的結果表現··以特 定之胺基酸殘基取代野生型ALS中特定位置之胺基酸殘基 所得之變異ALS ,其可顯示對於？(：類除草劑具有極高度之 抵抗性，從而完成本發明。 (1)亦即，本發明係一種編碼下列4)或（b)之蛋白質之基 因〇 (a) 含有序列編號1所載胺基酸序列之蛋白質。 (b) 具有乙醯乳酸生成酶活性之蛋白質，其係對於。密咬基 羧基（pyrimidinyl carboxy，PC)類除草劑具有抵抗性，並含 有序列編號1所載胺基酸序列中至少1個以上胺基酸被取代 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明說明（5 ) ' --—---—_ 、缺失、或付加之胺基酸序列。 (2)另外，·本發明係一種由 成酶蛋白。 （)之基因所編碼之乙醯乳酸生 (:)更進一步’本發明係一種含有⑴之基因之重組載體。 ，再者，本發明係一種含有（3)之重組載體之轉形體。 +·⑴此外’本發明係-種含有⑴之基因，並對料基竣基 通除草劑具有抵抗性之植物。 ⑹另外，本發明係、-種植物育成方法，其特徵為在料 基羧基類除草劑存在下育成植物（5)。 ()更進步，本發明係一種篩選轉形細胞之方法，其係 使用（1)之基因作為選擇標記使用，以篩選含有該基因之轉 形細胞的方法。 凰^之簡簟說明 圖1為變異形AL S蛋白質之胺基酸序列及野生型als蛋白 貝之胺基酸序列之比較圖。 圖2為變異形ALS基因之驗基序列及野生型als基因之驗 基序列之比較圖。 圖3表示對於抵抗性變異株之 之特性圖。 圖4表示對於野生株之bispyribac-sodium感受性之特性 圖。 圖5表示對於野生株之chlorsulfuron感受性之特性圖。 圖6表示對於抵抗變異株之(^1(^51111\11：〇11感受性之特性圖。 圖7表示由野生株所抽出之ALS蛋白質粗酵素之陰離子 - 8 - 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（6 ) 層析之特性圖。 圖8表示.對於野生型ALS蛋白質及變異型蛋白質中之 b i spy rib ac-s odium感受性之特性圖。 圖9表示對於野生型ALS蛋白質及變異型蛋白質中之 chlorsulfuron感受性之特性圖。 圖10表示對於野生型ALS蛋白質及變異型蛋白質中之 imazaquin感受性之特性圖。 圖11為日本晴EST與玉米ALS基因之鹼基序列比較圖。 圖12表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之 bispyribac-sodium感受性之特性圖。 一 圖13表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之 chlor_sulfuron感受性之特性圖。 圖14表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之 pyrithiobac-sodium感受性之特性圖。 圖15表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之 pyriminobac感受性之特性圖。 圖16表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之 bensulfuron-methyl感受性之特性圖。 圖17表示對於.實施例4所得之粗酵素溶液中之 pyrazosulfuron-ethyl感受性之特性圖。 圖18表示對於實施例4所得夕& & 士 | 1于之粗酵素溶液中之 imazosulfuron感受性之特性圖。 圖I 9表示對於實施例4所得之粗酜 〜、 、 r不〉谷液中之Imazaquin 感受性之特性_。 9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 _________B7 五、發明説明（7 ) 圖20表示對於實施例4所得之粗酵素溶液中之Imazapyr 感受性之特性圖。 圖2 1表示對於實施例·4所得之野生型粗-酵素溶液、 GST-ALS及ALS蛋白質之bispyribac-sodium感受性之特性 圖。 圖22表示對於實施例4所得之變異型粗酵素溶液及 GST-ALS之 bispyribac- sodium感受性之特性圖。 圖23表示對於實施例4所得之變異型粗酵素溶液及 03丁-八乙5之(：111€^5111尸111*〇11感受性之特性圖。 圖24表示對於實施例4所得之變異型粗酵素溶液及 GST-ALS之Imazaquin感受性之特性圖。 圖25表示僅含有W548L變異之ALS基因製作法之概念圖。 圖26表示接續圖25之僅含有W548L變異之ALS基因製作 法之概念圖。 圖27表示對於由實施例6(2)所得之粗酵素溶液中之 bispyribac-sodium感受性之特性圖。 圖28表示對於由實施例6(2)所得之粗酵素溶液中之 chlorsulfuron感受性之特性圖。 圖29表示對於由實施例6(2)所得之粗酵素溶液中之 Imazaquin感受性之特性圖。 圖3 0表示由實施例7所製作雙重載體之製作法之概念圖。 圖31為確認由大腸桿菌（JM 109)之單一選殖株分離出來 之質體中的ALS基因之插入之電泳照片，其中Une i為λ Hind ΙΙΙ/100 bp DNA marker，lane 2 為以保有變異型 ALS 基 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（8^) "— " "— 因之pMLH 7133轉形之大腸桿菌由來質體，Une 3為以保有 野生型ALS基因之pMLH 7133轉形之大腸桿菌由來質體， lane 4為保有GUS基因（對照區）之pMLH 7133，箭頭表示插 入 DNA。 圖3 2表示以質體DN A作為模板之p cR結果的電泳照片， 其中 lane 1為 λ Hind III/100 bp DNA marker’lane 2及 5 為保 有野生型ALS基因之pBI 121質體（對照區），lane 3及6為被 認為保有變異型ALS基因之pMLH 7133，lane 4及7為被認 為保有野生型ALS基因之pMLH 7133，箭頭表示PCR產物。 圖3 3表示確認AL S基因之插入方向之結果的電泳照片， lane 1為 A Hind III/100 bp DN A marker，lane 2為保有變異 型ALS基因之pMLH 7133，lane 3為保有野生型ALS基因之 pMLH 7133，lane 4為保有GUS基因（對照區）之pMLH 7133 ，箭頭表示PCR產物。 圖3 4為使用土壤桿菌之稻子（日本晴）的轉形方法所表示 之流程圖。 圖35為從脱（callus)再分化中之稻子（曰本晴）的照片。 圖36表示以變異型ALS基因轉形之稻子（曰本晴）胝的 bispyribac-sodium感受性。 圖37表示野生型稻子（日本晴）胝的bispyribac-sodium感 受性。 圖3 8表示以由轉形脱所配製之基因組D N A為模板所進行 之PCR結杲的電泳照片。Lane 1為入Hind III/100 bp DNA marker，lane 2〜7分別為以不同來源之胝的基因組DNA作為 ____ -11-____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 _____B7 五、發明説明（9 ) 模板之PCR結果，箭頭表示pcR產物。 圖39A〜D表示以由轉形胝所配製之基因組dna為模板所 進行之PCR結果，對所得之.pcR產物進行定序結果所示之特 性圖’八為藉由意識引子（561136卩]：丨11161：)(3-1-4)對於第548位 置附近之分析結果、B為藉由抗意識引子（antisense prime〇(ALS-Rsp2)對於第548位置附近之分析結果、C為藉 由意識引子(sense primer)(3-1-4)對於第627位置附近之分 析結杲、D為藉由抗意識引子（antisense primer)(ALS-Rsp2) 對於第627位置附近之分析結果。 圖40表示測定以變異型ALS基因轉形之稻子（曰本晴）的 bispyribac-sodium感受性結果之照片，A表示以變異型ALS 基因轉形之稻子、B表示以野生型ALS基因轉形之稻子。 實施本發明之最佳型態 以下茲詳細說明本發明。 本發明之乙醯乳酸生成酶蛋白質（以下稱為「變異型ALS 蛋白質」）係藉由將稻子中所表現之野生型ALS蛋白質之特 定部位予以變異所得，本發明之變異型ALS蛋白質之胺基 酸序列如序列編號1所示。此外，編碼本發明ALS蛋白質之 基因的鹼基序列則以序列編號2表示。 變異型ALS蛋白質，係野生型ALS蛋白質第548位置之色 胺酸以白胺酸取代，同時第627位置之絲胺酸以異白胺酸取 代者。圖1係表示變異型ALS蛋白質之胺基酸序列與野生型 ALS蛋白質之胺基酸序列比較之結果，圖1中第一行之胺基 酸序列表示變莫型ALS蛋白質，第二行之胺基酸序列則表 -12- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1280279

示野生型ALS蛋白質。 編碼變異型ALS蛋白賀之基因（序列編號2)，與編碼野生 型ALS蛋白質之基因比較起來，係編碼野生型ALS蛋白質第 〕48位置之色胺酸的密碼子以編碼白胺酸之密碼子取代，同 時編碼第627位置之絲胺酸的密碼子以編碼異白胺酸之密 馬子取代者。圖2係表示編踢變異型alS蛋白質之驗基序列 一、’扁馬*予上型AL S蛋白質之驗基序列比較之結果，圖2中第 一行之鹼基序列表示變異型ALS蛋白質，第二行之鹼基序 列則表示野生型ALS蛋白質。 、’扁媽成薆異型ALS蛋白質之基因，係藉由將上述變異導 入曰本型稻子品種金南風之基因組DNA中所存在編碼野生 型AL-S蛋白質之基因所得，導入變異之方法係可使用過去 昔知的手法，例如可使用部位特異性變異導入法。部位特 異f生支兴V入法可使用如Mutan-K(寶酒造股份有限公司製 )、GeneEditor(普羅梅卡公司製）、ExSite(斯脫拉特俊公司 製）等市售套組進行。 此外，編碼變異型ALS蛋白質之基因，係將1>(：類除草劑 感受性之野生株培養細胞於PC類除草劑存在下進行培養 ，之後即可由所出現之對於PC類除草劑顯示抵抗性之變異 株培養細胞得到該基因。具體上，先由PC類除草劑抵抗性 之變異型培養細胞中配製mRNA，合成cDNA後再作出又 gt Π嘆菌體之CDNA基因庫（考慮關於抵抗性特徵之異接合 性的基因庫）。將該基因庫以含有一部份之編碼野生型 蛋白質之基因的核酸探針（例如由日本型稻早σ絲 丄 Τ 土阳丁 〇〇檀之日本 -13-

1280279 A7 B7 五、發明説明（H ) —--

晴所得之EST (Expression SequenceTag，Genbank、DDBJ

及EMBL之接受編號為C7241 1))進行筛選，再於pB1 uescdpt II SK+中次選殖所得之陽性株之插入DNA以決定其鹼基序 列。其結果為，經由筛選具有編碼序列編號丨之胺基酸序列 之插入DNA的菌株，可得到編碣變異型ALS蛋白質之基因 。此外，將編碼以上述方式所得之變異型ALS蛋白質之基 因重組導入pBluescript II SK+所得之質體為Mutant ALS cDNA in pBluescript II SK+ (FgRM BP-7348)，其於平成 12 年11月2日，基於布達佩斯條約之國際寄存於獨立行政法人 產業綜合研究所專利生物寄存中心（日本國茨城縣筑波市 東1丁目1番地1中央第6)。該質體於2001年12月1〇日寄存於 中举民國（台灣）食品工業發展研究所之寄存編號為CCRC 940382 。 麦異型ALS蛋白質與野生型alS蛋白質相較之下，不只其 對於PC類除草劑具有優越之抵抗性，對於磺醯基尿素類 (sulfonylurea)除草劑及咪唑啉酮類（imidaz〇lin〇ne)除草劑 亦具有抵抗性。變異型ALS蛋白質對於pc類除草劑特別具 高度抵抗性。經由將編碼變異型ALS蛋白質之基因重組導 入大腸桿菌等之表現載體，觀察轉形於該表現載體之大腸 桿菌等之除草劑感受性可判斷出此現象β 此處可以化 i 所示之 bispyribac-sodium，pyrithiobac- sodium，pyriminobac為例作為pc類除草劑。 - . _- 14 - 本畝張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21GX297公爱) 1280279 A7 B7 五、發明説明（12 ) [化1]

OCHa bispyribac-sodium

OCH3 9 H3〇s^N

pyrithiobac-sodium C〇〇H OCH. 、 〇CH3 pyrirninabac 可以化 2 所示之 chlorsulfuron，bensulfuron-methyl， pyrazosulfuron-ethy卜imazosulfuron為例作為續醯基尿素類 ，除草劑。 [化2]

bensulfuron-methyl XOOCH2CH3 DCH3 ύ OCH3

PCHa och3 ri 〇

Ν\ II

S02NH-C-NH

I CH3 pyrazosulfuron-ethyl 可以化3所示之imazaquin，imazapyr為例作為咪峻琳酮類 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（13 ) 除草劑。 [化3]

imazaquin imazapyr 另一方面，藉由將編碼變異墊ALS蛋白質之基因轉形至 作為標的之植物，可給予該植物PC除草劑之抵抗性。轉形 至植物之手法可使用過去昔知的方法，例如利用根瘤土壤 桿菌（Agrobacterium turnefaciens)將外來基因導入標的植物 細胞之手法。 具體上，將編碼變異形ALS蛋白質之基因插入含有根瘤 土壤桿菌之Ti質體的T-DNA序列之雙重載體中，將此Ti質 體轉形於大腸桿菌中，再將保有編碼於大腸桿菌中所增殖 之變異形ALS蛋白質的基因之雙重載體轉形於含有協助者 質體（helper pi as mid)之根瘤土壌桿菌中。接著將此根瘤土 壤桿菌於標的植物中作感染後，藉由昔知之手法，可使得 此植物細胞再生為完全的植物。 另一方面，編碼變異形ALS蛋白質之基因，亦可轉形於 單子葉植物及雙子葉植物的任何種類之植物中。作為編碼 變異形ALS蛋白質之基因的轉形對象，可列舉如稻子、玉 米、小麥、大麥、大豆、棉、油菜、雜菜、及煙草等。再 者，經由導入編碼變異型ALS蛋白質之基因，亦可轉形結 履草及樹木等。 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279

上述各種情形中，藉由將編碼變異型AL s之基因轉形至 植物中，對於該植物即可賦予其對於PC類除草劑、磺醯基 尿素類除草劑及咪唑啉酮類枝抵抗性除草劑。. 在此，編碼變異型ALS蛋白質之基因亦可作為楂物轉形 貫驗中之選擇性標έ己使用，例如，使用目的基因轉形植物 細胞時，係將編碼變異型ALS蛋白質之基因與含有目的基 因之載體導入植物細胞後，再將該楂物細胞在pc類除草劑 存在下進行培養。其結果為：可觀察到編碼變異型ALs蛋 白質之基因與目的基因同時被導入pc類除草劑存在下所 存活之植物細胞。此外，關於目的基因及編碼變異型als 蛋白質之基因是否重組進入植物細胞之染色體，在觀察該 植物之表現型後，藉由基因組南方雜交反應或pCR ,可以 檢查此等基因之基因組上之存在進行確認β 【實施例】 以下係利用實施例詳細說明本發明，然而，本發明之技 術範圍並不僅限於此等實施例。 [實施例1]製作出具有pc類除草劑抵抗性之稻子（金南風） 培養細胞 去除稻子的種子（品種；金南風、學名：〇ryza sativa var Kinmaze)之稻殼後，將該種子於7〇%之乙醇中浸泡5分鐘， 接著再於〇 %的抗侯露敏中浸泡2〇分鐘後，以滅菌蒸餾水沖 洗數次，再將此種子以表1所示組成之培養基靜置培養。 -17- 本纸張尺度適财國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 1280279 A7 B7 五、發明説明（15 ) 【表1】 無機鹽（目拉西給·斯庫故培養基用混合鹽類） 1袋 維生素B!•鹽酸(0.1 g/1) 1 ml 菸鹼酸(0.5 g/1) lml 維生素B6•鹽酸(0.5g/l) lml 甘油(2 g/1) lml 環己六醇(50 g/1) 2 ml 2,4-D (200 ppm) 10 ml 蔗糠 30 g 另外，上述培養基組成中，2,4-D係合成之植物生成素 (auxin)製作培養基時，首先將上述培養基組成放入1公升 之燒杯，並加入蒸餾水使體積達1000 mi.，其次，再將pH 值調整為.5.7後，加入3 g明膠粉，使用電子爐加熱使明膠粉 溶解，再使用分注機以30 ml分注至各培養瓶。其次，再將 培養瓶以3層鋁箔覆蓋後，於高壓滅菌裝置内以1 2 1°C加熱 滅菌15〜20分鐘，之後，藉由冷卻至室溫製作出靜至培養上 述種子所用之培養基。 接著，於此培養基上進行從經誘導之胝上去除胚乳部分 之繼代培養，所得到之胝的一部份，再於已添加1 μΜ之PC 類除草劑之一的bispyribac-sodium之液體培養基（與表1之 培養基組成相同，但未添加明膠粉）中，大約2週1次一邊繼 代同時進行培養，其結果，從2週〜6週程度之培養細胞開始 _-18-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） Ι2δ0279 Α7 Β7 五、發明説明（16 ) 枯死，約2個月後完全枯死後變色為茶色之培養細胞集團中 ’可得到數個被認為未變色而持續進行細胞分裂之細胞塊 。分離此等細胞塊進行培養之結杲，可得到數個即使於2 μΜ 之bispyribac-sodium存在下也增殖之細胞株。 其後，所得之數個細胞株再順序增加bispyribac- sodium 之添加濃度後培養之結果，可得到即使於100 μΜ之 bispyribac-sodium存在下也增殖之細胞株。將此 bispyribac-sodium抵抗性培養細' 胞（以下稱為抵抗性變異株 )以添加 100 μΜ 之 bispyribac-sodium 之 MS-2,4-D 固體培養 基進行繼代培養。採取一部份繼代培卷之抵抗性變異株， 添加未含bispyribac-sodium之MS-2,4-D液體培養基，以 8〜10卫之週期進行懸浮培養。 接著，.將約1.5 g(濕重量）之此抵抗性變異株移楂入含有 50 ml之MS-2,4-D液體培養基及特定濃度之 bispyribac-sodium的200 ml三角瓶中，以約27°C培養特定期 間，歷時性測定胝的濕重量，以求得以所移植之抵抗性變 異株之濕重量為基準的相對性增殖量。再者，試驗以變化 bispyribac-sodium濃度者連續進行3次，算出其標準偏差 (standard error)。抵抗性變異株中之 bispyribac-sodium濃度 變化與第8日之相對重量之關係以圖3表示，另外，使罔金 南風之野生株進行相同之實驗作為對照組，測定其 bispyribac-sodium濃度與第8日之相對重量之關係的結杲以 圖4表示。 經由圖4可覲察到在野生株中，在1 nM之bispydbac- -19- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規招^(210X297公釐） ''

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k 1280279 A7 ___ B7 _ 五、發明説明（17 ) sodium添加區中未顯示其增殖抑制，在1〇 nM以上之 bispyribac-.sodium添加區則有增殖抑制現象。另一方面，由 圖3可觀察到在變異株中，即使在之bispyribac-sodium添加區中，對於增殖也幾乎不受影響。 此外’使用 chlorsulfuron 取代 bispyribac-sodium，以上述 方式測定野生株與抵抗性變異株之增殖率，野生株中之 chlorsulfuron濃度變化與第9曰之相對重量間的關係以圖5 表示。另外’抵抗性變異株中之chlorsulfuron濃度變化與第 9曰之相對重量間的關係則以圖6表示。 由圖5可觀察到在野生株中，添加inM之chlorsulfuron， 增殖即受到抑制，顯示比bispyribac-sodium之情形更高之感 受性另一方面，由圖6可觀察到變異株中，經由添加1|1% 之chlorsulfuron，其增殖受到強烈抑制。此外，對於 bispyribac-sodium及chlorsulfuron之感受性，在野生株與抵 抗性變異株中，即使長時間培養亦無太大之變化，.而在抵 抗性變異株及野生株中，其增殖速度程度相當。 從此等結杲中顯示：抵抗性變異株對於bispydba(> sodium具有特異性之抵抗性。再者，抵抗性變異株與野生 株相較之下，其對於chlorsulfuron之抵抗性較為提高。 [貫施例2]從抵抗性變異株所純化之部分ALS酵素之藥劑 感受性 在本例中，從實施例1中所得之抵抗性變異株純化部分變 異型ALS蛋白質，研究所得之變異型Als蛋白質中之藥劑感 受性，變異型kLS蛋白質係以以下方式進行部分純化。 ；__ -20· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） ' --- 1280279 A7 B7 五、發明説明（18 ) 首疋，以去除明膠粉之表1的組成，藉由液體培養法（未 添加bispyribac-sodium)配製200 g以上之抵抗性變異株，其 次，將其約150 g以組織重量之3倍量的緩衝液M (2〇% (v/v) 之甘油、0.5 mM之焦磷酸硫胺素（丁PP)、1〇 um黃素腺嘌呤 二核菩酸（FAD)、0.5 mM之MgCl2、pH 7.5 ,含有組織重量 之1/10的聚乙烯聚吡咯烷酮之1()〇 mM的磷酸鉀緩衝液），使 用虛斯寇多隆（匕又rz卜口 >)進行均漿化。所得之均漿以 而才龍棉片過濾後，以15000 xg^i心20分鐘。於離心上清液 中添加硫酸兹，使其達5 0 %飽和，放置於冰中約1小時。之 後再度以15000 xg離心20分鐘，將其沉澱部份溶解於約3〇 1111之緩衝液-2(20%(\^/\〇之甘油、0_5 11^之丁？？、？117.5之 含有Ό·5 mM MgCl2之10 mM Tris-HCl緩衝液）後，再度 15 000 xg離心20分鐘，將其上清液部分加入SephadexG-25 (Amersham Pharmacia Biotech公司製），收集約 40 ml未作用 直接沖出部分，將此收集液作為「粗酵素液」。 其次，依據Bio-Rad Protein Assay之操作手冊以Bradford 法測定粗酵素液之蛋白質濃度，之後，將粗酵素液以華德 曼過濾器（Whatmann公司製）進行過濾，以適當量之粗酵素 液（10〜15ml)作為蛋白質量，使用FPLC裝置（Amersham Pharmacia Biotech公司製）加入連結3管之HiTrap Q (Amersham Pharmacia Biotech公司製）。利用 HiTrap Q吸附 蛋白質成分後，以樹脂體積3〜5倍量之缓衝液-2將未吸附部 分洗出，其後，以樹脂體積之10倍量（150 ml)之溶離液將吸 附之蛋白質成分溶離，此處之溶離液係以〇〜〇·4 Μ之直線濃 ___-21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（19 ) 度梯度，將KC1溶解於緩衝液-2中所得。溶離蛋白質成分之 溶離液係以每管5 ml收集於複數之收集用試驗管中。此外 ，為安定含於溶離之蛋白·質成分之ALS酵母菌素，係事先 添加含有20 mM之丙酮酸鈉之緩衝液-2 (0.5 ml)於收急用 試驗管中。 其次，以下列方式測定來自收集於複數之收集用試驗管 中之溶離部分所含之變異型ALS蛋白質的ALS活性。測定反 應中所使用之反應液係由20 mlvl之丙酮酸鈉、〇.5 之TPP 、0·5 mM之MgCl2、10 μΜ之FAD及20 mM之碌酸_緩衝液 (pH 7·5)所組成之溶液中，混合測定對象之溶離部分者，使 用1 ml之此反應溶液。測定反應係添加測定對眾之溶離部 份後」以30°C進行40〜60分鐘《又，測定反應係藉由添加〇1 m 1之6 N疏酸（或〇 · 2 5 N之氫氧化納）停止反應。 其次，將反應終了之反應溶液以6 0 °C 10分鐘培育，藉此 ，將反應溶液中所含之乙醯乳酸轉變為3-羥基丁酮。 其次，為定量反應溶液中所含之3-羥基丁酮，添加1 mi 0.5% (w/v)之肌酸（creatine)與1 ml溶於2·5 N之氫氧化納之 5% (w/v) α-莕酚，以37艺培育10分鐘。之後，比色反應溶 液中之525 nm吸光度定量3·羥基丁酮，以評估ALS活性。 此外，反應溶液中，因含有少量之丙酮酸鈉，以反應時間〇 作為對照組。 其結杲，OD525 nm之吸光度對於0.2 ml之反應溶液相當 於7之高，然而，上述之測定反應以氫氧化納停止後，檢查 其藉由ALS活性以外之3-羥基丁酮生成活性，可觀察到所 _______ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 12^0279

表現之ALS活性中，接近80%為變異型ALs蛋白質以外之直 接性3’基丁酮生成活性。於是，使用陰離子交換樹脂， 以FPLC分離變異型ALS蛋·白f與變異型似蛋白質以外之 3-羥基丁酮生成活性。其結果如圖7所示，檢測出2者之活 性吸收峰。 為判斷此2者之活性吸收峰中，何者含有變異型als 質，調查兩吸枚峰之3·Μ基成活性。其結果可知， 變異型ALS蛋白質#含於先溶離之吸收峰所表示之部分。 因此，使用含有變異型ALS蛋白質之酵素溶液，調查該 變異型 ALS蛋白質對於 bispyribac,dium、chl〇rsuifu_及 imazaquin之感受性，對於各除草劑之感受性，以藉由在酵 素溶液添加前，以特定之除草劑濃度添加於反應液中，並 以與上述之測定反應相同方法測定ALS活性以進行評估。 此外，為作比較，以同樣方式分離純化野生型ALS蛋白質 供貫驗進行。其中，bispyribac-sodium以水溶液型態、 chl〇rsulfuron及imazaquin以丙酮型態進行，丙酮溶液之最 終濃度為1 %。 圖8表示ALS活性抑制率與bispyribac-s〇dium濃度之關係 圖9表示八1^活性抑制率與(：|11〇1：5111^111»〇11濃度之關係，圖 1〇表示ALS活性抑制率與imazaquin濃度之關係，其中，圖 8〜1 0中空方形點所連成之曲線代表野生型ALS蛋白質，填 滿菱形點所連成之曲線代表變異型ALS蛋白質。 此外彳之上述貫驗中可以概率單位（probit)法準確算出抑 d 5 0¾ ALS活性之除草劑濃度（15〇值），並可算出變異型 -23 本紙張尺歧;fl中國國家標準(CNS) AHi7i1〇 x 297公愛) 1280279 A7 B7 五、發明説明（21 ) ALS蛋白質中之150值與野生型ALS蛋白質中之150值的比 ，其結果如表2所示。 【表2】 化合物 I50(nM)a) Rsifcb) 野生株抵抗性變異株 抵抗性變異株 Bispyribac-sodium 5.63 421 * 74.8 Chlorsuifuron Π.3 92.8 136 Imazaquin 1480 16700 1L3 a) 抑制50%濃度 b) 從表1之抑制活性所算出：150(抵抗性變異株）/150(野性株） 如圖8〜10及表2所示，變異型ALS蛋白質與野生型ALS蛋 白質相較之下，顯示即使在除草劑存在下亦具有較高之 ALS活性。特別是變異型ALS蛋白質與野生型ALS蛋白質比 較中，對於bispyribac-sodium除草劑之感受性有最顯著之差 異，亦即，變異型ALS蛋白質對於bispyribac-sodium具有特 別優良之抵抗性。 [實施例3]變異型ALS基因之選殖 由抵抗性變異株中選殖編碼變異型ALS蛋白質之基因所 使用之探針以下述方式配製，在本例中使用顯示與玉米的 ALS基因具高同源性之來自稻子（日本晴）的一部分cDNA作 為探針。 __-24- _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 ___________B7 五、發明説明（22 ) (1)”’’員不與玉米的als基因具南同源性之來自稻子（曰本晴） 的一部分cDNA序列之定序 (社）農林水產先端技術產業振興中心及農林水產省農業 生物資源研究所正在進行之稻子基因組計劃中之一環中， 目前正在進行稻子（日本晴）cDNA的一部份鹼基序列的定 序’並建構cDNA的一部份鹼基序列之資料庫，以已知之顯 示與玉米之ALS基因具高同源性之cdNA純種株（登錄編號 :C7241 1)作為該資料庫中所包·含約35〇 bp之鹼基序列。此 外’玉米之ALS基因已被完全定出驗基序列。 因此，由農業生物資源研究所取得此cDNA純種株（登錄 編號：C7241 1)，在以下述方式決定鹼基序列，此外，該cDna 純種株係將ALS同源基因插入pBluescript II SK +中，再於 大腸桿菌内進行自主複製β 首先，將保持此ALS同源基因之質體轉形至大腸桿菌 (DH5 α )’將得自培養皿之白色菌株進行液體培養，依照一 般方法從菌體袖出質體，所植入（insert)之DNA因係插入質 體載體中之多選殖位置之限制酶Sail與N〇t I之間，因此可 以此2種酵素消化該載體，再以明膠電泳進行植入確認。之 後，使用RNaseA、PEG、LiCl等依常法純化所得之ALS同 源保持質體載體，再利用引子及ABI BigDyeTenninatCK Cycle Sequencing kit進行定序反應。PCR之反應條件則依實 驗手冊進行。另外，引子係使用由Μ 1 3引子及已決定之鹼 基序列所設計之合成的引子，所得之PCR產物以乙醇沉殺 純化之，再以ΑΒΙ PRISM 310定序儀決定鹼基序列。 本紙張尺度適用中@國家標準(CNS)厶4規格(21()><297公爱) '' ---- 1280279 A7 B7 五、發明説明（23 ) 在此ALS同源保持質體載體中，有已插入1.6 kbp之植入 段DNA (in?ert DNA)之資訊，所得之ALS同源保持質體載體 以限制酶Sal I與Not I消化1進行電泳時，pBluescript II SK+ 液檢測出相當與植入DNA片段之1.6 kbp帶的約3 kbp帶（未 出示圖譜），決定關於植入段DNA部份之全鹼基序列，進行 玉米之鹼基序列同源性檢索之結果，如圖丨丨所示，顯示 84.7。/〇之同源性，因此，因判斷此ALS同源物係日本晴中之 ALS基因之部分cDNA，可以Sal I與Not I消化所切出之植入 段DNA作為探針。此夕卜，圖π中，第一行為曰本晴中之ALS 基因之cDNA鹼基序列，第二行為玉米中之ALS基因之鹼基 序列。

(2)由_抵抗性變異株配製mRNA 首先，將以液態氮冷凍之抵抗性變異株用乳砵與乳棒磨 碎後’以混合機粉碎30秒，將粉碎後之粉末懸浮於抽出緩 衝液[(100 mM Tris-HCl pH 9.0，100 mM NaCl，1重量％ SDS ’ 5 mM EDTA) : (β-mercaptoethanol) : (Tris飽和笨紛） =15 : 3 : 20]中，再充分攪拌。此溶液以12000 xg離心15分 鐘後回枚上清液，再加入200 ml之PCI [(Tris飽和苯酚）： (chloroform) : (isoamyalcohol) = 25 : 24 : 1]，於 4°C 搖晃 1〇 分鐘後，12000X g離心15分鐘回收上清液，來回重複此操 作2次。於所得之上清液中加入1/20量之5MNaC卜2·2倍量 之乙醇，於-8(TC靜置30分鐘後，12000 xg離心5分鐘後回 收沉澱物。以70%乙醇清洗沉澱物，乾燥後溶在1 〇 mM之 β-mercaptoethanol溶液中，將此溶液以27000 xg離心10分鐘 ——__-26- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) " ' 1280279 Α7 Β7 五、發明説明（24 ) 後去除不溶性部分，加入1/4量之10 M LiCl後，靜置於冰上 1小時。再進一步以27000 xg離心10分鐘回收沉澱物，將該 沉殿物溶於4 ml水後，測定其260 nm吸光度以求得RNA之 濃度。再加入1/20量之5 M NaCl與2.2倍量之乙醇，於-80 C靜置3 0分鐘後，2 7 0 0 0 X g離心1 0分鐘後回收沉殿物。以 70%乙醇清洗沉澱物後乾燥之。再將其溶在適量水中作為 全RNA溶液。另外，離心超作皆在4°C下進行。 以下列方法，由此全RNA中 '進行mRNA之分離純化。加 入相對於所抽出之全RN A溶液液量之等量2 X結合緩衝液 (20 mM Tris-HCi pH 7.5，10 mM EDTA，1 M NaCl)。以 1χ 結合緩衝液清洗填充有0· 1 g oligo dT cellulose (Amersham Pharmacia Biotech公司製）的管柱後，將此全RNA溶液加入

管柱。以1 X結合緩衝液清洗後，加入溶離緩衝液（丨〇 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM EDTA)，溶離液以每管 0.5 mi 回收 之。此外，未與管柱反應的部分，則加入其它〇Ug〇 dT cellulose (Amersham Pharmacia Biotech公司製）的管柱，進 行相同之操作。由各部分之吸光度計算出所溶離之mRNA 的濃度後，將入1/10量之10 M LiCl與2.5倍量之乙醇，於-8〇 °C靜置30分鐘。將其離心再乾燥沉澱部分後，溶於丨〇〇 μ 水中，如此所得之mRNA以蔗糠密度梯度離心法區分其大 小 〇 將分離純化之rnRNA加入以25%蔗糖溶液及5%蔗糖溶液 作成密度梯度之離心管中，使用擺動碇轉座（swing r〇t〇r) 以27000 rpm在4t下離心η小時β離心後，以密度梯度之 -27- 本紙張尺度適用中國國家榇準(CMS) A4規格(210 X 297公釐）

I 1280279 A7 B7 五、發明説明（25

順序每0.5 ml回收區分，再測定各別部分之吸光度，計算所 回收之mRNA濃度，並藉由利用ECL套組（ECL direct nucleic acid labelling arid detection system, Amersham Pharmacia Biotec公司製）進行之雜交反應，確認ALS mRNA 之存在。雜交.反應係使用上述（1)所配製之探針，於42°C進 行16小時。此外，雜交反應後之清洗，係以套組所付之1 次清洗緩衝液，以42QC下清洗5分鐘進行2次，之後，使用2 X SSC溶液在42°C下清洗5分鐘行1次，清洗後之膜以透明 之塑膠薄膜包覆，維持在浸泡於套組附屬發光試劑的狀態 ，之後再以X光片予以感光。 一 藉由此等之操作，可從抵抗性變異株中抽出約35 mg之全 RNA.」同時約可抽出約4 mg之mRNA。又，利用蔡糖密度 梯度離心法可辨認出預想部分之雜交反應陽性之點潰。 另一方面，使用野生株約可抽出95 mg之全RNA及約7 mg 之mRNA。從野生株抽出mRNA時，除使用野生株代替抵抗 性變異株外，其餘之操作如上述之方法。 (3)來自抵抗性變異株之cDNA基因庫的製作 使用2 pg上述（2)所純化之mRNA及cDNA合成套組 (Amersham Pharmacia Biotec公司製）進行 cONA 之合成，以 製作來自抵抗性變異株之cDNA基因庫。 首先，在反轉錄反應中使闬套組所附之RTase，之後的互 補鏈加長反應中則使用套組所付之T4 DNAp〇lymerase ,互 補鏈加長反應中，為計算cDNA合成產率，添加np_dCTP， 所合成之cDNA附加上接和子（adaptor)後，在in vitro下包裝 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 裝 訂

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AT ____ B7 五、發明説明（26 ) (packaging)的方式整合（integrate)至人噬菌體。 附加於cDNA上之接合子係使用寶酒造股份有限公司製 之EcoRI-Notl-Bam HI接合子，於含有cDNA之溶液中，添 加相當於cDNA莫耳濃度50倍之接合子，於此混合溶液中再 加入T4 DNA Ligase (Pharmacia公司製），於4。(：進行連結 (ligation)反應一夜。將此反應溶液加入使用AsahiPak GS 710管柱（旭化成工業股份有限公司製）之HPCL中，以波長 260 nm之紫外光觀察溶離液”溶離液以每〇.5 區分成25 管，各分亦以Cerenkov計算儀測定，回收3〜4管計算值高之 分液。此分液以T4 polynucleotide kinase(寶酒造股份有限 公司製）將接合子之5f端磷酸化後，加上又gt 1 1 Eco RI臂後 ，進〃行連結反應。連結反應係以於溶液中添加GigaPack Gold III (Stratagene公司製）後，於室溫下進行2小時。反應 終了後，添加200 μΐ之SM緩衝液與8 μΐ之氣仿作為噬菌體 溶液。將此噬菌體溶液稀釋10倍，取其丨μ1感染於大腸桿 菌（Υ- 1 088)後，加入0·7ο/〇之丁 opArga，塗佈於LB培養jR中， 經過4〜8小時後，計算培養皿中所出現之斑片（plaque)數以 測定其力價（titer)。 從DE 81紙及Cerenkov計算之結果可判斷：約74 ng之來 自抵抗性變異株之cDNA已被合成。從附加接合子之載體在 連結反應後之Cerenkov計算結杲，可得到關於抵抗性變異 株播入約22 ng之植入段的久DNA。將此ADNA包裝5嗔菌 體以作為來自抵抗性變異株之cDNA基因庫。此基因庫溶液 之力價為16600·ρίϊι/μ卜 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1280^7(§012862〇號專利申請案 中文說明書替換頁(92年釀 五、發明説明（π 另一方面，使用由野生株所抽出之mRNA，按照上述方 法配製cDNA基因庫時，可合成約38 ng之來自野生株之 cDNA °又，可得到關於野生株插入約5 ng之植入段的入 DNA。再者，來自野生株icDNA基因庫溶液之力價為18160 pfu/μΐ 〇 (4)含ALS基因之cDNA的篩選 培養皿中出現20000個左右之斑片時，將上述（3)所配製 之基因庫溶液稀釋後，將來自野生株及抵抗性變異株之噬 菌體分別塗佈於10盤中，將斑片轉印於硝基纖維素膜 (Schleicher & Schnell公司製，PROTORAN BA85，孔洞大 小為0.45 μηι)，轉印之硝基纖維素膜以先變性溶液（〇·5 Μ NaOH，1.5 M NaCl)，繼以中和溶液（1·5 M NaCb0.5MTris-HC1 pH 7.5，1 mM EDTA)浸泡20秒。使用濾紙去除硝基纖 維素膜上多餘之水分後，硝基纖維素膜在8〇°C下培育2小時 。此外’使用 Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotec公司 製）代替硝基纖維素膜時，可省略培育之操作，而在0·4 Μ NaOH中固定2〇分鐘。 將上述（1)中所配製之植入段DNA以RI及非RI2種方法進 行標示以作為探針DNA使用。RI標示化與雜交反應洗以下 列方法進行。首先，將約2〇〇〜500 ng的探針DNA作熱變性 處理，再使用BcaBEST DNA labelling kit(寶酒造股份有限 公司製）進行標示。於此標示反應加入套組所付之缓衝液、 隨思引子（random prime r)及 32P-dCTP。再加入 BcaBEST ’ 於 65°C培育30分鐘，之後加入EDTA終止反應。於8片硝基纖 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（28 ) 維素膜中添加含約l〇〇ng容量之探針，於42t搖晃一晚進行 雜父反應。雜交反應後以2 X SSC，0.1% SDS溶液清洗3次 後’於BSA 2000之影像分析儀（imaging analy乙er)(富士軟片 股份有限公司製）之影像板（imaging plate)上曝光i小時，曝 光後使用影像分析儀檢測陽性菌株β 另一方面，非RI標示化係以其次方法進行，將約2〇〇〜500 ng之探針DNA作熱變性後，添加ECL直接DNA/RNA標示· 檢測系統（Amersham PharmacialBiotech公司）所附之DNA標 硪試劑（過氧化酶）及戊二醛，於37°c下培養。此時，於8片 硝基纖維素膜中添加含約10〇 ng容量之探針，於42。〇搖晃 免進行雜父反應’雜父反應終了後，以washing buffe-r於室溫清洗10分鐘3次，之後，再以2 x SSC於室溫進 行1次膜的清洗。將獏浸泡於ECl所附之發光液中，再以χ 光曝光3 0分鐘至3小時。 雜交反應（1次篩選）之結果所得之陽性噬菌體以經滅菌 牙籤括取其個別之上層瓊脂膠後，懸浮於2〇〇 WiSM緩衝 液中’可得噬菌體溶液。將此等噬菌體溶液以各菌株分別 適當稀釋，感染於大腸桿菌088株中，再塗佈於Lb培養 皿上。使用此新製之培養皿，進行相同之雜交反應（2次筛 選），將陽性噬菌體懸浮於20〇 pitSM緩衝液中以作為單一 嗤菌體。再者，無法分離於2次筛選中之單一噬菌體時，則 再度稀釋後，塗佈於LB培養孤上，進行雜交反應（3次篩選） 以得到單一噬菌體。 使用以下之方法自I 一 σ耆菌體配製久DNA。將使用竹籤 ---- - -31- 本紙張尺度· τ目g家標準(⑽）Α4·^χ撕公f ------ 1280279 A7 B7 五、發明説明（29 ) 或牙鉞自陽性菌株之斑片所收集之又嗜菌體，於含有5 之新鮮宿主大腸桿菌（γ 1 088)之懸浮液之200 μΐ之2χΥΤ培 養基（含10 mM MgCh及0.2%之麥芽糠）中培養。於靜置狀態 42 °C下培養一晚後，再度於含有25 μΐ之宿主大腸桿菌 (Υ1 088)之懸浮液之i mi之2χΥΤ培養基（含有1〇 MgCl2 及0.2%之麥芽糖）中搖晃一晚進行培養（以上為前培養）。將 前培養之溶液（10〜15 μΐ)於12 ml含有1〇 mM之MgCl2及〇·5 ml之大腸桿菌（Y1 088)懸浮液之·2χΥΤ培養基中培養，而一 邊施予較強之搖晃，以42°C培養一晚至溶菌後濁度增加為 止。培養終了後，加入50 μΐ之氯仿及丨.2 ml之5 M NaCl， 一邊搖晃而以42°C培養10分鐘。再以27000 xg進行1〇分鐘 之離β後，於新移至離心管之上清液中加入5 ml之50% P E G ’於冰上培養1小Η寸以上。將其以2 7 〇 〇 〇 X g進行離心1 〇 分鐘之後丢棄上清液，再度以27000 xg進行離心後丢棄液 體部分。對沉澱部分，使其懸浮於300 μΐ含有4 μ§之DNase I、20 pg之 RNase A及 10 mM之 MgCl22 3 0 mM Tris-HCl緩衝 液pH 7·5中，並移至1.5 ml之試管。以37eC培養該懸浮液3〇 分名里後’加入7·5 μΐ 之 20% SDS、3 μΐ 之 proteinase K (10 mg/ml)、12 μΐ之0.5 M EDTA，接著以55°C培養15分鐘。於 此加入150 μΐ之苯酚並激烈攪拌後，使用湯米（T〇mmy)微離 心機MR-150(〉努求精工公司製）’以15000 rpm離心3分鐘， 回收水層。於所收集之水層中加入800 μΐ之乙醚（預先加上 蒸餾水以除去過氧化物），並激烈攪拌後，以15000 rpm離 心1 0秒並丟棄乙醚層。重複該乙醚萃取操作後，以氮氣除 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ' 1280279 A7 B7 五、發明説明（30 ) 去殘存於水層之乙醚。於水層中加入30 μΐ之5 MNaCM、875 μΐ之乙醇以迅速回收沉澱之；I DNA，以1 ml左右之70%乙醇 對λ DNA加以潤濕後，於減壓下使其乾燥約1分鐘以除去乙 醇。以20 μΐ〜50 μΐ之ΤΕ緩衝液（pH 8.0)加以溶解而成λ DNA溶液。 所得之λ DNA溶液中之植入段DNA之次選殖及鹼基序列 決定係由以下方法進行。以Not I消化所得之；I DNA溶液（1 μΐ)以切出植入段DNA。切出反應之反應液組成係依照限制 酶所附之說明書，以37°C使其反應约2小時後。以使用1 % 瓊脂糖凝膠之電泳進行植入段尺寸之確認。以Not I消化具 有植入段DNA之λ DNA (10 μΐ〜20 μΐ)以切出植入段DNA。 以分取用之瓊脂糖凝膠對此加以分離後，自凝膠切出對應 之段（band)，並以通常法純化植入段DNA。以莫耳比1:1之 比例混合該植入段DN A及BAP處理（使用蝦之鹼性磷酸酶 進行脫磷酸化處理）後之載體，以T4 DNA連結酶進行1 6°C、 2小時以上之連結反應。此外，由於植入段DNA係以切出者 做為材料，故BAP處理時亦對以Not I切斷之載體進行。連 結反應結束後，將其溶液之一部分與感應細胞（competent cell)(DH5 α)混合，並放置於冰上30分鐘。對此以42°C進行 3 0秒之熱衝擊，並置於冰上2分鐘。接著添加S0C而以37°C 培養1小時後，將其塗佈於事先均一地塗有混合1 00 μΐ之2 χΥΤ(加入50 pg/ml之氨芊青黴素）、30 μΐ之3% X-Gal及1 Μ IPTG 3 μΐ者之LB培養基上，以37°C培養10小時以上。將轉 形之白色菌株於加入氨芊青黴素之LB培養基或2 χΥΤ培養 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 ____ B7 五、發明説明（31 ) 基之2 ml中接種一個菌株後，以37°C培養一晚。自該培養 液以通常法配製質體並溶解於H2〇中，定量DNA濃度後， 供給至定序用PCR反應。PCR反應及鹼基序列之決定係由上 述方法進行。 依據以上實驗，可得到約2.2 kb不完全長之ALS cDN A。 其自該DNA之5’側起約250 bp之位置存在有Sma I位置。接 著以其次之方法製作新探針。以宿主大腸桿菌JM109增加 保持約2.2 kbp之pBluescript ΙΓ SK+後，以自動分離裝置 (KURABO PI-100)抽出質體。以直接sma I消化該質體後， 以1 %之瓊脂糖電泳分離純化所生成之約25〇 bp之片段並算 出濃度後做為探針。使用該探針並以使用上述RI之方法再 度篩荽基因庫。自所得之單一噬菌體配製又DNA，以Eco RI 消化該λ DNA溶液（1 μΐ)，並以電泳確認尺寸後，固定於硝 基纖維素膜上。將電泳後之凝膠浸於含有1.5 M NaCl之0.5 M NaOH溶液中輕輕搖晃15分鐘左右。之後以水洗凝膠，浸 於含有3 Μ之NaCl之0.5 M Tris-HCl pH 7.5中，一邊搖晃15 分鐘左右一邊中和凝膠。於不鏽鋼板上張貼20 X SSC，其 中放置重疊5片左右之工業用厚濾紙之台座。其上依序放置 中和後之凝膠、膜（於蒸餾水中溶化切斷成預定大小之硝基 纖維素膜後，再以20 X SSC溶解10分鐘）、2張重疊之濾纸， 接著於其上疊放3 cm〜4 cm厚之纸巾。於其上放置玻璃板， 並於其上放置輕的秤錘後，進行約點染5分鐘。其後，確認 凝膠與膜間沒有氣泡並進行1 〇分鐘左右之點染。於點染結 束仗’以貫穿照明器（trans-illumator)對膜進行UV處理，並 ___ - 34 - G張尺度適财關家群((：Νϋ^格 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（32 ) 以80°C烘烤15分至30分j共烤後，藉由以32p標示之上述250 bp 探針DNA進行雜交（雜交緩衝液組成：5 X SSPE、0.5% SDS、 5 X Denharlts、solum sperm DNA、50% formamide)，將結合 之段（band)放射能映至影像板而取得，並以BAS-2000分析 其結杲。對該雜交化中顯示陽性植入段中具有較大尺寸者 加以大量配製，於以上述方法Eco RI消化後B AP處理之 pBluescript II SK+中進行次選殖（FERM BP-7348)。將其轉 形至大腸桿菌（JM 105)，並液體培養所得之轉形體後，以 通常法配製質體，並以上述方法決定鹼基序列。 結果’可取得包含完全長之變異ALS基因之cDNA。該 cDNA之鹼基序列如序列編號2所示。此*卜，從來自野生株 之cD_NA基因庫可取得一種類之包含完全長ALS基因之 cDNA。該等變異型ALS基因與野生型ALS基因之相同性比 較結果顯示於圖1中。 [實施例4]變異型ALS蛋白質之表現 以Eco RI消化實施例3(4)所得之質體，切出包含野生型 ALS基因之cDna及包含變異型ALS基因之CDNA後，分別將 其引入pGEX表現載體。包含野生型ALS基因之cDNA係具 有較起始密碼子長47鹼基長之5,非翻譯區域，引入於 pGEX-2丁之Ec〇 RI位置。此夕卜，包含變異型ALS基因之cDNA 係具有較起始密碼子長3 1鹼基長之5，非翻譯區域，引入於 pGEX-4T，3 之 Eco RI位置。 將該等分別轉形至大腸桿菌（JM 105),液體培養轉形所 得之菌株並抽出質體，以限制酶切斷圖譜及序列確認植入 _____ -35- 本紙張尺度適财S s家裙準(CNS) Μ規格(21GX297公爱) 1280279 A7 B7 五、發明説明（33 ) 段DNA之插入方向。一個個選擇植入段DNA方向正確之菌 株，將其以含有2 ml之氨芊青黴素之LB培養基中以27。(：搖 晃培養。使用1 ml該前培養液以.50 ml或250 ml之含氨芊青 黴素之LB培養基進行正式培養。經一晚培養後，加入1 mM IPTG並進行3小時至4小時之GST融合蛋白質之表現誘導。 此處，自添加IPTG起進行3小時至4小時培養後之ALS活 性測定結杲顯示於表3。 【表3】 · 樣品 ALS活性（OD525/4〇 min/0.05 mi) 蛋白質質量(mg/m〇 比活性（OD525/40 min/mg protein) 對照區(不含質體） 1.41 17.6 1·6Ό 野性株 - 4.10 18.2 4.5 抵抗性變異株· 3.62 12.8 5.66 由表3可知，與不含質體之對照區相比，具有野生株ALS 基因之大腸桿菌及具有變異型ALS基因之大腸桿菌顯示3 倍〜4倍左右之高比活性。因此，自添加IPTG後培養3小時 至4小時後，以-80°C保存轉形大腸桿菌，並以此純化GST 融合ALS蛋白質。 由大腸桿菌進行ALS之配製及純化之方法如下。首先， 將保存於-8CTC之轉形大腸桿菌之沉澱團（pellet)懸浮於 ALS柚出緩衝液（包含30%甘油及0.5 mM MgCl2之磷酸鉀缓 衝液pH 7.5)中（添加2.5 ml之緩衝液於自培養液50 ml所得 -36- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（34 ) 之沉澱團（pellet))。對該懸浮液進行超音波處理（Heat Systems-Ultrasonics公司製、Sonicator W-225R、微晶片、 輸出控制8、約1秒間隔、40秒2次）後，以4°C、1 5000 xg離 心2 0分鐘，以其上清液作為粗酵素溶液。 由粗酵素溶液純化GST融合ALS蛋白質（以下稱為 GST-ALS)係利用以下之方法進行。將由培養液250 ml分之 沉澱團（pellet)所配製之粗酵素溶液（12.5 ml)施加於榖胱甘 Ek (glutathion) sepharose 4Β·親和性管柱（Amersham Phamacia Biotech公司製，底容量為約1 ml，事先以10 ml 之 1 x PBS (0.14 M NaCl，2.7 mM ΚΧΓ，10.1 mM Na2HP〇4 ，1.8 mM KH2P04，pH 7·3)將其平衡化）後，使用10 ml之1 xPBS洗淨該管柱並將吸附之GST-ALS利用2 ml之10 Mm的 榖胱甘肽溶液溶離（4次）。測定各個部分之GST活性及ALS 活性，並收集高活性部分。另外，於使用ALS抽出缓衝液 時，因對於上述管柱之吸收率太差，故在以1 X PBS抽出酵 素後一併進行使其吸著於上述管柱之實驗。ALS活性測定 及蛋白質定量係遵循上述之方法，而GST活性測定則係以 l-chloro-2，4-dinitrobenzene(別名略記為 2,4-dichioronitrobenzen (CDNB))作基質之方法來進行。設定反應液量為3 ml、反應 液組成為1 mM CDNB、1 mM榖胱甘肽（還元型）、酵素溶液 、1 00 mM碟酸舒缓衝液pH 6.5。添加酵素溶液後，以30°C 紅分析增加之340 nm吸光度。又，CDNB係配製100倍濃度 之乙醇溶液並添加於反應液内。 雖亦檢測出多量未吸著上述親和性管柱之活性（ALS活 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（35 ) 性及GST活性），但因關於吸著於親和性管柱之部分其大部 分活性係於第1及第2次之榖胱甘肽溶離部分中檢測出，故 將其合併作為純化GST-ALS。 一 將該GST-ALS以凝血蛋白水解酶（25 unit)置於4°C，設定 其一晚所消化者為自GST游離的ALS。於表4係顯示出粗酵 素溶液、使用上述親和性管柱之色層分析後及凝血蛋白水 解酶處理後之ALS活性、蛋白質量及比活性。 【表4】 ' 樣品 ALS活性 蛋白質質量 比活性 (OD525/40 min/0.05 ml) (mg/ml) (OD525/40 min/mg protein) 野性1巷酵素 4.6105 9.6 9.61 色層分薪後 0.6083 0.189 64.4 凝血蛋白處理後 0.1089 0.189 Π.5 抵抗悻變異型粗酵素 3.1493 12 5.25 色層分梢：後 0.6025 0.045 268 凝血蛋白處理後 0.1203 0.045 53.5' 另外，於所配製的ALS酵素中係包含有來自大腸桿菌之 ALS活性。但如表5所示，來自大腸桿菌之ALS活性係來自 ALS同功酶I，故藉由添加1 mM之纈胺酸（valine)幾乎可完 全抑制。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（36 【表5】 樣品 ALS活性(OD525/40min/0.05ml) 抑制率(％) CK1(無質體） 1.2725 CK1+1 mM纈胺基 0.1768 86 CK2(無質體） 1.5508 CK2+1 mM纈胺基 0.1831 88 連續進行2次實驗 [實施例5]變異型ALS蛋白質之藥劑感受性 使用在實施例4所得之粗酵素溶液，調查變異型als蛋白 質之藥劑感受性。藥劑感受性測試係依照與實施例2相同之 步驟來進行。於該藥劑感受性測試中係使用 bispyribac-sodium、pyrithiobac-sodium、pyriminobac-sodium之.3藥劑作為PC類除草劑，chiorsulfuron、 bensulfuron-methyl > pyrazosulfuron-ethy 1. ' imazosulfuron 之4樂劑作為續酿基尿素類除草劑，imazaqU}n、imazapyr 之2藥劑作為咪唑啉酮類除草劑。 此類藥劑係於添加變異型ALS蛋白質之前，將該藥劑之 4 疋〉辰度之溶液（bispyribac-sodium及 pyrithiobac-sodium為 水溶液，其他則為丙酮溶液）添加於反應液中。丙酮之最終 濃度設定為1 % ^另外，因在大腸桿菌内所表現來自稻子 cDNA之ALS蛋白質為纈胺酸非感受性（Kilet al·，J· Biochem.

Mol· Biol· 3 1 287-295，1998)，故在利用纈胺酸抑制來自大 腸桿菌之ALS活性之條件下進行藥劑感受性測試。 圖1 2係顯示出使用b丨s p y r i b a c - s 〇 d i u m時之感受性結不1。 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ 297公釐）

裝 訂

k 1280279 Α7 Β7 五、發明説明（37 ) 另外，於圖1 3則顯示出使用chi orsul fur on時之成a丨生# 由圖12瞭解到可藉由bispyribac-sodium抑制野生φ 活性，但對於變異型ALS之活性卻完全無法抑 「 之 圖13可知關於chlorsulfuron，其變異型ALS蛋白質與野刊 ALS蛋白質比較時，可維持高活性到特定濃度為止 < 和 與bispyribac-sodium時比較則抵抗性為中等程度。 另外，使用pyrithiobac-sodium作為藥劑時之残受性纟士果 顯示於圖14，使用pyriminobac作為藥劑時之感受性龄果顯 示於圖15 ’使用bensulfuron-methyl作為藥劑時之残受性、会士 果顯示於圖16，使用pyrazosulfuron-ethyl作為藥劑時之咸 受性結果顯示於圖17，使用imazosulfuron作為藥劑時之减 X性結果顯示於圖1 8，使用imazaquin作為藥劑時之成受怡 結果顯示於圖1 9，使用imazapyr作為藥劑時之感受性結果 顯示於圖20。另外，於圖12〜圖20中，連結塗滿之三角之圖 形係顯示出包含野生型ALS蛋白質之粗酵素溶液，而連結 塗滿之四角之圖形則為顯示出包含變異型AL S蛋白質之粗 酵素溶液。 如該圖14〜圖20所示，變異型ALS蛋白質較野生型ALS蛋 白質具有對各藥劑之優良抵抗性，特別是對於PC類除草劑 具有優良抵抗性。又，若與圖12、圖14及圖15比較，可得 知變異型ALS蛋白質係在pc類除草劑中對bispyribac-sodium之抵抗性為最優良的。

該結果由於可判斷與實施例2之結果有關聯，故顯示於實 施例2提昇對PC類除草劑之抵抗性之要因，係變異型al S -40- I故張尺度適财國國家辟(CNS) A4規格(21Q χ 297公爱）-- 1280279 A7 B7 五、發明説明（38 ) 基因。 另一方面，使用實施例4中所配製之純化GST-ALS及游離 ALS來進行藥劑感受性測試。於圖2 1顯示對野生型ALS蛋白 質之bispyribac-sodium之抵抗性結杲，於圖22顯示對變異型 八1^蛋白質之1^5卩>^1^&(：-5〇(1111111之抵抗性結杲。另*卜，於圖 23顯示對變異型ALS蛋白質之chlorsulfuron之抵抗性結杲 ，而於圖24則顯示對變異型ALS蛋白質之imazaquin之抵抗 性結果。又，在於圖21〜圖24所顯示之藥劑感受性測試結果 中，係未添加續胺酸而進行。另外，於圖2 1連結塗滿之三 角之圖形係顯示包含野生型ALS蛋白質之粗酵素溶液，其 連結塗滿之四角之圖形則顯示野生型GST-ALS，而連結塗 滿之圓之圖形則為顯示游離之ALS蛋白質。在於圖22〜圖24 中，其連結塗滿之三角之圖形係顯示包含變異型ALS蛋白 質之粗酵素溶液，而連結塗滿之四角之圖形係顯示變異型 GST-ALS。 如該圖21〜圖24所示，即使於純化GST-ALS，亦顯示出與 使用粗酵素溶液情形相同之藥劑感受性。 [實施例6] 於變異型ALS基因之變異處與藥劑感受性之關係

在實施例3(4)所決定之於變異型ALS基因之變異處，係如 圖1所示，於野生型之548號色氨酸（W)變異成白氨酸（L)之 W54 8L變異，及於野生型之627號絲氨酸（S)變異成異白氨 酸（I)之S627I變異。在此，為研究對因該等變異所造成之藥 劑感受性之影響，故配製僅具有該W548L變異及S627I變異 中之一之變異型ALS基因，並調查僅具其中之一變異之ALS -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（39 ) 蛋白質之藥劑感受性。 (1;)變異基因的配製 真短上，僅具W548L變異之變異型ALS基因(以下稱之為 「W5 48L變異型基因」）係如圖25及圖26所示般而配製。 首先，使用命名為ALS-Rsp6之意識引子（sense primer) (5'-CATCACCAACCACCTCTT-3·:序歹，J 編號 3)及命名 為 ALS-RspF 之反意識引子（2111^6115601*111^1：)(5·-ACACGGACTGCAGGAATA- 3，·：序歹U 編號 4)，以保持 2點變 異型 ALS 基因之 pBluescript II SK+ (FERM BP-7348)作為 鑄模而進行PCR，並增幅具有W548L變異但不具有S627I變 異之DNA片段（圖25)。另一方面，利用命名為ALS-RspE之 (5’-TTACAAGGCGAATAGGGC-3，：序歹ij 編號 5)及命名為 1^1311之（5,-00八八八匸八0(：丁八丁0八(：0八丁0-3,:序歹《1編號6)， 以保持野生型ALS基因之pBluescript II SK+作為鑄模，並 增幅包含編碼627號絲氨酸之區域之DNA片段（圖25)。 其次，將該2個DNA片段還原，且.藉甴SPR法（使單股之 DNA彼此間於序列所對應之端末部分結合，互相作為鑄模 而.以DNA polymerase使其複製，以做為雙股之DNA之基因 製作法：Self Polymerase Reaction)取得連結2個DNA片段尺 寸大之DNA片段（圖26)。並將所得到之DNA片段利用Acc I 及Eco RI消化而取得Acc I-Eco RI之片段。另夕卜，將引入野 生型 ALS 基因之 pGEX-2T 質體（pGEX-2T-wALS)於 Acc I 位 置消化後，再以Eco RI進行37°C、1分鐘之部分消化，取得 pGEX-2T質體部分片段（圖26)。並且，將Acc I-Eco RI片段 _-42-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（40 ) 及pGEX-2丁質體部分片段，藉由連結反應而取得具有 W548L變異，型ALS基因之質體β 另外’僅具S627I變異之變異型aLS基因（以下稱之為 「S627I變異型ALS基因」）可依照配製上述W548L變異型 ALS基因之方法取得。即，除了藉由以pBiuescriin n SK + (FERM BP-7348)做為鑄模之 PCR,將 ALS-RspE 及 M13R 作 為引子使用，藉由以保持野生型ALS基因之pBluescript II SK+作為鑄模之PCR，將ALS-Rsp6及ALS-RspF作為引子使 用以外則係同樣地進行。 使用具W548L變異型ALS基因之質-體及具S627I變異型 ALS基因之質體，分別轉形至大腸桿菌（jM1〇9株）。且於進 行所得到之大腸桿菌菌株之ALS基因之全定序後，可確認 W 5 4 8 L變異及S 6 2 71變異之1點變異。 (2)各變異蛋白質之藥劑感受性 將具有W548L變異型ALS基因之質體或具有S627I變異 型ALS基因之質體轉形至大腸桿菌（JM 1〇9),對由轉形所得 之菌株進行液體培養，與實施例4及5同樣，進行G S T誘導 蛋白質之表現誘導，配製粗酵素液，於1 mM之纈胺酸存在 之下調查ALS之藥劑感受性。 圖27顯示使用bispyribac-sodium時之結果。此外，圖28 及圖29顯示使用chlorsulfuron及imazaquin時之結果。由 bispyribac-sodium之圖27可知，W548L變異及S627I變異其 各自之1點變異會給予對bispyribac-sodium之抵抗性，其程 度為僅有W548L變異之1點變異較僅有S627I變異之1點變 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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AT _57 __ 五、發明説明（41 ) 異為高。 但可得知該等1點變異之抵抗性程度皆較實施例5所示之 2點變異之情形低。亦即同時具有W548L變異及S627I變異 之情形，對bispyribac-sodium之抵抗性顯著地強，其程度則 為由僅具有W548L變異或S627I變異之一之情形無法預測 之程度。 另一方面，chlorsulfuron之情形時（圖28)，若僅有W548L 變異時，雖給予對chlorsulfuroii之抵抗性，但僅有S627I變 異時則未給予明確之抵抗性。此外，若比較僅有W54 8L變 異與僅有S627I變異之情形，則其對chlorsulfuron之抵抗性 之程度則為相同程度。而於imazaquin之情形（圖29)，可得 與bispyribac-sodium相同之結果，但對於本例濃度中同時具 有2點變異之相乘之抵抗性增大則未能得到確認。 由以上結杲，得知此次新表現之S627I變異，飛躍性地提 南了因W548L之bispyribac-sodium抵抗性。因此可下具有 WMSL變異及S627I變異之ALS基因係能給予對 bispyribac-sodium特別高之抵抗性之基因之結論。 [實施例7]製作轉形植物 ^ 使用實施例3(4)中所決定之變異型ALS基因，轉形至稻子 (曰本晴），調查轉形稻子之bispyribac-sodium抵抗性。 (1)引入變異ALS基因之二元載體之製作 藉由以下之方法，將由實施例3(4)得到之變異型ALS基因 加入稻子之轉形用而開發之二元載體，亦即pMLH 7133 (Mitsuhara et al·，Plant Cell Physiol· 37 49_59，1 996)中。 • 44 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱） 1280279 A7 _B7___ 五、發明説明（_ ) 42 亦即如圖3 0所示，首先，利用多重選殖位置之限制酶切 斷部位及接合子之切斷部位，將來自引入變異型ALS基因 之 pBluescript II SK十（FERM BP-7348)之變異 ALS 基因切 出（利用Sac I消化及Bam HI之部分消化）。此外，使用Sac I 及Bam HI消化pMLH 7 133，切出pMLH 7133之GUS區域使 其成直鎖狀。連結包含變異型ALS基因之DNA片段及直鎖 狀之 pMLH 7133，而得到pMLH 7133-ALS。 將所得之pMLH 7133-ALS轉形至大腸桿菌（JM 105株）， 將所得之單一菌株液體培養後配製質體。藉由以Sac I及 Bam HI消化所配製之質體並確認植入段之有無（圖31)，挑 選出保持有變異ALS基因之純種系。以確認出有植入段之 質體.ί故為鑄模，使用特異性增幅變異ALS基因之至少一部 分之2組引子進行PCR。引子組為使用ALS-Rspl意識引子 (5,-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3,：序歹，J 編號 7)與 4-8 3-3反意識引子（5，-0(：1'丁丁0(：0八八0八丁八€八〇-3|:序列編 號 8)之組，3-1-4 意識引子（S’-AGGTGTCACAGTTGTTGe :序列編號9)與3-1-1 反意識引子（5，-GCATCTTCTTGAATGGCG-3· :序列編號10)之組。結果，檢測出特異之片段帶（fragment band)(圖3 2)，而可判斷實施例3(4)所得之變異型ALS基因已 被加入pMLH 7133載體中。 此外，變異型ALS基因是否已正常引入，係藉由PCR植入 段之插入方向的確認及序列的決定而確認。PCR楂入段之 插入方向確認係以以下方法進行。藉由以Eco RI完全消化 pMLH 7133-AL/S而除去TNOS部分並使其成直鎖狀，以其為 ---------- - 45 -____ 本紙張尺度適財s a家標準(CNS) M規格(⑽χ 297公爱） A7 B7 1280279 五、發明説明（43 鑄模，使用上述ALS-Resl與4-83-3之組及3-1-4與3-1-1之組 而進行PCR。結杲（圖33),因預測位置處確認出PCR產物之 段（band)，故判斷變異型ALS基因為以順方向插入。此外， 於變異型ALS基因為以逆方向插入之情形，因Ec〇 ri消化而 自PMLH7133-ALS切出該變異型ALS基因部分，故DNA片段 未被增幅，且未檢測出PCR產物。 另一方面，序列之決定，係配製pMLH7133_ALs ,以其 為鑄模而對變異ALS基因之5,側·與PMLH7133之接合區域而 進行。此外，由於大腸桿菌内之複製數量少，故由習知之 20倍量之培養液（2 ml之培養液2〇瓶份）以鹼性SDS法配製 pMLH 7133-ALS。結果，判斷變異型Als基因為以順方向 插入一。 (2)對土壌桿菌（Agrobacterium)導入二元載體

如以下而將土壌桿菌導入上述（丨）所得到之二元載體 (pMLH 7133-ALS)。土壌桿菌係使用於-80。(：保存之根瘤土 壤桿菌（Agrobactedum tumefaciens) EHA 105之感應細胞 (competent cell)溶解於冰中者。於包含根瘤土壤桿菌eh a 105之感應細胞（competent cell)之溶液中加入pMLH 7133-ALS，放置於冰中15分鐘後，以37°C施予5分鐘之熱 衝擊（heat shock)。其後於冰中放置2分鐘，接著加入1 ml 之SOC液體培養基，於28°C下緩慢搖晃2〜4小時。之後， 離心並丟棄上面澄清之大部分，使沉澱之菌體懸浮於上澄 清部分。於分別含有50 ppm之康那黴素（kanamycin)及潮黴 素（hygromycin)之LB板培養基上，塗抹懸浮液，以2fC培 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 12^0279 A7 B7 五、發明説明（44 ) 養2至3日而得到單一菌株。 (3)利用pMLH 713 3-ALS導入土壌桿菌之稻子轉形 將（2)所得到之土壤桿菌·，以滅菌後之微量吸管取1/2匙左 右，於以10 mg/1之濃度加入表6所示acetosyringone之30 ml 之A AM培養基（falcon tube)中充分懸浮。 【表6】 iMgS〇4-7H2〇 250 CaCr2-2H2〇 150 NaH2P04-2H2〇 150 KC1 3000 Fs^EDTA 40 MnS〇4-6H2〇 · 10 ZnS〇4-TH2〇 2 CuS〇4-5H2〇 0. 025 C0CI2-6H2O 0.025 KI 0. 75 H3B0 3 Νί39ινη〇4-9μ9Π 0. 25 Myo-inos i tol 100 Nicotinic acid 1 Pyridoxine-HCl 1 Thiamine-HCl 10 Casamino acid 500 Glycine 7. 5 L-Arginine 176. 7 L-Glutamine 900 L-Aspartic acid 300 Sucrose 68. 5 Glucose 36 pH . 5. 2 (數值為mg/1) 此時為不留下土壌桿菌之塊體，而以巴斯德微量吸量管 (Pasteur pipet)充分衝擊。將所得之懸浮液放入9 cm之盤中。 另一方面，自日本晴種子誘導，將以表7所示N6D培養基 __-47-_ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7

前培養之脱放入不鏽鋼網或茶葉篦子，每一網置於土壤桿 之懸浮液1，·5至2分鐘（此時使胝全體浸於菌液中，以藥匙^ 慢攪摔）。之後，將不鏽鋼.網置於滅菌後之濾紙上，除去多 餘之菌液。將如此處理之胝置於表8所示之2Ν6 AS固態培養 基（acetosyringone 10 mg/Ι)上（1盤16胝），以手術闬膠帶密 封，而以2 8 °C、黑暗條件下培養2〜3日（培養至菌體增殖至 薄薄地覆蓋胝）。

CHU之粉末 1袋 _ Myo-inos i tol 100 Nicotinic acid 0· 5 Pyridoxine-HCl 0· 5 Thiamine-HCl 1 2, 4-D 2 . . Casamino acid 300 Glycine 2 Proline 2827 k Sucrose 30000 gelrite 4000 carbenicillin 500 •： hygromycin 50 :· pH 5.8 (數值為mg/1) -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 五、發明説明（46 )~ B7 -------- 【表8】 CHU之粉末 1袋 Myoinositol 100 Nicotinic Acid 0· 5 Pyridoxine-HCl 0.5 Thiamine-HCl 1 2, 4-D 2 Casamino acid 300 Glycine 2 Sucrose 30g Glucose 10 g gel rite 4000 acetosyringone 10 pH 5. 2 (數值為mg/l) 以3天的共存培養於胝上覆蓋薄薄的一層菌體之時，利用 下列之方法洗淨胝並除去土壌桿菌。將如上述處理過之胝 放入不鏽鋼濾網（或茶葉濾網），·並將整個濾網浸泡於N6D 液體培養基（包含羧苄青黴素（carbeniciUin) 5〇〇 mg/1)，直 到該培養基不再呈白濁為止時交換培養器皿。藉由該處理 清洗附著於胝上之土壤桿菌。其後，將濾網置放於已滅菌 之濾紙上並除去多餘之水分。將該胝置於N6D固態形培養 基（包含：>〇〇 mg/l之羧芊青黴素及5〇 mg/1之潮黴素）上，以 -49 - 本纸蘇尺度適财s S家料(CNS) A4規格(210 X297公爱)----- 1280279

28 C、於明亮處培養2〜3週。另外，於該動作後若土壤桿有 再度繁殖 < 情形時，同樣地再度清洗並置於新的培養基上。 以28 C、於明亮處2〜3週的培養而經挑選蚤，每次以1培 養态皿9個胝而將胝移植至再分化培養基（包含25〇 之 羧卞青黴素及50 mg/Ι之潮黴素），並以28它、明亮處培養 2〜3週。於自胝莖葉部及根部起各自分化1 上之時，以 一培養器皿2〜3胝而移植至不含荷爾蒙之培養基（包含5〇 mg/Ι之潮黴素）。之後，所得到之植物體在培養器亚中到處 擴散時，入盆於培養土（彭索爾）中進行馴化。另外，於移 植時將附著於根部之培養基在水中完全洗落。以上之操作 流私·顯不於圖3 4。 另二方面，於上述入盆時，將未再分化胝之一部份（9株） (圖3:>) ’利用實施例！所使用之bispyribac_s〇dium抵抗性胝 生成用之個體培養基繼代培養。另外，於該個體培養基中 含有10 μΜ之bispydbac-sodium。其結果於9株中有6個會正 吊的；η殖，因此，關於顯示正常繁殖之biSpyribac-S0dium 抵抗性之胝其6株中之一，進行液體培養，詳細調查對於 bispyribac-sodium之藥劑感受性。該結果如圖36所示，與2 點麦異型基因之由來株，亦即bispyribac-sodium抵抗性之 Sr乐統株幾乎相同’顯示出bispyribac-sodium抵抗性。又如 圖37所示，於野生型稻子（日本晴）之胝中顯示出 bispyribac-sodium之感受性。由此，可判斷在含有之 bispyribac-sodium固體培養基所生長之6株，皆具有強 bispyribac-sodium抵抗性。 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

1280279 A7 B7 五、發明説明（48 ) 另一方面，由該bispyribac-sodium抵抗性之脱，使用 QIAGEN公司之DNeasy Plant Kit而配製基因組DNA，將此 作為鑄模，以夾住2點變異部分之意識引子（3-1-4 ··序列編 號9)及反意識引子（4-83-3 :序列編號8)之組來進行PCR。其 結果，如圖38所示，增幅了所預測之DNA片段。純化所增 幅之DNA片段後調查鹼基序列（解讀意識鏈係使用引子 (3-1-4 :序列編號9)，解讀反意識鏈則使用引子（ALS-Rsp2 :5’-八0丁(：0：丁0(：0八丁0八(：0八丁0€八0-3，序歹|厂編號11)。 編碼ALS蛋白質之548號氨基酸之鹼序列周邊之解析結 果顯示於圖39A及B。另外，編碼ALS蛋白質之627號氨基酸 之鹼序列周邊之解析結杲顯示於圖39C及D。如該圖39A〜D 所示可認定於該等株之2點變異部分係為野生型及變異型 之異質（hetero)序列。因此，可確認變異型ALS基因已加入 於基因組中。另外，其9株中之3株在10 μΜ bispyribac-sodium存在下生育差，其被認為是因所導入之2 點變異型ALS基因之表現量低所致。. 另一方面，於約80株之入盆之潮黴素抵抗性之轉形稻子 中，在5葉期階段正常成長者係導入變異型ALS基因者為27 個體，而導入野生型ALS基因者為46個體。野生型ALS基因 具有較導入變異型ALS基因者健全成長的傾向。於此時， 適當挑選出導入變異型ALS基因4株及野生型ALS基因5株 ，添加 0.2%表面活性劑 K於 1 kg a」./ha之 bispyribac-sodium 鹽類中並散佈於莖葉部。之後，約40曰後進行成長調查， 其結果顯示於ί 40。另外，於圖40中A的草長約90 cm。 -51 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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k 1280279 A7 B7 五、發明説明（49 ) 由圖40瞭解到導入變異型ALS基因之1個體大致正常地 成長（A) ’ ·且該株係具bispyribac-sodium抵抗性。由該 bispyribac-sodium抵抗性之轉升少稻子藉由QIAGEN公司之 DNeasy Plant Kit配製基因組DNA，以夾住2點變異部分之 意識引子（3-1-4 :序列編號9)與反意識引子（4-83-3 :序列編 號8)之組來進行PCR，再利用與上述胝之情形相同之方法 調查所得到之DN A片段之鹼序列。其結果可確認於該轉形 稻子存在著2點變異。 一 於本說明書中係將所引用全部之刊物、專利及專利申請 ，毫無變更地作為參考而記入本說明書中。 產業上利用之可能性 如；上詳細之記載，依據本發明，可提供一種ALS基因 ，其可編碼對於各種藥劑具有優良的抵抗性且對PC類除草 劑顯示極高度抵抗性之ALS酵素。 _-52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公嫠) 1280279 A7 B7五、發明説明（50 ) 序列表 <1丨0>組合化學工業股份有限公司 r * * <120〉.編瑪乙酿乳酸生成酶之基因 <130> PH-1273PCT <150〉 JP 2000-362630 <151> 2000-1H9 · <160> 11 . <170> Patentln Ver. 10 <210> 1 <211> 644^ <212> PRT <213〉金南風 <400〉 1 Met Ala Thr Thr Ala Aia Ala Ala Ala Ala Aia Leu Ser Ala Ala Ala 15 10 15 Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gin Arg His His Val Leu Pro 20 25 30 Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser 35 ’ 40 45 -53- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格(210 x 297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（51 ) Pro Val Tlir Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro 50 55 60 Trp Gly Pro Ala GIu Pro Arg Lys Gly Ala Asp lie Leu Val GIu Ala 65 TO 75 80 Leu GIu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Giy Ala 85 90 95 Ser Met GIu lie His Gin Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val lie Thr Asn 100 105 110 His Leu Pfie Arg His GIu Gin Gly GIu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr 一 Π5 120 125 Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro 130 135 140 Gly Ala Γπγ Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Lsu Asp Ser 145 150 155 160 Val Pro Met Val Ala He Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met lie Gly 165 170 175 Thr Asp Ala Phe Gin Gia Thr Pro He Vai Gla Val Thr Arg Ser lie 180 185 190 Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val GIu Asp He Pro Arg Vai 195 200 205 -54-

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k 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（52 ) lie Gin Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val 210 215 220

Leu Val Asp lie Pro Lys Asp lie Gin Gin Gin iMet Ala Val Pro Val 225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr lie Ala Arg Lsa Pro Lys

245 250 25S

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gin Vai Leu Arg Leu Val Gly Glu 260 265 270

Ser Arg Arg Pro lie Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Giy 275 280 285

Asp Clu Lsu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly lie Pro Val Thr Thr 290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu 305 310 315 320

Arg Met Lea GIv Met His Gly Tnr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp 325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val 340 345 350

Thr Gly Lys lie Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys lie Val His lie -55- 本泯張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格(210 x 297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（53 ) 355 360 365

Asp lie Asp Pro Ala GIu lie Gly Lys Asn Lys. Gin Pro His Val Ser 370 375 380 lie Cys Ala t^sp Val Lys Leu Ala Leu Gin Gly Leu Asn Ala Leu Leu 385 390 395 400

Gin Gin Ser Thr Tnr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn 405 410 415

Glu Leu Asp Gin Gin Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe 420 425 430·

Gly Glu Glu lie Pro Pro Gin Tyr Ala lie Gin Val Leu Asp Glu Leu 435 ' 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala lie lie Ala Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met 450 455 460

Trp Ala Ala Gin Tyr Tyr Γπγ Tyr Lys Arg Pro Arg Gin Trp Lsu Ser 465 470 475 480

Ser Aia Gly Lsu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly 485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Vai Val Asp He Asp Gly Asp 500 505 510 -56- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（54 )

Gly Ser Phe Leu Met Asn lie Gin Glu Leu Ala Leu lie Arg He Giu 515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met 530 535 540

Val Val Gin Lsu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr 545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu lie Tyr Pro Asp Phe Vai 565 570 575

Thr lie Ala Lys Gly Phe Asn lie Pro Ala Vai Arg Val Thr Lys Lys - 580 ‘ 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala lie Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro 595 600 605

Tyr Leu Leu Asp lie lie Vai Pro His Gin Glu His Val Leu Pro Met 610 615 620

He Pro He Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met lie Leu Asp Gly Asp Gly 625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr <210> 2 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（55 ) <211> 2279 <2I2> DNA <213〉金南風 <400> 2 ctcgccgccg ccgccgccgc caccacccac catggctacg accgccgcgg ccgcggccgc 60 cgccctgtcc gccgccgcga cggccaagac cggccgtaag aaccaccagc gacaccacgt 120 ccttcccgct cgaggccggg igggggcggc ggcggtcagg tgctcggcgg tgtccccggt 180 caccccgccg tccccggcgc cgccggccac gccgctccgg ccgtgggggc cggccgagcc 240 ccgcaagggc gcggacatcc tcgtggaggc gctggagcgg tgcggcgtca gcgacgtgtt 300 cgcctacccg ggcggcgcgt ccatggagat ccaccaggcg ctgacgcgct ccccggtcat 360 caccaaccac ctcttccgcc acgagcaggg cgaggcgttc gcggcgtccg ggtacgcgcg 420 cgcgtccggc cgcgtcgggg tctgcgtcgc cacctccggc cccggggcaa ccaacctcgt 480 gtccgcgctc gccgacgcgc tgctcgactc cgtcccgatg gtcgccatca cgggccaggt 540 cccccgccgc atgatcggca ccgacgcctt ccaggagacg cccatagtcg aggtcacccg 600 ctccatcacc aagcacaatt accttgtcct tgatgiggag gacatccccc gcgicataca 660 ggaagccttc ttcctcgcgt cctcgggccg tcctggcccg gtgctggtcg acatccccaa 720 ggacatccag cagc^atg? ccgtgccggt ctgggacacc tcgatgaatc taccagggta 780 catcgcacgc ctgcccaagc cacccgcgac agaattgctt gagcaggtct tgcgtctggt 840 tggcgagtca cggcgcccga ttctctatgt cggtggtggc tgctctgcat ctggtgacga 900 attgcgctgg tttgttgagc tgactggtat cccagttaca accactctga tgggcctcgg 960 caatttcccc agtgacgacc cgttgtccct gcgcatgctt gggatgcatg gcacggtgia 1020 cgcaaattat gccgtggata aggctgacct gttgcttgcg tttggtgtgc ggtttgatga 1080 tcgtgtgaca gggaaaattg aggcttttgc aagcagggcc aagattgtgc-acattgacat 1140 tgatccagca gagattggaa agaacaagca accacatgtg tcaatttgcg cagatgitaa 1200 gcttgcttta cagggcttga atgctctgct acaacagagc acaacaaaga caagttctga 1260 ttttagtgca tggcacaatg agttggacca gcagaagagg gagtttcctc tggggtacaa 1320 aacttttggt .gaagagatcc caccgcaata tgccattcag gtgctggatg agctgacgaa 1380 aggtgaggca atcatcgcta ctggtgttgg gcagcaccag atgtgggcgg cacaatatta 1440 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）

裝 訂

1280279 A7 B7 五、發明説明（56 ) cacctacaag cggccacggc agtggctgtc ttcggctggt ctgggcgcaa tgggatttgg 1500 gctgcctgct gcagctggtg cttctgtggc taacccaggt gtcacagttg ttgatattga 1560 tggggatggt agcttcctca tgaacattca ggagctggca ttgatccgca ttgagaacct 1620 ccctgtgaag gtgatggtgt tgaacaacca acatttgggt atggtggtgc aattggagga 1680 taggttttac aaggcgaata gggcgcatac atacttgggc aacccggaat gtgagagcga 1740 gatatatcca gattttgtga ctattgctaa ggggttcaat attcctgcag tccgtgtaac 1800 aaagaagagt gaagtccgtg ccgccatcaa gaagatgctc gagactccag ggccatactt 1860 gttggatatc atcgtcccgc accaggagca tgtgctgcct atgatcccaa ttgggggcgc 1920 attcaaggac atgatcctgg atggtgatgg caggactgtg tattaatcta taatctgtat 1980 gttggcaaag caccagcccg gcctatgttt gacctgaatg acccataaag agtggtatgc 2040 ctatgatgtt tgtatgtgct ctatcaataa ctaaggtgtc aactatgaac catatgctct 2100 tctgttttac ttgtttgatg tgcttggcat ggtaatccta attagcttcc tgctgtctag 2160 gtttgtagtg tgttgttttc tgtaggcata tgcatcacaa gatatcatgt aagtttcttg 2220 tcctacatat caataataag agaataaagt acttctatgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2279 訂 <210> 3 <211〉 18 <2i2> DNA <213〉人工序列 線 <220〉 <223〉人工序列之敘述：引子 <400> 3 CATCACCAAC CACCTCTT 18 <210> 4 -59

1280279 A7 B7 五、發明説明（57 ) <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列<220〉 <223〉人工序列之敘述··引子 <400> 4 ACACGGACTG CAGGAATA 18 <210> 5 - <211> 18 <212〉脆 <213〉人工序列<220〉 <223〉人工序列之敘述··引子 <400> 5 nACAAGGCG AATAGGGC 13 <210> 6 <2il> 19 <212> DNA <213〉人工序列<220〉 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（58 ) <223〉人工序列之敘述··引子 <400> 6 GGMACAGCT ATGACCATG <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之敘述：引子 <400〉 7 21 裝

GCTCTGCTAC-MCAGAGCAC A 訂 <210> 8 <211> 17 <2i2> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之敘述：引子 <400〉 8 Π 線 GCHTGCCAA CATACAG ‘ 61 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1280279 A7 B7 五、發明説明（59 ) <210> 9 <211> 17 <212〉脆 <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：引子 <400〉 9 AGGTGTCACA GTTGTTG 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之敘述：引子 <400〉 10 GCATOTOT GAATGGCG 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1280279 A7 B7 五、發明説明（60 ) <220〉 <223>人工序列之敘述：引子 <400> 11

AGTCCTGCCA TCACCATCCA G -63- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims (1)

1. T · ·. 'j 號專利申請案 甲文里請ϋ範園替換本(95 ^ 12 f) 1 0 ;:"龙)正本 、申請專利範圍 1· 一種基因’其係含有編碼由序列編號1之胺基酸序列所 組成之乙酿乳酸生成酶蛋白質之核酸序列，該乙醯乳酸 生成酶蛋白質係以異白氨酸取代野生型稻米之乙醯乳 酸生成酶蛋白質中第627號位置之絲氨酸而得，且對於 嘧哫基羧基（pyrimidinyl carboxy)類除草劑具有抵抗性 者。 2· 一種乙醯乳酸生成酶蛋白質，其係由如申請專利範圍第 1項之基因所編碼。 一種重組載體，其係具有如申請專利範圍第1項之基因。 一種轉形體，其係具有如申請專利範圍第3項之重遨 體。 、、秋 5. 一種植物育成方法’其特徵為在㈣基縣除草在 之育成下具有申請專利範圍第1項之基因的植物。 一種篩選轉形細胞之方法，其係使用如申請專利範圍第 1頁《基因作為師選標記，篩選具有該基因之轉形細胞。 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X297公董）