ES2305256T3 - Acido lipoteicoico derivado de bacterias de acido lactico para el uso como medicamento y en el tratamiento de enfermedades bacterianas. - Google Patents

Abstract

Una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico como ingrediente activo, en la que las bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM1-2332, para el tratamiento de la sepsis, translocación bacteriana, inflamación, infección y enfermedades y/o un crecimiento bacteriano excesivo.

Description

Ácido lipoteicoico derivado de bacterias de ácido láctico para el uso como medicamento y en el tratamiento de enfermedades bacterianas.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM-2332, como ingrediente activo según una de las reivindicaciones 1 ó 2. Se refiere también al uso del ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico como ingrediente activo para la fabricación de un medicamento, un producto oral o tópico para aplicaciones cosméticas, dermatológicas u oftalmológicas, una composición alimentaria o de pienso para animales de compañía para modular la colonización bacteriana, las respuestas inmunes y disminuir los procesos inflamatorios asociadas con enfermedades mediadas por bacterias e infecciones del tracto gastrointestinal, óseas, cutáneas, oculares, auditivas, pulmonares o de la cavidad oral, elegidas entre la sepsis, la translocación, la inflamación, la infección y las enfermedades bacterianas y el crecimiento excesivo de las bacterias, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM-2332.

Antecedentes de la invención

En el parto hay una colonización del intestino fetal previamente estéril con un amplio inóculo microbiano. El establecimiento de la microflora intestinal es un proceso muy dinámico durante los primeros días de vida, antes de que se establezcan poblaciones estables en regiones definidas del trato gastrointestinal. Hay una colonización sucesiva en primer lugar por parte de la E. coli y de especies de Streptococcus (Mata, L.J. y J.J. Urrutia, Ann. N. Y. Acad. Sci. 176, 93-108, 1971) y después por parte de una microflora bifidogénica, que es muy dominante en bebés alimentados del pecho materno y que aporta cierta protección contra patógenos potenciales (Gibson, G.R. y X. Wang, J. Appl. Bacteriol. 77, 412-420, 1994).

Las bacterias de ácido láctico (LAB), como son los Lactobacillus y las bifidobacterias, son residentes normales del tracto gastrointestinal de las personas humanas adultas. Hay cepas selectas de estos géneros, llamadas probióticas, que tienen beneficios para la salud cuando se administran por vía oral al hospedante (Brassart, D. y E.J. Schiffrin, Trends Food Sci. Technol. 9, 321-326, 1997). Al igual que las LAB comensales, los probióticos antagonizan a los organismos patógenos y estimulan los mecanismos de la defensa inmune. Sin embargo, se sabe muy poco acerca del mecanismo preciso que subyace a estos efectos biológicos, se ha aceptado en general que las cepas, que con gran probabilidad despliegan efectos beneficiosos para la salud, son aquellas que se adhieren de forma transitoria al epitelio intestinal, quizá a través del ácido lipoteicoico (LTA) de su pared celular.

El LTA es un polímero complejo de glicero-fosfato unido a un resto lípido hidrófobo (Fischer, W., Bacterial phosphoglycolipids and lipoteichoic acids; en: Glycolipids, phosphoglycolipids and sulfoglycolipids, M. Kates, coordinador; Hanahan, D.J., Nueva York y Londres, pp. 123-234, 1990). Es un componente de la pared celular de la mayor parte de bacterias Gram-positivas y aunque haya una gran diversidad en el LTA de las diferentes bacterias, presenta similitudes estructurales con el LPS encontrado en la pared celular de los organismos Gram-negativos.

Los LPS de organismos Gram-negativos tienen fama por sus efectos pro-inflamatorios, mientras que hasta ahora se han realizado pocos trabajos con el LTA de organismos Gram-positivos. Parece, sin embargo, que solamente el LTA de especies bacterianas concretas media en tales efectos (Suda, Y. y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 12, 97-112, 1995; Arakaki, R. y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 22, 283-291, 1998).

Aunque los LTA de bacterias Gram-positivas presentan una gran diversidad de una cepa bacteriana a otra, existe una cierta similitud estructural con los LPS presentes de la pared celular de organismos Gram-negativos. Los receptores de reconocimiento patrón (Pattern Recognition Receptors, PRR) reconocen regiones conservadas de estructuras bacterianas y señalizan al hospedante la presencia de un inóculo bacteriano. El CD14, una glucoproteína anclada sobre el glucosilfosfatidil-inositol (GPI), presente en células mieloides, es un receptor de este tipo. Ahora se sabe que puede fijarse tanto sobre el LTA y como sobre el LPS. Es verdad que la sepsis provocada por los organismos Gram-negativos tiene lugar a través de la fijación del LPS sobre el CD14 en la membrana de los monocitos-macrófagos. Hay indicios cada vez más claros de que una forma soluble del receptor CD14 media fijando el LPS sobre las células CD14-negativas. No obstante, esta molécula reconoce también otros componentes bacterianos, como son el peptidoglicano, el lipoarabinomanano y los polímeros de ácido manurónico (Dziarski, R. y col., Chem. Immunol. 74, 83-107, 2000). Hemos publicado que una forma soluble del CD14 (sCD14) presente en la leche de pecho de madres humanas estimulates las células epiteliales del intestino humano (IEC) liberando citoquinas después del contacto con E. coli no patógena o con su LPS (Labeta, M.O. y col., J. Exp. Med. 191, 1807-1812, 2000) pero no después del contacto con bacterias Gram-positivas vivas o con los componentes de su pared celular.

La presente invención pretende proporcionar una composición capaz de modular las respuestas inmunes que se producen durante la colonización o la infección bacterianas e impedir o reducir cualquier respuesta inflamatoria inducida por ellas en el tracto gastrointestinal, en los huesos, piel, ojos, pulmones, oídos y cavidad oral de humanos o de animales.

Resumen de la invención

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico como ingrediente activo, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332 según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

Esta composición que contiene al ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332, puede mantener la homeostasis inmune, impedir o reducir los procesos inflamatorios inducidos por bacterias Gram-negativas y/o los trastornos mediados por el LPS. Puede utilizarse también contra trastornos mediados por bacterias Gram-positivas patógenas o potencialmente patógenas y/o por el LTA.

De hecho, se ha encontrado que hay un efecto antagonista del LTA de cepas de bacterias de ácido láctico, por ejemplo la cepa de Lactobacillus johnsonii La1 y la cepa de Lactobacillus acidophilus La10, por ejemplo, en la capacidad de respuesta de las IEC que han tenido contacto con LPS purificados de E. coli y Salmonella enteridis o con bacterias E. coli enteras. Además, cuando se administra el LTA de cepas de Lactobacillus junto con el LPS en presencia de leche humana, entonces se inhibe la producción de IL-8 mediada por LPS-sCD14.

Dicha composición puede ser un medicamento, un producto cosmético, dermatológico u oftalmológico de aplicación oral o tópica, una composición alimentaria o una composición de pienso para animales de compañía. Tiene efectos en los procesos inflamatorios asociados con la enfermedad mediada por bacterias o con los trastornos mediados por el LPS del tracto gastrointestinal, los huesos, la piel, los ojos, los pulmones, los oídos o la cavidad bucal y puede utilizarse para modular la colonización bacteriana de los tejidos recién mencionados y las respuestas inmunes.

Cuando se administra por vía oral, el ácido lipoteicoico de la invención puede utilizarse para mantener la homeostasia inmune, modular la colonización bacteriana o dirigirse contra la enfermedad e infección mediada por bacterias o contra la enfermedad mediada por LTA/LPS, no solo en el tracto gastrointestinal sino también en los huesos, la piel, los ojos, los oídos, los pulmones y la cavidad oral.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona el uso de la reivindicación 5. El ácido lipoteicoico puede utilizarse para la fabricación de un medicamento, un producto tópico, por ejemplo una crema o una loción, una composición alimentaria o de pienso para animales de compañía para disminuir el proceso inflamatorio asociado con una enfermedad mediada por bacterias o por trastornos mediados por LTA/LPS en seres humanos o en animales.

En una forma de ejecución, el uso se dirige a preparar una composición, que es un componente de una comida equilibrada desde el punto de vista nutritivo.

En una forma preferida de ejecución, el componente se incluye en formulación seca o húmeda de pienso para animales de compañía.

En un último aspecto, la invención se refiere a una formulación de pienso para animales de compañía, que contiene una comida equilibrada desde el punto de vista nutritivo y un ingrediente activo elegido por su capacidad de modular una respuesta inmune inducida en el animal de compañía por una cepa de bacteriana Gram-negativa, por una cepa bacteriana Gram-positiva potencialmente patógena y/o un derivado del mismo.

En una forma de ejecución, el ingrediente activo contiene un microorganismo que tiene LTA. El LTA está presente con preferencia en la pared celular de dicho microorganismo.

El microorganismo es con preferencia un probiótico capaz de adherirse de forma transitoria al epitelio intestinal de un animal de compañía que lo ingiera. en una forma preferida de ejecución, el microorganismo es una bacteria de ácido láctico.

Una ventaja de la presente invención es que proporciona un medio para regular las respuestas inmunes a organismos Gram-negativos, organismos Gram-positivos patógenos o potencialmente patógenos o de sus LPS o LTA derivados, en particular un medio para reducir los procesos inflamatorios como son la producción de citoquinas proinflamatorias del tipo IL-8, TNF-\alpha y la proteína ENA-78, activadora de neutrófilos y derivada de células epiteliales por parte de las IEC.

Otra ventaja de la presente invención es que proporciona un medio para regular en sentido menguante la respuesta inflamatoria de macrófagos, por ejemplo, mediante la disminución de la liberación de citoquinas proinflamatorias, como son la IL-8 o el TNF-\alpha.

Otra ventaja más de la presente invención es que, por simple consumo de una composición alimentaria según la presente invención, puede mejorarse el proceso inmunoprotector y reducirse el riesgo de inflamación e infección perjudiciales. Se apreciará que la administración intravenosa o subcutánea de un fármaco requiere habilidad y experiencia y, si se compara con la administración oral, no es segura, conveniente ni aceptable para el paciente. Tomando estos temas en consideración, la invención proporciona la ventaja manifiesta de un producto nutritivo y/o terapéutico, que puede administrarse por vía oral.

Además, la presente invención utiliza el LTA de especies bacterianas de calidad alimentaria y por ello tiene la categoría GRAS (Generally Regarded As Safe) y proporciona algunos de los beneficios atribuidos a los organismos probióticos. Por tanto, la presente invención puede utilizarse en medicamentos estériles, composiciones enterales o tópicas para tratar trastornos clínicos o infecciones, en los que no sea posible el uso de organismos probióticos vivos.

Descripción detenida

En la siguiente descripción se han empleado las siguientes abreviaturas: ENA-78, proteína 78 activadora de neutrófilos, derivada de células epiteliales; HM, leche humana; IEC, células epiteliales intestinales; IL, interleucina; LPS, lipopolisacárido; LTA, ácido lipoteicoico; mAb, anticuerpo monoclonal; PBMC, células mononucleadas de sangre periférica; PRR, receptores de reconocimiento patrón; TNF, factor de necrosis tumoral.

Finalmente, "NCC" significa Nestlé Culture Collection (centro de investigación de Nestlé en Verschez-les-Blanc, Lausana, Suiza).

Según un primer aspecto se refiere a una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332, para modular respuestas inmunes, en particular procesos inflamatorios inducidos por bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas potencialmente patógenas y/o sus derivados.

Tales procesos inflamatorios pueden inducirse con bacterias Gram-negativas y/o su LPS de bacterias Gram-negativas, por ejemplo la Escherichia ssp., Helicobacter spp., Samonella spp.; pueden inducirse también con bacterias Gram-positivas patógenas o potencialmente patógenas, es decir, bacterias que, en ciertas condiciones, pueden convertirse en patógenas.

El ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332, se fija al CD14 e induce la liberación de citoquinas proinflamatorias, como son la IL-8 o el TNF-\alpha, de las IEC. El ácido lipoteicoico debería contener su resto lípido.

Las cepas Lactobacillus johnsonii NCC 533, Lactobacillus acidophilus NCC 90, se han depositado por ejemplo en el Instituto Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris Cédex 15, Francia, con fechas 30.06.92 y 12.10.99, respectivamente, con los números de depósito CNCM I-1225 y CNCM I-2332, respectivamente.

En una forma especialmente preferida de ejecución, el LTA de bacterias de ácido láctico puede utilizarse en combinación con moléculas del tipo sCD14.

El ácido lipoteicoico y/o las bacterias de ácido láctico, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332, que lo producen y/o su líquido sobrenadante de cultivo, pueden incorporarse a composiciones alimentarias secas o húmedas o a alimentos enterales, para la nutrición infantil, para la nutrición de animales de compañía y para piensos de animales, para la nutrición clínica o para aplicaciones farmacéuticas.

Puede utilizarse también para aplicaciones cosméticas o dermatológicas en forma de preparaciones tópicas (cremas y ungüentos) o para aplicaciones orales, oftálmicas (lavados oculares) o aplicaciones orales (colutorios, pastas dentífricas). El LTA podría emplearse para impedir infecciones de oído. El LTA puede utilizarse además en productos destinados a impedir trastornos óseos mediados por el LPS.

Por consiguiente, dicha composición puede ser un medicamento, una preparación oral o una preparación cosmética tópica, dermatológica u oftalmológica; una composición alimentaria o una composición de pienso para animales de compañía.

La cantidad de ácido lipoteicoico a utilizar puede variar, pero podría ajustarse a los niveles de bacterias en una composición alimentaria, que puede variar entre 10^{5} cfu/g y 10^{11} cfu/g, con preferencia especial aproximadamente entre 10^{7} cfu/g y 10^{9} cfu/g. En el caso de una preparación farmacéutica, la cantidad de LTA puede variar y ajustarse a la cantidad de bacterias, que varía entre 10^{5} cfu/g 6 10^{16} cfu/g, con preferencia aproximadamente entre 10^{7} cfu/g y 10^{10} cfu/g.

Tiene efectos en procesos inflamatorios asociados con enfermedades mediadas por bacterias o en trastornos mediados por LTA/LPS en el tracto gastrointestinal, en huesos, en la piel, en los ojos, en los oídos, en los pulmones y en la cavidad bucal.

Más en concreto, estos productos podrían modificar la colonización bacteriana y la infección durante el período neonatal y, de este modo, la competencia inmune del bebé y en la nutrición clínica podrían utilizarse para tratar la sepsis, la translocación bacteriana, la inflamación, la infección y enfermedades de crecimiento bacteriano excesivo.

En una forma preferida de ejecución, la composición puede ser un alimento o un pienso para animales de compañía, completos y nutritivamente equilibrados. Puede ser también, por ejemplo, un suplemento dietético.

Si se prepara una composición alimentaria para consumo humano, esta puede ser una fórmula nutritivamente completa, un producto lácteo, una bebida refrigerada o estable al almacenaje, una sopa, un suplemento dietético, un sucedáneo alimentario, una barra nutritiva o un producto de confitería.

Aparte del ácido lipoteicoico y/o de las bacterias de ácido láctico que lo producen, dichas bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCMI-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332 y/o su líquido sobrenadante de cultivo, según la invención, la fórmula nutritiva puede contener una fuente de proteínas. Las proteínas dietéticas se utilizan con preferencia como fuentes de proteínas. Las proteínas dietéticas pueden ser cualquier proteína dietética adecuada; por ejemplo las proteínas animales (tales como las proteínas lácticas, proteínas de la carne y proteínas de los huevos); proteínas vegetales (por ejemplo proteínas de soja, proteínas de trigo, proteínas de arroz y proteínas de guisantes); mezclas de aminoácidos libres; o combinaciones de las mismas. Son preferidas en especial las proteínas de la leche, por ejemplo la caseína, las proteínas del suero y las proteínas de soja. Las composiciones pueden contener además una fuente de hidratos de carbono y una fuente de grasa.

Si la fórmula nutritiva incluye una fuente de grasa, la fuente de grasa proporciona con preferencia del 5% al 55% de de la energía de la fórmula nutritiva; por ejemplo del 20% al 50% de la energía. Los lípidos que conforman esta fuente de grasas pueden ser cualquier grasa idónea o mezcla de grasas. Son especialmente indicadas las grasas vegetales; por ejemplo el aceite de soja, el aceite de palma, el aceite de coco, el aceite de cártamo, el aceite de girasol, el aceite de maíz, el aceite de canola, las lecitinas y similares. Pueden añadirse también, si se desea, grasas animales, por ejemplo grasas de la leche.

Puede añadirse a la fórmula nutritiva una fuente de hidratos de carbono. Esta proporciona con preferencia del 40% al 80% de de la energía de la composición nutritiva. Puede utilizarse cualquier hidrato de carbono adecuado, por ejemplo la sucrosa, lactosa, glucosa, fructosa, sólidos de jarabe de maíz y maltodextrinas, y mezclas de los mismos. Pueden añadirse también, si se desea, fibras dietéticas. Si se emplean, su cantidad aportará con preferencia el 5% de la energía de la fórmula nutritiva. Las fibras dietéticas pueden proceder de cualquier origen adecuado, incluidos por ejemplo la soja, los guisantes, la avena, la pectina, la goma guar, la goma arábiga y los fructooligosacáridos.

En la fórmula nutritiva pueden incluirse las vitaminas y los compuestos minerales apropiados, en una cantidad que cumpla las directrices correspondientes.

Pueden incorporarse a la fórmula nutritiva, si se desea, uno o más emulsionantes de calidad alimentaria; por ejemplo los ésteres de mono- y diglicéridos del ácido diacetil-tartárico, la lecitina y los mono- y diglicéridos. Pueden incluirse de igual manera sales y estabilizantes apropiados.

La fórmula nutritiva puede administrarse con preferencia por vía enteral; por ejemplo en forma de polvo, tableta, cápsula, un concentrado líquido, un producto sólido o una bebida lista para el consumo. Si se desea producir una fórmula nutritiva en polvo, se transfiere la mezcla homogeneizada a un aparato apropiado de secado, por ejemplo un secador de pulverización o un secador de congelación y se convierte en polvo.

En otra forma de ejecución, puede enriquecerse un producto alimentario usual por lo menos con un ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico según la presente invención. Por ejemplo, una leche fermentada, un yogurt, un queso fresco, una leche cuajada, un artículo de confitería, por ejemplo una leche dulce o edulcorada, una barra de confitería, copos o barras de cereales para el desayuno, bebidas, leches en polvo, productos basados en la soja, productos fermentados no lácteos o suplementos nutritivos para la nutrición clínica.

En otra forma de ejecución puede prepararse un pienso nutritivamente completo para animales de compañía. El pienso nutritivamente completo para animales de compañía puede presentarse en cualquier forma idónea; por ejemplo en forma seca, semihúmeda o húmeda; puede ser un producto alimenticio para animales de compañía que necesite refrigeración o que pueda guardarse en estantería. Estos productos para animales de compañía pueden producirse de manera convencional. Aparte del ácido lipoteicoico según la invención, estos piensos para animales de compañía pueden incluir una o más fuentes de hidratos de carbono, una fuente de proteínas y una fuente de lípidos.

Puede utilizarse cualquier fuente idónea de hidratos de carbono. La fuente de hidratos de carbono se proporciona con preferencia en forma de granos, harinas o almidones. Por ejemplo, la fuente de hidratos de carbono puede ser el arroz, la cebada, el sorgo, el mijo, la avena, la harina de maíz o la harina de trigo. Puede utilizarse también azúcares simples, como son la sucrosa, glucosa y los jarabes de maíz. La cantidad de hidratos de carbono proporcionados por la fuente de hidratos de carbono puede elegirse del modo que se desee. Por ejemplo, el pienso para animales de compañía puede contener hasta un 60% en peso de hidratos de carbono.

Las fuentes idóneas de proteínas pueden elegirse entre las fuentes idóneas animales o vegetales de proteínas; por ejemplo carne muscular o esquelética, harina de carne y hueso, harina de pollo, harina de pescado, proteínas lácteas, gluten de maíz, gluten de trigo, harina de soja, concentrados de proteína de soja, aislados de proteína de soja, proteínas de huevo, suero, caseína, gluten y similares. La cantidad de proteínas aportadas por la fuente de proteínas puede elegirse del modo que se desee. Por ejemplo, el pienso para animales de compañía puede contener del 12% al 70% en peso de proteínas, porcentaje referida a la base seca.

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El pienso para animales de compañía puede contener una fuente de grasas. Puede utilizarse cualquier fuente de grasas, tanto de grasas animales como de grasas vegetales. La fuente de grasas es con preferencia una fuente de grasas animales, por ejemplo el sebo. Pueden utilizarse también aceites vegetales, por ejemplo el aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de colza, aceite de soja, aceite de oliva y otros aceites ricos en ácidos grasos monoinsaturados o poliinsaturado. Además de los ácidos grasos esenciales (ácido linoleico y ácido alfa-linoleico), la fuente de grasas pueden incluir ácidos grasos de cadena larga. La cantidad de grasas aportada por la fuente de grasas puede elegirse del modo que se desee. Por ejemplo, el pienso para animales de compañía puede contener del 5% al 40% en peso de grasas, porcentaje referido a la base seca. El pienso para animales de compañía tiene con preferencia una cantidad relativamente reducida de grasas.

El pienso para animales de compañía puede contener otros ingredientes activos, por ejemplo ácidos grasos de cadena larga. Los ácidos grasos de cadena larga idóneos incluyen al ácido alfa-linoleico, ácido gamma-linoleico, ácido linoleico, ácido eicosapentanoico y ácido docosahexanoico. Los aceites de pescado son una fuente idónea de ácido eicosapentanoico y de ácido docosahexanoico. Son fuentes idóneas del ácido gamma-linoleico el aceite de borraja, el aceite de grosella negra y el aceite de onagra. Son fuentes idóneas de ácido linoleico los aceites de cártamo, aceites de girasol, aceites de maíz y aceites de soja.

La elección de las fuentes de los hidratos de carbono, de las proteínas y de los lípidos no es crítica y se podrá elegir en base a las necesidades nutritivas de los animales, de las consideraciones de palatabilidad y del tipo de producto fabricado. Además, si se desea, pueden incorporarse también al pienso para animales de compañía otros ingredientes diversos, por ejemplo, azúcar, sal, especias, condimentos, vitaminas, sales minerales, agentes saborizantes, gomas, microorganismos prebióticos y probióticos.

Para los piensos secos para animales de compañía es idóneo un proceso de extrusión-cocción, aunque pueden utilizarse también la cocción en horno y otros procesos adecuados. Si se emplea la extrusión-cocción, el pienso seco para animales de compañía se presenta normalmente en forma de caldero (kibble). Si se emplea un prebiótico, entonces se puede mezclar el prebiótico con otros ingredientes del pienso seco para animales de compañía antes del procesado. Un proceso adecuado se describe en la solicitud de patente europea nº 0850569. Si se emplea un microorganismo probiótico, lo mejor es recubrir el organismo con o dentro del pienso seco para animales de compañía. Un proceso idóneo se describe en la solicitud de patente europea nº 0862863.

Para los piensos húmedos para animales de compañía, se puede recurrir a los procesos descritos en las patentes US 4,781,939 y 5,132,137 para fabricar productos simulados de carne. Pueden utilizarse otros procedimientos para fabricar productos de tipo troceado (chunk); por ejemplo la cocción en un horno de vapor. Como alternativa, pueden fabricarse productos de tipo pan (loaf) por emulsión de un material de carne adecuado para producir una emulsión de carne, adición de un agente gelificante apropiado y calentamiento de la emulsión de carne antes de envasarla en latas o en otros recipientes.

Se facilitan los siguientes ejemplos a título meramente ilustrativo, que de modo alguno deberían considerarse como limitadores del alcance del objeto de la presente solicitud. Los porcentajes y las partes son en peso, a menos que se indique lo contrario. A los ejemplos se antepone una breve descripción de las figuras.

Figura 1. Efecto del LTA de la cepa La1 del L. johnsonii y de la cepa La10 del L. acidophilus en la liberación de la IL-8 por parte de las células HT29 tratadas con LPS purificado de E. coli. Se determina la producción de la IL-8 por ensayo ELISA en líquidos sobrenadantes de células HT29 incubadas durante 24 horas en un medio suplementado con un 2% de leche humana (HM) en presencia de LPS de E. coli a razón de 10 ng/ml (\bullet) o 100 ng/ml (\sqbullet) y cantidades variables de LTA de La1 (A) o de La10 (B). Se representa la activación de las células HT29 por el LPS-HM solo en forma de líneas de guiones. Las barras de error indican la desviación estándar (SD). Estos resultados son representativos de tres ensayos independientes.

Figura 2. Efecto del LTA de la cepa La1 del Lactobacillus en la liberación de la IL-8 por parte de las células HT29 tratadas con el LPS de la Sal. enteridis o con bacterias E. coli enteras. Se determina la producción de la IL-8 por ensayo ELISA en líquidos sobrenadantes de células HT29 incubadas durante 24 horas en un medio suplementado con un 2% de leche humana (HM) y con LPS de Salmonella enteridis (A) a razón de 10 ng/ml (\bullet) o 100 ng/ml (\sqbullet) o 2,5 x10^{5}/ml de bacterias E. coli enteras (B) en presencia de cantidades variables de LTA de La1. La activación de las células HT29 en ausencia del LTA se representa mediante líneas de guiones. Las barras de error indican la SD.

Figura 3. Efecto del LTA de la cepa La1 y de la La10 del Lactobacillus en la liberación del TNF-\alpha por parte de las células HT29 tratadas con LPS de E. coli. Se determina la producción del TNF-\alpha mediante un ensayo ELISA en líquidos sobrenadantes de células HT29 incubadas durante 24 horas en un medio suplementado con un 2% de leche humana (HM) en presencia del PS de E. coli a 100 ng/ml y cantidades variables de LTA de La1 (\sqbullet) o de La10 (\bullet). La activación de las células HT29 en ausencia del LTA se representa mediante líneas de guiones. Las barras de error indican la SD.

Figura 4. Efecto del LTA de la cepa La1 del Lactobacillus en la inducción del LPS de la expresión del mRNA de ENA-78 en las células HT29. Se evalúa la expresión del ENA-78 por una reacción RT-PCR del RNA total de células HT29 tratadas con 100 ng/ml de LPS de E. coli en ausencia (pista 1) o en presencia de un 2% de leche humana (pistas de 2 a 6) y la adición del mAb MY4 anti-CD14 (pista 3); control con anticuerpo marcado con isotipo (pista 4); o el LTA de la cepa La1 a razón de 1 g/ml (pista 5) o de 50 g/ml (pista 6). El tamaño del producto esperado de la PCR para los transcritos de ENA-78 es de 220 bp. Como patrón interno se emplean bandas amplificadas de la \beta-actina (460 bp) como genes de referencia (house-keeping). SM significa marcador de tamaño.

Figura 5. Efecto del LTA de la cepa La1 y de la La10 del Lactobacillus en la liberación de la IL-8 por parte de células HT29 diferenciadas, tratadas con LPS de E. coli. Se determina la producción de la IL-8 por ensayo ELISA en líquidos sobrenadantes de células HT29 diferenciadas incubadas durante 24 horas en un medio suplementado con un 2% de leche humana (HM) en presencia de LPS de E. coli a razón de 100 ng/ml y las cantidades indicadas de de LTA de la cepa La1 de Lactobacillus (\sqbullet) o la cepa La10 (\bullet). La activación de células HT29 diferenciadas en ausencia de adición de LTA se representa mediante líneas de puntos.

Figura 6. Efecto del LTA de la cepa La1 del Lactobacillus en la activación de las PBMC humanas. (A) Se incuban células PBMC humanas recién aisladas (2 x 10^{5} células/hoyo) en medio RPMI suplementado con un 1% de suero humano en presencia de cantidades variables de LPS de E. coli LPS (\ding{115}) o LTA de la cepa La1 (\bullet). (B) y (C) Se incuban las células PBMC a 37ºC durante 30 min en ausencia (líneas de guiones) o en presencia (líneas continuas) de cantidades variables de LTA de la cepa La1 antes de la adición del LPS de E. coli (1 ng/ml). Después de una incubación de 24 horas se recogen los líquidos sobrenadantes de los cultivos y se analizan para determinar la presencia de IL-8 (A) y (B), o de TNF-\alpha (C) mediante un ensayo ELISA específico. Las barras de error indican la SD.

Figura 7. Efecto de la desacilación de los LTA en su actividad antagonista. Se tratan las células HT29 con LPS de E. coli (100 ng/ml) en un medio suplementado con un 2% de leche humana (HM) en ausencia (líneas de guiones) o en presencia (líneas continuas) de cantidades variables de LTA nativo (\sqbullet) o de LTA desacilado (\bullet) purificado a partir de la cepa La1 (A) o de la La10 (B). Después de 24 horas, se determina la liberación de la IL-8 en los líquidos sobrenadantes de los cultivos mediante un ensayo ELISA.

Figura 8. Efecto de la pre-incubación de las células con LTA y sCD14 o bien con LTA y LPS en el antagonismo. (A) Se preincuban las células HT29 durante 4 horas con LTA de la cepa La1 (50 y 100 g/ml) en presencia de un 2% de leche humana (HM), se lavan dos veces con medios exentos de suero y después se tratan durante 20 horas con LPS de E. coli (100 ng/ml) en ausencia o en presencia de HM. (B) Se incuban las células HT29 con LTA de la cepa La1 (1, 10 y 50 g/ml) en presencia de leche humana (HM) durante 4 horas antes de la adición del LPS de E. coli (100 ng/ml). (C) Se incuban las células HT29 con LTA de la cepa La1 (1, 10 y 50 g/ml) en presencia de LPS de E. coli (100 ng/ml) durante 4 horas antes de la adición de un 2% de leche humana (HM). (D) Se tratan las células HT29 con LPS de E. coli (100 ng/ml) en presencia de un 2% de leche humana (HM) durante 4 horas antes de la adición del LTA de la cepa La1 (1, 10 y 50 g/ml). Se determina la liberación de la IL-8 en los líquidos sobrenadantes después de un total de 24 horas de cultivo mediante un ensayo ELISA. Las barras de error indican la SD.

Ejemplo 1

Los ácidos lipoteicoicos de la cepa NCC 533 de Lactobacillus johnsonii y de la cepa NCC 90 de Lactobacillus acidophilus antagonizan la respuesta de las células epiteliales del intestino humano frente al LPS o a las bacterias Gram-negativas.

Materiales y métodos Células, medios y reactivos

La línea celular HT29 de adenocarcinoma de colon humano se obtiene de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ATCC: HTB-38). Se mantienen las células no diferenciadas en medio DMEM que contiene glucosa, suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FCS; Amimed BioConcept, Allschwill, Suiza) a 37ºC en un incubador con un 5% de CO_{2}/aire, mientras que las células diferenciadas se cultivan en un medio exento de glucosa. Se cambia el medio de cultivo cada 2 días hasta que las monocapas celulares alcanzan una confluencia del 90%. Se aíslan las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) humana de sangre heparinizada de donantes adultos sanos mediante una centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Isopaque (Pharmacia). Se lavan las células PBMC aisladas tres veces y se suspenden de nuevo en un medio RPMI 1640 (Life Technologies, dirección) suplementado con un 1% de FCS. Se adquieren los LPS de las cepas de E. coli y Salmonella enteritidis a la empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se adquiere el anticuerpo monoclonal murino MY4 anti-CD14 (IgG2b) a la empresa Coulter (Instrumentation Laboratory AG, Suiza).

El mAb de control marcado con isotipo es un IgG2b de ratón (kappa), derivado de las MOPC 141 (Sigma). La leche humana se obtiene de madres sanas. Se obtienen las muestras en el período de 70 días después del parto mediante la extracción con bomba de la leche del pecho, recogida en tubos estériles de centrifugación y procesado en un período de 2 horas después de la recogida. Después de la centrifugación a 200 x g durante 30 min se congela a -80ºC la fracción acelular libre de lípidos y se guarda hasta el momento de su utilización.

Aislamiento y purificación de los LTA

Se aíslan los LTA de la cepa La1 de Lactobacillus johnsonii NCC 533 y de la cepa La10 de Lactobacillus acidophilus NCC 90 con arreglo al método de Fischer y col. (Fischer, W. y col., Eur. J. Biochem. 133, 523-530, 1983). En resumen: se cultivan las bacterias durante una noche en un caldo MRS, se recolectan y se suspenden de nuevo en un acetato sódico 0,1 M de pH 4,5 a razón de 800 mg de peso húmedo/ml de tampón. Después se desengrasan por mezclado con dos volúmenes de metanol y un volumen de cloroformo a temperatura ambiente durante una noche. Se recuperan por filtración las bacterias desengrasadas, se lavan con dos volúmenes de metanol y se suspenden de nuevo en acetato sódico 0,1 M de pH 4,7 en una concentración de 500 mg de bacterias por ml de tampón. Se mezcla esta suspensión con un volumen igual de fenol acuoso caliente del 80% p/v y se agitan continuamente durante 45 minutos en un baño de agua a 65ºC. Después de enfriar se centrifuga la emulsión que se ha formado a 5000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Se dializa a fondo la capa acuosa superior con acetato sódico 0,1 M de pH 5 (corte en 6-8 kDa). Se digieren los ácidos nucleicos con 30 U/ml de DNAsa I (Sigma), 9 U/ml de ribonucleasa A (Sigma) en MgSO4 5 mM, EDTA disódico 40 mM y NaN3 0,2 mM (24 h a temperatura ambiente) con 1 ml de tolueno que se añade para prevenir la contaminación microbiana. Se dializa el material digerido una vez más frente a acetato sódico 0,1 M de pH 4,7 y se ajusta al 15% con 1-propanol. Se introduce en una columna de Octyl-Sepharose equilibrada en acetato sódico 0,1 M más un 15% de 1-propanol, con un caudal de 0,1 ml/minuto. Se recogen fracciones de 5 ml. Se realiza la elución del LTA con un gradiente de 1-propanol del 15 al 80% en el mismo tampón, con un caudal de 0,5 ml/minuto. Se recogen fracciones de 3 ml. Se efectúa el seguimiento de la concentración del 1-propanol midiendo el índice de refracción. Se analiza el contenido de azúcares neutros totales de cada fracción (Dubois, M.A. y col., Colorimetric method for determination of sugars and related substances; Anal. Chem. 28, 350-356), de fósforo (Chen, P.S. y col., Microdetermination of phosphorus; Anal. Chem. 28, 1756-1758, 1956), ácidos nucleicos e índice de refracción. Se concentran los picos con un evaporador rotatorio para eliminar el propanol, después se dializan a fondo con agua. Después de la concentración se añade acetato sódico 0,1 M de pH 4,7, CaCl_{2} y MgCl_{2} 1 mM y se congelan partes alícuotas a -20ºC. Se verifica la actividad antigénica del LTA de la cepa La1 mediante un ensayo ELISA del modo que se ha descrito recientemente (Granato, D. y col., Appl. Environ. Microbiol. 65, 1071-1077, 1999). Se efectúa la desacilación del modo descrito por Teti y col. (Teti, G. y col., Infect. Immun. 55, 3057-3064, 1987).

Ensayo de lisado de Limulus amoebocyte

Se ensayan todos los reactivos, a los que se exponen las células, para determinar la contaminación de endotoxina mediante en ensayo cinético turbidimétrico de coagulación de lisado de Limulus amoebocyte (ensayo E-Toxate®). El ensayo tiene una sensibilidad de 0,05-0,1 unidades de endotoxina (E. coli 0,55:B5 LPS) por ml. Se encuentra que los diferentes medios empleados en este estudio son inactivos o contienen <50 pg/ml de endotoxina.

Tratamiento de las células

Se extienden las células HT29 en placas de 96 hoyos de fondo plano a razón de 10^{4} células/hoyo. Después de una incubación de 5 días se lavan las células HT29 dos veces con un medio sin suero, después se les añade leche humana, LPS y/o LTA en 200 \mul de DMEM. En algunos hoyos, se introducen también anticuerpos monoclonales anti-CD14 en una concentración final de 20 \mug/ml. En otros ensayos se suspenden las PBMC en un medio RPMI 1640 con un 1% de FCS y después se extienden en placas de 96 hoyos de fondo plano en una concentración de 2 x 10^{5} células/hoyo. Después se incuban las células con LTA a 37ºC durante 30 min y a continuación se estimulan con LPS.

Después de 24 h de incubación a 37ºC se recogen los líquidos sobrenadantes se almacenan a -20ºC para la posterior determinación de su contenido de citoquinas. Se examina la viabilidad celular empleando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics), que mide la actividad de la lactato-deshidrogenasa (LDH) liberada por el citosol de células dañadas dentro del líquido sobrenadante.

Concentraciones de IL-8 y TNF-\alpha en los líquidos sobrenadantes de los cultivos

Con un ensayo ELISA se determinan las cantidades de la IL-8 generada en los líquidos sobrenadantes de los cultivos celulares. En resumen, se recubre con anticuerpos monoclonales contra la IL-8 (2 g/ml, ImmunoKontakt, Bioggio, Suiza) las placas de 96 hoyos (Nunc) y se mantienen en incubación a 4ºC durante una noche. Después se lavan las placas dos veces con Tween-20 al 0,05% en PBS. Se bloquea la incubación no específica por incubación de las placas con FCS al 10% en PBS a temperatura ambiente durante 2 h más. A continuación se añaden las muestras o las concentraciones estándar de citoquinas recombinantes (de 15,625 a 2000 pg/ml, ImmunoKontakt) en FCS-PBS y se incuban a temperatura ambiente durante 3 h. Después se lavan las placas 4 veces con PBS-Tween y a continuación se les añade el anticuerpo monoclonal anti-IL-8 humana marcado con biotina (1 \mug/ml, ImmunoKontakt) y se incuban a temperatura ambiente durante una hora más. Después de 4 lavados se añade la estreptavidina-peroxidasa (0,5 \mug/ml, KPL, Bioreba, Reinach, Suiza) y se mantiene a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavan las placas otra vez y se añade el sustrato (TMB-peroxidasa, KPL) durante 10-30 min. Se interrumpe la reacción enzimática con la adición de HCl 1N. Se lee la absorbancia a 450 nm en un lector ELISA (Dynex Technologies). El límite de la detección se sitúa aproximadamente en 30 pg/ml. Se miden las cantidades de TNF-\alpha liberado en los líquidos sobrenadantes de los cultivos celulares mediante un kit ELISA, que es un producto comercial (R&D Systems).

Reacción en cadena de polimerasa y transcripción inversa (RT-PCR) para la amplificación del activador neutrófilo epitelial (ENA)-78

Se extrae el RNA celular total de las células HT29 de las placas de cultivo empleando el método Trizol (GIBCO-BRL). Se somete el RNA aislado de células epiteliales intestinales a transcripción inversa con transcriptasa inversa de virus de leucemia murina Moloney (Perkin-Elmer, dirección). En resumen, se incuban muestras de RNA (0,5 \mug de RNA total), 0,5 unidades de inhibidor de RNasa, 1 mM de cada dNTP, 0,5 nmoles/ml de cebador 3' específico, 5 mM de MgCl_{2} y 1,25 unidades de transcriptasa inversa en un volumen total de 10 \mul de mezcla reaccionante que contiene el tampón de enzima suministrado por el fabricante.

Se incuba la mezcla reaccionante a 42ºC durante 30 min y después se calienta a 95ºC durante 5 min. Los productos transcritos inversamente se amplifican seguidamente en un termociclador (Biolabo, Scientific Instruments, Chatel St. Denis, Suiza) con Gold DNA-polimerasa (Perkin Elmer). Se efectúa la reacción PCR en un volumen total de 50 \mul empleando 10 \mul de los productos transcritos inversamente en tampón de PCR, 2 mM MgCl_{2}, 5 M de cada dNTP, 0,2 nmoles/ml de ambos cebadores 3' antisentido y 5' sentido específicos de la ENA-78 (CGTTCTCAGGGAGGCTC y TCCTTCGAGCTCCTTGTG, respectivamente (ver Keates y col., Am. J. Physiol. 273, G75-G82, 1997) y 1,25 unidades de DNA-polimerasa. Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 min se amplifican las muestras mediante 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 s, fusión a 60ºC durante 1 min y extensión a 72ºC durante 1 min 30 s, seguidos por un paso de extensión a 72ºC durante 7 min. Todas las muestras se someten a RT-PCR de la \beta-actina como control positivo. Se introducen las muestras de los productos de la RT-PCR en geles de agarosa del 1,2% (que contienen bromuro de etidio) en tampón TAB y se separan por electroforesis a 150 V durante 1 h. Se visualizan los productos de la RT-PCR con luz UV. El tamaño correcto de las bandas se determina por comparación con marcadores de tamaño de DNA (Boehringer Mannheim).

Resultados

Los LTA de las especies Lactobacillus inhiben la liberación de la IL-8, TNF-\alpha y ENA-78 inducida por la E. coli o el LPS por parte de las células HT29.

Hemos examinado si las bacterias Gram-positivas o sus derivados pueden estimular también a las células HT29 del epitelio intestinal humano. Se incuban diferentes organismos Gram-positivos con células HT29 en presencia o ausencia de leche humana como fuente de sCDl4. A diferencia de la E. coli, las bacterias Gram-positivas L. sakei, L. casei, la cepa L10 de L. acidophilus y la cepa La1 de L. johnsonii así como el Staphilococcus aureus y el Staphilococcus epidermidus son incapaces de estimular la liberación de la IL-8 por parte de las células HT29, incluso en presencia de sCD14. Además, no se observa secreción de IL-8 cuando se añaden el LTA de la La1, La10 o del Staphilococcus aureus en concentraciones de hasta 100 \mug/ml.

Dado que se sabe que el sCD14 reconoce a los componentes de las bacterias tanto Gram-negativas como y Gram-positivas, hemos estudiado si los componentes de organismos Gram-positivos, por ejemplo el LTA, pudieran antagonizar el efecto de las bacterias Gram-negativas en las células HT29. A tal fin se tratan las células HT29 con LPS (10 y 100 ng/ml) en presencia o ausencia de leche humana como fuente de sCD14, y varias cantidades de LTA procedentes de la cepa La1 (Fig. 1A) o de la La10 (Fig. 1B). Como era de esperar, las células HT29 expuestas a 10 o 100 ng/ml de LPS de E. coli en presencia de sCD14 liberan cantidades significativas de la IL-8 (Fig. 1, líneas de puntos). La adición del LTA de la cepa La1 (Fig. 1A, líneas continuas) o de la La10 (Fig. 1B, líneas continuas) provoca una disminución acusada de la secreción de la IL-8 inducida por el LPS. Esta actividad inhibidora es dependiente de la dosis, observándose la inhibición completa cuando se utiliza un exceso de 100 a 1000 veces mayor de LTA. Para confirmar que la actividad inhibidora del LTA es un fenómeno general, se estudia la actividad antagonista del LTA en la respuesta de las células HT29 a otra fuente de LPS. Tal como se representa en la fig. 2A, el LTA de la cepa La1 inhibe la secreción de la IL-8 por parte de las células HT29 tratadas con 10 o 100 ng/ml de LPS de Salmonella enteridis. Además, el LTA de la cepa La1 antagoniza el efecto la E. coli entera-sCD14 en las células HT29 (Fig. 2B).

Tal como se representa en la fig. 3, tanto el LTA de la cepa La1 y como el de la cepa La10 inhiben también la liberación del TNF-\alpha inducido por el LPS de la E. coli por parte de las células HT29. Además, la expresión del mRNA de la ENA-78 inducida por el LPS se inhibe también de forma acusa por el LTA de la cepa La1 (fig. 4). Cabe notar que las actividades inhibidoras observadas de los LTA de Lactobacillus no se deben a un efecto citotóxico de las preparaciones de LTA en las células HT29, ya que no se consigue detectar una liberación significativa de LDH en líquidos sobrenadantes de cultivos (datos no presentados).

LTA de la cepa La1 y de la cepa La10 inhiben la liberación de la IL-8 inducida por el LPS por parte de células HT29 diferenciadas

Tal como se representa en la fig. 5, las células HT29 diferenciadas, tratadas con 10 ng/ml de LPS de E. coli en presencia de leche humana, liberan cantidades significativas de la IL-8 (línea de puntos). Igual que antes, el LTA de la cepa La1 o de la cepa La10 (líneas continuas) provoca una disminución de esta secreción en función de la dosis. Se observa la inhibición completa en un exceso de 5000 veces del LTA.

El LTA de la cepa La1 inhibe la estimulación de monocitos humanos por el LPS

Un gran número de LTA interaccionan con CD14 fijados a membranas de monocitos y macrófagos de la sangre y estimulan la secreción de varias citocinas. Por consiguiente, hemos analizado la secreción de la IL-8 y del TNF-\alpha en las células PBMC expuestas a los LTA de Lactobacillus. Las células PBMC se incuban en presencia de cantidades crecientes de LTA de Lactobacillus (de 100 a 10000 ng/ml) durante 30 min y después se les añaden el LPS de la E. coli en una concentración de 1 ng/ml. Tal como se representa en la fig. 6, cuando se administra solo, el LTA de la cepa La1 estimula la secreción de la IL-8 en concentraciones de 5 \mug/ml o más (fig. 6A), sin embargo, no se observa estimulación de la liberación del TNF-\alpha en ninguna de las concentraciones ensayadas. Además, el LTA de la cepa La1 tiene solamente un débil efecto antagonista en la secreción de la IL-8 inducida por el LPS en las células PBMC (fig. 6B), pero inhibe de forma más significativa la secreción del TNF-\alpha inducida por el LPS en de una manera que depende de la dosis (fig. 6C). El LTA de la cepa La10, solo o con LPS, no tiene un efecto significativo en la producción de la IL-8 ni del TNF-\alpha.

La actividad biológica del LTA desacilado

La desacilación del LTA se traduce en una pérdida de la actividad biológica celular. Esto implica que el resto lípido del LTA es crítico para la actividad inmunomoduladora. Por ello hemos examinado el efecto de la desacilación de los LTA en su efecto antagonista del LPS en nuestros modelos celulares. Tal como se representa en la fig. 7, la actividad antagonista del LTA de la cepa La1 (fig. 7A) y de la cepa La10 (fig. 7B) frente a la inducción de la IL-8 por el LPS-sCD14 en las células HT29 es significativamente más débil después de la desacilación. Por consiguiente, la actividad antagonista de los LTA de Lactobacillus en nuestro sistema celular está también mediada por el resto lípido.

Rol de las interacciones sCD14-LTA en la inhibición de los efectos LPS-sCDl4

Con el fin de comprender la manera en la que el LTA puede ejercer su efecto antagonista en bacterias Gram-negativas se realizan diferentes procedimientos de tratamiento, en los que las células HT29 se preincuban con LTA de la cepa La1 y con sCD14 de leche humana o con LPS de E. coli. Cuando se preincuban las células HT29 durante 4 horas con el LTA de la cepa La1 (50 y 100 \mug/ml) con o sin leche humana, se lavan dos veces con un medio libre de suero y después se tratan con LPS (100 ng/ml) durante 20 horas en presencia de leche, entonces no se elimina la secreción de la IL-8 (fig. 8A). Sin embargo, cuando se preincuban las células durante 4 horas con LTA de la cepa La1 (de 1 a 50 \mug/ml) en presencia de sCD14, y a continuación, sin lavado, se tratan durante 24 horas con LPS (100 ng/ml), entonces el nivel de la producción de la IL-8 es simular al obtenido cuando se incuban las células HT29 durante 24 horas con LTA, LPS y sCDl4 juntos (Fig. 8B). En la fig. 8C se representa el nivel de la producción de la IL-8 obtenida 24 horas después de la adición de la fuente de sCD14 a las células preincubadas durante 4 horas con el LTA de la cepa La1 (1-50 \mug/ml) y LPS (100 ng/ml). Este nivel es similar a la cantidad obtenida cuando las células HT29 se incuban durante 24 horas con la mezcla de LTA, LPS y sCD14. Se obtienen resultados similares cuando se preincuban las células durante 4 horas con LPS (100 ng/ml) y la fuente de CD14 después de la adición del LTA (fig. 8D).

Las IEC no se expresan en la CD14 de membrana y requieren la forma soluble para responder al LPS "in vitro" (Pugin, J. y col., PNAS 90, 2744-2748, 1993). Hemos demostrado con anterioridad que las bacterias Gram-negativas y el LPS median la producción de citoquinas proinflamatorias en las IEC a través de la acción de una sCD14 de la leche humana (Labeta, M.O. y col. J. Exp. Med. 191, 1807-1812, 2000). Sin embargo, las IEC no reaccionan frente a varias fuentes de LTA, a pesar de la presencia de sCD14. Dado que otros estudios sugieren que la fijación del LTA a las membranas de las células eucariotas requiere restos de ácidos grasos y dado que las proteínas de fijación de ácidos grasos se expresan únicamente en las IEC diferenciadas de la porción superior de las vellosidades intestinales, hemos examinado también los efectos de LTA-leche en las células HT29 diferenciadas. De modo interesante, los LTA no consiguen provocar respuesta alguna, mientras que los LTA de la cepa La1 de L. johnsonii y de la cepa La10 de L. acidophilus son capaces de estimular la liberación de la IL-8 de los monocitos de la sangre.

Estos resultados constituyen un apoyo adicional a la condición probiótica de la cepa La1 del L. johnsonii y de la cepa La10 del L. acidophilus y sugieren un rol terapéutico para sus LTA en la lucha contra enfermedades causadas por bacterias Gram-negativas o sus derivados.

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Ejemplo 2 Fórmula infantil

Para obtener una fórmula infantil hemos preparado la siguiente mezcla, que contiene por 100 ml de fórmula: del 0,5 al 5%, con preferencia un 2% de péptidos, del 0,2 al 10%, con preferencia un 4% de grasas, del 1 al 25%, con preferencia un 8% de hidratos de carbono no levanos (incluyendo lactosa 65%, maltodextrina 20%, almidón 15%) y por lo menos 10^{6} cfu/ml de las cepas siguientes: Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM 1-2332) o Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM I-1225), en combinación con trazas de vitaminas y oligoelementos para satisfacer las necesidades diarias y del 0,01 al 2%, con preferencia un 0,3% de sales minerales y del 50 al 90%, con preferencia un 75% de agua.

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Ejemplo 3 Uso en productos lácteos

Una o más cepas de Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM I-2332) o de Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM I-1225) de la presente invención pueden utilizarse para la fabricación de productos lácteos fermentados de tipo yogurt.

Para ello se prepara 1 l de un producto lácteo que contenga un 2,8% de grasas y suplementado con un 2% de leche desnatada en polvo y un 6% de sucrosa, se pasteuriza a 96ºC durante 30 minutos y después se baja su temperatura hasta 42ºC.

Se reactivan precultivos de una cepa no espesante de Streptococcus thermophilus y de una cepa no viscosa de Lactobacillus bulgaricus en un medio de cultivo MSK estéril, que contiene un 10% de leche en polvo reconstituida y un 0,1% de extracto de levadura comercial.

Se reactiva también un precultivo de una o más cepas en un medio que contiene un 10% de leche en polvo reconstituida y un 0,1% de extracto de levadura comercial con un 1% de sucrosa. Después se inocula el producto lácteo pasteurizado con un 1% de cada uno de estos precultivos reactivados y después se hace fermentar este producto lácteo a 32ºC hasta que el pH alcanza un valor de 4,5. De este modo se preparan los productos lácteos fermentados de tipo yogurt y se almacenan a 4ºC.

Ejemplo 4 Pienso seco para animales de compañía

Se prepara una mezcla de pienso que contiene un 58% en peso de maíz, un 6% en peso de gluten de maíz, un 23% en peso de carne de pollo y las sales, vitaminas y sales minerales que constituyen el resto.

Se introduce la mezcla en un preacondicionador y se humedece. Después se introduce el pienso humedecido en una máquina de extrusión-cocción y se gelatiniza. El material gelatinizado que sale de la extrusora se obliga a pasar por una boquilla y se extruye. Se corta el material extruido en piezas idóneas para la alimentación de gatos, se seca a unos 110ºC durante 20 minutos y se enfría en forma de perdigones. A continuación se añade a los perdigones un polvo liofilizado de una o más cepas de las siguientes especies de Lactobacillus: Lactobacillus johnsonii NCC533 (CNCM 1-1225) o Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM I-2332). De este modo se proporciona polvo suficiente para la ingestión dietética correspondiente de los animales de compañía, que se sitúa entre 10^{7} y 10^{9} cfu/día. Cierta cantidad del polvo se mezcla con la primera masa de perdigones y se envasa en bolsas. Se mide una segunda cantidad del polvo y se mezcla con un vehículo lípido, que después se pulveriza encima de la segunda masa de perdigones. Se envasan los perdigones en bolsas después de que el recubrimiento se haya secado de modo suficiente a 50-60ºC durante algunos minutos.

El pienso seco para perros es particularmente indicado para disminuir los procesos inflamatorios asociados con la colonización bacteriana.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

Claims (7)

1. Una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico como ingrediente activo, en la que las bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM1-2332, para el tratamiento de la sepsis, translocación bacteriana, inflamación, infección y enfermedades y/o un crecimiento bacteriano excesivo.

2. Una composición que contiene ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico como ingrediente activo, en la que las bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM I-2332, para uso en medicina.

3. Una composición según una de las reivindicaciones 1-2, que contiene bacterias de ácido láctico que producen ácido lipoteicoico o un líquido sobrenadante de su cultivo.

4. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en la que el ácido lipoteicoico está presente en una cantidad que equivale a una cantidad de bacterias que varía entre 10^{5} cfu/g y 10^{11} cfu/g.

5. Uso por lo menos de un ácido lipoteicoico de bacterias de ácido láctico y/o bacterias de ácido láctico que lo producen y/o su líquido sobrenadante de cultivo, para la fabricación de una composición destinada a reducir o prevenir procesos inflamatorios asociados con enfermedades mediadas por bacterias o con trastornos mediados por LTA/LPS del tracto gastrointestinal, de los huesos, de la piel, de los ojos, de los oídos, de los pulmones o de la cavidad bucal de los seres humanos o de los animales, que se elige entre sepsis, translocación bacteriana, inflamación, infección y enfermedad y crecimiento bacteriano excesivo, en el que las bacterias de ácido láctico son el Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 o el Lactobacillus acidophilus CNCM1-2332.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que la composición es una composición alimentaria o un alimento enteral, para la nutrición infantil, para la nutrición de animales de compañía o para la nutrición clínica.

7. Uso según la reivindicación 5, en el que la composición es una composición cosmética o dermatológica en forma de preparación tópica u oral, aplicación oftalmológica o aplicación oral.