ES2693584T3 - Uso de microorganismos probióticos para el tratamiento y prevención de obesidad y trastornos relacionados - Google Patents
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Abstract
Uso de una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricación de un soporte para administración a un sujeto para el tratamiento y/o prevención de obesidad y/o para la prevención de una enfermedad causada por obesidad; en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivó y/o del microorganismo.
Description
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DESCRIPCION
Uso de microorganismos probioticos para el tratamiento y prevencion de obesidad y trastornos relacionados Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la saciedad del apetito.
En una realizacion la presente invencion se refiere al uso de al menos una cepa de un microorganismo, preferentemente una bacteria acido lactica, preferentemente una bacteria probiotica, tal como Lactobacillus spp. (por ejemplo, L. acidophilus y/o L. salivarius) y/o Bifidobacterium spp. (tal como B. lactis), para preparar un soporte administrado a seres humanos o animales para modular la senalizacion de la saciedad, preferentemente para inducir la saciedad.
Ademas la presente invencion se refiere adicionalmente a al menos una cepa de un microorganismo, preferentemente una bacteria acido lactica, preferentemente una bacteria probiotica, tal como Lactobacillus spp. (por ejemplo L. acidophilus y/o L. salivarius) y/o Bifidobacterium spp. (tal como B. lactis), para uso en el tratamiento o reduccion o gestion de la obesidad y/o para uso en el tratamiento de trastornos relacionados con la obesidad.
Antecedentes tecnicos
La dieta y la perdida de peso por razones esteticas (cosmeticas) son practicadas por personas de todo el mundo. Los cientfficos, desarrolladores de medicamentos y desarrolladores de alimentos han introducido en la ultima decada una variedad de supresores del apetito y/o medicamentos para perder peso y/o gamas de alimentos "saludables" para ayudar a las personas que hacen dieta en su diffcil situacion de perder peso.
La dieta no se limita a los seres humanos, sino que incluye a otros animales, con planes de dieta para mascotas siendo comunes.
Desde una perspectiva evolutiva, los animales (incluidos seres humanos) se han adaptado a atiborrarse de comida y almacenar energfa en caso de hambruna. Desafortunadamente, sin embargo, aunque esto fue util en momentos en los que la comida escaseaba, ahora en momentos en los que es posible comer constantemente, esto puede llevar al sobrepeso y, en algunos casos, a la obesidad.
La obesidad se ha convertido en un importante problema de salud publica. Las patologfas causadas o exacerbadas por la obesidad incluyen hipertension, diabetes mellitus, apnea del sueno, hipoventilacion relacionada con la obesidad, problemas de espalda y articulaciones, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de tugado graso no alcoholico y enfermedad por reflujo gastroesofagico.
El mdice de masa corporal (IMC) (calculado como peso en kilogramos dividido por el cuadrado de la altura en metros) es la medida mas comunmente aceptada para el sobrepeso y/o la obesidad. Un IMC superior a 25 se considera sobrepeso, mientras que la obesidad se define como un IMC de 30 o mas, con un IMC de 35 o mas considerado como comorbilidad grave y un IMC de 40 o mas considerado obesidad morbida.
La obestatina es una hormona peptfdica que se produce en las celulas que revisten el estomago y el intestino delgado de varios mairnferos, incluidos los seres humanos; reduce drasticamente el apetito en ratones y se espera que haga lo mismo en seres humanos.
De manera sorprendente, la obestatina esta codificada por el mismo gen que tambien codifica la grelina, una hormona peptfdica que aumenta el apetito. Tanto la grelina como la obestatina se obtienen a partir de una prohormona producida por el mismo gen y se dividen por procesamiento postraduccional. La finalidad de este mecanismo sigue sin estar clara, sin embargo, explica los hallazgos anteriores, en particular que la eliminacion del gen de la grelina de ratones no redujo de forma significativa su apetito.
La obestatina se ha considerado para su uso como un farmaco contra la obesidad, sin embargo, se debena administrar como un aerosol nasal o mediante inyeccion, ya que el peptido es destruido por los jugos gastricos.
En la actualidad hay pocos tratamientos para la obesidad. De los dos farmacos aprobados para uso en Estados Unidos, el Xenical™ de Roche (que bloquea la digestion de la grasa) es relativamente eficaz para estimular la perdida de peso, pero tiene algunos efectos secundarios desagradables. El otro farmaco aprobado para uso en Estados Unidos es Meridia™ de los Laboratorios Abbot, que supuestamente no se ha demostrado que sea particularmente eficaz (Schaffer A.
www.slate.com/id/2117332, 26 de abril de 2005).
www.slate.com/id/2117332, 26 de abril de 2005).
Un farmaco experimental en la actualidad en ensayos es Rimonabant™ (un antagonista del receptor de cannabinoides) que supuestamente detienen los antojos en seres humanos, reduciendo de este modo los apetitos de los pacientes obesos.
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Por lo tanto, existe una necesidad de una herramienta eficaz para reducir el peso, prevenir el aumento de peso, facilitar la perdida de peso y/o tratar la obesidad.
Entre los microorganismos, en particular entre las bacterias, algunos tienen una influencia positiva en el sistema inmunologico en particular las bacterias acido lacticas y las bifidobacterias, y se describen como bacterias o cepas "probioticas".
Generalmente, por bacteria o cepa probiotica se hace referencia a un microorganismo no patogeno que, cuando se ingiere, ejerce un efecto beneficioso sobre la salud o la fisiologfa del hospedador. Estas cepas probioticas generalmente tienen la capacidad de sobrevivir al paso a traves de la parte superior del tracto digestivo. No son patogenicas, no son toxicas y ejercen su efecto beneficioso sobre la salud por un lado a traves de las interacciones ecologicas con la flora residente en el tracto digestivo, y por otro lado a traves de su capacidad para influir en el sistema inmunologico de manera positiva a traves del "GALT" (tejido linfoide asociado al intestino). Dependiendo de la definicion de probioticos, estas bacterias, cuando se administran en un numero suficiente, tienen la capacidad de avanzar vivas a traves del intestino, sin embargo, no atraviesan la barrera intestinal y, por lo tanto, sus efectos principales se inducen en el lumen y/o la pared del tracto gastrointestinal. A continuacion forman parte de la flora residente durante el periodo de administracion. Esta colonizacion (o colonizacion transitoria) permite que las bacterias probioticas ejerzan un efecto beneficioso, tal la represion de microorganismos potencialmente patogenos presentes en la flora e interacciones con el sistema inmunologico del intestino.
Las cepas probioticas usadas mas comunmente, en particular en productos lacteos, son principalmente bacterias y levaduras de los siguientes generos: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. y Saccharomyces spp.
Entre los efectos probioticos registrados por estas bacterias, se pueden mencionar por ejemplo la mejora de la tolerancia a la lactosa, potenciacion de la funcion inmunitaria, prevencion o tratamiento de infecciones gastrointestinales y urogenitales y reduccion del riesgo de cancer. Algunas bacterias probioticas se usan en la tecnica anterior para el tratamiento o prevencion de obesidad y trastornos relacionados. Por ejemplo, el documento WO02/38165 desvela el uso de una cepa de Lactobacillus plantarum 299 para reducir el riesgo de factores implicados en el smdrome metabolico. La publicacion internacional WO2004/014403 ensena el uso de Lactobacillus reuteri PRD202 y Lactobacillus fermentum NM316 para disminuir el peso corporal y para la prevencion y tratamiento de obesidad y diabetes mellitus. El documento US2005/186189 se refiere al uso de Lactobacillus rhamnosus GM- 020 para el tratamiento de obesidad y complicaciones de la misma.
Aspectos del sumario
Un hallazgo trascendental de la presente invencion es que los microorganismos, en particular las bacterias acido lacticas y/o microorganismos probioticos y/o bacterias acido lacticas probioticas, y/o un metabolito de los mismos de acuerdo con la presente invencion inducen saciedad, en particular saciedad postprandial, en un sujeto.
En particular, un hallazgo trascendental de la presente invencion es que las bacterias acido lacticas (tales como Lactobacillus acidophilus, por ejemplo la cepa PTA-4797; Lactobacillus salivarius; y/o Bifidobacterium lactis) y/o un metabolito de las mismas induce saciedad, en particular saciedad postprandial, en un sujeto.
En un aspecto la presente invencion proporciona el uso de una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto para el tratamiento y/o prevencion de obesidad y/o para la prevencion de una enfermedad causada por obesidad; en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus pTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo. En otro aspecto la presente invencion proporciona una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para uso en un metodo para tratar y/o prevenir la obesidad y/o para la prevencion de una enfermedad causada por obesidad en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo. En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo no terapeutico para reducir el exceso de peso en un sujeto no obeso que comprende la administracion de una cantidad eficaz de una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo, en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo. En otro aspecto, la presente invencion proporciona el uso de una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto para el tratamiento y/o prevencion de obesidad y/o para la prevencion de una enfermedad causada por obesidad; en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus pTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo. En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para uso en un metodo para tratar y/o prevenir la obesidad y/o prevenir una enfermedad causada por la
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Aspectos detallados
Los aspectos detallados de la presente invencion se detallan a continuacion. en parte de algunos de los aspectos detallados se discuten en secciones separadas. Esto se hace para facilitar la referencia y no es limitante en modo alguno.
En un aspecto, la presente invencion proporciona el uso de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para administracion a un sujeto para modular la senalizacion de la saciedad (por ejemplo, en el intestino).
En un aspecto, la presente invencion proporciona el uso de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto para modular la senalizacion de la saciedad (por ejemplo, en el intestino).
La expresion "modular la senalizacion de la saciedad" como se usa en el presente documento hace referencia a variar la amplitud y/o frecuencia de la senalizacion neuronal y/o endocrina asociada con la saciedad.
En algunas realizaciones, "modular la senalizacion de la saciedad" se refiere a variar la amplitud y/o frecuencia de marcadores de saciedad.
El termino "saciedad" como se usa en el presente documento se refiere al estado de estar saciado o con exceso de apetito, es decir, plenitud mas alla del deseo de estar totalmente satisfecho.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto para inducir la saciedad.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona el uso de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de obesidad, y/o una enfermedad o trastorno relacionados con la obesidad.
Ademas en otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para modular la senalizacion de la saciedad (por ejemplo, en el intestino) en un sujeto, metodo que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para inducir la saciedad en un sujeto, metodo que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo.
En el presente documento se desvela un metodo para tratar y/o prevenir el exceso de peso, incluyendo obesidad, y/o una enfermedad o trastorno causados por el exceso de peso, incluyendo una enfermedad relacionada con la obesidad en un sujeto, de todo que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo cosmetico para reducir el exceso de peso en un sujeto no obeso, metodo que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo.
En otro aspecto la presente invencion proporciona un uso cosmetico de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto no obeso para inducir la saciedad.
En el presente documento se ensena un metodo para seleccionar un microorganismo y/o un metabolito del mismo para administracion a un sujeto para inducir la saciedad y/o tratar el exceso de peso, incluyendo la obesidad, en el que el metodo comprende las etapas de:
a) poner un microorganismo y/o un metabolito del mismo en contacto con al menos una celula epitelial,
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b) detectar la expresion de un marcador de saciedad (tal como protema tirosina tirosina (PYY)) en al menos una celula epitelial.
En el presente documento se desvela un metodo para seleccionar un microorganismo y/o un metabolite del mismo para preparar un soporte para administracion a un sujeto para inducir la saciedad y/o tratar el exceso de peso, incluyendo la obesidad, en el que el metodo comprende las etapas de:
a) poner un microorganismo y/o un metabolito del mismo en contacto con al menos una celula epitelial,
b) detectar la expresion de un marcador de saciedad (tal como protema tirosina tirosina (PYY)) en al menos una celula epitelial.
La celula o celulas epiteliales usadas durante las etapas a) o b) provienen preferentemente de la lmea de celulas Caco-2. se trata de una lmea de celulas de cancer de colon. Tambien pueden ser celulas aisladas y purificadas de biopsias de elementos de operaciones en seres humanos. Las celulas Caco-2 estan disponibles al publico en un numero de catalogos de lmeas celulares, tal como a partir de la ATCC (Coleccion Americana de Cultivos Tipo) con un numero HTB-37, por ejemplo.
La etapa a) se realiza preferentemente usando de 1 a 100 celulas de microorganismo por una celula epitelial que se va a someter a ensayo con al menos una celula epitelial.
El periodo de contacto, durante la etapa a), puede variar de 0 horas a 24 horas, y es preferentemente de aproximadamente 3 horas o al menos 3 horas.
Generalmente, la puesta en contacto con las celulas de acuerdo con la etapa a) se realiza bajo temperatura estandar, atmosferas modificadas y condiciones de esterilidad bien conocidas para una persona con experiencia en la materia, en particular en condiciones de cultivo de celulas epiteliales in vitro.
La etapa b) del proceso de seleccion de acuerdo con la invencion se realiza preferentemente detectando la expresion, y opcionalmente su nivel, del ARN mensajero del marcador de saciedad (tal como PYY), por ejemplo mediante PCR entre otros mediante PCR cuantitativa o mediante inmunohistoqmmica o mediante radioinmunoensayo. Para la deteccion de ARNm y su medicion se pueden usar otras tecnicas bien conocidas por una persona con experiencia en la materia.
Para algunos aspectos, el microorganismo de acuerdo con la presente invencion puede ser viable.
Para algunos aspectos, el microorganismo de acuerdo con la presente invencion puede estar muerto o no ser viable. Sin desear quedar ligado por la teona, se cree que los metabolitos, por ejemplo los metabolitos solubles, asociados con, por ejemplo producidos por, el microorganismo puede estar causando el efecto ventajoso del microorganismo. Para algunos aspectos, no es necesario por lo tanto que las celulas del microorganismo esten en contacto directo con las celulas diana.
Para algunos aspectos, se cree que uno o mas metabolitos asociados con, por ejemplo producidos por, el microorganismo pueden ser adecuados para conseguir los efectos beneficiosos que se ensenan en el presente documento. En tales casos, puede no ser necesario incluir los propios microorganismos.
La expresion "metabolito del mismo" como se usa en el presente documento se refiere a un extracto bruto de un medio de cultivo en el que un microorganismo de acuerdo con la presente invencion se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo. De forma adecuada, para algunos aspectos, el metabolito puede ser uno o mas compuestos aislados y/o purificados a partir del medio de cultivo y/o el microorganismo.
En algunos aspectos de forma adecuada el metabolito puede ser un metabolito soluble.
En algunos aspectos el metabolito puede ser un metabolito soluble en agua.
En algunos aspectos el metabolito puede ser un metabolito soluble en lfpido. De forma adecuada, el metabolito puede ser un metabolito que esta presente en la fase sobrenadante aislada a partir de un cultivo del microorganismo usando la metodologfa tal como se ensena en el documento de patente US 5.578.302 y/o de acuerdo con los ejemplos que se ensenan en el presente documento.
En un aspecto el metabolito se puede obtener (preferentemente obtener) mediante cultivo de Lactobacillus acidophilus PTA-4797, Bifidobacterium lactis 420, Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33 en un medio de cultivo hasta que la DO del cultivo a A600 alcanza al menos 0,6, preferentemente de 0,6 a 1,5; eliminacion de las bacterias mediante centrifugacion y/o filtracion (tal como, por ejemplo, centrifugacion a 25 °C, 5 min, 3000 g y/o filtracion esteril) para dar como resultado un filtrado que comprende dicho metabolito(s).
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De forma adecuada, el metabolito(s) se puede obtener (preferentemente obtener) usando un medio de cultivo de MRS ya sea con azucar al 1,0 % o sin azucar. De forma adecuada, el metabolito(s) se puede obtener (preferentemente obtener) por cultivo de las bacterias a 37 °C. De forma adecuada, el metabolito(s) se puede obtener (preferentemente obtener) por cultivo de las bacterias por via anaerobica.
En ensayos in vitro el metabolite en forma del filtrado se puede mezclar opcionalmente con celulas de cultivo tisular en un medio de cultivo tisular. Preferentemente, el filtrado que contiene el metabolito(s) se mezcla con el medio de cultivo celular de modo que la mezcla de filtrado/medio de cultivo tisular mixture comprende al menos un 10 % en v/v de filtrado y como maximo un 90 % en v/v de medio de cultivo tisular.
Cuando el metabolito(s) se carga sobre un soporte, la proporcion de mezcla de filtrado/soporte es preferentemente 1:10 o superior.
De forma adecuada, el microorganismo de acuerdo con la presente invencion se puede cocultivar con una o mas celulas diana permitiendo de ese modo la transferencia de fracciones solubles.
De forma adecuada, el microorganismo puede no estar en contacto de celula a celula con la celula(s) diana.
De forma adecuada, el microorganismo de acuerdo con la presente invencion o el metabolito del mismo puede estar en forma de una suspension bacteriana, antes o despues de su congelacion, en la forma de concentrados, Ya sea en forma seca, liofilizada o congelada. Sea cual sea la forma usada, la cepa se puede congelar.
De forma adecuada, el microorganismo y/o metabolito del mismo de acuerdo con la presente invencion puede contener diferentes aditivos. De forma adecuada los aditivos se pueden anadir durante su secado y/o durante su liofilizacion.
El microorganismo usado de acuerdo con la presente invencion, (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por
ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus y/o L. salivarius y/o una cepa de Bifidobacterium, por ejemplo B.
612 812 lactis), puede comprender de 10 a 10 CFU de bacterias/g de soporte, y mas particularmente de 10 a 10 CFU de
bacterias/g de soporte, preferentemente de 109 a 1012 CFU/g para la forma liofilizada.
De forma adecuada el microorganismo usado de acuerdo con la presente invencion, (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus y/o L. salivarius y/o una cepa de Bifidobacterium, por ejemplo B. lactis), se puede administrar alguna dosificacion de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis. Con el termino "por dosis" se hace referencia a que esta cantidad de microorganismo se proporciona a un sujeto ya sea al dfa o por ingesta, preferentemente al dfa. Por ejemplo, si el microorganismo se va a administrar en un soporte alimentario (por ejemplo en un yogur) - entonces el yogur contendra preferentemente de aproximadamente 108 a 1012 CFU del microorganismo. Como alternativa, sin embargo, esta cantidad de microorganismo se puede separar en multiples administraciones cada una consistiendo en una cantidad mas pequena de carga microbiana - siempre y cuando la cantidad total de microorganismo recibida por un sujeto encuentro momento espedfico (por ejemplo cada periodo de 24 h) sea de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo, preferentemente de 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo.
De acuerdo con la presente invencion una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo puede ser al menos 106 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis.
En un ejemplo, preferentemente el microorganismo usado de acuerdo con la presente invencion, (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus y/o L. salivarius y/o una cepa de Bifidobacterium, por ejemplo B. lactis) se puede administrar alguna dosificacion de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismoMa, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dfa. Por lo tanto, la cantidad eficaz en esta realizacion puede ser de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dia, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dfa.
CFU se refiere a "unidades formadoras de colonias". Por gramo de soporte se hace referencia preferentemente al producto alimentario o al soporte farmaceuticamente aceptable.
De forma ventajosa, la presente invencion es una herramienta eficaz para reducir el aumento de peso y/o facilitar la perdida de peso y/o tratar o prevenir la obesidad y/o tratar o aliviar trastornos o enfermedades relacionadas con o causadas por la obesidad o que se convierten en sobrepeso.
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Sin desear quedar ligado por la teona, el microorganismo y/o metabolito del mismo puede mediar en la perdida de peso y/o dar como resultado saciedad aumentando la senalizacion de la saciedad en el intestino.
Sin desear quedar ligado por la teona el microorganismo y/o metabolito puede mediar en la perdida de peso y/o dar como resultado saciedad mediante su efecto en una hormona intestinal y/o en uno o mas receptores encontrados en el intestino.
Alguno de los reguladores perifericos del apetito, incluyendo hormonas intestinales, se discuten en Stanley et al., Physiol. Review 85: 1131-1158 2005.
Sin desear quedar ligado por la teona el microorganismo y/o metabolito del mismo puede mediar en la perdida de peso y/o dar como resultado o saciedad mediante su efecto en un marcador de saciedad (tal como la hormona intestinal Peptido Tirosina Tirosina (PYY) por ejemplo).
Saciedad
El termino "saciedad" como se usa en el presente documento se refiere al estado de estar saciado o con exceso de apetito, es decir, plenitud mas alla del deseo de estar totalmente satisfecho.
De forma adecuada, la presente invencion puede ser para aumentar la saciedad.
Preferentemente la presente invenciones para inducir y/o aumentar la saciedad postprandial.
La persona con experiencia en la materia podna comprender que la saciedad y la saciedad postprandial se puede medir en un numero de formas.
Por ejemplo, sin desea quedar ligado por la teona existe una relacion entre el nivel de marcador(s) de saciedad (tal como la hormona intestinal PYY ya sea en la sangre o en el intestino) y el nivel de saciedad.
Por lo tanto, la saciedad y/o la saciedad postprandial se puede medir determinando el nivel de uno o mas marcadores de saciedad (por ejemplo PYY ya sea en la sangre del sujeto y/o en el intestino del sujeto). De forma adecuada las muestras se pueden tomar a intervalos antes de y a intervalos despues de que el sujeto consuma una comunidad espedfica. Por ejemplo, el aumento de los niveles de expresion de PYY y/o aumento de los niveles de PYY puede indicar saciedad. Las personas con experiencia habitual en la materia conocen las relaciones entre otros marcadores de saciedad y la saciedad.
Ademas, o como alternativa, la saciedad y/o saciedad postprandial se puede medir en estudios con animales midiendo la ingesta de alimento por parte del animal y/o el intervalo de tiempo entre la alimentacion del animal y/o el peso del animal. Una reduccion de la ingesta de alimento y/o peso del animal indica saciedad. Ademas, o como una alternativa, un aumento en el intervalo de tiempo entre la alimentacion del animal indica saciedad.
Ademas, o como alternativa, un sujeto puede medir de forma subjetiva la saciedad y/o saciedad postprandial mediante el uso de un cuestionario en el que a los sujetos se les hacen las siguientes preguntas: "^cuanta hambre tiene?", "^esta muy lleno?", "^cuanto puede comer?" y "^cual es su deseo de comer?". Su percepcion se puede clasificar de 0 (el valor mas bajo) a 10 (el valor mas elevado) en una escala analogica visual de 100 mm (tal como se ensena en Stock et al., J. of Clinical Endocrinology and Metabolism, publicado en primer lugar el 18 de enero de 2005 como doi:10.1210/jc.2004.1251). Al sujeto se le pide preferentemente que complete el cuestionario a intervalos antes y a intervalos despues de que el sujeto consuma una comida espedfica.
En algunos aspectos la saciedad puede hacer referencia a uno o mas de los siguientes:
a) saciedad postprandial;
b) una reduccion del hambre antes de las comidas;
c) un fortalecimiento de la saciedad dentro de la comida para reducir el tamano de la comida; y/o
d) un aumento del estado de saciedad entre comidas, que puede evitar los aumentos compensatorios en el numero de comidas y/o puede reducir el picoteo entre comidas.
En algunos aspectos la saciedad se puede medir como uno o mas de los siguientes:
i) una reduccion de la ingesta de alimentos por el sujeto en comparacion con un sujeto de ensayo comparativo y/o en comparacion con el tratamiento previo del sujeto;
ii) una reduccion del peso corporal del sujeto en comparacion con el tratamiento previo del sujeto;
iii) una reduccion de la adiposidad en comparacion con un sujeto de ensayo comparativo y/o en comparacion con el tratamiento previo del sujeto.
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Marcador de saciedad
La expresion "marcador de saciedad" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto(s) y/o hormona u hormonas intestinales implicadas en la regulacion del apetito y/o ingesta de alimentos.
Los marcadores de saciedad incluyen, pero no se limitan a, polipeptido pancreatico (PYY), colecistoquinina (CCK), peptido 1 similar al Glucagon (GLP-1), insulina, leptina, grelina, orexinas, neuropeptido Y hipotalamico orexigenico (NPY), acido acetico, amilina, y oxintomodulina.
En una realizacion, el marcador de saciedad es preferentemente una hormona intestinal.
En una realizacion el marcador de saciedad puede ser uno o mas de PYY, CCK, GLP-1, insulina, leptina, grelina, orexinas, neuropeptido Y hipotalamico orexigenico (NPY), amilina o oxintomodulina.
De forma adecuada, el marcador de saciedad se puede seleccionar entre uno cualquiera aun mas de los siguientes: PYY, CCK, GLP-1 e insulina.
Sin desear quedar ligado por la teona el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede inducir la saciedad aumentando los niveles en plasma de uno cualquiera o mas de: PYY, CCK, GLP-1 e insulina. El aumento se compara con un control equivalente, pero al que no se le administraron el microorganismo y/o metabolito del mismo.
En una realizacion, el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede inducir saciedad aumentando los niveles de uno cualquiera o mas de los siguientes marcadores de saciedad en el intestino: PYY, CCK, GLP-1 e insulina. El aumento se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
Sin desear quedar ligado por la teona el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede inducir saciedad aumentando el nivel de leptina en sangre periferica y/o mediante disminucion del nivel de leptina en el cerebro. El aumento se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
En una realizacion, el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede aumentar el nivel de PYY. El aumento se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
En una realizacion alternativa o adicional, el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede aumentar el nivel de CCK. El aumento se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
En otra realizacion, el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede inducir saciedad disminuyendo el nivel de una o mas hormonas intestinales en el intestino y/o en el plasma tal como una cualquiera o mas de las siguientes: grelina y orexinas. La disminucion se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
En otra realizacion, el marcador de saciedad puede ser acido acetico. En esta realizacion, el microorganismo y/o metabolito del mismo de la presente invencion puede inducir saciedad aumentando el nivel de acido acetico en la sangre. El aumento se compara con un control al que no se le ha administrado el microorganismo y/o metabolito del mismo.
Soporte
El soporte usado durante el uso de acuerdo con la presente invencion es preferentemente un soporte farmaceuticamente aceptable o un producto alimentario. A continuacion se proporciona informacion adicional con respecto tanto a alimentos como a agentes farmaceuticos.
Un soporte farmaceuticamente aceptable puede ser por ejemplo un soporte en forma de comprimidos formados mediante compresion, comprimidos, capsulas, pomadas, supositorios o soluciones que se pueden beber. A continuacion se proporcionan otras formas adecuadas.
Preferentemente, el soporte usado durante el uso de acuerdo con la invencion es un producto alimentario tal como un suplemento alimentario, una bebida o un polvo a base de leche. Preferentemente es un producto lacteo de origen animal o vegetal. Como se indica a continuacion adicionalmente, en el presente documento el termino "alimento" se usa en su sentido mas amplio - y cubre alimento para seres humanos asf como alimento para animales (es decir, una alimentacion).
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La expresion "producto lacteo" como se usa en el presente documento pretende hacer referencia a la inclusion de un medio que comprende leche de origen animal y/o vegetal. Como leche de origen animal se puede mencionar la leche de vaca, de oveja, de cabra o de bufalo. Como leche de origen vegetal en el presente documento se puede mencionar cualquier sustancia fermentable de origen vegetal que se pueda usar de acuerdo con la invencion, en particular con origen en sojas, arrojo cereales.
Aun mas preferentemente del soporte usado de acuerdo con la invencion es una leche fermentada o leche humanizada.
Sobrepeso/obesidad
El mdice de masa corporal (IMC) (calculado como peso en kilogramos dividido entre el cuadrado de la altura en metros) es la medicion mas comunmente aceptada para sobrepeso y/o obesidad.
Un IMC que supera 25 se considera sobrepeso.
La obesidad se define como un IMC de 30 o mas, con un IMC de 35 mas siendo considerado una comorbidez grave y un IMC de 40 o mas se considera obesidad morbida.
El termino "obesidad" como se usa en el presente documento incluye obesidad, obesidad por comorbidez y obesidad morbida. Por lo tanto, el termino "obesidad" como se usa el presente documento se puede definir que hace referencia a un sujeto que tiene un IMC mayor o igual a 30.
En algunos aspectos de forma adecuada un sujeto obeso puede tener un IMC mayor o igual a 30, de forma adecuada 35, de forma adecuada 40.
La expresion "exceso de peso" como se usa en el presente documento hace referencia al exceso de peso del sujeto. La expresion "exceso de peso" como se usa en el presente documento hace referencia a que se considera que el sujeto tiene sobrepeso. El termino "sobrepeso" como se usa en el presente documento hace referencia a que el sujeto tiene un IMC que supera 25.
El exceso de peso y/o obesidad se pueden medir usando el IMC. Por lo tanto una reduccion del exceso de peso y/o obesidad se puede medir usando el IMC.
Una reduccion en el exceso de peso y/o obesidad tambien (o como alternativa) se puede medir simplemente midiendo el peso del sujeto con respecto a un control y/o antes y despues de la administracion de los microorganismos y/o metabolito del mismo de acuerdo con la presente invencion.
Sin desear quedar ligado por la teona, tambien puede haber una relacion entre los marcadores inflamatorios en suero o sangre (tales como protema C reactiva y/o interleuquina 6 y/o TNF-RII por ejemplo) y obesidad. Ademas, Tambien puede haber una correlacion entre los marcadores inflamatorios en suero o sangre y el IMC. Por lo tanto, en una realizacion, los marcadores inflamatorios en sangre se pueden medir para determinar la obesidad y/o una reduccion de la obesidad en un sujeto.
Trastornos/enfermedades relacionados con o causados por un exceso de peso y/u obesidad
Las afecciones de la salud (es decir, trastornos y/o enfermedades) causados o exacerbados por la obesidad incluyen hipertension, diabetes mellitus, por ejemplo diabetes de tipo 2, apnea del sueno, hipoventilacion relacionada con la obesidad, problemas de espalda y articulaciones, enfermedad cardiovascular, enfermedad del tngado graso no alcoholico enfermedad de reflujo gastroesofagico.
Sujeto
El termino "sujeto", como se usa en el presente documento, hace referencia a un animal. Preferentemente con el sujeto es un mairnfero, incluyendo por ejemplo ganado (incluyendo vacuno, caballos, cerdos, pollos y ovejas), y seres humanos. En algunos aspectos of de la presente invencion el animal es un animal de comparMa (incluyendo mascotas), tales como un perro o un gato por ejemplo. En algunos aspectos de la presente invencion, en un sujeto de forma adecuada puede ser un ser humano.
Medicamento
El termino "medicamento" como se usa en el presente documento incluye medicamentos para uso tanto humano como animal y en medicina veterinaria. Ademas, el termino "medicamento" como se usa en el presente documento hace referencia a cualquier sustancia que proporcione un efecto terapeutico y/o beneficioso. El termino "medicamento" como se usa en el presente documento no esta necesariamente limitado a sustancias que necesitan Aprobacion de Marketing, pero pueden incluir sustancias que se pueden usar en cosmetica, nutraceutica, alimento
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(incluyendo comidas y bebidas por ejemplo), cultivos probioticos, y remedios naturales. Ademas, el termino "medicamento" como se usa en el presente documento incluye un producto disenado para su incorporacion en alimentos para animales, por ejemplo alimentos para ganado y/o alimentos para mascotas.
Tratamiento
Se debe observar que en el presente documento todas las referencias a tratamiento incluyen tratamiento curativo, paliativo y profilactico.
Forma sustancialmente pura y/o forma aislada
Para algunos aspectos el microorganismo y/o metabolito de acuerdo con la presente invencion puede estar en una forma sustancialmente pura o puede estar en una forma aislada.
La expresion "forma sustancialmente pura" se usa para indicar que el microorganismo y/o metabolito de acuerdo con la presente invencion esta presente a un nivel elevado. Cuando el microorganismo y/o metabolito esta en una forma sustancialmente pura, el microorganismo y/o metabolitos es de forma deseable el componente predominante presente en una composicion. Preferentemente esta presente a un nivel de mas de un 30 %, de mas de un 50 %, de mas de un 75 %, de mas de un 90 %, o incluso de mas de un 95 %, siendo dicho nivel determinado en peso seco / una base de peso seco con respecto a la composicion total en consideracion.
A niveles muy elevados (por ejemplo, a niveles de mas de un 90 %, de mas de un 95 % o de mas de un 99 %) se puede contemplar que el componente de esta "aislado". Las sustancias biologicamente activas de la presente invencion (incluyendo polipeptidos, moleculas de acido nucleico, carbohidratos identificados/identificables mediante identificacion sistematica, lfpidos identificados/identificables mediante identificacion sistematica, restos identificados/identificables mediante identificacion sistematica, etc.) se pueden proporcionar en una forma que esta sustancialmente libre de uno o mas contaminantes con los que la sustancia se podna asociar de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, puede estar sustancialmente libre de uno o mas polipeptidos y/o moleculas de acido nucleico potencialmente contaminantes.
Se pueden proporcionar en una forma que este sustancialmente libre de otros componentes celulares (por ejemplo, de membranas celulares, de citoplasma, etc.). Cuando una composicion esta esencialmente libre de un contaminante dado con el contaminante estara a un nivel bajo (por ejemplo, a un nivel inferior a un 10 %, inferior a un 5 % o inferior a un 1 % basandose en el peso seco/base de peso seco que se ha establecido anteriormente).
Microorganismo
Los microorganismos viables adecuados para su uso en la presente invencion incluyen bacterias. Preferentemente, los microorganismos viables para su uso en la presente invencion son bacterias viables.
La expresion "microorganismo viable" hace referencia a un microorganismo que es metabolicamente activo.
El microorganismo puede ser un microorganismo de origen natural o puede ser un microorganismo transformado. El microorganismo tambien puede ser una combinacion de microorganismos adecuados.
El microorganismo de acuerdo con la presente invencion es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN0l9, o Lactobacillus salivarius 33. Preferentemente el microorganismo que se va a usar de acuerdo con la presente invencion es un microorganismo que generalmente esta reconocido como seguro y, que preferentemente esta aprobado como GRAS.
Preferentemente, el microorganismo usado de acuerdo con la presente invencion es uno que es adecuado para consumo por seres humanos y/o animales.
De forma adecuada, el microorganismo puede ser una cepa de la especie B. lactis seleccionada entre B. lactis 420 o B. lactis HN019.
Para algunas realizaciones el microorganismo puede ser una mezcla de mas de un microorganismo probiotico (preferentemente mas de una bacteria probiotica); una mezcla de mas de mas bacterias acido lacticas; o una mezcla de uno o mas microorganismos probioticos (preferentemente bacterias probioticas) y una o mas bacterias acido lacticas. Preferentemente, la mezcla puede comprender una o mas cepas de Lactobacillus spp, y/o Bifidobacterium spp.
En una realizacion preferentemente el microorganismo es al menos una cepa de Lactobacillus spp seleccionada entre Lactobacillus acidophilus PTA-4797 y Lactobacillus salivarius 33. El Lactobacillus acidophilus de acuerdo con la presente invencion es Lactobacillus acidophilus PTA-4797. Esta cepa de Lactobacillus acidophilus Ha sido registrada por Rhodia Chimie, 26, quai Alphonse Le Gallo, 92 512 BOULOGNE-BILLANCOURT Cedex Francia, de
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acuerdo con el Tratado de Budapest en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), en la que se registra con el numero de registro PTA-4797.
La cepa de Lactobacillus acidophilus para uso de acuerdo con la presente invencion puede estar en forma de una mezcla con otras bacterias acido lacticas. Las bacterias acido lacticas que probablemente van a ser adecuadas De acuerdo con la invencion incluyen cualquier bacteria acido lactica usada normalmente en las industrias agncolas, alimentarias o farmaceuticas.
De forma ventajosa, cuando el producto es un producto alimentario, el microorganismo viable y/o metabolites solubles producidos por dicho microorganismo debenan permanecer eficaces durante el periodo normal de "caducidad" o fecha de "expiracion" durante la cual el producto alimentario es ofrecido para su venta por el minorista. Preferentemente con el tiempo eficaz no debena extenderse mas alla de tales fechas hasta el final del periodo normal de frescura cuando el deterioro del alimento se hace evidente. Los periodos de tiempo deseados y la vida util normal variaran de producto alimentario a producto alimentario y las personas con experiencia habitual en la materia reconoceran que los tiempos de vida util variaran dependiendo del tipo de producto alimentario, el tamano del producto alimentario, temperaturas de almacenamiento, condiciones de procesamiento, material de envasado y equipo de envasado.
Ensayo de exposicion basado en celulas caco-2
La lmea de celulas de carcinoma colorrectal humano, Caco-2, se mantiene a 37 °C y con CO2 al 5 % en MEM Modificado Con Dulbecco (Biochrom AG) suplementado con suero bovino fetal al 20 % (FBS, Gibco) glutamina estable 2 mM (Biochrom AG) y 1 X de aminoacidos no esenciales (Biochrom AG)) 20 Uml-1 de penicilina (Gibco), 20 lugml"1 de estreptomicina (Gibco) y 0,5 pgml"1 de anfotericina (Gibco). Cuando se subcultivan, las celulas se lavan con 1x PBS (Gibco) y se desprenden con Tryple Select (Gibco).
Para determinar los efectos de diversos microorganismos y/o metabolito del mismo en la hormona intestinal, tal como PYY, 6,6 x 105/cm2 de celulas Caco-2 se siembran y se diferencian en secciones de cultivo celular de Transpocillo revestido con colageno (Corning) de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita et al., 2001, J. Pharm. Sci. 91 (3): 669-679). Despues de la siembra en inserciones de Transpocillo las celulas Caco-2 se mantienen durante 48 h en medio que consiste en MEM modificado con Dulbecco (Biochrom AG), suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco), glutamina estable 2 mM (Biochrom AG), y 1 X de aminoacidos no esenciales pero no antibioticos. Despues de 48 h el medio se cambia con medio Enterostim (BD Biosciences) suplementado con diluyente de suero MITO+ (BD Biosciences) anadido al medio de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Las celulas se usan en experimentos el cuarto dfa despues de la siembra en inserciones de Transpocillo o despues de que la resistencia electrica transepitelial haya aumentado a un nivel que indica la diferenciacion celular. En todos los experimentos no se usaron ni antibioticos ni suero. Los metabolitos y/o diversos microorganismos se anaden el lado apical de la insercion.
Despues de 24 horas de exposicion, el medio se descarta, las celulas dentro de las inserciones se someten a lisis y el ARN se extrae usando el Kit RNeasy Mini de Qiagen (Alemania). El ADN se digiere usando la misma DNasa sin Rnasa del fabricante. La transcripcion inversa se realiza usando la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. El patron de expresion hormonal (por ejemplo, PYY) se determina mediante PCR de TaqMan cuantitativa en tiempo real (es decir, un metodo de cuantificacion relativa - vease Holland et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Aug 15; 88 (16): 7276-80; y Livak Y Scmittgen, 2001 Methods Dec; 25 (4): 402-8) usando los ajustes por defecto en un instrumento de Deteccion de Secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems)) o mediante un metodo de cuantificacion absoluta tal como PCR De TaqMan (Applied Biosystems) con el Analizador Genetico ABI Prism 7000 usando un conjunto de oligonucleotidos y un oligonucleotido patron que reconoce la hormona (por ejemplo, PYY de Homo sapiens) de forma espedfica.
La suspension microbiana para su uso en el ensayo que se ha mencionado anteriormente se puede preparar mediante cultivo del microorganismo en un medio adecuado. El cultivo se puede centrifugar para formar un sedimento celular que posteriormente se puede suspender en un medio adecuado, por ejemplo, DMEM.
La suspension de metabolitos para su uso en el ensayo que se ha mencionado anteriormente se puede preparar mediante cultivo del microorganismo en un medio de cultivo adecuado. El cultivo se puede centrifugar y/o el caldo de cultivo se puede filtrar (de forma adecuada se puede filtrar mediante esterilizacion) para proporcionar suspension del metabolito.
Los microorganismos que causan una modificacion en el nivel de expresion hormonal (por ejemplo, un aumento de PYY) en comparacion con un control sin tratar, pueden ser microorganismos de acuerdo con la presente invencion y/o que se pueden usar de acuerdo con la presente invencion.
Una persona con experiencia podna ser capaz facilmente de identificar sistematicamente microrganismos probioticos y no probioticos usando el "ensayo de exposicion basado en celulas Caco-2" para identificar microorganismos espedficos, ademas de los que se ensenan de forma espedfica en el presente documento, capaces de producir el efecto que se reivindica.
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Combinacion con otros componentes
El microorganismo y/o metabolito del mismo para su uso en la presente invencion se puede usar en combinacion con otros componentes. Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a combinaciones. El microorganismo y/o metabolito del mismo se puede denominar en el presente documento "la composicion de la presente invencion".
La combinacion de la presente invencion comprende la composicion de la presente invencion y otro componente que es adecuado para consumo animal o humano y es capaz de proporcionar un beneficio medico o fisiologico al consumidor.
Otros componentes de las combinacion es de la presente invencion incluyen polidextrosa, tal como Litesse®, y/o una maltodextrina y/o lactitol. Estos otros componentes se pueden anadir opcionalmente a la composicion para ayudar en el proceso de secado y para ayudar en la supervivencia de los microorganismos.
Los ejemplos adicionales de otros componentes adecuados incluyen uno o mas de: agentes espesantes, agentes gelificantes, emulsionantes, aglutinantes, modificadores cristalinos, edulcorantes (incluyendo concordantes artificiales), modificadores de reologfa, estabilizantes, antioxidantes, colorantes con enzimas, portadores, vefnculos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes saborizantes, material colorante, agentes de suspension, agentes disgregantes, aglutinantes de granulacion, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes se pueden preparar mediante uso de tecnicas qmmicas y/o enzimaticas. El microorganismo y/o metabolito del mismo se puede encapsular. El microorganismo y/o metabolito del mismo para uso en la presente invencion se puede usar en combinacion con uno o mas lfpidos.
Por ejemplo, el microorganismo y/o metabolito del mismo para uso en la presente invencion se puede usar en combinacion con una o mas micelas lipfdicas. La micela lipfdica puede ser una micela lipfdica simple o una micela lipfdica compleja.
La micela lipfdica puede ser un agregado de moleculas orientadas de sustancias anfipaticas.
Las micelas lipfdicas pueden ser un agregado, de dimensiones coloidales, de moleculas orientadas de sustancias anfipaticas que existen en equilibrio en solucion con la especie qrnmica a partir de la que se forman. Las micelas generalmente tienen carga electrica. En solucion acuosa las moleculas individuales del agregado micelar se orientan con sus grupos polares apuntando hacia el medio acuoso y su resto hidrofobo dirigido al centro de la micela.
Las micelas lipfdicas pueden comprender un lfpido y/o un aceite.
Por lo tanto en un ejemplo la presente invencion proporciona el uso de una combinacion de al menos una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo y una micela lipfdica para modular la senalizacion de la saciedad y/o para uso para tratar y/o para uso para prevenir la obesidad y/o una enfermedad causada por la obesidad.
Como se usa en el presente documento la expresion "agente espesante o gelificante" se refiere a un producto que evita la separacion disminuyendo o evitando el movimiento de las partfculas, ya sea gotitas de lfquidos inmiscibles, Aire o solidos insolubles. El espesamiento se produce cuando las moleculas hidratadas individuales producen un aumento de la viscosidad, disminuyendo la separacion. La gelificacion se produce cuando las moleculas hidratadas se unen para formar una red tridimensional que atrapa las partfculas, inmovilizandolas de ese modo.
El termino "estabilizante" como se usa en el presente documento se define como un ingrediente o combinacion de ingredientes que mantiene un producto (por ejemplo, un producto alimentario) sin cambios en el tiempo.
El termino "emulsionante" como se usa en el presente documento se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente de producto alimentario) que evita la separacion de emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presenta en forma de gotita, contenida dentro de la otra. Las emulsiones pueden consistir en aceite en agua, en el que la gotita o fase dispersa es aceite y la fase continua es agua; o agua en aceite, en la que el agua llega a la fase dispersa y la fase continua es aceite. Las espumas, que son gas en lfquido, y suspensiones, que son solido en un lfquido, tambien se pueden estabilizar a traves del uso de emulsionantes. La aireacion se puede producir en un sistema de tres fases en las que el aire queda atrapado por aceite lfquido y a continuacion se estabiliza mediante cristales de grasa aglomerados estabilizados con una emulsionante. Los emulsionantes tienen un grupo polar con una afinidad hacia el agua (hidrofilo) y un grupo no polar que es atrafdo al aceite (lipofilo). Se absorben en las superficies de contacto de las dos sustancias, proporcionando una pelfcula interfacial que actua para estabilizar la emulsion. Las propiedades hidrofilas/lipofilas de los emulsionantes se ven influidas por la estructura de la molecula. Estas propiedades se identifican mediante el valor del equilibrio hidrofilo/lipofilo (HLB). Los valores de HLB bajos indican tendencias lipofilas mas elevadas que se usan para estabilizar las emulsiones de agua en aceite. Los valores de HLB elevados se asignan a agentes emulsionantes hidrofilos, usados generalmente en emulsiones de aceite en agua. Estos valores se obtienen a partir de sistemas sencillos. Dado que a menudo los alimentos contienen otros ingredientes que influyen en las propiedades de la emulsificacion, los valores de HLB pueden no siempre ser una directriz de viable para seleccion de emulsionantes.
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Como se usa en el presente documento el termino "aglutinante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimentario) que une el producto en conjunto a traves de una reaccion ffsica o qmmica. Durante la "gelificacion" por ejemplo, el agua se absorbe, proporcionando un efecto de union. Sin embargo, los aglutinantes pueden absorber otros lfquidos, tales como aceites, manteniendolos dentro del producto. En el contexto de la presente invencion los aglutinantes se podnan usar generalmente en productos solidos o de bajo contenido de humedad por ejemplo productos de panadena: pastas, donuts, pan y otros.
La expresion "modificador cristalino" como se usa en el presente documento se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimentario) que influye en la cristalizacion de cualquiera de la grasa o el agua. La estabilizacion de los cristales de hielo es importante por dos razones. La primera esta relacionada directamente con la estabilidad del producto a partir de un punto de vista de separacion. Cuantos mas ciclos de congelacion/descongelacion experimenta un producto, los cristales de hielo o se hacen mas grandes. Estos cristales grandes pueden descomponer la estructura del producto, ya sea de forma natural, como es el caso de las paredes celulares, o por el caso en el que se crea por "elacion". Dado que el agua ya no se mantiene en su sitio, el producto puede presentar sineresis, o separacion, despues de la descongelacion. En segundo lugar, en el caso de un producto que se consume congelado, estos cristales grandes dan como resultado una sensacion arenosa en la boca, no deseable.
"Excipientes" o "vefnculos" se refieren a materiales adecuados para la administracion del compuesto incluyen cualquiera de tales materiales conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, cualquier lfquido, gel, disolvente, diluyente lfquido, solubilizante, o similar, que no es toxico y que no interactua con cualquier otro componente de la composicion de una manera perjudicial.
Los ejemplos de vefnculos nutricionalmente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, aceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azucares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, acido silfcico, parafina viscosa, aceite de perfume, monogliceridos y digliceridos de acidos grasos, esteres de acidos grasos de petroetral, hidroximetil-celulosa, polivinilpirrolidona, y similares.
Los ejemplos de excipientes incluyen uno o mas de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato sodico, carbonato calcico, fosfato calcico dibasico, glicina, almidon, del azucar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.
Los ejemplos de agentes disgregantes incluyen uno o mas de: almidon (preferentemente almidon de mafz, patata o tapioca), glicolato de almidon sodico, croscarmelosa sodica y ciertos silicatos complejos.
Los ejemplos de aglutinantes de granulacion incluyen uno o mas de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arabiga.
Los ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o mas de: estearato de magnesio, acido estearico, behenato de glicerilo y talco.
Los ejemplos de diluyentes incluyen uno o mas de: agua, etanol, propilenglicol glicerina, y combinaciones de los mismos.
Los otros componentes se pueden usar de forma simultanea (por ejemplo, cuando se anaden en una mezcla en conjunto o cuando se administran mediante diferentes vfas) o de forma secuencial (por ejemplo, se pueden administrar mediante diferentes rutas).
Preferentemente, cuando la composicion de la presente invencion se mezcla con cualquier otro componente, Los microorganismos permanecen viables.
Como se usa en el presente documento la expresion "componente adecuado para consumo animal o humano" se refiere un compuesto que se anadio se puede anadir a la composicion de la presente invencion como un suplemento que puede tener un beneficio nutricional, un sustituto de fibra o puede tener un efecto generalmente beneficioso para el consumidor. Los ingredientes se pueden usar en una amplia variedad de productos que necesitan gelificacion, texturizacion, estabilizacion, suspension, formacion de pelfcula y estructuracion, deteccion de jugosidad, sin anadir viscosidad innecesaria. Preferentemente, los ingredientes seran capaces de mejorar el periodo de almacenamiento y estabilidad del cultivo viable.
Los componentes pueden ser prebioticos tales como alginato, xantano, pectina, goma de algarrobo (LBG), inulina, goma guar, galacto-oligosacarido (GOS), fructo-oligosacarido (FOS), polidextrosa (es decir, Litesse®), lactitol, lactosacarosa, oligosacaridos de soja, palatinosa, isomalto-oligosacaridos, gluco-oligosacaridos y xilo- oligosacaridos.
La cantidad optima de la composicion que se va a usar en la combinacion de la presente invencion dependera del producto que se va a tratar y/o el metodo de cuesta en contacto el producto con la composicion y/o el uso pretendido
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para la misma. La cantidad de microorganismos viable usado en las composiciones debena ser una cantidad suficiente para ser eficaz y para permanecer suficientemente eficaz para mejorar el aroma, sabor, suavidad, consistencia, textura, cuerpo, sensacion en boca, viscosidad, estructura y/o propiedades organolepticas, beneficios nutricionales y/o de salud de productos alimentarios que contienen dicha composicion. Este periodo de tiempo para eficacia se debena prolongar hasta al menos el momento de la utilizacion del producto.
Concentrados
Las composiciones para uso en la presente invencion pueden estar en forma de concentrados. Generalmente, estos concentrados comprenden una concentracion sustancialmente elevada de un microorganismo viable y/o un metabolito del mismo. El microorganismo y/o metabolito del mismo en el presente documento se puede denominar "la composicion de la presente invencion" o "composiciones".
Los polvos, granulos y composiciones lfquidas en forma de concentrados se pueden diluir con agua o se pueden volver a suspender en agua u otros diluyentes adecuados, por ejemplo, un medio de crecimiento apropiado como leche o aceites minerales o vegetales, para dar composiciones listas para usar.
Las combinaciones de la presente invencion en forma de concentrados se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica.
En un aspecto de la presente invencion, el producto se pone en contacto con una composicion en una forma concentrada. Preferentemente, el producto se pone en contacto con una composicion secada por pulverizacion y/o resuspendida.
Las composiciones de la presente invencion se pueden secar por pulverizacion o se pueden liofilizar con metodos conocidos en la tecnica.
Los procesos habituales para hacer partfculas usando un proceso de secado por pulverizacion implican un material solido que se disuelve en un disolvente apropiado (por ejemplo, un cultivo de un microorganismo en un medio de fermentacion). Como alternativa, el material se puede suspender o se puede emulsionar en un no disolvente para formar una suspension o emulsion. En esta etapa se pueden anadir opcionalmente otros ingredientes (como se ha discutido anteriormente) o componentes tales como agentes antimicrobianos, agentes estabilizantes, colorantes y agentes que ayudan con el proceso de secado.
A continuacion la solucion se atomiza para formar una fina niebla de gotitas. Las gotitas entran inmediatamente en una camara de secado en la que entran en contacto con un gas de secado. El disolvente se evapora de las gotitas en el gas de secado para solidificar las gotitas, formando de ese modo partfculas. A continuacion las partfculas se separan del gas de secado y se recogen.
Productos
En la presente invencion se puede usar cualquier producto que se pueda beneficiar de la composicion. Estos incluyen, pero no se limitan a, conservas de frutas y productos lacteos y productos obtenidos a partir de productos lacteos, cosmeticos y productos farmaceuticos. En el presente documento el microorganismo y/o metabolito del mismo se puede denominar "la composicion de la presente invencion" o "la composicion".
A modo de ejemplo, la composicion de la presente invencion se puede usar como un ingrediente para refrescos, un zumo de fruta o una bebida que comprende protema de suero de leche, infusiones de salud, bebidas de cacao y bebidas de bacterias acido lacticas, yogur y yogur para beber, queso, helado, helados de hielo y postres, confitena, pasteles de bizcocho y mezclas de pasteles, bocadillos, comidas y bebidas equilibradas, rellenos de frutas, glaseados, rellenos de chocolate, rellenos con sabor a carta de queso, relleno de pasteles con sabor a frutas, pasteles y glaseado, cremas de relleno de panadena instantanea, rellenos para galletas, relleno de panadena listo para usar, relleno de calonas reducidas, bebida nutricional para adultos, bebida de soja/zumo acidificada, bebida de chocolate aseptica/mezclada, mezclas de barras, polvos de bebida, leche de soja/pura y de chocolate enriquecida con calcio, bebida de cafe enriquecida con calcio.
La composicion se puede usar adicionalmente como un ingrediente en productos alimentarios tales como salsa de queso americana, agente antiaglomerante para queso rallado y desmenuzado, salsa de chips, queso crema, crema agria sin grasa con cobertura abatida mezclada seca, crema batida lactea congelada/descongelada, puntas batidas estables congeladas/descongeladas, queso Cheddar natural bajo en grasa y ligero, yogur bajo en grasa estilo suizo, postres congelados aireados, helado en envase duro, etiqueta ecologica, econoirna mejorada y tolerancia de helado con envase duro, helado con bajo contenido de grasa: servicio suave, salsa barbacoa, salsa para mojar de queso, aderezo de queso Cottage, salsa Alfredo mezcla seca, salsa de queso mezcla, salsa de tomate mezcla seca y otros.
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Para ciertos aspectos, la presente invencion se puede usar preferentemente en relacion con la produccion de yogur, tal como de vida de yogur fermentado, yogur, yogur para beber, queso, crema fermentada, postres a base de leche y otros.
De forma adecuada, la composicion se puede usa tradicionalmente como un ingrediente en una o mas de las aplicaciones de queso, aplicaciones de carne o aplicaciones que comprenden cultivos protectores.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para preparar un alimento o un ingrediente alimentario, el metodo comprendiendo la mezcla de la composicion de acuerdo con la presente invencion con otro ingrediente alimentario.
De forma ventajosa, la presente invencion se refiere a productos que se han puesto en contacto con la composicion de la presente invencion (y opcionalmente con otros componentes/ingredientes), en la que la composicion se usa en una cantidad que puede mejorar los beneficios del producto para la nutricion y/o para la salud.
Como se usa en este documento, la expresion "que se pone en contacto" se refiere a la aplicacion directa o indirecta de la composicion de la presente invencion al producto. Los ejemplos de los metodos de aplicacion que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, tratamiento del producto en un material que comprende la composicion, aplicacion directa mezclando la composicion con el producto, pulverizacion de la composicion sobre la superficie del producto o inmersion del producto en una preparacion de la composicion.
Cuando el producto de la invencion es un producto alimentario, la composicion de la presente invencion se mezcla preferentemente con el producto. Como alternativa, la composicion se puede incluir en la emulsion o ingredientes sin procesar de un producto alimentario. En una alternativa adicional, la composicion se puede aplicar como condimento, glaseado, mezcla de colorante y similares.
Para algunas aplicaciones, es importante hacer que la composicion este disponible en o sobre la superficie de un producto en el que se va a influir/tratar. Esto permite que la composicion proporcione una o mas de las siguientes caractensticas favorables: beneficios de para la nutricion y/o para la salud.
Las composiciones de la presente invencion se pueden aplicar para entremezclar, revestir y/o impregnar un producto con una cantidad controlada de un microorganismo viable.
Alimento
La composicion de la presente invencion se puede usar como - o en la preparacion de - un alimento. En el presente documento, el termino "alimento" se usa en un sentido amplio - y abarca alimento tanto para seres humanos como alimento para animales (es decir, un pienso). En un aspecto preferente, la comida es para consumo humano.
El alimento puede estar en forma de una solucion o como un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
Cuando se usa como - o en la preparacion de - un alimento - tal como alimento funcional - la composicion de la presente invencion se puede usar en conjunto con uno o mas de: un vehfculo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un ingrediente nutricionalmente activo.
Preferentemente, la composicion se usa para fermentar la leche o leche reforzada con sacarosa o medio lactico con sacarosa y/o maltosa, en la que el medio resultante que contiene todos los componentes de la composicion - es decir, dicho microorganismo de acuerdo con la presente invencion - se puede anadir como un ingrediente a leche de yogur en concentraciones adecuadas - tal como por ejemplo en concentraciones en el producto final que ofrecen una dosis diaria de 106-1010 cfu. El microorganismo de acuerdo con la presente invencion se puede usar antes o despues de la fermentacion del yogur.
Para algunos aspectos los microorganismos de acuerdo con la presente invencion se usan como - o en la preparacion de - piensos para animales, tales como ganado para animales, en particular piensos para aves de corral (tales como pollos) o alimentos para mascotas.
Ingrediente alimentario
La composicion de la presente invencion se puede usar como ingrediente alimentario y/o ingrediente alimenticio.
Como se usa en el presente documento, la expresion "ingrediente alimentario" o "ingrediente alimenticio" incluye una formulacion que se puede anadir a alimentos funcionales o alimentos comestibles como un suplemento nutricional.
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El ingrediente alimentario puede estar en forma de una solucion o como un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
Suplementos alimenticios
La composicion de la presente invencion puede ser - o se puede anadir a, suplementos alimentarios.
Alimentos funcionales
La composicion de la presente invencion puede ser - o se puede anadir a, a alimentos funcionales.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "alimento funcional" se refiere a alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional, sino que tambien es capaz de proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor.
En consecuencia, los alimentos funcionales son alimentos habituales que tienen componentes o ingredientes (tales como los que se describen en el presente documento) incorporados en ellos que imparten al alimento un efecto funcional espedfico - por ejemplo, beneficio medico o fisiologico - aparte de un efecto puramente nutricional.
Aunque no existe una definicion legal de un alimento funcional, la mayona de las partes interesadas con interes en este area estan de acuerdo en que son alimentos comercializados que tienen efectos espedficos para la salud mas alla de los efectos nutricionales basicos.
Algunos alimentos funcionales son nutraceuticos. En el presente documento, el termino "nutraceutico" se refiere a un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o una satisfaccion de sabor, sino que tambien es capaz de proporcionar un efecto terapeutico (u otro beneficio) al consumidor. Los nutraceuticos cruzan las lmeas divisorias tradicionales entre alimentos y medicina.
Las encuestas han sugerido que los consumidores ponen el mayor enfasis en las demandas de alimentos funcionales relacionados con enfermedades del corazon. La prevencion del cancer es otro aspecto de la nutricion que interesa mucho a los consumidores, pero curiosamente esta es el area en la que los consumidores sienten que pueden ejercer el menor control. De hecho, segun la Organizacion Mundial de la Salud, al menos un 35 % de los casos de cancer estan relacionados con la dieta. Ademas, las demandas relacionadas con efectos de osteoporosis, salud intestinal y obesidad tambien son factores fundamentales que probablemente pueden incitar a la compra de alimentos funcionales y fomentar el desarrollo del mercado.
Probiotico
Para algunas aplicaciones, se cree que los microorganismos viables de acido lactico en la composicion de la presente invencion pueden ejercer un efecto de cultivo probiotico. Dentro del alcance de la presente invencion tambien esta anadir a la composicion de la presente invencion otros probioticos y/o prebioticos.
En el presente documento, un prebiotico es:
"un ingrediente alimentario no digerible que afecta de manera beneficiosa al hospedador al estimular de forma selectiva el crecimiento y/o la actividad de una o un numero limitado de bacterias beneficiosas".
La expresion "cultivo probiotico", como se usa en el presente documento, define microorganismos vivos (incluidas bacterias o levaduras, por ejemplo) que, cuando se ingieren o se aplican de forma local en cantidad suficiente, afecta de manera beneficiosa al organismo hospedador, es decir, le confiere uno o mas beneficios para la salud demostrables en el organismo hospedador. Los probioticos pueden mejorar el equilibrio microbiano en una o mas superficies de mucosa. Por ejemplo, la superficie de mucosa puede ser el intestino, el tracto urinario, el tracto respiratorio o la piel. El termino "probiotico", como se usa en el presente documento, tambien abarca microorganismos vivos que pueden estimular las ramas beneficiosas del sistema inmunologico y al mismo disminuye las reacciones inflamatorias en una superficie de la mucosa, por ejemplo, el intestino.
Aunque no hay lfmites inferiores o superiores para la ingesta de probioticos, se ha sugerido que al menos 106-1012, preferentemente al menos 106-1010, preferentemente lO^-l 09, cfu como una dosis diaria sera eficaz para conseguir los efectos beneficiosos para la salud en un organismo hospedador, tal como un ser humano.
Ademas del efecto probiotico que puede tener el microorganismo de acuerdo con la presente invencion, dentro del alcance de la presente invencion tambien esta proporcionar prebioticos como otros compuestos que se pueden incluir en una combinacion junto con la composicion. En el presente documento el microorganismo de acuerdo con la presente invencion y/o un metabolito del mismo se puede denominar "la composicion". El componente prebiotico de la combinacion que comprende la composicion de la presente invencion se caracteriza por una fermentacion lenta en el intestino grueso. Los prebioticos de ese tipo pueden ejercer un efecto positivo sobre la flora intestinal, de
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forma espedfica en el lado izquierdo del colon, un area del intestino que es especialmente propensa a trastornos, en particular cancer intestinal y colitis ulcerosa.
Los prebioticos generalmente son carbohidratos no digeribles (oligo- o polisacaridos) o un alcohol de azucar que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebioticos conocidos usados en productos comerciales y utiles de acuerdo con la presente invencion incluyen inulina (fructo-oligosacarido o FOS) y transgalacto- oligosacaridos (GOS o TOS). Otros prebioticos adecuados incluyen oligosacarido palatinosa, oligosacarido de soja, gentiooligosacarido, xilooligomeros, almidon no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, polidextrosa (es decir, Litesse®) o similares.
En una realizacion la presente invencion se refiere a la combinacion de un microorganismo y/o metabolito del mismo de acuerdo con la presente invencion con un prebiotico.
El prebiotico para uso en esta combinacion puede ser uno o mas de los siguientes: inulina (fructo-oligosacarido, o FOS) y transgalacto-oligosacaridos (GOS o TOS). Otros prebioticos adecuados incluyen oligosacarido palatinosa, oligosacarido de soja, gentiooligosacarido, xilooligomeros, almidon no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, polidextrosa (es decir, Litesse®), o lactitol.
El prebiotico se puede administrar de forma simultanea con (por ejemplo, en mezcla junto con o se puede administrar de forma simultanea mediante la misma o diferentes vfas) o de forma secuencial (por ejemplo, con la misma o diferentes vfas) el microorganismo de acuerdo con la presente invencion y/o un metabolito del mismo.
La presente invencion contempla el uso de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en combinacion con un prebiotico en la fabricacion de un medicamento para uso en la induccion de saciedad y/o para tratar o prevenir el exceso de peso u obesidad.
Simbioticos
A presente invencion tambien contempla el uso tanto de pre- como de probioticos como ingredientes en combinacion. Con la composicion de la presente invencion que cuando se combinan se convierten en sinbioticos. En el presente documento el microorganismo de acuerdo con la presente invencion y/o un metabolito del mismo se puede denominar " la composicion". La finalidad de esto es combinar los efectos de nuevas bacterias beneficiosas y la estimulacion de las bacterias beneficiosas del propio organismo. Existe un potencial elevado en el desarrollo y en el consumo de mezclas de ese tipo, ya que algunas de estas pueden mostrar un buen efecto nutricional sinergico potente y/o efectos para la salud.
Por lo tanto la composicion de la presente invencion se puede disenar de forma espedfica para que contenga diferentes componentes que pueden proporcionar un efecto sinbiotico al consumidor.
Producto farmaceutico
La composicion de la presente invencion se puede usar como - o en la preparacion de - un producto farmaceutico. En el presente documento, la expresion "producto farmaceutico" se usa en un amplio sentido - y cubre productos farmaceuticos para seres humanos asf como productos farmaceuticos para animales (es decir, aplicaciones en veterinaria). En un aspecto preferente, el producto farmaceutico es para uso humano y/o para ganadena.
El producto farmaceutico puede ser para fines terapeuticos - que pueden ser de naturaleza curativa o paliativa o preventiva. El fruto farmaceutico puede ser incluso para fines de diagnostico.
Cuando se usa como - o en la preparacion de - un producto farmaceutico, la composicion de la presente invencion se puede usar en conjunto con uno o mas de: un vehnculo farmaceuticamente aceptable, un diluyente farmaceuticamente aceptable, un excipiente farmaceuticamente aceptable, un adyuvante farmaceuticamente aceptable, un ingrediente farmaceuticamente activo.
El producto farmaceutico se puede presentar en forma de una solucion o como un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
Ingrediente farmaceutico
Los microorganismos de la presente invencion se pueden usar con ingredientes farmaceuticos. En el presente documento, la composicion puede ser el unico componente activo o puede ser al menos uno de un numero (es decir, 2 o mas) de componentes activos.
El ingrediente farmaceutico puede estar en forma de una solucion o con un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
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Formas
El microorganismo de la presente invencion y/o un metabolite del mismo se puede usar en cualquier forma adecuada - ya sea cuando esta solo o cuando esta presente en una composicion con otros componentes o ingredientes. En el presente documento el microorganismo de la presente invencion y/o un metabolite del mismo se puede denominar "la composicion". Del mismo modo, las combinaciones que comprenden la composicion de la presente invencion y otros componentes y/o ingredientes (es decir, ingredientes - tales como ingredientes alimentarios, ingredientes alimentarios funcionales o ingredientes farmaceuticos) se pueden usar en cualquier forma adecuada.
El microorganismo de la presente invencion se puede usar en forma de preparaciones solidas o lfquidas o alternativas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones solidas incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, capsulas, polvos finos, granulos y polvos que se pueden humectar, secar por pulverizacion o liofilizar. Los ejemplos de preparaciones lfquidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones acusas, organicas o acuosas-organicas, suspensiones y emulsiones.
Los ejemplos adecuados de formas incluyen uno o mas de: comprimidos, pfldoras, capsulas, ovulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberacion inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.
A modo de ejemplo, si la composicion de la presente invencion se usa en forma de comprimido - tal como para su uso como un ingrediente funcional - los comprimidos tambien pueden contener uno o mas de: excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato sodico, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibasico y glicina; agentes disgregantes tales como almidon (preferentemente almidon de mafz, patata o tapioca), almidon glicolato sodico, croscarmelosa sodica y ciertos silicatos complejos; aglutinantes de granulacion tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arabiga; se pueden incluir agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico, behenato de glicerilo y talco.
Los ejemplos de vehteulos nutricionalmente aceptables para su uso en la preparacion de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azucares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, acido silteico, parafina viscosa, aceite de perfume, monogliceridos y digliceridos de acidos grasos, esteres de acidos grasos de petroetral, hidroximetil-celulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Los excipientes preferentes para las formas incluyen lactosa, almidon, una celulosa, azucar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular.
Para suspensiones acuosa y/o elixires, la composicion de la presente invencion se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, material colorante o colorantes, con agentes emulsionantes y/o de suspension y con diluyentes tales como agua, propilenglicol glicerina, y combinaciones de los mismos.
Las formas tambien pueden incluir capsulas de gelatina; capsulas de fibra, comprimidos de fibra, etc.; o incluso bebidas de fibra.
Los ejemplos adicionales de formas estan en la forma de una crema por ejemplo. Para algunos aspectos el microorganismo y/o un metabolito del mismo se puede incluir en cremas farmaceuticas y/o cosmeticas tales como cremas solares y/o cremas para despues del sol por ejemplo.
En un aspecto, la composicion de acuerdo con la presente invencion se puede administrar en un aerosol, por ejemplo a modo de una pulverizacion nasal, por ejemplo para administracion al tracto respiratorio.
Ejemplos
La presente invencion se describira a continuacion, solamente a modo de ejemplo, en la que se puede hacer referencia a las siguientes figuras:
La Figura 1 muestra el patron de expresion genetica del Peptido YY (PYY) en celulas Caco-2 tratadas con L. acidophilus. Los datos normalizaron con respecto a la cantidad de ARN. El mdice de diferencia se calculo al igual que en Livak y Schmittgen, 2001;
La Figura 2 muestra el efecto de medio de cultivo acondicionado con L. acidophilus en la expresion de PYY en celulas Caco-2;
La Figura 3 muestra la expresion genetica de PYY despues de exposicion a diferentes microorganismos que tienen propiedades probioticas;
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La Figura 4 muestra el efecto de celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus; micelas lip^dicas simples y una combinacion de las mismas en la expresion de PYY en celulas Caco-2 diferenciadas;
La Figura 5 muestra los efectos de metabolites de L. acidophilus; micelas lipfdicas complejas y una combinacion de los mismos en la expresion de PYY en celulas Caco-2 diferenciadas; y
La Figura muestra el efecto de sobrenadante sin celulas NCFM de L. acidophilus y bacterias en la expresion de PYY; y
La Figura 7 muestra el efecto de L. curvatus 853 en la expresion de PYY.
Ejemplo 1
Analizar el patron de expresion genetica del peptido YY (PYY) en celulas Caco-2 tratadas con L. acidophilus.
Metodo:
La lmea de celulas de carcinoma de colon humano, Caco-2, se cultivo en inserciones de cultivo celular semiporoso y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de diferenciacion de 5 dfas usando medios de diferenciacion (DM) formados por medio Entero-STIM suplementado con diluyente de suero MITO+ y que no contema antibioticos. La diferenciacion se monitorizo usando mediciones de TER y medicion de actividad de fosfatasa alcalina.
Las bacterias Lactobacillus acidophilus (cepa PTA-4797) se cultivaron en caldo de cultivo de MRS suplementado con glucosa al 1 % (peso/vol) hasta que la DO600 alcanzo 0,6-0,7. El tratamiento de L. acidophilus se anadio en el lado apical de la insercion del cultivo celular y se incubo durante 24 horas. el ARN se aislo de las celulas de acuerdo con el protocolo que se proporciona en el kit RNeasy mini (Qiagen), y el ADNc se sintetizo usando transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen). El patron de expresion geneticas en monitorizo usando el Verde SYBR (Applied Biosystems) con el Analizador Genetico ABI Prism 7000 con cebadores espedficos para el peptido YY de Homo sapiens. El cebador directo fue: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3' y el cebador inverso: 5'tGc GCA CGA ACA CCA TAG 3'. El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en valor de expresion relativo usando el metodo de Livak et al. (2001).
Como un control, las celulas Caco-2 crecieron del mismo modo en inserciones de cultivo celular sin tratamiento con L. acidophilus.
Resultados:
Los resultados de la actividad de fosfatasa alcalina asf como las mediciones de TER indican que las celulas se diferenciaron bien (los datos no se muestran).
EL analisis de expresion genetica muestra la expresion del peptido YY (PYY) marcador de saciedad. La expresion del peptido YY (PYY) aumento con un 255 % cuando se compara con el control cuando las celulas CaCo-2 se trataron con L. acidophilus (p < 0,05, ANOVA) (Figura 1).
El L. acidophilus - tratamiento de celulas Caco-2 aumento la expresion de un marcador de saciedad, el peptido YY. El resultado indica que el consumo de Lactobacillus acidophilus pueda aumentar la saciedad postprandial mediante el aumento de la senalizacion de saciedad en el intestino.
Ejemplo 2
Experimento in vitro que imita al alimento con glucosa
Experimento con celulas Caco-2 diferenciadas. Efecto de caldo de cultivo acondicionado con L. acidophilus en celulas tratadas con diversas cantidades de glucosa
Las celulas Caco-2 se cultivaron en inserciones de cultivo celular semiporoso y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de diferenciacion de 5 dfas usando medios de diferenciacion (DM) formados por medio Entero-STIM suplementado con diluyente de suero MITO+ y que no contema antibioticos. La diferenciacion se monitorizo usando mediciones de TER y medicion de actividad de fosfatasa alcalina. El cuarto dfa del experimento, el medio se cambio por un medio que no contema glucosa en ambos lados de la insercion y las celulas se privaron de glucosa durante 24 h.
Los tratamientos de las celulas Caco2 consistieron en celulas de control, que se trataron en el lado apical con medio que contema glucosa 0,5 mM, y 5 mM, y celulas de ensayo, que se trataron en el lado apical con medio que contema glucosa 0,5 mM, y 5 mM con adicion simultanea de tratamiento con L. acidophilus. Ademas, control se
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incluyeron celulas Caco2 sin ninguna adicion medio que contuviera glucosa en el lado apical. En todos los pocillos se anadio glucosa 5 mM en el lado basal. Las celulas se incubaron durante 24 h a 37 °C, Co2 al 5 %.
Las bacterias L. acidophilus se cultivaron en caldo de cultivo de MRS que no contema azucar hasta que la DO600 alcanzo 0,6-0,7. Las celulas se centrifugaron y el caldo de cultivo se filtro con esterilizacion y se uso en los medios de ensayo.
El ARN se aislo de las celulas Caco2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el kit RNeasy mini (Qiagen), y el ADNc se sintetizo usando la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen). El patron de expresion genetica de PYY se monitorizo usando la qmmica de sonda TaqMan (Applied Biosystems) con el Analizador Genetico ABI Prism 7000 usando un conjunto de oligonucleotidos que reconodan el PYY de Homo sapiens de forma espedfica.
Los oligonucleotidos inclman: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3', cebador inverso: 5'TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3', y una sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en valor cuantitativo absoluto usando una curva patron a partir de oligonucleotidos sinteticos cuantificados que representaban la secuencia antisentido de la transcripcion diana que muestra la relacion lineal log inversa entre el numero de copias y el ciclo de PCR (Nurmi et al., 2005 Nutrition and Cancer 51 (1): 83-92.) La secuencia de este oligonucleotido convencional es: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3'.
Resultados
Los resultados de la actividad de fosfatasa alcalina asf como las mediciones de TER indican que las celulas estaban bien diferenciadas (los datos nos muestran).
Los resultados se muestran en la Figura 2.
La adicion de caldo de cultivo de L. acidophilus aumento o la expresion de PYY en 1,3 veces en las muestras que conteman glucosa 0,5 mM (p < 0,05, ANOVA) y 2 veces en las muestras que conteman grupos 5 mM (p < 0,05) en comparacion con el control respectivo con una cantidad de glucosa similar). El cocultivo de L. acidophilus junto con celulas Caco2 aumento la expresion de PYY en 1,7 veces en las muestras que conteman glucosa 0,5 mM, and y en 2 veces en las muestras que conteman glucosa 5 mM en comparacion con las respectivas celulas de control con valores similares de glucosa.
Ejemplo 3
Experimentos in vitro con otros probioticos
Las celulas Caco-2 se cultivaron en inserciones de cultivo celular semiporoso y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de diferenciacion de 5 dfas usando medios de diferenciacion (DM) formados por medio Entero-STIM suplementado con diluyente de suero MITO+ y que no contema antibioticos. La diferenciacion se monitorizo usando mediciones de TER y medicion de actividad de fosfatasa alcalina.
Los tratamientos de las celulas Caco2 consistieron en celulas de control, que se trataron con medio de cultivo de Caco-2, y celulas de ensayo, que se trataron con caldo de cultivo prebiotico en medio de cultivo de Caco-2. Ademas, se incluyeron las celulas Caco2 de control con adicion de caldo de cultivo de MRS diluido en medio de cultivo de Caco-2. Las celulas se incubaron durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %.
Las bacterias pro bioticas se cultivaron en caldo de cultivo de MRS suplementado con un 1 % (peso/vol) de glucosa hasta que la DO600 alcanzo 0,6-0,7. Las celulas se centrifugaron y el caldo de cultivo se filtro con esterilizacion y se uso en el medio de ensayo. Las cepas probioticas sometidas a ensayo incluyeron las siguientes cepas comercializadas: B. lactis 420 (de Danisco), B. lactis HN019 (Nombre comercial Howaru™ Bifido - Danisco A/S) y L. salivarius Ls-33 (de Danisco).
El ARN se aislo de las celulas Caco2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el kit RNeasy mini (Qiagen), y el ADNc se sintetizo usando la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen). El patron de expresion genetica de PYY se monitorizo usando la qmmica de sonda TaqMan (Applied Biosystems) con el Analizador Genetico ABI Prism 7000 usando un conjunto de oligonucleotidos que reconodan el PYY de Homo sapiens de forma espedfica.
Los oligonucleotidos inclman: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3', cebador inverso: 5'TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3', y una sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en un valor cuantitativo absoluto usando una curva patron a partir de oligonucleotidos sinteticos cuantificados que representaban la secuencia antisentido de la transcripcion diana que muestra la relacion lineal log inversa entre el numero de copias y el ciclo de PCR (Nurmi et al., 2005 Nutrition and Cancer 51 (1): 83-92.). La secuencia de este
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oligonucleotido convencional es: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3'.
Resultados:
Los resultados se muestran en la Figura 3.
La adicion de B. lactis 420 y B. Lactis HN019 aumento la expresion de PYY en un 76 % y un 68 %, respectivamente, en comparacion con el control. El tratamiento de L. salivarius 33 aumento la expresion de PYY en un 67 % en comparacion con el control. Por lo tanto, otras materias distintas a L. acidophilus pueden tener el mismo efecto inductor de saciedad.
Ejemplo 4
Medida de la senalizacion de la saciedad en sangre en ratas
En este estudio como un modelo humano se usaron ratas aunque existen algunas diferencias fisiologicas. A diferencia del estomago humano, la parte proximal del estomago de la esta casi libre de jugo gastrico lo que permite que las bacterias sobrevivan y fielmente en el alimento en ese lugar. Esto puede producir diferencias en la saciedad entre el ser humano y la rata. Por lo tanto del plasma de rata obtenido usando el protocolo que sigue a continuacion se analizara para senales neuroendocrinologicas que surgen del estomago (grelina, leptina), intestino (CCK, GLP-1, PYY, orexinas) o metabolitos en circulacion sangumea (acido acetico, glucosa) y sus respuestas hormonales (insulina).
El tracto gastrointestinal es rico en celulas endocrinas y neuronales que sintetizan y secretan peptidos que aumentan la saciedad, colecistoquinina (CCK) y peptido YY (PYY), como respuesta a los estfmulos intraluminales asociados con la ingestion de una comida. La CCK inhibe la ingesta de comida rapidamente, y la duracion de la inhibicion es relativamente breve. Tambien se sabe que los acidos grasos de cadena corta producidos por microbios del intestino inducen saciedad induciendo la hormona intestinal PYY. Los probioticos tambien pueden producir la disminucion del apetito estimulando los peptidos grelina y orexina. La concentracion en plasma de los mencionados anteriormente aumenta antes de la comida y disminuyen rapidamente despues de la comida.
En consecuencia, la atencion se centrara en los niveles en plasma de peptidos que aumentan la saciedad CCK y PYY y tambien peptidos que estimulan el apetito grelina u orexina como un indicador del control de la ingesta de alimento corto plazo despues del suplemento con probioticos. Ademas, la concentracion en plasma de acido acetico se analizara para observar el nivel de productos de fermentacion en plasma.
Las ratas Wistar macho (HsdRddHan:WIST) con un peso de 248 g (STDEV 12,1 g) en el momento del inicio de los experimentos se alojaron a 21 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso libre a agua corriente a voluntad. Durante el periodo de aclimatacion (14 dfas) los ciclos normales se invirtieron y las ratas fueron entrenadas para consumir todo su alimento (20 g/dfa,) dentro de las 5 h desde el inicio del ciclo de oscuridad a las 8 AM. La Dieta Formulab 5008 usada fue una dieta con alto contenido de protema, y alto contenido de energfa y contema carbohidratos digeribles 49,5 5 y fibra. Las ratas se colocaron de forma aleatoria en dos grupos de tratamiento de 20 animales cada uno, y un grupo de 5 ratas. El ultimo grupo se anestesio a las 8 AM antes de recibir el alimento para proporcionar muestras de sangre en ayunas. Los grupos restantes fueron: Bifido 420 (1010), NCFM (1010), NCFM(1010) + lactitol (2 g), lactitol (2 g) solo y grupo de control. El Lactitol se incluyo ya que se sabe que aumenta la concentracion de PYY en circulacion por via postprandial. Todos los objetos de ensayo se administraron mediante alimentacion con tubo en un volumen de 2,5 ml de agua esteril/animal. al grupo de control se le administro agua esteril sin ningun suplemento, en las mismas condiciones. A los animales se les proporciono alimento convencional despues de la dosificacion. Cada grupo de ensayo se dividio en cinco subgrupos y cada subgrupo a su vez se anestesio para tomar muestras de sangre a las 1, 5, 10 y 24 h despues del inicio del ciclo de oscuridad. Las ratas se anestesiaron con dioxido de carbono para tomar muestras de sangre mediante puncion cardiaca.
Las concentraciones de PYY se analizaran a partir del plasma de acuerdo con Gee y Johnson (2005). Otras hormonas que se pueden analizar incluyen: GLP-1 con radioinmunoensayo (RIA) de acuerdo con Deacon et al., (2002) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282: E873-E879, grelina con RIA, CCK de acuerdo con Paloheimo y Rehfeld (1995), orexina de acuerdo con Heinonen et al., (2005), y acido acetico mediante HPLC. Todas las muestras de sangre se extraeran mediante puncion cardiaca en tubos de EDTA. Las muestras se centrifugaron a 1.600 x g a 4 °C durante 15 minutos. La fraccion de plasma se eliminara y se transferira a tubos recien preparados y se almacenara a -70 °C hasta su analisis.
Ensayos para monitorizar la ingesta de alimento en una comida
Se usan ratas Wistar macho como se ha descrito anteriormente. En cada grupo se usan diez ratas (grupos de ratas de control y alimentadas con dieta de ensayo).
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La ratas primero tienen diez dfas de aclimatacion al ensayo, tras lo cual el ensayo comienza y tiene una duracion de diez d^as. Las ratas se dividen en cinco grupos, un grupo de control y cuatro grupos de ensayo. En todos los grupos, la ratas se alimentan a voluntad con dieta de control. El grupo de control recibe solucion salina mediante una sonda una vez al dfa y los grupos de ensayo reciben L. acidophilus en una cantidad de 108 y 1010 con sonda una vez al dfa. Las ratas se alimentan preferentemente durante el ciclo de oscuridad.
La ingesta de alimentos y el aumento de peso se monitorizan despues de cada ciclo de oscuridad en cada rata.
Las investigaciones preliminares sugieren que la adicion de microorganismos, y en particular de cepas probioticas, en el alimento de las ratas disminuye la ingesta de alimentos por estas ratas.
Ensayo clinico: estudio de senalizacion de la saciedad postprandial en seres humanos
Un estudio piloto se pudo realizar con 15-20 voluntarios (sujetos humanos). Los sujetos son sus propios controles (dos ensayos separados con cualquiera de bebida de control o bebida de ensayo).
Los sujetos son preferentemente un numero igual de hombres y mujeres sanos de edad media (mdice de masa corporal IMC de aproximadamente 25).
Los sujetos se someten a una noche de ayuno.
A partir de ese momento, se les administra una bebida de ensayo (que comprende una o mas de las cepas de interes que se desvelan en la presente memoria descriptiva), y bebida de control (si las cepas de interes).
A continuacion, se toman muestras de sangre venosa a las 0, 2 y 5 horas.
Los sujetos tienen que rellenar un cuestionario, para hacer referencia a las sensaciones de hambre y saciedad que han tenido despues de haber tomado la bebida de ensayo o de control.
En paralelo, las concentraciones de PYY se miden a partir del plasma (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, USA).
Ejemplo 5
Experimento con celulas Caco-2 diferenciadas. Efecto de caldo de cultivo acondicionado de L. acidophilus en celulas tratadas con lipidos
Este experimento se realiza para imitar un alimento con acidos grasos:
El experimento se realizo con celulas Caco-2 que se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) JPharm Sci 91, 669-79). Las celulas se diferenciaron hasta que la resistencia electrica transepitelial (TEER) era de aproximadamente 200 ohm*cm2. Las micelas lipfdicas complejas se prepararon de acuerdo con (Chateau, D., Pauquai, T., Delers, F., Rousset, M., Chambaz, J. y Demignot, S. (2005) J. Cell Physiol 202, 767-776) con o sin 10 % metabolitos de NCFM de L. acidophilus. Las celulas Caco-2 se trataron con las micelas lipfdicas durante 3 horas tras lo cual la expresion de PYY se midio a partir de las celulas.
Materiales y Metodos
Las celulas Caco-2 (HTB-37, Coleccion Americana de Cultivos Tipo, ATCC) se mantuvieron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo basal que consistfa en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Invitrogen Carlsbad, CA, US) suplementado con FBS al 20 % (Invitrogen), glutamina estable 2 mM (Invitrogen), 1 x de aminoacidos no esenciales (Invitrogen), 20 U/ml de penicilina (Invitrogen), 20 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen), y 0,5 pg/ml de anfotericina (Invitrogen).
Las celulas Caco-2 se usaron en el pase 26 y se sembraron como 6,6 x 105 celulas/cm2 en inserciones de cultivo celular de 12 pocillos (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) JPharm Sci 91, 669-79). En resumen, despues de la siembra, las celulas se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo de celulas basales sin antibioticos, tras lo cual el medio se aspiro y se sustituyo con medio de diferenciacion (Entero-STIM, BD Biosciences), suplementado con diluyente de suero MITO+ (BD Biosciences) 250 pl/250 ml de medio. Al 4° dfa de cultivo, el medio se sustituyo, y al 5° dfa se realizo el experimento con micelas lipfdicas.
Las celulas NCFM de L. acidophilus (de Danisco Cultures, Paris, Francia) se cultivaron a 37 °C por via anaerobica en caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) suplementado con glucosa al 1,0 % hasta que la DO600 alcanzo 0,6-0,7. La densidad de las celulas bacterianas se determino con citometna de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, US) como se ha descrito anteriormente (Apajalahti, J. H., Kettunen, H., Kettunen, A.,
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Holben, W. E., Nurminen, P. H., Rautonen, N. y Mutanen, M. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68, 4986-4995). Los sobrenadantes sin celulas se recogieron mediante centrifugacion (25 °C, 5 min, 3000 g) y el sobrenadante se retiro. El sobrenadante sin celulas NCFM de L. acidophilus (denominados posteriormente como metabolitos de NCFM de L. acidophilus) asf como el control de MRS se diluyeron a un 10 % (v/v) en medio de diferenciacion y las micelas lipfdicas complejas se prepararon en los medios resultantes (vease a continuacion).
Las micelas lip^dicas complejas se prepararon en taurocolato 24 mM (Sigma, St Louis, MO, USA) en medio de diferenciacion. La composicion de las micelas complejas usada fue: acido oleico 0,6 mM - taurocolato 2 mM - 0,2- mono-oleilglicerol 2 mM - colesterol 0,05 mM - fosfatidilcolina 0,2 mM. Un mililitro de micelas se preparo mezclando acido oleico (6 pl de solucion de reserva 100 mM) con otros lfpidos (2 pl) en un tubo de vidrio esteril. Los lfpidos se secaron en atmosfera de gas nitrogeno a temperatura ambiente y el residuo se disolvio en 83 pl de taurocolato 24 mM en medio de diferenciacion y el volumen se llevo hasta 1 ml ya fuera con medio de diferenciacion desnudo, con medio de diferenciacion que consiste en un 10 % (v/v) MRS, o con medio de diferenciacion que consiste en un 10 % (v/v) metabolitos de NcFm de L. acidophilus.
Las micelas lipfdicas se aplicaron al quinto dfa de la diferenciacion de Caco-2 en el lado apical de las celulas, y se dejo que reaccionaran con las celulas durante 3 horas. Como controles 10 % (v/v) MRS y se usaron micelas lipfdicas complejas sin metabolitos de NCFM de L. acidophilus. Se prepararon en medio de diferenciacion.
Despues de los tratamientos los medios de cultivo celular se aspiraron en las celulas se sometieron a lisis con 150 pl of RA1 (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) suplementado con p-mercaptoetanol al 1 % (Sigma). El ARN de los lisados celulares se recogio con el kit de aislamiento de ARN Nucleospin 96 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Macherey-Nagel). La smtesis de la primera hebra de ADNc se realizo con cebadores aleatorios usando Superscript III de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Invitrogen). El patron de expresion de PYY en las muestras se analizo usando el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando oligonucleotidos que detectan de forma espedfica PYY de Homo sapiens. Los oligonucleotidos inclrnan: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; cebador inverso: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; y la sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en valor cuantitativo absoluto usando una curva patron a partir de oligonucleotidos sinteticos cuantificados que representaban la secuencia antisentido de la transcripcion diana que muestra la relacion lineal log inversa entre el numero de copias y el ciclo de PCR (Nurmi, J. T., Puolakkainen, P. A. y Rautonen, N. E. (2005) Nutr Cancer 51, 83-92). La secuencia de este oligonucleotido convencional es: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3'.
El analisis estadfstico se realizo con ensayo de t de Student.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 5.
La expresion del peptido YY marcador de saciedad (PYY) aumento cuando las celulas Caco-2 se trataron con metabolitos de NCFM de L. acidophilus solos o combinados con las micelas lipfdicas complejas.
En el experimento con micelas lipfdicas complejas (formadas por acido oleico 0,6 mM, 2-mono-oleilglicerol 2 mM, colesterol 0,2 mM y L-a-fosfatidilcolina 0,05 mM), el caldo de cultivo de MRS combinado con la mezcla de micelas lipfdicas complejas no induda la expresion de PYY cuando se comparo con el tratamiento con micelas lipfdicas complejas solo. Los metabolitos de NCFM de L. acidophilus aumentaron la expresion de PYY en comparacion con los controles (p < 0,05 cuando se comparan con micelas lipfdicas complejas solo, y p = 0,05 cuando se comparan con un 10 % de MRS solo). Cuando las micelas lipfdicas complejas se combinaron con los metabolitos de NcFm de L. acidophilus al 10 % aumento adicionalmente la expresion de PYY (p < 0,05 cuando se compara con cualquiera del tratamiento con micelas lipfdicas complejas, o con el tratamiento con MRS al 10 %).
Ejemplo 6
Efecto de celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus en celulas Caco-2 diferenciadas tratadas con lipidos
El experimento se realizo con celulas Caco-2 que se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci 91, 669-79). Las celulas se diferenciaron hasta que la resistencia electrica transepitelial (TEER) era de aproximadamente 200 ohm*cm2. Las micelas lipfdicas complejas se prepararon de acuerdo con (Chateau, D., Pauquai, T., Delers, F., Rousset, M., Chambaz, J. y Demignot, S. (2005) J. Cell Physiol 202, 767-776), con o sin celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus en una proporcion de 50 celulas bacterianas con respecto a una celula Caco-2. Las celulas Caco-2 se trataron con las micelas lipfdicas durante 3 horas tras lo cual la expresion de PYY se midio a partir de las celulas.
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Materiales y Metodos
Las celulas Caco-2 (HTB-37, Coleccion Americana de Cultivos Tipo, ATCC) se mantuvieron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo basal que consistia en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Invitrogen Carlsbad, CA, US) suplementado con FBS al 20 % (Invitrogen), glutamina estable 2 mM (Invitrogen), 1 x de aminoacidos no esenciales (Invitrogen), 20 U/ml de penicilina (Invitrogen), 20 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen), y 0,5 pg/ml de anfotericina (Invitrogen).
Las celulas Caco-2 se usaron en el pase 26 y se sembraron como 6,6 x 105 celulas/cm2 en inserciones de cultivo celular de 12 pocillos (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) JPharm Sci 91, 669-79). En resumen, despues de la siembra, las celulas se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo de celulas basales sin antibioticos, tras lo cual el medio se aspiro y se sustituyo con medio de diferenciacion (Entero-STIM, BD Biosciences), suplementado con diluyente de suero MITO+ (BD Biosciences) 250 pl/250 ml de medio. Al 4° dfa de cultivo, el medio se sustituyo, y al 5° dfa se realizo el experimento con micelas lipfdicas.
Las celulas NCFM de L. acidophilus (de Danisco Cultures, Paris, Francia) se cultivaron a 37 °C por via anaerobica en caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) suplementado con un 1,0 % (peso/volumen) de glucosa hasta que la DO600 alcanzo 0,6-0,7. La densidad de las celulas bacterianas se determino con citometna de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, US) como se ha descrito anteriormente (Apajalahti, J. H., Kettunen, H., Kettunen, A., Holben, W. E., Nurminen, P. H., Rautonen, N. y Mutanen, M. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68, 4986-4995). Las celulas bacterianas se recogieron mediante centrifugacion (25 °C, 5 min, 3000 g) y el sobrenadante se retiro. Las celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus se lavaron una vez con medio de diferenciacion y las micelas lipfdicas simples se prepararon con las bacterias (vease a continuacion).
Las micelas lipfdicas simples se prepararon en taurocolato 24 mM (Sigma, St Louis, MO, USA) en medio de diferenciacion. La composicion de las micelas simples fue: acido oleico 0,6 mM - taurocolato 2 mM. Un mililitro de micelas se preparo a partir de acido oleico (6 pl de solucion de reserva 100 mM) en un tubo de vidrio esteril. El acido oleico se seco en atmosfera de gas nitrogeno a temperatura ambiente y el residuo se disolvio en 83 pl de taurocolato 24 mM en medio de diferenciacion y el volumen se llevo hasta 1 ml ya sea con medio de diferenciacion desnudo, con medio de diferenciacion que consiste en un 10 % (v/v) de MRS, o con medio de diferenciacion que consiste en un celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus en una proporcion de 50 celulas bacterianas con respecto a una celula Caco-2.
Las micelas lipfdicas se aplicaron al quinto dfa de la diferenciacion de Caco-2 en el lado apical de las celulas, y se dejo que reaccionaran con las celulas durante 3 horas. Como controles se uso un 10 % (v/v) de medio MRS y micelas lipfdicas simples sin celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus. Se prepararon en medio de diferenciacion.
Despues de los tratamientos los medios de cultivo celular se aspiraron en las celulas se sometieron a lisis con 150 pl de RA1 (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) suplementado con p-mercaptoetanol al 1 % (Sigma). El ARN de los lisados celulares se recogio con el kit de aislamiento de ARN Nucleospin 96 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Macherey-Nagel). La smtesis de la primera hebra de ADNc se realizo con cebadores aleatorios usando Superscript III de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Invitrogen). El patron de expresion de PYY en las muestras se analizo usando el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando oligonucleotidos que detectan de forma espedfica PYY de Homo sapiens. Los oligonucleotidos inclrnan: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; cebador inverso: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; y la sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en valor cuantitativo absoluto usando una curva patron a partir de oligonucleotidos sinteticos cuantificados que representaban la secuencia antisentido de la transcripcion diana que muestra la relacion lineal log inversa entre el numero de copias y el ciclo de PCR (Nurmi, J. T., Puolakkainen, P. A. y Rautonen, N. E. (2005) Nutr Cancer 51, 83-92).
La secuencia de este oligonucleotido convencional es: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3'.
El analisis estadfstico se realizo con ensayo de t de Student.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 4.
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La expresion del peptido YY marcador de saciedad (PYY) aumento cuando las celulas Caco-2 se trataron con celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus solo o combinado con las micelas lip^dicas simples.
En el experimento con micelas lipfdicas simples formadas por acido oleico 0,6 mM en taurocolato 2 mM, el caldo de cultivo de MRS combinado con la mezcla de micelas lipfdicas simples no indujo la expresion de PYY cuando se comparo con el tratamiento con micelas lipfdicas solo. Las celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus aumentaron la expresion de PYY en comparacion con los controles (p < 0,05 cuando se comparan con micelas lipfdicas solo, y cuando se comparan con un 10 % de MRS solo). Cuando las micelas lipfdicas se combinaron con las celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus en una proporcion de 50 celulas bacterianas con respecto a una celula Caco-2 la expresion de PYY se indujo del mismo modo aun que la alta variacion provoco una disminucion de la significancia estadfstica (p = 0,08 cuando se compara con el tratamiento con micelas lipfdicas complejas).
Ejemplo 7
Efecto de L. acidophilus NCFM en la expresion de PYY (Series de tiempo)
Esbozo del ensayo
El experimento se realizo con celulas Caco-2 que se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) JPharm Sci 91, 669-79). Las celulas se diferenciaron hasta que la resistencia electrica transepitelial (TEER) era de aproximadamente 200 ohm*cm2. Las celulas se trataron con celulas bacterianas (50 microbios: Una celula Caco-2) o con un 0,1 % (v/v), un 1 % (v/v), y un 10 % (v/v) de sobrenadante sin celulas diluido en medio de cultivo de celulas Caco-2. Las muestras para estudios de expresion de PYY se recogieron en dos puntos temporales 3 h y 24 h despues de administrar las sustancias de ensayo.
Materiales y Metodos
Las celulas Caco-2 (HTB-37, Coleccion Americana de Cultivos Tipo, ATCC) se mantuvieron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo basal que consistfa en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Invitrogen Carlsbad, CA, US) suplementado con FBS al 20 % (Invitrogen), glutamina estable 2 mM (Invitrogen), 1 x de aminoacidos no esenciales (Invitrogen), 20 U/ml de penicilina (Invitrogen), 20 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen), y 0,5 pg/ml de anfotericina (Invitrogen).
Las celulas Caco-2 se usaron en el pase 58 y se sembraron como 6,6 x 105 celulas/cm2 en inserciones de cultivo celular de 12 pocillos (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci 91, 669-79). En resumen, despues de la siembra, las celulas se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo de celulas basales sin antibioticos, tras lo cual el medio se aspiro y se sustituyo con medio de diferenciacion (Entero-STIM [BD Biosciences] suplementado con diluyente de suero MITO+ [BD Biosciences], 250 pl/250 ml de medio.) Al 4° dfa de cultivo, el medio se sustituyo, y al 5° dfa se realizo el experimento con bacterias asf como con sobrenadante sin celulas.
La cepa NCFM de L. acidophilus (Danisco Cultures, Paris, Francia) se cultivo recien preparada en condiciones anaerobicas a 37 °C en caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) suplementado con glucosa al 1,0 % (p/v) hasta que la DO600 alcanzo 1,0-1,5. El sobrenadante sin celulas se recogio mediante centrifugacion (25 °C, 5 min, 3000 g) y se retiro, y se diluyo a un 0,1 % (v/v), un 1 % (v/v) y un 10 % (v/v) en medio de diferenciacion, y se filtro a traves de unidades de filtro de jeringa esteriles de 0,2 pm (Sartorius, Goettingen, Alemania). La densidad de las celulas bacterianas se calculo basandose en el valor de la DO, y se lavaron una vez con EnteroStim y se volvieron a suspender en EnteroStim en una proporcion de 50 celulas bacterianas con respecto a una celula Caco-2. Las sustancias de ensayo se aplicaron sobre el lado apical de las celulas Caco-2.
Despues de los tratamientos los medios de cultivo celular se aspiraron en las celulas se sometieron a lisis con 150 pl de RA1 (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) suplementado con p-mercaptoetanol al 1 % (Sigma). Las muestras para el analisis de expresion de PYY de muestras de NCFM de L. acidophilus se tomaron despues de 3 h y 24 h de incubacion. El aRn de los lisados celulares se recogio con el kit de aislamiento de ARN Nucleospin 96 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Macherey-Nagel). La smtesis de la primera hebra de ADNc se realizo con cebadores aleatorios usando Superscript III de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Invitrogen). El patron de expresion de PYY en las muestras se analizo usando el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando oligonucleotidos que detectan de forma espedfica PYY de Homo sapiens. Los oligonucleotidos inclrnan: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; cebador inverso: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; y la sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de umbral de fondo, se transformo en valor cuantitativo absoluto usando una curva patron a partir de oligonucleotidos sinteticos cuantificados que representaban la secuencia antisentido de la transcripcion diana que muestra la relacion lineal log inversa entre el numero de copias y el ciclo de PCR (Nurmi, J. T., Puolakkainen, P. A. y
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Rautonen, N. E. (2005) Nutr Cancer 51, 83-92). La secuencia de este oligonucleotido convencional es: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3'.
El analisis estadfstico se realizo con ANOVA.
Resultados
La Figura 6 muestra el efecto del sobrenadante sin celulas de NCFM de L. acidophilus y bacterias en la expresion de PYY. Se usaron tres diluciones diferentes de sobrenadante sin celulas de un 0,1 (v/v), un 1 % (v/v), y un 10 % (v/v). Las muestras para el estudio de expresion de PYY se recogieron 3 y 24 horas despues de la aplicacion de la sustancia de ensayo. * p < 0,05 en comparacion con el control de Enterostim (medio); LA NCFM bact = bacterias NCFM de L. acidophilus.
Las celulas bacterianas de NCFM de L. acidophilus aumentaron la expresion de PYY en ambos puntos temporales, 3 h y 24 h despues de la aplicacion de las bacterias.
El sobrenadante sin celulas aumento la expresion de PYY como un 10 % de dilucion despues de 3 h de incubacion.
La dosis asf como el momento del tratamiento influye en la expresion de PYY. Las celulas bacterianas, en particular las celulas bacterianas viables, pueden tener un efecto mas sostenible en la expresion de PYY que los metabolitos.
Ejemplo 8
Efecto de las celulas bacterianas de L. curvatus 853 en la expresion de PYY
El experimento se realizo con celulas Caco-2 que se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) JPharm Sci 91, 669-79). Las celulas se diferenciaron hasta que la resistencia electrica transepitelial (TEER) era de aproximadamente 200 ohm*cm2. Las celulas se trataron con las celulas bacterianas de L. curvatus 853 (50 microbios: Una celula Caco-2. Las muestras para analisis de expresion genetica se recogieron despues de 4 horas de tratamiento.
Materiales y Metodos
Las celulas Caco-2 (HTB-37, Coleccion Americana de Cultivos Tipo, ATCC) se mantuvieron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo basal que consistfa en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Invitrogen Carlsbad, CA, US) suplementado con FBS al 20 % (Invitrogen), glutamina estable 2 mM (Invitrogen), 1 x de aminoacidos no esenciales (Invitrogen), 20 U/ml de penicilina (Invitrogen), 20 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen), y 0,5 pg/ml de anfotericina (Invitrogen).
Las celulas Caco-2 se usaron en el pase 58 y se sembraron como 6,6 x 105 celulas/cm2 en inserciones de cultivo celular de 12 pocillos (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y se diferenciaron de acuerdo con un protocolo de 5 dfas (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. y Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci 91, 669-79). En resumen, despues de la siembra, las celulas se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada en medio de cultivo de celulas basales sin antibioticos, tras lo cual el medio se aspiro y se sustituyo con medio de diferenciacion (Entero-STIM [BD Biosciences] suplementado con diluyente de suero MITO+ [BD Biosciences], 250 pl/250 ml de medio.) Al 4° dfa de cultivo, el medio se sustituyo, y al 5° dfa se realizo el experimento con celulas bacterianas.
L. curvatus 853 se cultivo recien preparado en condiciones anaerobicas a 37 °C en caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) suplementado con glucosa al 1,0 % hasta que la DO600 alcanzo 1,0-1,5. El sobrenadante sin celulas se recogio mediante centrifugacion (25 °C, 5 min, 3000 g) y se retiro. La densidad de las celulas bacterianas se calculo basandose en el valor de la DO, y se lavaron una vez con EnteroStim, se diluyeron y se aplicaron sobre el lado apical de las celulas Caco-2.
Despues del tratamiento de 4 horas, los medios de cultivo celular se aspiraron en las celulas se sometieron a lisis con 150 pl de RA1 (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) suplementado con p-mercaptoetanol al 1 % (Sigma). El ARN de los lisados celulares se recogio con el kit de aislamiento de ARN Nucleospin 96 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Macherey-Nagel). La smtesis de la primera hebra de ADNc se realizo con cebadores aleatorios usando Superscript III de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Invitrogen). El patron de expresion de PYY en las muestras se analizo usando el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando oligonucleotidos que detectan de forma espedfica PYY de Homo sapiens. Los oligonucleotidos inclrnan: cebador directo: 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; cebador inverso: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; y la sonda: sonda Universal ProbeLibrary N.° 10 (Roche). El ciclo del umbral obtenido (Ct), que es el ciclo de PCR en el cual la intensidad de fluorescencia cruza un valor de
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El analisis estadfstico se realizo con ANOVA.
Resultados
La Figura 7 muestra el efecto de L. curvatus 853 en la expresion de PYY. Las muestras para el estudio de expresion de PYY se recogieron 4 horas despues de la aplicacion de la sustancia de ensayo. * p < 0,05 en comparacion con el medio solo de control.
Las celulas bacterianas de L. curvatus 853 aumentaron la expresion de PYY despues de 4 horas de incubacion. Referencias
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Claims (19)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Uso de una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo en la fabricacion de un soporte para administracion a un sujeto para el tratamiento y/o prevencion de obesidad y/o para la prevencion de una enfermedad causada por obesidad; en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo.
- 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el microorganismo y/o un metabolito del mismo modula uno o mas marcadores de saciedad.
- 3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 2 en el que la modulacion se produce de forma postprandial.
- 4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el microorganismo y/o un metabolito del mismo modula uno o mas de los marcadores de saciedad seleccionados entre el grupo que consiste en: PYY, CCK, Grelina, Leptina, GLP-1, orexinas, neuropeptido Y hipotalamico orexigenico, acido acetico, amilina y oxintomodulina.
- 5. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que el nivel de uno o mas de los siguientes marcadores de saciedad aumenta en plasma y/o el intestino: PYY, CCK, GLP-1, leptina (en sangre periferica), insulina y acido acetico.
- 6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que el nivel de uno o mas de los siguientes marcadores de saciedad disminuye: grelina, orexinas y leptina (en el cerebro).
- 7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el soporte es un soporte farmaceuticamente aceptable o un producto alimentario.
- 8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el soporte es un medicamento.
- 9. Uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en el que el microorganismo es la cepa PTA-4797 de Lactobacillus acidophilus.
- 10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el microorganismo y/o un metabolito del mismo se usa en combinacion con uno o mas lfpidos y/o una o mas micelas lipfdicas.
- 11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el microorganismo y/o metabolito del mismo se usa en combinacion con un prebiotico.
- 12. Uso de acuerdo con la reivindicacion 11 en el que el prebiotico es uno mas de los siguientes: inulina, un transgalacto-oligosacarido, oligosacarido de palantinosa, oligosacarido de soja, gentiooligosacarido, oxilooligomeros, almidon no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, o polidextrosa.
- 13. Una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para uso en un metodo para tratar y/o prevenir la obesidad y/o prevenir una enfermedad causada por la obesidad en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA- 4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolito es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo.
- 14. Una cepa de un microorganismo o un metabolito del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 13 en el que la cepa se incorpora en un soporte.
- 15. Una cepa de un microorganismo o un metabolito del mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 en la que el soporte es un soporte farmaceuticamente aceptable o un producto alimentario.
- 16. Una cepa de un microorganismo o un metabolito del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 15 en la que el soporte es un medicamento.
- 17. Una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en la que el microorganismo y/o metabolito del mismo se administra en combinacion con un prebiotico.
- 18. Una cepa de un microorganismo y/o un metabolito del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 17 en la que el prebiotico es uno mas de los siguientes: inulina, un transgalacto-oligosacarido, oligosacarido de palantinosa, oligosacarido de soja, gentiooligosacarido, oxilooligomeros, almidon no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, o polidextrosa.
- 19. Un metodo no terapeutico para reducir el exceso de peso en un sujeto no obeso que comprende la administracion de una cantidad eficaz de una cepa de un microorganismo y/o un metabolite del mismo, en el que la cepa es Lactobacillus acidophilus PTA-4797, o Bifidobacterium lactis 420, o Bifidobacterium lactis HN019, o Lactobacillus salivarius 33, y en el que el metabolite es un extracto bruto de un medio de cultivo en el que el 5 microorganismo se cultiva o se cultivo y/o del microorganismo.
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