ES2296335T3 - Utilizacion de uteroglobina humana recombinante en el tratamiento de afecciones fibroticas. - Google Patents
Utilizacion de uteroglobina humana recombinante en el tratamiento de afecciones fibroticas. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina humana recombinante (rhUG) o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Description
Utilización de uteroglobina humana recombinante
en el tratamiento de afecciones fibróticas.
La invención se refiere en general al
tratamiento de afecciones inflamatorias y fibróticas utilizando
uteroglobina humana (hUG) o uteroglobina humana recombinante
(rhUG). Se han identificado papeles fisiológicos y terapias
novedosas para la UG (hUG o rhUG). Específicamente, la invención
hace referencia al tratamiento de afecciones inflamatorias y
fibróticas mediante la administración de hUG o rhUG para inhibir
PLA_{2} y/o para prevenir el depósito de fibronectina. La
invención proporciona adicionalmente el tratamiento del síndrome de
fatiga respiratoria neonatal (RDS) y la displasia broncopulmonar
(BPD), una afección crítica del pulmón, y la nefropatía glomerular,
una enfermedad del riñón, ambas caracterizadas por afecciones
inflamatorias y fibróticas.
Los documentos citados en esta solicitud hacen
referencia al estado de la técnica a la cual pertenece esta
invención.
La búsqueda de agentes terapéuticos mejorados
para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias y fibróticas
ha recibido mucha atención en los últimos años. La RDS neonatal, una
enfermedad por deficiencia en tensioactivo pulmonar, es una
afección de particular interés ya que es una de las causas
principales de mortalidad en los neonatos prematuros. Si bien la
introducción de la terapia con tensioactivos mejora
espectacularmente la supervivencia de los pacientes con RDS, el
desarrollo de enfermedades inflamatorias y fibróticas crónicas en un
porcentaje significativo de esta población de pacientes es un
problema principal. Del mismo modo, la nefropatía glomerular
hereditaria por depósito de fibronectina conduce a una insuficiencia
renal en la fase final cuando los riñones del paciente se quedan
bloqueados y no filtran más la sangre. La nefropatía se caracteriza
por depósitos de fibronectina y fibrosis de los riñones que
convierten el órgano en no funcional, y a la larga, incapaz de
mantener la
vida.
vida.
La PLA_{2} (fosfolipasa A_{2}), una clase de
enzimas endógenas que hidrolizan el enlace éster de la posición Sn2
de los glicerofosfolípidos, es una de las muchas proteínas
implicadas en las afecciones inflamatorias y fibróticas. Asimismo
es responsable de la hidrólisis de los fosfolípidos tensioactivos en
los pulmones. La uteroglobina (también conocida como CC10, CC16,
CC17, proteína-1 de la orina, P-1,
proteína de unión a progesterona, proteína de unión a PCB, proteína
secretora de células Clara (CCSP), blastoquinina, proteína de unión
a retinol, proteína de unión a fosfolípidos, y alfa2 microglobulina)
inhibe la actividad de PLA_{2} in vitro.
La uteroglobina es una proteína homodimérica
globular pequeña. Tiene un peso molecular de 15,8 kDa, pero migra
en geles electroforéticos a un tamaño correspondiente a 10 kDa. La
uteroglobina humana es abundante en el pulmón humano adulto, y
comprende hasta aproximadamente un 7% de la proteína soluble total.
No obstante, su expresión no está totalmente activada en el feto
humano en desarrollo hasta el final de la gestación. Por
consiguiente, los fluidos extracelulares del pulmón de los lactantes
pre-término contienen bastante menos UG que los de
los adultos. La UG también es expresada por el páncreas.
Las PLA_{2} juegan papeles críticos en la
respuesta inflamatoria debido a que liberan ácido araquidónico (AA)
de los reservorios de fosfolípidos celulares. El AA es metabolizado
a numerosos mediadores inflamatorios potentes en un proceso
referido como cascada de ácido araquidónico.
Varias afecciones clínicas agudas y crónicas
están caracterizadas por una elevada actividad de PLA_{2} en
suero o local (véase la Tabla 1, más abajo).
No existen inhibidores de PLA_{2} eficaces
disponibles en la actualidad para uso clínico. Hasta la fecha,
solamente unos pocos inhibidores de PLA_{2} han progresado en las
pruebas clínicas, pero ninguno se ha cualificado para su
comercialización en el mercado.
La fibronectina (Fn) es una glicoproteína de 200
kDa que existe en varias formas diferentes y es secretada por
diferentes tejidos. La Fn es una proteína esencial y la
desorganización dirigida del gen de la Fn en ratones demostró que
tiene un papel central en la embriogénesis. La Fn también juega un
papel clave en la inflamación, la adherencia celular, la reparación
de tejidos y la fibrosis, y se deposita en el lugar de la lesión. La
fibronectina del plasma (pFn) es secretada por el hígado y circula
en el plasma. En el pulmón, la Fn celular (cFn) es secretada tras
la inflamación y la lesión. Ambos tipos de Fn son factores
quimiotácticos para las células inflamatorias y los fibroblastos.
Un gran número de células inflamatorias y fibroblastos se infiltran
en el pulmón durante los episodios inflamatorios, que pueden
conducir a la fibrosis pulmonar y por último a la muerte. Se han
detectado niveles elevados de Fn en condiciones clínicas en seres
humanos tales como RDS neonatal y PBD del pulmón, y nefropatía
glomerular del riñón.
El análisis de aminoácidos de la UG humana
purificada revela que es estructuralmente similar pero no idéntica
a otras proteínas "de tipo UG", por ejemplo UG de conejo.
Treinta y nueve de los 70 aminoácidos son idénticos entre la UG
humana y de conejo (véase la Figura 1). Las proteínas "de tipo
UG", incluyendo UG/CC10 humana, CC10 de rata, CC10 de ratón, y
UG de conejo, muestran diferencias antigénicas específicas de la
especie y específicas del tejido, así como diferencias en su
distribución en los tejidos y actividades bioquímicas in
vitro. Se han descrito proteínas de tipo UG en muchos contextos
diferentes con respecto al tejido y la especie de origen,
incluyendo pulmón de rata, orina humana, esputo, componentes de la
sangre, útero de conejo, próstata de rata y humana, y pulmón
humano. En la actualidad no existen papeles fisiológicos conocidos
para estas proteínas.
A pesar de años de estudio, los papeles
biológicos de estas proteínas in vivo permanecen poco claros.
La ausencia de identidad estructural entre las proteínas de tipo UG
hace imposible predecir si una proteína poseerá función terapéutica
in vivo en seres humanos basándose en la actividad in
vitro u otra actividad mostrada por una proteína
estructuralmente relacionada. Por ejemplo, la uteroglobina humana se
une a menos del 5% de la cantidad de progesterona que la UG de
conejo en el mismo análisis. La UG humana tiene un punto
isoeléctrico más bajo (4,6) que la UG de conejo (5,4).
Stripp et al. (1.996) han informado sobre
estudios con ratones con el gen de la uteroglobina desactivado
generados para eliminar la expresión de la uteroglobina. El ratón
tiene células Clara que muestran estructuras intracelulares
extrañas en lugar de gránulos de secreción de uteroglobina, pero no
existe otro fenotipo. Esta observación es muy significativa debido
a que se esperaba una función pulmonar acompañada de inflamación y
fibrosis pulmonar. Por otra parte, este ratón con el gen
desactivado no mostraba evidencia de anomalías renales,
pancreáticas, o reproductivas, indicando que la proteína
uteroglobina no tenía un papel significativo en el control de la
inflamación o la fibrosis
in vivo.
in vivo.
Por lo tanto, un objeto de la invención es
proporcionar una composición farmacéutica que incluye una
fibronectina que se une a una cantidad eficaz de uteroglobina
humana recombinante o un fragmento o derivado de la misma, un
tensioactivo pulmonar, y un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
Adicionalmente, la invención describe un método
para inhibir enzimas PLA_{2} in vivo en un mamífero que
necesita semejante tratamiento, donde el método incluye administrar
a un mamífero una cantidad eficaz inhibidora de PLA_{2} de
uteroglobina humana nativa o recombinante o un fragmento o derivado
de la misma.
Aún más, la presente invención describe un
método para tratar o prevenir una afección inflamatoria en un
paciente que necesita semejante tratamiento, donde el método
incluye administrar una cantidad eficaz como
anti-inflamatorio de UG nativa o recombinante o un
fragmento o derivado de la misma.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar el uso, para la fabricación de una composición
farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica en un
paciente que necesita semejante tratamiento, de una fibronectina
que se une a una cantidad eficaz de UG nativa o recombinante o un
fragmento o derivado de la misma.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el uso, para la fabricación de una composición
farmacéutica para tratar o prevenir una afección inflamatoria o
fibrótica caracterizada por una deficiencia en UG endógena, de una
cantidad compensatoria de UG nativa o recombinante o un fragmento o
derivado de la misma.
Finalmente, un objeto de la presente invención
es proporcionar un análisis que cuantifica los complejos de
uteroglobina-fibronectina en una muestra
clínica.
Se ha encontrado ahora que la uteroglobina juega
un papel fisiológico central en la inhibición de PLA_{2} y en la
prevención del depósito de fibronectina y la fibrosis in
vivo. Una combinación de experimentos realizados en una nueva
cepa de ratones transgénicos con el "gen de la uteroglobina
desactivado", y en un modelo de mono de síndrome de fatiga
respiratoria neonatal (RDS) que implica inflamación y fibrosis
pulmonar demuestran estos efectos. Los ratones con el gen de la
uteroglobina desactivado de la presente invención (referidos en
adelante como "ratones/ratón UG KO") muestran una nefropatía
glomerular y una fibrosis parenquimal renal letales, como
enfermedades de comienzo temprano y tardío, respectivamente. La
administración de Fn exógena a los ratones normales ocasiona el
depósito de Fn en los riñones, pero la administración de cantidades
equimolares de Fn y rhUG no.
Se ha demostrado la reducción de la actividad de
PLA_{2} in vivo en presencia de rhUG. En un primer
experimento, el fenotipo de los ratones UG KO reveló que la
actividad de PLA_{2} en suero es significativamente elevada en
ausencia de UG, en comparación con la actividad de PLA_{2} en
camadas que poseen un gen UG funcional. En un segundo experimento,
se demostró que la administración de rhUG a monos
pre-término que padecían RDS inhibía la actividad
de PLA_{2} en los fluidos extracelulares de los pulmones.
Otros experimentos demostraron que la PLA_{2}
in vitro puede degradar el tensioactivo artificial
(típicamente Survanta) utilizado en el tratamiento de RDS y que la
UG puede inhibir su degradación. Estos experimentos demuestran que
la UG media la inhibición de PLA_{2} y el depósito de Fn in
vivo siguientes a la administración intratraqueal o
intravenosa.
Los experimentos en ratón con el gen de la
uteroglobina desactivado demuestran que se puede utilizar la rhUG
para tratar afecciones en las cuales se ha encontrado que la
uteroglobina es deficiente o la propia proteína porta una mutación
de pérdida de función. Se ha descubierto ahora que se puede utilizar
la rhUG para tratar o prevenir las afecciones inflamatorias o
fibróticas en las cuales la uteroglobina endógena funcional es
deficiente en la circulación o en el sitio de la inflamación o la
fibrosis. Se han encontrado reducciones de los niveles de rhUG en
suero y/o fluidos de lavado bronco-alveloar en
ciertas afecciones inflamatorias o fibróticas pulmonares,
incluyendo lactantes pre-término con riesgo de
desarrollar BPD neonatal. Se ha encontrado que se puede utilizar la
UG como suplemento de la uteroglobina endógena deficiente o
defectuosa para prevenir o tratar tales afecciones inflamatorias
y
fibróticas.
fibróticas.
Según un aspecto, la invención describe un
método de tratamiento de una afección inflamatoria in vivo
que comprende administrar a un paciente que necesita semejante
tratamiento una cantidad eficaz como
anti-inflamatorio de UG.
Según un aspecto adicional, la invención
describe un método de inhibición de las enzimas PLA_{2} solubles
in vivo, que comprende administrar a un paciente que necesita
semejante tratamiento una cantidad eficaz como inhibidor de
PLA_{2} de UG.
La invención proporciona el uso, para la
fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir
una afección fibrótica, de una cantidad eficaz en la unión a
fibronectina de UG.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
el uso, para la fabricación de una composición para tratar o
prevenir la fibrilogénesis de una cantidad en la unión a
fibronectina de UG.
Según un aspecto adicional, la invención
proporciona el uso, para la fabricación de una composición
farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica
caracterizada por una deficiencia de UG funcional endógena, de un
tensioactivo pulmonar y una cantidad compensatoria de UG.
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de rhUG asociada
con un tensioactivo pulmonar y un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden adoptar la
forma de soluciones inyectables, y líquidos o
semi-aerosoles para la administración
intratraqueal.
Según un aspecto adicional, la invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la rhUG y un
tensioactivo pulmonar (p. ej., Survanta (un extracto de pulmón
bovino de Abbott Labs) y Exosurf (un tensioactivo de pulmón
químicamente sintético de Glaxo Wellcome)) asociado con un portador
o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona un
análisis para cuantificar los complejos de
uteroglobina-fibronectina en una muestra clínica,
donde la muestra clínica que se sospecha que contiene un complejo
uteroglobina-fibronectina se pone en contacto con
un agente de captura de antígenos, por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal de conejo monoespecífico, inmovilizado sobre un soporte
insoluble; un agente de detección de antígenos, por ejemplo un
anticuerpo específico para la fibronectina, se añade a la muestra; y
se detecta la presencia de cualquier complejo unido al soporte
utilizando, por ejemplo, un anticuerpo secundario, p. ej.,
anticuerpo anti-IgG conjugado con una enzima tal
como peroxidasa de rábano picante utilizando una reacción enzimática
normalizada donde el sustrato enzimático se convierte en un
compuesto cromogénico o fluorogénico que se cuantifica utilizando
un aparato espectrofotométrico o fluorométrico normalizado.
La invención se describirá a continuación con
más detalle, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra un alineamiento de las
proteínas de tipo UG;
La Figura 2 muestra el constructo de
redireccionamiento pretendido del ratón con el gen UG desactivado
transgénico; los sitios de restricción son B - BamIII, E = EcoRI, H
= HindIII;
Las Figuras 2B-2D muestran la
verificación de los constructos genéticos en la progenie de los
embriones transgénicos mediante análisis de PCR y transferencia
Southern; (B) análisis de transferencia Southern de los clones de
las células ES R1 dirigidos, donde Wt = tipo salvaje; (C) análisis
de PCR representativos del ADN genómico de biopsias de la cola de
los vástagos; los genotipos y sus correspondientes productos de la
PCR son los siguientes: UG^{+/+}, 304 pb; UG^{+/-}, 304 y 667
pb; UG^{-/-}, 667 pb; (D) transferencia Southern de ADN genómico
de cola de ratón; la Figura 2E muestra la confirmación de la
ausencia de ARNm de UG en tejidos de pulmón de ratones UG^{-/-}
mediante análisis de RT-PCR; los análisis de
RT-PCR del ARN total extraído de los tejidos de
pulmón de camadas con genotipos UG^{+/+}, UG^{+/-}, y
UG^{-/-}; era detectable un producto de la RT-PCR
de 273 pb en los pulmones de UG^{+/+} y UG^{+/-} pero ausente de
los de los ratones UG^{-/-}; La Figura 2F muestra la confirmación
de la ausencia de proteína UG en los pulmones de ratones UG^{-/-}
mediante análisis Western; las proteínas (30 microgramos cada una)
de producto lisado de pulmón fueron resueltas mediante
electroforesis utilizando un gradiente 4-20% de
SDS-Page en condiciones no reductoras y sometidas a
inmunotransferencia utilizando UG anti-ratón de
conejo; la Figura 2G muestra la confirmación de la ausencia de UG en
secciones de tejido de pulmón de los ratones UG^{-/-} utilizando
métodos inmunohistoquímicos en células epiteliales bronquiolares;
la tinción oscura sobre las células epiteliales bronquiolares de
ratón UG^{+/+} (panel superior) indica inmunorreactividad con UG;
obsérvese la ausencia de inmunorreactividad en pulmones de ratón
UG^{-/-} (panel inferior).
Las Figuras 3A-3J comparan los
análisis histopatológicos de secciones de riñón de ratones normales
versus UG^{-/-}, que muestran fibrosis parenquimal anormal y
depósito de Fn glomerular en los ratones con el gen desactivado
solamente; H & E tinción de secciones de riñón de camadas
UG^{+/+} (A) y su camada UG^{-/-} (B); (C) secciones de riñón
de un ratón de 10 meses de edad con fibrosis parenquimal grave; (D)
una región del mismo riñón de ratón en (C) que muestra hiperplasia
tubular renal (aumento 40X, g = glomérulo; f = fibrosis; t =
túbulo); (E) microscopía electrónica de transmisión del depósito
glomerular de un ratón UG^{-/-} con enfermedad renal grave
(aumento 6000X); (F) el recuadro de (E) está aumentado 60.000X, lo
que muestra las estructuras fibrilares estriadas largas indicativas
de colágeno (col) y las difusas cortas que coinciden con las
fibrillas de Fn; (G) inmunofluorescencia de Fn de una sección de
riñón de un ratón UG^{+/+} utilizando anticuerpo para Fn de
múrido; (H) inmunofluorescencia de Fn de una sección de riñón de un
ratón UG^{-/-} con enfermedad renal grave; tinción con tricrómico
de Mason de secciones de riñón con ratones UG^{+/+} (I) y
UG^{-/-} (J); la tinción azulada sobre los glomérulos de secciones
de riñón de ratón UG^{-/-} es colágeno (aumento aproximadamente
40X).
La Figura 4A muestra la presencia de agregados
de Fn solamente en los riñones de los ratones UG^{-/-};
inmunoprecipitación y transferencia western de Fn de plasma, riñón,
e hígado de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-}; se detectaba una banda
de Fn multimérica (flecha en negrita) solamente en los productos
lisados de riñón de ratones UG^{-/-}.
Las Figuras 4B y 4C muestran la formación de
complejos UG-Fn in vitro; (B) se incubaron
concentraciones equimolares de UG y Fn, se inmunoprecipitaron y se
detectaron mediante transferencia Western con anticuerpo para Fn o
UG; los productos inmunoprecipitados contienen tanto Fn (calle 2,
panel superior) como UG (calle 2, panel inferior); las calles 1 de
ambos paneles representan patrones de Fn y UG; (C) se incubaron
concentraciones equimolares de UG-I^{125} y Fn a
4ºC durante 1 hora y el complejo resultante se resolvió mediante
electroforesis sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes
al 6%; calle 1, heterómero Fn-UG teñido con azul de
coomassie; calle 2, su autorradiograma.
La Figura 4D muestra la presencia de complejos
UG-Fn en el plasma de ratones normales pero no
UG^{-/-}; inmunoprecipitación de plasma de ratones UG^{+/+} y
UG^{-/-} con anticuerpo para Fn y transferencia western con
anticuerpos para Fn y UG; Fn (panel superior); UG (panel inferior);
std = patrones para UG y Fn.
La Figura 4E muestra la inhibición dependiente
de la dosis de la autoagregación de Fn por UG in vitro; el
entrecruzamiento por afinidad de Fn-I^{125} con Fn
no marcada en ausencia (calle 2) y presencia de cantidades
variables de UG (calles 3-5); la intensidad de la
banda de Fn radiactiva, de peso molecular muy elevado (calle 2)
formada en ausencia de UG se reduce de una manera dependiente de la
dosis; calle 1, Fn-I^{125} con Fn no marcada en
ausencia de UG y DSS; flecha abierta - Fn multimérica; flecha fina
inferior = Fn de 220 kDa.
La Figura 4F muestra la inhibición de la
formación del complejo Fn-colágeno por UG;
entrecruzamiento de afinidad de colágeno
I-I^{125} con Fn no marcada en ausencia (calle 3)
y presencia (calle 4) de UG; calle 1, colágeno I teñido con azul de
coomassie; cadena alfa_{1}-alfa_{1} de colágeno
I y cadena alfa_{2}-alfa_{2} de colágeno I;
calle 2, colágeno I-I^{125} y Fn no marcada en
ausencia de UG y DSS.
Las Figuras 5A-5F muestran el
análisis inmunohistoquímico del depósito de Fn en los riñones de
ratones normales y UG^{-/-} solamente en ausencia de UG; (A)
sección de riñón de un ratón de tipo salvaje que recibió una mezcla
de concentraciones equimolares de Fn y UG intravenosamente; (B)
ratón UG^{+/+} que recibió la misma dosis de Fn que en (A) pero
sin UG; (C) ratón UG^{-/-}, aparentemente sano que recibe una
mezcla de Fn y UG; (D) ratón UG^{-/-} que recibe Fn sola (la
misma dosis que en (C)), pero sin UG; (E) fibrilogénesis de Fn por
células cultivadas desarrolladas en medio con un suplemento de hFn
soluble sola; (F) un cultivo celular idéntico al de (E) que se
alimentó con medio que contenía una mezcla de concentraciones
equimolares de hFn soluble y UG (aumento 40X, g = glomérulo).
Las Figuras 6A-6B muestran el
formato para un análisis de diagnóstico para detectar complejos
UG-Fn en muestras clínicas.
La Figura 7 muestra el paso del dímero de UG a
través de una membrana de diálisis MWCO de 8,0 kDa pero no de una
membrana de diálisis MWCO de 3,5 kDa.
La rhUG de la invención tiene sustancialmente la
misma secuencia de aminoácidos que la de la proteína UG humana
nativa. Una secuencia de aminoácidos que tiene "sustancialmente la
misma" secuencia de aminoácidos que la de la proteína humana
nativa incluye una rhUG que tiene una identidad de al menos 75% con
la proteína humana nativa. En una realización preferida, la rhUG
tienen una identidad de al menos 85%, y en una realización muy
preferida, la rhUG tiene una identidad de al menos 98% con la UG
nativa.
También está incluido en la presente invención
el uso de fragmentos o derivados de UG. Un "fragmento" de UG
hace referencia a una porción de la secuencia de aminoácidos de hUG
nativa que tiene seis o más aminoácidos contiguos de la secuencia
de la proteína nativa. El término "derivado" hace referencia a
los análogos peptídicos de UG, que incluyen una o más sustituciones
de aminoácidos y/o la adición de uno o más radicales químicos; p.
ej., agentes acilantes o agentes sulfonantes, con la condición de
que el derivado conserva la actividad biológica de la molécula
parental.
Adicionalmente, la UG utilizada en la presente
invención es sustancialmente pura. El término "sustancialmente
pura" hace referencia a una UG que tiene una pureza de
aproximadamente 75% a aproximadamente 100%. En una realización
preferida, UG tiene una pureza de aproximadamente 90% a
aproximadamente 100%, y en la realización más preferida, UG tiene
una pureza de al menos 95%.
La invención proporciona, en otro aspecto, el
tratamiento o la prevención de una afección inflamatoria o fibrótica
en un mamífero, que puede ser un animal o ser humano, con una
cantidad eficaz de UG.
La siguiente lista no limitante de afecciones
son ejemplos representativos de aquellas asociadas con deficiencias
de UG, actividad de PLA_{2} excesiva, y deposito de
fibronectina.
Las relaciones típicas entre la deficiencia de
UG, la actividad de PLA_{2} y la agregación y el depósito de
fibronectina en las afecciones inflamatorias/fibróticas humanas se
resumen más abajo.
La BPD neonatal está caracterizada por
inflamación grave y fibrosis irreversible del tejido pulmonar en
niños recién nacidos, normalmente como resultado del síndrome de
fatiga respiratoria (RDS). No obstante, esta afección también puede
estar causada por el síndrome de aspiración de meconio o
infección.
Una deficiencia de hUG ha sido implicada en esta
afección debido a que la síntesis de hUG pulmonar puede ser
regulada simultáneamente con tensioactivo, que comienza tarde en la
gestación. De este modo, los neonatos gravemente prematuros pueden
carecer de UG así como de tensioactivo. La deficiencia de hUG puede
ocasionar un incremento de la actividad de PLA_{2} y la fibrosis
relacionada con Fn, que están asociados con la inflamación y la
fibrosis observadas en BPD neonatal. Algunos niños no responden al
tensioactivo sintético, lo que puede estar debido al exceso de
actividad de PLA_{2}. De este modo, se puede utilizar UG para
tratar la BPD neonatal.
La ruta de administración preferida es la
instilación directa por vía endotraqueal o las rutas sistémicas.
La actividad excesiva de PLA_{2} ha sido
implicada en el MOF debido a sepsis bacteriana o trauma. Esta
afección se caracteriza por una respuesta inflamatoria sistémica,
que implica una lesión del tejido rápida, masiva y la pérdida de
función orgánica en los pulmones, el riñón, el páncreas, los
intestinos, y la vasculatura. La evidencia reciente apunta al
desencadenante de MOF como la elevada actividad de la fosfolipasa
A_{2} soluble sistémica, su lisis directa de las membranas
celulares de los tejidos, y la hidrólisis de los fosfolípidos
esenciales, tales como los tensioactivos pulmonares. Los intentos
para inhibir la PLA_{2} directamente en marcos clínicos no han
tenido éxito.
En el MOF, la cantidad de UG endógena es
insuficiente para la superactivación de PLA_{2}. La UG
suministrada exógenamente se puede utilizar para combatir el
MOF.
El fallo de órganos remotos (ROF) implica la
lesión de órganos distintos del órgano afectado principalmente por
el trauma o la infección. A menudo el fallo de órganos remotos
implica más de un órgano remoto, dando como resultado el fallo
multiorgánico. Por ejemplo, la pancreatitis es una inflamación del
páncreas en respuesta a la ingesta de alcohol, a una infección, o a
un trauma, que puede dar como resultado un síndrome de fatiga
respiratoria en adultos (ARDS), una insuficiencia renal aguda (ARF),
y un choque generalizado. Un episodio de enfermedad inflamatoria
del intestino o peritonitis puede dar como resultado ROF/MOF. El
ROF/MOF está asociado con elevados niveles de PLA_{2} activada,
circulante. La aplicación generalizada de hUG podría prevenir el
ROF/MOF. La inyección inmediata de UG en pacientes con ROF/MOF,
podría reducir la gravedad o eliminar el fallo de órganos y el
choque mediados por PLA_{2}.
Todas las formas de pancreatitis implican una
actividad elevada de PLA_{2} soluble de Tipo I, tanto sistémica
como local. La pancreatitis a menudo da como resultado una
insuficiencia pulmonar o ARDS, caracterizada por una elevada
actividad de PLA_{2} soluble en los pulmones. Por lo tanto, como
inhibidor de las PLA_{2} de Tipo I solubles in vivo, la UG
es un excelente candidato para el tratamiento de las dos formas de
pancreatitis aguda, y es una medida preventiva de la insuficiencia
pulmonar en todas las formas agudas de la pancreatitis.
La ruta de administración preferida es por ruta
intravenosa.
La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD),
incluyendo la colitis ulcerativa, la diverticulitis, y la
enfermedad de Crohn, se caracteriza por una producción local y una
actividad de la PLA_{2} soluble de Tipo II elevadas. La actividad
de la PLA_{2} soluble circulante también puede ser elevada en IBD.
La IBD ocasiona insuficiencia pulmonar o ARDS en casos graves, como
resultado de una actividad de PLA_{2} elevada (que es similar a
la pancreatitis).
La base lógica de la aplicación de UG exógena en
IBD es idéntica a la de la pancreatitis: regular a la baja la
respuesta inflamatoria inhibiendo la PLA_{2}, la agregación y/o el
depósito de Fn y evitar la implicación de órganos remotos (pulmones
y riñones).
La ruta de administración preferida es la ruta
intravenosa en pacientes hospitalizados.
Se demostró que los fluidos BAL de pacientes que
han sobrevivido a pneumonía bacteriana tienen niveles
2-3X superiores de UG que aquellos que han
fallecido. La infección bacteriana de los pulmones puede
sobreactivar la PLA_{2} soluble endógena. La UG se puede
administrar para inhibir o controlar este efecto.
La ruta de administración preferida es la ruta
intra-traqueal si el paciente está intubado o
intravenosa si no.
La principal complicación de la diálisis es la
trombosis, esto es, coágulos de sangre formados espontáneamente.
Estos a menudo taponan el puerto de acceso vascular, deteriorando el
tratamiento, así como causando episodios isquémicos, amenazadores
para la vida a veces, en el paciente. Un segundo problema con los
pacientes de hemodiálisis es la inflamación y/o fibrosis de la vena
proximal que devuelve la sangre dializada a la circulación principal
del paciente. La fibrosis de la vena proximal se detecta
generalmente como un incremento en la resistencia, o presión,
frente al retorno de la sangre dializada. Un tercer problema es la
fibrosis y el cierre del sitio de acceso vascular, o fístula. Un
cuarto problema es la aterosclerosis acelerada y un quinto es la
pérdida de función renal residual, muy probablemente debido a
depósito de Fn.
La posibilidad de que la UG endógena sea
dializada durante el procedimiento proporciona una explicación para
estos problemas. La separación selectiva de la UG endógena deja
libre la Fn para agregarse, formando los focos para la formación de
coágulos de sangre o el depósito sobre los glóbulos rojos,
cebándolos para una respuesta de coagulación pegándolos entre sí o
al lúmen vascular. Las transglutaminasas (TG) son enzimas
responsables de la construcción de redes macromoleculares
encontradas en las membranas del basamento, la piel y los coágulos
de sangre. En ausencia de UG libre que compite como sustrato por las
TG activadas, la Fn y otros componentes de los coágulos de sangre
se entrecruzan.
La inflamación y la fibrosis tanto de la vena
proximal como del sitio de acceso vascular, así como la
aterosclerosis acelerada, se pueden explicar por el depósito de Fn
en el lúmen vascular. El depósito de fibronectina sobre el
endotelio vascular promueve la adherencia de las plaquetas y los
glóbulos blancos, ambos los cuales se pueden agravar en ausencia de
inhibición de PLA_{2}. Los depósitos vasculares de Fn también
pueden promover los depósitos locales de grasa, colesterol y
proteínas encontrados en la placa aterosclerótica. Se sabe que la
fibroconexión es un componente principal de la placa
aterosclerótica, así como de los depósitos glomerulares renales
asociados con la nefropatía y la pérdida de la función renal
primaria y residual. Por lo tanto, la administración de UG puede
reducir o eliminar estos problemas reduciendo la inflamación y el
depósito de fibronectina.
La ruta de administración preferida de UG sería
la infusión intravenosa antes, durante o después de la diálisis.
Alternativamente, la pérdida de UG endógena se
puede evitar por medio de la adición de UG al tampón de diálisis o
recubriendo previamente la membrana de diálisis con UG o ambos.
El término "órgano" hace referencia, por
ejemplo, a órganos sólidos, tales como riñón, hígado, y corazón,
así como médula ósea, córnea y piel.
Existen dos tipos de rechazo de trasplante de
órganos; agudo y crónico. El rechazo agudo es un proceso
inflamatorio que implica la actividad de PLA_{2} y la
infiltración por las células inflamatorias que a menudo destruyen
el injerto.
El rechazo crónico implica la fibrosis mediada
por Fn del injerto, incluyendo aterosclerosis confinada al injerto.
De este modo, se puede utilizar la administración de UG para tratar
o prevenir el rechazo de los injertos tanto agudo como crónico.
La ruta de administración preferida es mediante
inyección.
Otro aspecto del trasplante de órganos es la
isquemia del órgano antes de la retirada del donante, durante el
transporte y en el receptor, que contribuye al rechazo agudo. Se
sabe que la isquemia produce una actividad de PLA_{2} elevada y
la necrosis del tejido. Por tanto, se podría utilizar UG para evitar
semejante isquemia. La forma preferida de UG es un líquido de
perfusión o un tampón de almacenamiento en el que se conserva el
órgano ex vivo.
La diabetes de Tipo 1 surge de la destrucción
del tejido pancreático por una respuesta autoinmunitaria. El
páncreas secreta normalmente PLA_{2} soluble y hUG a la
circulación. Se ha informado sobre lesiones necróticas en el
páncreas de ratón con el gen de la uteroglobina desactivado (KO) de
la presente invención (referido en adelante como "ratón KO
UG").
En ausencia de uteroglobina, el ratón KO UG
muestra una destrucción del tejido pancreático similar que podría
desencadenar una respuesta autoinmunitaria. De este modo se puede
utilizar la UG para prevenir o detener el lento progreso de la
diabetes de Tipo I. La ruta de administración preferida es mediante
inyección.
Los depósitos de Fn y la fibrosis renales en el
ratón KO UG son similares a los depósitos de Fn y la fibrosis en
las nefropatías humanas. De este modo, la administración de UG
podría evitar o ralentizar el progreso de la nefropatía en
pacientes con riesgo, tales como la diabetes de Tipo II.
La inflamación ocular, incluyendo la uveítis, la
retinitis, y la inflamación siguiente a la cirugía, se caracteriza
por un aumento de la actividad de PLA_{2}. Por lo tanto, se puede
administrar la UG tópicamente, intraocularmente, o sistémicamente
para reducir la inflamación ocular.
La arteriosclerosis es un engrosamiento
fibrótico de los vasos sanguíneos por todo el organismo. Se inicia
y/o está mediado por el depósito de Fn sobre las paredes de la
vasculatura. La aterosclerosis es una forma de arteriosclerosis que
implica depósito de colesterol, además de depósito de Fn. Por lo
tanto, se puede administrar UG para prevenir o reducir la
arteriosclerosis.
La insuficiencia renal aguda (ARF) es
típicamente una consecuencia de la inflamación, la infección o el
trauma directo de un órgano remoto, que da como resultado la
liberación y activación de PLA_{2} soluble a la circulación. La
lesión de los riñones durante la ARF puede ser bastante grave, con
lesión tisular aguda promovida por la inflamación y se puede
resolver en fibrosis en el riñón, que conduce a una reducción de la
función del riñón a largo plazo. Las propiedades
anti-inflamatorias y anti-fibróticas
de la UG son particularmente relevantes en el riñón como se muestra
por medio del ratón KO UG.
La ruta de administración preferida es mediante
inyección o administración sistémica.
Sobre todo, la siguiente lista no limitante de
afecciones incluye aquellas asociadas a la inhibición de PLA_{2}
y/o el depósito de fibronectina, cada una de las cuales son
candidatos para el tratamiento o la prevención por medio de la
presente invención:
\vskip1.000000\baselineskip
- Articulación/Hueso:
- artritis reumatoide;
- Autoinmunitarias:
- artritis reumatoide, esclerosis múltiples, diabetes de Tipo I, uveitis, psoriasis, lupus eritematoso generalizado (SLE), y enfermedad de Crohn;
- Páncreas:
- pancreatitis;
- Peritoneo:
- peritonitis, apendicitis;
- Vascular/sistémico:
- choque séptico; enfermedad vascular por colágeno, arteriosclerosis, aterosclerosis, choque anafiláctico, esquistosomiasis, y choque inducido por trauma;
- Renal:
- insuficiencia renal aguda, infección bacteriana de los riñones, inflamación debida a tumores renales, prevención de la fibrosis resultante de la quimioterapia o terapia con anticuerpos, prevención de la nefropatía diabética, prevención y/o tratamiento de la nefropatía idiopática;
- Hígado:
- hepatitis, hepatitis viral, y cirrosis;
- Vejiga:
- cistitis, inflamación de la uretra, inflamación del uréter, e inflamación de la vejiga tal como cistitis intersticial;
- Reproductor/femenino:
- vaginitis, cérvix inflamado, enfermedad inflamatoria pélvica, inflamación del ovario (salpingitis), endometriosis, candidiasis vaginal, e inflamación o fibrosis de las trompas de Falopio;
- Reproductor/masculino:
- inflamación del pene, inflamación de la próstata, inflamación de los túbulos y vesículas seminales, inflamación testicular, e inflamación del vaso deferente, epidídimos y glándula prostática
- Ocular:
- uveitis, retinitis, trauma, lesión con quemadura por producto químico o humo, inflamación ocular debida a retinitis por CMV, conjuntivitis (infección bacteriana), infección viral, inflamación ocular debida a agente infeccioso, inflamación ocular siguiente a cirugía ocular; incluyendo la eliminación de cataratas, cirugía por láser, trasplante de córnea, eliminación de tumores, inflamación ocular debida a retinoblastoma (tumor), inflamación ocular debida a exposición a radiación, inflamación debida a respuesta alérgica;
- Corazón:
- Endocarditis
- Pulmones:
- asma bronquial, ARDS, pneumonía, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar resultante de quimioterapia (bleomicina, metotrexato), fibrosis pulmonar resultante de la exposición a productos químicos medioambientales (amianto, líquidos de limpieza, contaminantes, p. ej., dioxina y PCB del escape de los automóviles), inhalación de humo, inflamación pulmonar durante la recuperación del ahogo, y RDS neonatal;
- Intestino:
- enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn, diverticulitis, enterocolitis necrotizante neonatal, inflamación debida a un agente infeccioso, rotavirus, virus de la polio, VIH, úlceras de estómago, enfermedad de reflujo gastro-esofágico, y tonsilitis;
- Hemorroides; Trasplantes:
- administración siguiente a la cirugía de trasplante de cualquier órgano o tejido para controlar la inflamación o fibrosis y los rechazos;
- Oídos:
- Otitis media; y
- Piel:
- psoriasis, urticaria, alergia y dermatitis, esclerodermia, dermatitis de contacto, dermatitis química (debido a hiedra venenosa, roble venenoso, y exposición a productos químicos como PCB, cloro, amoniaco, (agentes de limpieza, agentes tóxicos).
Por otra parte, se puede administrar UG sola o
combinada con otros agentes activos o composiciones utilizados
típicamente en el tratamiento o la prevención de los estados de
enfermedad identificados antes. Tales agentes activos o
composiciones incluyen, pero no están limitados a,
anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), agentes
quimioterapéuticos, analgésicos, agentes inmunoterapéuticos, agentes
antivirales, agentes antifúngicos, vacunas, inmunosupresores,
factores de crecimiento hematopoyético, hormonas, citocinas,
anticuerpos, anti-trombóticos, fármacos
cardiovasculares, o fármacos de fertilidad. También están incluidos
fármacos de tolerancia, vitaminas y minerales.
Por otra parte, se puede administrar UG como
portador para la supresión de la inflamación en el sitio de la
inyección o administración de otro agente terapéutico o profiláctico
para suprimir la inflamación o la respuesta inmunitaria causada por
tal agente. Con respecto a esto, la UG permitiría la administración
de una cantidad eficaz del agente activo para la indicación
diana.
La UG también se puede administrar como una
composición cosmética para su uso en la limitación de la fibrosis,
la formación de cicatrices o queloides a partir de la curación de
heridas, o durante una respuesta inflamatoria dérmica.
La presente invención hace referencia al uso de
UG en la prevención o tratamiento de las afecciones asociadas con
la fibronectina. Con respecto a la prevención de un estado de
enfermedad, "prevención" hace referencia a la prevención del
desarrollo de la enfermedad en una población susceptible o
potencialmente susceptible, o a la limitación de su gravedad o
progreso, mientras el término "tratamiento" hace referencia al
alivio de una enfermedad o estado patológico.
La UG se puede administrar intravenosamente o,
en el caso del tratamiento de RDS/BPD neonatal y RDS en adultos, en
forma de un líquido o semi-aerosol vía tubo
intratraqueal. Otras rutas de administración viables incluyen
tópica, ocular, dérmica, transdérmica, anal, sistémica,
intramuscular, de liberación lenta, oral, vaginal, intraduodenal,
intraperitoneal, e intracolónica. Tales composiciones se pueden
administrar a un sujeto o paciente que necesita semejante
administración en dosificaciones y mediante técnicas bien conocidas
por los expertos en las técnicas médica, nutricional o veterinaria
tomando en consideración factores tales como la edad, el sexo, el
peso, y el estado del sujeto o paciente concreto, y la ruta de
administración. Las composiciones de la presente invención también
se pueden administrar en una formulación de liberación controlada.
Las composiciones se pueden administrar simultáneamente o
administrar sucesivamente con otros agentes activos, de nuevo,
tomando en consideración factores tales como la edad, el sexo, el
peso, y el estado del sujeto o paciente concreto, y, la ruta de
administración.
Los ejemplos de las composiciones de la
invención incluyen composiciones comestibles para la administración
oral tales como formulaciones sólidas o líquidas, por ejemplo,
cápsulas, comprimidos, píldoras, y preparaciones líquidas similares
para los orificios, p. ej., oral, nasal, anal, vaginal etc.,
formulaciones tales como suspensiones, jarabes o elixires; y,
preparaciones para la administración parenteral, subcutánea,
intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., administración
inyectable), tales como suspensiones o emulsiones estériles. No
obstante, el ingrediente activo de las composiciones puede formar
complejos con proteínas de manera que cuando se administra a la
corriente sanguínea, puede producir coagulación debido a la
precipitación de las proteínas de la sangre; y, los artesanos
expertos deben tener esto en cuenta.
En tales composiciones la UG puede estar
mezclada con un portador, diluyente, o excipiente adecuado tal como
agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, DMSO, etanol, o
similar. La UG se puede proporcionar en forma liofilizada para su
reconstitución, por ejemplo, en solución acuosa, salina, glucosa
isotónica, o tampón de DMSO. En algunas soluciones salinas, se ha
observado cierta precipitación de rhUG; y esta observación se puede
emplear como medio para aislar los compuestos de la invención, p.
ej., mediante un procedimiento de "precipitación por adición de
sal".
Adicionalmente, la invención también comprende
un kit donde se proporciona la UG. El kit puede incluir un
recipiente separado que contiene un portador, diluyente o excipiente
adecuado. El kit puede incluir un agente adicional que reduce o
alivia los males de la enfermedad de las afecciones identificadas
antes para la administración simultánea o sucesiva. Se pueden
proporcionar uno o varios agentes adicionales en recipientes
separados o mezclados con UG. Adicionalmente, el kit puede incluir
instrucciones para mezclar o combinar ingredientes y/o para su
administración.
La invención también contempla el tratamiento o
la prevención de una afección fibrótica caracterizada por una
deficiencia de UG funcional endógena, que comprende administrar a un
paciente que necesita semejante tratamiento una cantidad
compensatoria de UG. El término "cantidad compensatoria"
representa una cantidad de UG requerida para llevar la
concentración pulmonar local o generalizada de UG total (UG
funcional endógena y UG exógena) a su intervalo normal. Más
específicamente, el intervalo normal para la concentración pulmonar
local de UG endógena es de aproximadamente >50 microgramos de
UG/miligramo de albúmina o >50 microgramos/litro. El intervalo
normal para la concentración de UG en suero es >15
microgramos/litro.
Las composiciones de la invención comprenden hUG
nativa y/o recombinante en una cantidad eficaz para alcanzar el
propósito pretendido, esto es un incremento de los niveles de UG en
plasma o tejido para producir el efecto deseado de inhibición
selectiva de PLA_{2} y una reducción de la inflamación y/o unión
de fibronectina para mitigar su agregación y/o depósito en
condiciones fibróticas. Las composiciones comprenden una cantidad
eficaz de UG humana nativa y/o recombinante sustancialmente pura,
asociada con un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
En un aspecto adicional, las composiciones de la
invención comprenden una cantidad eficaz de hUG nativa y/o
recombinante y tensioactivo pulmonar, asociada con un portador o
diluyente farmacéuticamente aceptable. La administración
intratraqueal local de UG a los pulmones, suficiente para la
inhibición de la actividad de PLA_{2} y/o el depósito de
fibronectina, requiere cantidades de UG sustancialmente pura en el
intervalo de 0,2 \mug/kg a 500 mg/kg de proteína en una única o
en múltiples dosis. La UG se administra normalmente en una cantidad
de un único bolo de 20 ng/kg a 500 mg/kg, en una sola o en múltiples
dosis, o en forma de una infusión continua de hasta 10 gramos.
La hUG nativa y/o recombinante también se puede
administrar junto con tensioactivo pulmonar artificial, tal como
Survanta, por ruta intratraqueal. La UG y Survanta (5 ml/kg) se
administran simultáneamente y la UG no se une al tensioactivo,
evitando que funcione terapéuticamente. El tensioactivo pulmonar
está generalmente presente en la composición en una cantidad de
aproximadamente 10-90% en peso, más normalmente
aproximadamente 20-80% en peso. El tensioactivo, en
virtud de su tensión superficial muy baja se disemina sobre la
superficie interna de los pulmones, llevando con él la UG. La
administración generalizada de UG mediante inyección intravenosa,
suficiente para la inhibición de la actividad de PLA_{2} y/o el
depósito de fibronectina, requiere cantidades de UG nativa y/o
recombinante sustancialmente pura en el intervalo de 0,5 \mug para
una infusión continua de varios gramos de proteína a lo largo de un
período de tiempo prolongado (días).
Las formulaciones adecuadas para la inyección y
la liberación intratraqueal en semi-aerosol incluyen
soluciones acuosas de hUG nativa y/o recombinante opcionalmente con
modificadores de la viscosidad y estabilizadores.
El término "cantidad eficaz inhibidora de
PLA_{2}" según se utiliza en la presente memoria representa una
cantidad de UG que inhibe la actividad de PLA_{2} y que reduce o
alivia la inflamación en el tejido u organismo del paciente. El
término "cantidad eficaz de unión a fibronectina" representa la
cantidad de UG que se une a la fibronectina para reducir la
agregación y/o depósito de la misma, y evita o reduce la
fibrilogénesis o la fibrosis. El término "cantidad
anti-inflamatoria" según se utiliza en la
presente memoria representa la cantidad que reduce o alivia la
inflamación en el tejido u organismo. Típicamente, la cantidad de UG
administrada a adultos para el tratamiento de afecciones
inflamatorias y fibróticas será de bolos de 0,2 \mug/kg a 500
mg/kg o hasta varios gramos administrados a lo largo de un período
de tiempo prolongado. Para los neonatos, en el tratamiento de la
RDS neonatal, el intervalo será típicamente de 50 nanogramos/kg a
100 mg/kg en un único bolo o hasta 10 gramos administrados
continuamente a lo largo de un período de tiempo prolongado. Las
velocidades de infusión continua eficaces y seguras están entre 50
ng/kg/hora a 500 mg/kg/hora.
La invención se describirá ahora adicionalmente
con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Las partes
y porcentajes son en peso a menos que se establezca de otro
modo.
Se obtuvo UG humana recombinante mediante el
método de Mantile et al. (1.993).
Un macho y una hembra de la especie P.
cyanocephalus, que pesaban aproximadamente 400 gramos cada uno
fueron liberados por la Sección C a los 142 días de gestación. Este
es un modelo establecido de RDS (Coalson, J.J., et al.
Baboon Model of BPD. II: Pathologic features. Exp. Mol. Pathol.
37:355-350 (1.982)).
Tras la liberación, las crías fueron
anestesiadas con cetamina (10 mg/kg) e intubadas con tubo
endotraqueal de 2,5 mm de diámetro. Se controlaron los gases y la
presión de la sangre por medio de un conducto arterial situado
mediante inyección percutánea en la arteria radial. Se colocó un
conducto venoso profundo percutáneamente en la vena safena a través
del cual se administraron fluidos, antibióticos, y fármacos. Los
animales se mantuvieron sobre calentadores de infrarrojos
servo-controlados y se ventilaron con un ventilador
normalizado regulado por presión, con ciclos de tiempo con
humidificadores mantenidos a 36-37ºC. Los ajustes
iniciales fueron FiO_{2} 1,0, velocidad 40/minuto, razón I/E
1:1,5, presión positiva al final de la expiración (PHEP) a 4 cm
H_{2}O, y presión inspiratoria de pico (PIP) según se requería
para una exploración del pecho adecuada. La FiO_{2} se mantuvo a
1,0 y la PIP se reguló para mantener PaCO_{2} a 0,052\pm0,0013
atm. Los gases en sangre, el hematocrito, los electrolitos, el
tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial y
Dextrostix se controlaron cada hora. La sangre retirada para los
estudios se remplazó volumétricamente por sangre de babuino adulto.
Los fluidos intravenosos se administraron con electrolitos a 10
cc/kg/hora y se incrementaron según fue necesario cuando el ritmo
cardíaco sobrepasó 180 latidos/minuto. Se administró bicarbonato
sódico (2 meq/kg) cuando el déficit de la base sobrepasó -10. Se
administraron Ampicilina (50 mg/kg/día en dos dosis divididas) y
Gentamicina 5 mg/kg/día en dos dosis divididas) continuamente a lo
largo de la duración del experimento.
Un animal recibió tensioactivo más PBS
(tratamiento núm. 1), y el segundo animal (tratamiento núm. 2)
recibió tensioactivo más dos dosis de 1 mg/kg de rhUG. Tanto el
tensioactivo como la rhUG se administraron directamente a los
pulmones a través del tubo endotraqueal. El tensioactivo utilizado
fue Survanta (Ross Labs), una preparación de tensioactivo derivada
de tejido pulmonar bovino, que contenía apoproteínas B y C
tensioactivas además de fosfolípidos. La primera dosis de rhUG se
administró con el tensioactivo y la segunda se administró cuatro
horas después de la primera. Se controlaron los gases de la sangre
arterial, los electrolitos y el EKG de los animales. Se
sacrificaron 50 horas después del inicio de la terapia con
tensioactivo. Los pulmones se lavaron a las 24 y 48 horas con PBS
que contenía inhibidores de proteasa (PMSF, 10 \mug/ml de
leupeptina, 10 \mug/ml de pepstatina y bacitracina). Se
congelaron a -80ºC hasta que se analizó la actividad PLA_{2}. Las
proteínas totales se determinaron mediante el método de Bradford
(BioRad). La actividad PLA_{2} de los lavados pulmonares se midió
según Levin et al. (1.986; supra) y se presenta en la
siguiente Tabla.
Los datos dados antes son la media de dos
determinaciones. Los resultados muestran que la administración
endotraqueal de rhUG inhibe la PLA_{2} in vivo. Los
animales que recibieron tensioactivo y rhUG tuvieron una actividad
PLA_{2} apreciablemente inferior en su fluido de lavado pulmonar
en comparación con los animales que recibieron tensioactivo sin
rhUG. Los datos confirman que la administración de rhUG junto con el
tensioactivo es beneficiosa al proteger los fosfolípidos
tensioactivos.
La rhUG inhibe la hidrólisis del tensioactivo
artificial por la PLA_{2} soluble in vitro. Survanta es un
tensioactivo artificial derivado de pulmón bovino y se utiliza para
tratar neonatos con RDS y adultos con RDS (ARDS). La hidrólisis de
Survanta por una PLA_{2} soluble del Grupo I, esto es, PLA_{2}
porcina, pancreática (Boehringer Mannheim) se caracteriza por su
capacidad para competir como sustrato con un sustrato de
fosfatidilcolina fluorescente (Cayman Chemicals), generando ácido
araquidónico como producto.
Survanta es un sustrato para la degradación
in vitro por las PLA_{2} solubles del Grupo I. Survanta es
rápidamente degradado in vitro por las PLA_{2} encontradas
en los fluidos extracelulares de un pulmón humano. La rhUG inhibe
la degradación de Survanta in vitro.
Se creó un ratón KO UG transgénico con el fin de
determinar el papel de la uteroglobina en la fisiología de los
mamíferos, así como para generar un modelo para la UG como agente
terapéutico en numerosas afecciones clínicas inflamatorias. La
primera etapa consistió en construir un vector de ADN apropiado con
el cual dirigir e interrumpir el gen de la uteroglobina de ratón
endógena. El fragmento de ADN BamHI-EcoRI de 3,2 kb
que contenía el exón 3 y las secuencias contiguas del gen de la
uteroglobina de la cepa de ratón 129/SVJ (Ray, 1.993) fueron
subclonados en los sitios correspondientes del vector pPNW como
describen Lei et al. (1.996). Se amplificó mediante PCR un
fragmento de 0,9 kb que contenía parte del exón 2 y su secuencia
aguas arriba (con los cebadores Primer-L (del
Intrón 1): 5'-TTC CAA GGC AGA ACA TTT GAG
AC-3'; Primer-R (del Exón 2):
5'-TCT GAG CCA GGG TTG AAA GG C-3')
con los sitios de restricción NotI y XhoI diseñados en los extremos
para la subclonación direccional en el vector de redireccionamiento
del gen. En este constructo, se suprimieron 79 pb del Exón 2 que
codifica 27 aminoácidos. El fragmento de la PCR se situó aguas
arriba del gen que codifica la resistencia a la neomicina en pPNW,
generando el vector de redireccionamiento del gen, pPNWUG. El vector
se muestra en la Figura 2A, en la que la casete
PGK-neo interrumpe el gen de la uteroglobina,
desorganizando la secuencia codificadora de la proteína.
El vector de redireccionamiento del gen pPNWUG
se linealizó con NotI y se sometió a electroporación en células ES
R_{1} según Nagy, A., et al. PNAS 90:8424 (1.993). La
selección con Ganciclovir y G-418 de las células
sometidas a electroporación produjo 156 clones. El análisis de
transferencia Southern (ADN) identificó un fragmento HindIII de 5,1
kb del alelo de la uteroglobina de tipo salvaje y un fragmento
HindIII de 8,2 kb adicional resultante de la recombinación homóloga
en tres de los 156 clones, mostrados en la Fig. 2B. Estos clones ES
R1 se inyectaron en blastocitos C57BL/6 según Capecchi, Science 244:
1288 (1.989). Se generaron dos líneas diferentes de ratones, que
descendían de diferentes fundadores quiméricos. Los vástagos
heterocigotos (UG^{+/-}) que portaban el locus del gen de la
uteroglobina elegido como diana fueron emparejados y se analizaron
los genotipos de la progenie mediante la PCR mostrada en la Figura
2C, así como la transferencia Southern, mostrada en la Figura
2D.
Con el fin de verificar que los ratones con el
gen desactivado homocigotos (UG^{-/-}) no poseían ninguna mUG
detectable, se sometieron a ensayo ratones con el gen de la
uteroglobina elegido como diana en cuanto a la expresión del ARNm
de UG y la proteína de mUG en diversos órganos incluyendo los
pulmones. Se aprobó un protocolo experimental por el comité de
cuidado y uso institucional de animales. Los ARN totales se aislaron
de diferentes órganos de ratones UG^{+/+}, UG^{+/-}, y
UG^{-/-}. La reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (RT-PCR) se utilizó para
detectar el ARNm de mUG. Las moléculas diana fueron sometidas a
transcripción inversa utilizando un cebador específico de mUG, mPr
(5'-ATC TTG CTT ACA CAG AGG ACT
TG-3), y el ADNc generado se amplificó utilizando
los cebadores de PCR mPr y mPl (5'-ATC GCC ATC ACA
ATC ACT GT-3'). El producto de la PCR se hibridó
con una sonda oligonucleotídica, mPp (5'-ATC AGA GTC
TGG TTA TGT GGC ATC C-3') derivada del exón 2 de la
secuencia génica de UG. Los cebadores y la sonda utilizados en la
RT-PCR de GAPDH de ratón son los siguientes:
mGAPDH-r (5'-GGC ATC GAA GGT GGA AGA
GT-3'); mGAPDH-l
(5'-ATG GCC TTC CGT GTT CCT AC-3');
mGAPDH-p (5'-GAA GGT GGT GAA GCA GGC
ATC TGA GG-3'). La Figura 2E demuestra que el ARNm
de mUG se detectaba en pulmones de ratones UG^{+/+} y UG^{+/-},
pero no UG^{-/-}. Datos similares (no mostrados) muestran que el
ARNm de mUG no está presente en próstata o útero de ratones
UG^{-/-}, pero está presente en los ratones con un gen de
uteroglobina intacto.
Los análisis de inmunoprecipitación y
transferencia Western de proteína mUG en los pulmones produjeron
resultados similares corroborativos, mostrados en la Figura 2F. Los
productos lisados de los riñones, el hígado, y los pulmones de los
ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} fueron preparados mediante
homogeneización en un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH
7,5, Tritón X-100 al 1%, desoxicolato al 0,2%, NaCl
150 mM, EDTA 5 mM) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2
mM y aprotinina, leupeptina, y pepstatina A, 20 \mug/ml cada una.
Los productos homogeneizados se centrifugaron a 17.500 x g durante
30 minutos a 4ºC y se inmunoprecipitaron como se ha descrito (E.
Harlow y D. Lane, Antibodies; a laboratory manual, 1^{a} Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1.998)
incubando los productos lisados de los tejidos o las proteínas del
plasma (1 mg/ml) con anticuerpo de conejo contra Fn de múrido
(dilución 1:100). La inmunoprecipitación simultánea de Fn de múrido
purificada (mFn) y rhUG (Mantile, G. et al., J. Biol. Chem.
267:20343 (1.993)) se realizó incubando concentraciones equimolares
de mFn con rhUG en presencia de glicerol al 10%,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, fosfato de
sodio 4,3 mM a 4ºC durante 1 hora, seguido de adición de anticuerpo
anti-mFn (dilución 1:100). Se resolvieron cantidades
iguales de proteínas extraídas de tejidos (30 \mug) o productos
inmunoprecipitados o sobre geles de
SDS-poliacrilamida al 4-20% o al 6%
en condiciones reductoras, seguido de transferencia Western con
anticuerpos de conejo frente a Fn de ratón (dilución 1:2000) o UG
(dilución 1:2000). No se detectó mUG en tejidos o fluidos de los
ratones UG^{-/-}, mientras los tejidos de ratones UG^{+/+} y
UG^{+/-} no contenían la proteína mUG.
Finalmente, los análisis histopatológicos de los
pulmones de UG^{-/-}, solamente, carecían de la inmunotinción
específica de mUG en células epiteliales bronquiolares. Los tejidos
de pulmón de ratones UG^{-/-}, UG^{+/-}, y UG^{+/+} fueron
fijados en fluido de Bouin o en fijadores de formalina tamponados
neutros al 10%, embebidos en parafina y seccionados a
4-6 micras. Se tiñeron con hematoxilina y eosina (H
& E). Los tejidos seleccionados se tiñeron mediante el método
tricrómico de Masson para la detección de colágeno, PTAH para la
fibrina, o Rojo Congo para la proteína amiloide. Para la detección
inmunohistoquímica de mUG y mFn, se utilizó el kit Vectastain Elite
ABC de conejo (Vector Laboratories). El anticuerpo de conejo
(CytImmune) para mUG se originó utilizando un péptido sintético
(Peptide Technologies, Inc.) correspondiente a la secuencia de
aminoácidos de mUG (Lys28 a Thr49, específicamente
KPFNPGSDLQNAGTQLKRLVDT). El anticuerpo de conejo para mFn (GIBCO
BRL) se utilizó como una dilución de 1:1000, y el anticuerpo para
mUG se utilizó a 1:500.
Estos tres grupos de resultados confirman que el
ratón con el gen de la uteroglobina desactivado homocigoto,
UG^{-/-}, carece de proteína mUG, o cualquier porción detectable
de la proteína.
De los 179 ratones nacidos de los cruces de
ratones UG^{-/-}, 46 (26%) eran del genotipo +/+, 90 (50%) del
+/- y 43 (24%) del UG^{-/-}, indicando que el locus mUG
desorganizado es heredado de modo Mendeliano y que los ratones
UG^{+/+}, UG^{+/-} y UG^{-/-} eran igualmente viables al
nacer. No obstante, los ratones UG^{-/-} mostraban un fenotipo
novedoso en el cual desarrollaban una enfermedad progresiva
caracterizada por caquexia, fuerte proteinuria, e hipocalcemia
asociada con una pérdida de peso profunda. La proteinuria es una
afección en la que niveles anormalmente elevados de albúmina y otras
proteínas del suero se excretan en la orina. Es indicativa de
disfunción glomerular e insuficiencia renal. El examen
histopatológico de los riñones de los animales afectados (como se
ha descrito antes para los pulmones) reveló la enfermedad glomerular
renal fulminante mostrada en la Figura 3. En comparación con los
glomérulos de los ratones UG^{+/+}, los de los ratones UG^{-/-}
eran hipocelulares y tenían depósitos proteináceos eosinofílicos
masivos. El desarrollo en el tiempo de la fatal enfermedad renal en
los ratones UG^{-/-} era de comienzo temprano (período de
4-5 semanas) o de comienzo tardío (período de 10
meses). Aquellos ratones UG^{-/-} que inicialmente parecían sanos
a las 4 semanas de edad tenían depósitos glomerulares focales a los
dos meses de edad. Aproximadamente a los 10 meses, estos ratones
tenían una caquexia extrema similar a la de los ratones que morían
de enfermedad de comienzo temprano. Los heterocigotos tenían una
forma más suave de la enfermedad renal observada en los ratones
UG^{-/-}. La histopatología de los riñones de los ratones con
enfermedad de comienzo tardío mostraba no solamente una
glomerulopatía grave como en la enfermedad de comienzo temprano,
sino también una marcada fibrosis del parénquima renal e
hiperplasia tubular (véase la Figura 3). Aunque la patología
predominante en los ratones UG^{-/-} se encontraba en los
riñones, los estudios histopatológicos también descubrieron zonas
focales ocasionales de necrosis en el páncreas que parecían estar
orientadas vascularmente. Por otra parte, también se encontraron
zonas focales en el timo y en las estructuras del bazo sugerentes de
cuerpos apoptóticos. Interesantemente, el páncreas expresa el gen
mUG, y este órgano también es una fuente rica de PLA_{2}
extracelular del grupo I, puesto que esta es principalmente una
enzima digestiva, su activación puede causar lesión tisular.
Debido a que se ha informado de que las
proteínas uteroglobina tienen propiedades inmunomoduladoras y
anti-inflamatorias y debido a que se sabe que
ocurre una amiloidosis reactiva en respuesta a la inflamación, es
probable que los depósitos glomerulares en los ratones sin mUG
fueran proteínas amiloides. La amiloidosis reactiva se caracteriza
por el depósito de proteína amiloide y complejos autoinmunitarios.
La identidad de los depósitos renales en los ratones UG^{-/-} fue
establecida mediante inmunohistoquímica de secciones de riñón. Las
secciones de riñón de ratones UG^{-/-} y UG^{+/+} se tiñeron
con rojo Congo y se examinaron con luz polarizada. Las proteínas
amiloides producen una birrefringencia positiva en este ensayo; sin
embargo, los glomérulos de los ratones UG^{-/-} eran claramente
negativos. Los estudios de inmunofluorescencia para la presencia de
inmunocomplejos con IgA, IgG o IgM en los glomérulos de los ratones
UG^{-/-} y los análisis inmunohistoquímicos para la presencia de
proteínas amiloides principales también fueron negativos. De este
modo, los depósitos glomerulares de los ratones UG^{-/-} no
contenían proteínas amiloides ni inmunocomplejos, y por lo tanto, no
parecían ser el resultado de una respuesta inflamatoria.
Los depósitos en los riñones de ratones
UG^{-/-} se examinaron mediante microscopía de transmisión de
electrones para dilucidar su estructura y morfología. Se fijó un
riñón de un ratón UG^{-/-}, con lesión glomerular, en formalina y
se embebió en resina epoxídica. Las secciones finas se tiñeron con
acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen al microscopio
electrónico. Se tomaron microfotografías a 6.000X o a 60.000X. Los
depósitos contenían principalmente dos tipos de estructuras
fibrilares: un tipo de fibrillas largas y estriadas que son
relativamente infrecuentes, las otras cortas y difusas que son más
abundantes (Figuras 3E y 3F). Debido a que las proteínas ECM, tales
como el colágeno y la fibronectina, producen estructuras fibrilares
similares, los depósitos glomerulares en los ratones UG^{-/-}
pueden contener estas proteínas.
Los depósitos glomerulares se analizaron a
continuación mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpo
anti-mFn. Se utilizaron secciones de tejido fijadas
con formalina para la inmunoflurescencia utilizando un
anti-mFn de conejo e IgG anti-conejo
de cabra conjugada con FITC. De un modo similar, también se
realizaron estudios de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos
específicos para mFn, colágeno I y III, vitronectina, laminina y
osteopontina. La epifluorescencia se fotografió utilizando un
microscopio Zeiss Axiophot. La inmunofluorescencia específica de Fn
en los glomérulos renales de los ratones de tipo salvaje era
virtualmente indetectable (Figura 3G), la de los glomérulos de las
camadas UG^{-/-} era intensa (Figura 3H). Cuando se utilizaba la
tinción tricrómica de Masson, los glomérulos de los ratones
UG^{+/+} eran negativos (Figura 3I) y los de los ratones
UG^{-/-} (Figura 3J) eran positivos, sugiriendo la presencia de
colágeno en los depósitos glomerulares. La inmunofluorescencia,
utilizando anticuerpos específicos de colágeno I y colágeno III
confirmó estos resultados. Debido a que se sabe que Fn interacciona
con otras proteínas de la matriz extracelular (ECM), los autores
también sometieron a ensayo la presencia de laminina, vitronectina y
osteopontina en los glomérulos de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-}
mediante inmunohistoquímica, cuyos resultados fueron negativos.
Con el fin de determinar si la producción
excesiva de Fn puede justificar su depósito en los glomérulos
renales, los autores de la invención evaluaron la cantidad relativa
de ARNm de Fn en los riñones, los pulmones, y el hígado de ratones
UG^{-/-} y UG^{+/+} mediante RT-PCR y
densitometría. Los resultados indican que las cantidades relativas
de ARNm de Fn eran esencialmente idénticas en animales tanto
UG^{+/+} como UG^{-/-}. De este modo, la producción en exceso
de ARNm de Fn no era una causa probable de depósito de Fn en los
glomérulos de ratones UG^{-/-}. Después los autores de la
presente invención compararon la proteína Fn en plasma, riñones, e
hígado de ratones UG^{-/-} y UG^{+/+} mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras, y transferencia
Western. En el plasma, los riñones y el hígado de los ratones de
tipo salvaje solamente se pudieron detectar especies de Fn de 220
kD; no obstante, mientras el producto lisado de plasma e hígado de
los ratones UG^{-/-} tenía la banda de Fn de 220 kD, los
productos lisados de riñón contenían otra banda de Fn distinta
multimérica, unida covalentemente (Figura 4A).
Basándose en los conceptos actuales, se piensa
que las etapas críticas en el ensamblaje en la matriz de Fn y la
fibrilogénesis, al menos en la superficie celular, implican la
activación de la integrina y la auto-agregación de
Fn. Debido a que UG es un potente inhibidor de la fosfolipasa
soluble A_{2} (sPLA_{2}), una enzima clave en la ruta
inflamatoria, la carencia de mUG en ratones UG^{-/-} puede
contribuir al desarrollo de glomerulonefritis, una enfermedad renal
inflamatoria. De este modo, los autores de la presente invención
midieron la actividad PLA_{2} en el suero de ratones UG^{+/+}
(n=3) y UG^{-/-} de edad, sexo y peso similares. Los animales se
sacrificaron y se midieron las actividades PLA_{2} de cada muestra
por triplicado utilizando un kit de análisis de PLA_{2} (Cayman
Chemical) según las instrucciones del fabricante. Las
concentraciones de proteína en suero se determinaron mediante
análisis de Bradford (Bio Rad) y se calcularon las actividades
específicas de PLA_{2}. Las actividades específicas
(\mumoles/min/mg de proteína) de PLA_{2} en suero de ratones
UG^{-/-} [36+3,3 (ETM)] eran significativamente superiores
(p<0,05) que los de los ratones UG^{+/+} [18+2,8 (ETM)]. Estos
resultados aumentaban la posibilidad de que una actividad PLA_{2}
superior pueda conducir a un aumento de la producción de ácido
lisofosfatídico (LPA) y por consiguiente promover la activación de
la integrina y la auto-agregación de Fn en ratones
UG^{-/-}.
Para comprender adicionalmente cómo la
uteroglobina puede evitar el auto-ensamblaje de Fn,
se determinó la capacidad de rhUG para desorganizar la interacción
mFn-Fn in vitro. Se incubaron concentraciones
equimolares de rhUG y mFn para permitir cualquier unión de
proteínas u otras interacciones, después se inmunoprecipitaron con
anticuerpo anti-Fn, y los productos
inmunoprecipitados se resolvieron mediante SDS-PAGE
en condiciones reductoras. La transferencia Western, como se ha
descrito previamente, con anticuerpo para mFn o mUG detectó cada
proteína, respectivamente. Los resultados muestran que la
fibronectina inmunuprecipita simultáneamente con rhUG (Figura 4B).
Para confirmar estos resultados, se incubó
rhUG-I^{125} con mFn y los complejos se
resolvieron mediante electroforesis, utilizando un gel de
poliacrilamida al 6% en condiciones no desnaturalizantes y no
reductoras (Figuras 4C). La detección de un heterómero
Fn-UG en el autorradiograma (calle 2) demostró que
la Fn soluble interacciona con UG in vitro. Para averiguar si
la heteromerización Fn-UG tiene lugar in
vivo, se inmunoprecipitó plasma de ratones UG^{+/+} y
UG^{-/-} con un anticuerpo anti-mFn que no
presenta reacción cruzada con rhUG (Figura 4D). El anticuerpo
anti-mFn precipitó simultáneamente tanto con mFn
como con rhUG del plasma de ratones UG^{+/+}, pero no de
UG^{-/-}, sugiriendo que los heterómeros de Fn-UG
están presentes en el plasma de ratones UG^{+/+}. Por lo tanto, el
complejo Fn-UG no es simplemente un artefacto
formado in vitro sino que existe naturalmente en el
suero.
Para determinar la especificidad y afinidad de
la unión de UG a Fn, los autores de la presente invención incubaron
Fn-I^{125} con Fn no marcada en presencia y
ausencia de UG. Cualquiera de los complejos presentaba
entrecruzamiento por afinidad con suberato de disuccinimidilo
(DSS). Utilizando placas de 24 pocillos recubiertas con Fn humana
(hFn) (Collaborative Biomedical Products), se incubaron 3 \mul de
Fn-I^{125} (Sp. Act. 6 mCi/mg: ICN Biomedicals)
en ausencia y en presencia de UG o Fn
(10^{-12}-10^{-6} M) en 500 \mul de HBSS a la
temperatura ambiente durante 2 horas. La SDS-PAGE y
la transferencia Western de toda la Fn con anticuerpo para UG no
lograron detectar ninguna contaminación con UG. El complejo
radiomarcado se lavó dos veces con PBS, se solubilizó en NaOH 1N,
se neutralizó con HCl 1N, y se midió la radiactividad mediante un
contador gamma. En un experimento separado, se incubó
hFn-I^{125} (3 \mul) con 20 \mul (1 mg/ml) de
Fn de ratón en 40 \mul de HBSS, pH 7,6 en ausencia o presencia de
concentraciones crecientes de rhUG reducida (5-500
\mug) a la temperatura ambiente durante 2 horas. Las muestras se
entrecruzaron con DSS 0,20 mM a la temperatura ambiente durante 20
minutos, se hirvieron en tampón de muestra para SDS durante 5
minutos, se sometieron a electroforesis sobre gel de
SDS-poliacrilamida al 4-20% y se
sometieron a autorradiografía. En ausencia de UG,
Fn-I^{125} formaba un complejo radiactivo de
elevado peso molecular, con Fn no marcada, pero en presencia de UG
la formación de productos agregados Fn-Fn se
inhibió de una manera dependiente de la concentración de UG (Figura
4E).
Para determinar si hay diferencia entre las
afinidades de unión de Fn por UG y Fn por sí misma, se realizaron
experimentos de unión en los que Fn-I^{125} se
incubó con Fn no marcada y se inmovilizó sobre placas de múltiples
pocillos junto con concentraciones variables de UG. En experimentos
por separado, también se realizaron estudios de unión de
Fn-I^{125} con Fn no marcada inmovilizada
utilizando diversas concentraciones de Fn soluble no marcada. Los
análisis Scatchard de los datos de ambos tipos de experimentos de
unión produjeron líneas directas con constantes de disociación
(kds) de 13 nM para la unión de UG a Fn y de 176 nM para la unión
de Fn consigo misma. Estos resultados sugieren que, debido a una
afinidad de unión relativamente superior de UG por Fn, la UG
contrarresta eficazmente la auto-agregación de Fn.
Los experimentos de entrecruzamiento por afinidad en los que se
incubó colágeno I-(I^{125}) marcado con yodo radiactivo con Fn no
marcada en ausencia o presencia de UG, también se realizaron como
se ha descrito antes para Fn. Se incubaron 15 \mul de colágeno
I-I^{125} no desnaturalizado (Sp. Act. 65,4
mCi/mg) con Fn en presencia o ausencia de UG reducida (250 \mug),
se sometieron a entrecruzamiento por afinidad, se sometieron a
electroforesis y se sometieron a autorradiografía. Los resultados
indican que UG contrarresta la formación de agregados de
colágeno-I^{125}-Fn de elevado
peso molecular (Figura 4F).
Para someter a ensayo si rhUG protege los
glomérulos renales de la acumulación de Fn, se administró
intravenosamente Fn humana soluble (hFn) sola, o hFn mezclada con
concentraciones equimolares de rhUG a camadas UG^{+/+} y
UG^{-/-} aparentemente sanas.
Se administró Fn humana (500 \mug/150 \mul
de PBS) en la vena de la cola de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-}
aparentemente sanos de dos meses de edad, con un peso de
aproximadamente 22 g. De un modo similar, se inyectó a los ratones
de control una mezcla de 500 \mug de hFn o bien a concentraciones
equimolares de rhUG o bien albúmina en 150 \mul de PBS.
Veinticuatro horas después de la última inyección, los ratones se
sacrificaron y los diversos órganos se fijaron en formalina
tamponada. Las secciones histológicas de los riñones y otros
órganos se examinaron mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo
anti-Fn monoespecífico (GIBCO BRL; clon 1) e IgG
anti-ratón de conejo conjugada con FITC (Cappel). En
un experimento por separado, se inyectó 1 mg de hFn sola en 150
\mul de PBS diariamente durante 3 días consecutivos, en ratones
UG^{+/+}.
La base lógica para inyectar Fn humana era poder
discriminar entre la Fn de ratón endógena y la hFn administrada. Se
ha descrito el método de administración intravenosa y detección
inmunohistoquímica de hFn en diversos tejidos.
La inmunofluorescencia de Fn humana en
glomérulos de ratones UG^{+/+} de tipo salvaje a los que se había
inyectado una mezcla de hFn y rhUG (razón molar 1:1) o hFn sola era
similar (Figuras 5A y 5B). No obstante, los ratones UG^{-/-} a
los que se había inyectado una mezcla de hFn y UG mostraron una
pequeña inmunofluorescencia específica de hFn en glomérulos (Figura
5C), mientras aquellos que recibieron Fn sola mostraron una
intensidad de inmunofluorescencia mayor (Figura 5D). La
administración de una mezcla de hFn y BSA, como control, no produjo
efecto protector.
Para determinar si este efecto protector de UG
podía ser superado inyectando cantidades mayores de Fn en ratones
UG^{+/+}, los autores de la presente invención inyectaron 1 mg de
hFn por animal diariamente durante tres días consecutivos. Aunque
la administración intravenosa de hFn a ratones UG^{+/+} a dosis
más bajas (500 \mug/animal) no fue eficaz al causar un depósito
glomerular apreciable (Figura 5A), la administración de dosis más
altas (3 mg/animal) condujo a una acumulación apreciable. De este
modo, la UG previene el depósito de Fn glomerular, y los ratones
UG^{+/+} en oposición a los UG^{-/-} tienen un umbral más alto
para la acumulación de Fn soluble, debido a la presencia de UG
endógena.
Para determinar si la UG previene la
fibrilogénesis de Fn y el ensamblaje en la matriz en un análisis de
cultivo de tejidos in vitro típico, se cultivaron
fibroblastos embrionarios de ratón en medio que contenía hFn
soluble sola o una mezcla de concentraciones equimolares de hFn y
rhUG. El ensamblaje en la matriz de Fn y la fibrilogénesis en
células cultivadas (CRL6336, ATCC) se determinaron como se ha
descrito. El nivel de fibrilogénesis observado en las células de
los cultivos tratados con hFn sola fue mucho mayor (Figura 5E) en
comparación con el de aquellas que recibieron una mezcla de hFn y
rhUG (Figura 5F).
La detección de complejos UG-Fn
en muestras clínicas de fluidos corporales tales como suero, fluidos
BAL, y esputo es importante en la determinación del papel de este
complejo en las enfermedades humanas. Se desarrolla un análisis
diagnóstico en fase de solución para la detección de complejos
UG-Fn y el formato del análisis se muestra en la
Figura 6. El anticuerpo de captura, anclado covalentemente a un
soporte sólido, es un anticuerpo policlonal de conejo
monoespecífico originado contra la proteína humana. El soporte
sólido puede ser una cuenta, tal como una cuenta magnética, un
tubo, o una placa de ELISA. El soporte sólido permite la
flexibilidad de realizar etapas de lavado después de cada reacción
de unión con el fin de obtener resultados más consistentes con una
variedad de tipos de muestras. El anticuerpo de detección es
específico para Fn, y está disponible en numerosas fuentes
comerciales. Después se utiliza un anticuerpo
anti-IgG, conjugado con una enzima tal como
peroxidasa de rábano picante (HRP), para detectar la IgG
anti-Fn en el extremo de la cadena molecular en una
reacción enzimática normalizada en la que el sustrato de la enzima
se convierte en un compuesto cromogénico o fluorogénico que es
cuantificado con un espectrofotómetro o un fluorómetro (Amersham).
El límite de detección para este análisis es de 500 \mug de
complejo UG-Fn por ml de fluido de muestra.
Una deficiencia transitoria pero aguda de hUG es
creada por la técnica de limpieza de la sangre conocida como
diálisis clínica, incluyendo hemodiálisis, diálisis peritoneal y
diálisis continua (CRRT). Todas las formas de diálisis clínica
implican el uso de una membrana semi-permeable para
filtrar los productos de desecho corporales tóxicos, incluyendo
metabolitos químicos tales como urea, y pequeñas proteínas tales
como beta2-microglobulina, de la sangre.
La UG es una proteína extremadamente compacta,
conocida por su migración anómala en SDS-PAGE,
correspondiente a un peso molecular de aproximadamente
10-13 kDa, a pesar de que su verdadero peso
molecular es de 15,7 kDa. Por lo tanto, se esperaba que el dímero
de UG se comportara como una proteína de 10-13 kDa
en los experimentos de diálisis. Sorprendentemente, se encontró que
el dímero es tan compacto que pasa a través de una membrana de
diálisis de 8,0 kDa MWCO. La UG también pasaba a través de una
membrana de diálisis de 14,0 kDa MWCO.
La composición de las membranas de diálisis
utilizadas en estos ejemplos es similar, si no idéntica, a la
composición de la mayoría de las membranas fabricadas y utilizadas
para la diálisis clínica. Estas consisten en celulosa regenerada o
acetato de celulosa.
Para este experimento, se sometieron a diálisis
alícuotas de 1,0 ml de dos productos lisados de células con rhUG
(uno puro en >90% y uno puro aproximadamente en 70%), sin
aditivos de tampón, frente a 1.000 ml de acetato de amonio 50 mM no
tamponado, utilizando tres tamaños de tubos de diálisis: 3,5 kDa,
8,0 kDa, y 14,0 kDa (Spectra/Por; Thomas Scientific). Hubo cuatro
cambios de tampón para cada muestra a lo largo de un período de
tiempo de 48 horas, todos realizados a la temperatura ambiente
(aproximadamente 25-27ºC). La apariencia de cada
muestra de diálisis cambiaba de amarillo claro a un líquido
incoloro, transparente. El tubo de diálisis se verificó en cuanto a
pérdidas al principio y al final del proceso mediante una breve
aplicación de presión directamente al tubo (retorciendo) y
observación de cualquier pérdida, de las cuales no hubo ninguna. El
tubo se cerró doblemente con abrazaderas en cualquier extremo para
asegurarlo adicionalmente frente a pérdidas.
La Figura 7 muestra el análisis
SDS-PAGE de estos resultados. La muestra de
pre-diálisis pura en 90% se muestra en la calle 7 y
8 próxima a las tres muestras de post-diálisis en
las calles 1, 2, y 3. El dímero de UG ya no estaba presente en las
calles que representan las muestras sometidas a diálisis con
membranas de 8,0 kDa MWCO. Estos resultados se confirmaron más
tarde con diferentes lotes de preparaciones de UG parcialmente
purificada.
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 70
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: uteroglobina humana
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 69
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: uteroglobina de conejo
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 75
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: uteroglobina de rata
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 75
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: uteroglobina de ratón
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador L
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipttccaaggca gaacatttga gac
\hfill23
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador R
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskiptctgagccag ggttgaaagg c
\hfill21
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<210> 7
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 7
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\hfill23
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<210> 8
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 8
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\hfill20
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<210> 9
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipatcagagtct ggttatgtgg catcc
\hfill25
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<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 10
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\hfill20
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<210> 11
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipatggccttcc gtgttcctac
\hfill20
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<210> 12
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<211> 26
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 12
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\hfill26
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<210> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de aminoácidos de uteroglobina de ratón
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<400> 13
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Claims (24)
1. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina humana
recombinante (rhUG) o un derivado de la misma, con la condición de
que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula
parental, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
2. El uso de una cantidad eficaz de unión a
fibronectina de uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un
derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve
la actividad biológica de la molécula parental, en la fabricación
de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección
fibrótica en un paciente que necesite semejante tratamiento.
3. El uso de una cantidad compensatoria de
uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un derivado de la
misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad
biológica de la molécula parental, en la fabricación de una
composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección
fibrótica caracterizada por una deficiencia de uteroglobina
endógena.
4. El uso de la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, donde dicha afección fibrótica es la fibrosis
pulmonar, la fibrosis renal o la fibrosis vascular.
5. El uso de la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica es para el
tratamiento de una afección fibrótica caracterizada por una
deficiencia de uteroglobina endógena, donde dicha afección se
selecciona del grupo que consiste en displasia broncopulmonar
neonatal, complicaciones de hemodiálisis, pulmón con bleomicina,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y glomerulopatía
heredada.
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, donde dicha UG tiene una pureza entre
aproximadamente 75% y aproximadamente 100%, preferiblemente entre
aproximadamente 90% y aproximadamente 100%, muy preferiblemente al
menos 95%.
7. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, donde dicha UG es recombinante (rhUG),
teniendo sustancialmente la misma secuencia que la uteroglobina
humana nativa.
8. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, donde dicha UG va a ser administrada
asociada con un tensioactivo pulmonar.
9. El uso de la reivindicación 8, donde dicho
tensioactivo pulmonar está presente en una cantidad de
aproximadamente 20% a aproximadamente 80% en peso.
10. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 9, donde dicha UG va a ser administrada por
ruta endotraqueal, oftálmica, intravenosa, generalizada,
intraperitoneal, intramuscular, u oral.
11. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, donde dicha UG va a ser administrada en
forma de un líquido o semi-aerosol vía un tubo
traqueal.
12. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 11, donde dicha UG va a ser administrada
combinada con un agente activo seleccionado del grupo que consiste
en esteroides, agentes antiinflamatorios no esteroideos, agentes
quimioterapéuticos, analgésicos, anticuerpos, antiparasitarios,
antivirales, antibióticos, antifúngicos, vacunas, vacunas
tumorales, inmunosupresores, factores de crecimiento
hematopoyéticos, antitrombóticos, fármacos cardiovasculares, una o
más vitaminas y suplementos minerales, y fármacos de fertilidad.
13. Un análisis para cuantificar los complejos
de uteroglobina-fibronectina en una muestra clínica,
donde
(a) se pone en contacto una muestra clínica que
se sospecha que contiene uno o más complejos de
uteroglobina-fibronectina con un agente para la
captura de antígenos,
(b) se añade un agente de detección de antígenos
a dicha muestra, y
(c) se detecta la presencia de cualquier
complejo unido a dicho agente de captura utilizando un anticuerpo
secundario que se une al agente de detección de antígenos y se
conjuga con un radical que es susceptible de ser detectado mediante
la adición de un compuesto que reacciona con dicho radical.
14. El análisis de la reivindicación 13, donde
dicho agente para la captura de antígenos es un anticuerpo
policlonal de conejo monoespecífico, inmovilizado sobre un soporte
insoluble.
15. El análisis de la reivindicación 13 o la
reivindicación 14, donde el anticuerpo secundario es un anticuerpo
anti-IgG, el radical al que se conjuga es una
enzima, y el compuesto que reacciona con el radical es un sustrato
para la enzima que se convierte en un compuesto cromogénico o
fluorogénico tras la reacción con la enzima.
16. El análisis de la reivindicación 15, donde
la enzima es peroxidasa de rábano picante.
17. El análisis de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, donde el agente para la detección de
antígenos es un anticuerpo específico para fibronectina.
18. El uso de una cantidad eficaz de unión a
fibronectina de uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un
derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve
la actividad biológica de la molécula parental, en la fabricación
de una composición farmacéutica para tratar o prevenir la
fibrilogénesis en un paciente que necesita semejante
tratamiento.
19. El uso de la reivindicación 18, donde dicha
UG tiene una pureza entre aproximadamente 75% y aproximadamente
100%, preferiblemente entre aproximadamente 90% y aproximadamente
100%, muy preferiblemente al menos 95%.
20. El uso de la reivindicación 18 o la
reivindicación 19, donde dicha UG es recombinante (rhUG), teniendo
sustancialmente la misma secuencia que la uteroglobina humana
nativa.
21. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, donde dicha UG va a ser administrada
asociada con un tensioactivo pulmonar.
22. El uso de la reivindicación 21, donde dicho
tensioactivo pulmonar está presente en una cantidad de
aproximadamente 20% a aproximadamente 80% en peso.
23. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 22, donde dicha UG va a ser administrada por
ruta endotraqueal, oftálmica, intravenosa, generalizada,
intraperitoneal, intramuscular, u oral.
24. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23, donde dicha UG va a ser administrada en
forma de un líquido o semi-aerosol vía un tubo
intratraqueal.
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