ES2249586T3 - El dominio de tipo lectina de la trombomodulina y su uso terapeutico. - Google Patents
El dominio de tipo lectina de la trombomodulina y su uso terapeutico.Info
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Abstract
Uso de un polipéptido como el descrito por la SEC ID Nº 1, o un fragmento del mismo que comprende al menos aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 1 y capaz de suprimir la adhesión de leucocitos a células endoteliales en un ensayo de adhesión estática, para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la inflamación.
Description
El dominio de tipo lectina de la trombomodulina y
su uso terapéutico.
La presente invención se refiere al dominio de
tipo lectina de la trombomodulina y su uso para la prevención y/o el
tratamiento de enfermedades tales como trastornos inflamatorios.
Aunque se ha reconocido ampliamente que el
sistema de coagulación desempeña un papel en la modulación de la
inflamación, ha sido sólo recientemente cuando se ha apreciado el
impacto de esta contribución y cuando se han establecido algunas de
las conexiones moleculares. A este respecto, la vía anticoagulante
de la proteína C es especialmente relevante. Además de su papel bien
caracterizado en la modulación de la generación de trombina, este
sistema, compuesto de un complejo de proteínas solubles y asociadas
a membranas, desempeña una parte integral en la regulación de la
respuesta a agentes inflamatorios seleccionados (revisado
en^{44}). Datos clínicos sustanciales han revelado que pacientes
con sepsis grave tienen los niveles de proteína C y proteína S
significativamente disminuidos, y el alcance de la supresión de la
proteína C puede correlacionarse con consecuencias clínicas^{49}.
Parece que la proteína C activada (APC) modula la respuesta
inflamatoria por varios mecanismos, que incluye la inhibición de la
activación de células polimorfonucleares (PMN) y la liberación de
elastasa, el bloqueo de las interacciones de PMN con selectinas y la
prevención de la liberación de citoquinas por
monocitos^{48,52-55}. Más recientemente, también
se ha encontrado que el receptor de la proteína celular endotelial
(EPCR), un cofactor que potencia la activación de la proteína C por
trombina-trombomodulina, modula la función de APC en
la inflamación. Además, la inhibición de la interacción de APC/PC
con EPCR in vivo, da lugar a un aumento de la respuesta
inflamatoria tras las infusiones de E. coli en
babuinos^{56}. Se están explorando conexiones adicionales entre
EPCR y la inflamación, aunque no completamente delineadas, como
Esmon y colaboradores que han informado de que durante la sepsis se
libera una forma soluble de EPCR^{57}, que interfiere con la
activación de la proteína C y se une a un receptor en neutrófilos
activados que es un autoantígeno en la granulomatosis de
Wegener^{58, 59}. Otro participante especialmente relevante en el
sistema anticoagulante es la trombomodulina (TM), un cofactor
crítico en la activación de la proteína C y un receptor
glicoproteico para trombina ampliamente expresado. Con la clonación
y secuenciación del gen de la trombomodulina^{1}, se ha aclarado
la probable organización estructural de la proteína y las regiones
responsables de su función anticoagulante y antifibrinolítica. La TM
de cadena única madura en humanos tiene 557 aminoácidos de longitud
y está estructuralmente dividida en cinco dominios. La región
N-terminal (restos
1-226)^{2} tiene un módulo (restos
1-154) con homología con los dominios lectina del
receptor de asialoglicoproteína hepático y de la IgE, así como con
los miembros de la familia de selectinas. A pesar de la
controversia, los análisis in vitro sugieren que este dominio
se requiere para la internalización constitutiva del receptor en
algunas células^{5, 6}. Desde el resto 155 al 226, hay una región
hidrófoba que puede estar asociada con la membrana plasmática y que
contiene dos sitios potenciales para la
O-glicosilación. El siguiente dominio comprende seis
repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF),
las últimas 3 ó 4 son necesarias para la activación del TAFI o de la
proteína C, respectivamente, por trombina. Se desconoce la función
de las otras repeticiones similares a EGF. El tercer dominio, entre
las repeticiones similares a EGF y la región transmembranal, es rico
en serina/treonina y contiene cuatro sitios posibles de
O-glicosilación, a uno de los cuales se une un
condroitín sulfato, importante para la actividad anticoagulante
completa de TM. En cuarto lugar, hay un dominio transmembrana
altamente conservado y en quinto, una corta cola citoplásmica que
contiene sitios posibles de fosforilación, y una única cisteína que
puede mediar en la multimerización de la molécula. Se ha demostrado
que TM es importante para regular el proceso inflamatorio por medio
de la vía anticoagulante. La regulación negativa de TM de la célula
endotelial vascular por citoquinas inflamatorias (un efecto que se
refleja en la expresión del EPCR celular) altera directamente la
generación de APC. También se altera la función de TM como cofactor
de la proteína C de cara a la inflamación, con la liberación por PMN
activados de proteasas liposomales y oxidantes que dan lugar a la
proteolisis del receptor y a la oxidación de una metionina crítica
en las repeticiones similares a EGF de TM, que inactiva la función
de la glicoproteína para la activación de la proteína C. Varias
líneas adicionales de evidencias mantienen un papel de TM como
agente antiinflamatorio. Se usaron formas solubles recombinantes de
TM, la mayoría de las cuales estaban compuestas por las regiones
extramembranales completas, para prevenir la acumulación pulmonar de
leucocitos inducida por endotoxina y por el SDRA, insuficiencia del
órgano o letalidad en modelos con animales pequeños^{54, 63, 64}.
La transferencia génica mediada por adenovirus de TM en un modelo de
restenosis en conejo no sólo fue eficaz para la reducción de la
restenosis, sino que también dio lugar al descenso de la inflamación
y de la extravasación de leucocitos^{22}. En un modelo de daño
inducido por compresión de la médula espinal en ratas, la TM soluble
recombinante proporcionaba neuroprotección, con reducción de la
acumulación de leucocitos y de la expresión de ARNm de
citoquinas^{65}. En cada uno de estos estudios, los resultados
mejorados que seguían a la administración de TM se atribuyeron a la
potenciación de la activación de la proteína C, mientras que nunca
se consideró la posibilidad de que otros dominios de TM pudieran
contribuir al aparente efecto antiinflamatorio.
En la presente invención hemos determinado la
función in vivo del dominio N-terminal de
tipo lectina de TM generando ratones carentes de este dominio y
hemos demostrado que la adición del dominio
N-terminal de tipo lectina recombinante proporciona
al endotelio vascular propiedades antiinflamatorias naturales
interfiriendo con la adhesión del leucocito. (1) TM es una molécula
conocida. Por ejemplo, el documento EP 0 290 419 B1 describe un clon
de ADNc que representa la secuencia completa codificadora de la
trombomodulina humana (TM), incluyendo una región aminoterminal de
unión a la trombina de 223 aminoácidos. (2) Se sabe que las regiones
EGF de TM tiene actividad anticoagulante (e indirectamente
antiinflamatoria). Adicionalmente, Villoutreix y Dahlbäck (Journal
of Molecular Modelling vol. 4, 1998, 310-322)
describen que la región N-terminal de TM de 155
aminoácidos es un dominio lectina de tipo C. Sin embargo, la
invención actual sorprendentemente demuestra que la región de tipo
lectina de TM tiene una función antiinflamatoria. De hecho, puesto
que se ha demostrado en la técnica que varios miembros de la familia
de lectinas de tipo C (a la que pertenece el dominio de tipo lectina
de TM) funcionan potenciando la adhesión de leucocitos, cabría
esperar que el dominio de tipo lectina de TM tuviera mejor una
función proinflamatoria.
Figura
1
Un alineamiento de los primeros 269 restos de
aminoácidos del extremo N-terminal de la TM humana
(hTM) con los primeros 268 restos de aminoácidos del extremo
N-terminal de la TM murina. En cada tercera línea se
muestran los restos idénticos. Se ha encuadrado la región que se
delecionó en los ratones TM^{Led/Led} (carentes del supuesto
péptido señal del extremo N-terminal) y tiene una
longitud de 223 restos de aminoácidos. El fragmento de
trombomodulina murina (mTM_{lec155}) se extiende 155 restos desde
el resto aminoacídico 3 tras el supuesto péptido señal (flecha
rellena) hasta terminar con la secuencia "...CRP" en la línea
vertical punteada. El fragmento de la trombomodulina murina
TM_{lec223} se extiende 223 restos desde el resto aminoacídico 3
tras el péptido señal hasta el final con la secuencia
"...GAWD". El fragmento de la trombomodulina humana
(hTM_{lec226}), SEC ID Nº 1, se extiende 224 restos desde el
aminoácido 4 tras el supuesto péptido señal (flecha de puntos) hasta
terminar con la secuencia "...GAWD". El fragmento de
trombomodulina humana (hTM_{lec154}) se extiende 154 restos desde
el resto aminoacídico 4 tras el supuesto péptido señal (flecha de
puntos) hasta el final de la secuencia "...CRP" en la línea
vertical de puntos.
Figura
2
Vista general esquemática de la construcción del
vector dirigido para delecionar el dominio
N-terminal de la trombomodulina. Puede encontrarse
una descripción detallada en la sección 2 de materiales y
procedimientos.
Tabla
1
Respuesta de los ratones expuestos a hipoxia.
Niveles en tejido pulmonar de fibrina y niveles en plasma de FPA con
la DT asociada. No se demostraron diferencias significativas entre
ratones TM^{LeD/LeD} y TM^{ts/ts} (p > 0,1).
Tabla
2
Respuesta de los ratones expuestos a LPS. Niveles
en tejido pulmonar de fibrina con la DT asociada. No se demostraron
diferencias significativas entre los ratones TM^{LeD/LeD} y
TM^{ts/ts} (p > 0,1).
Tabla
3
Respuesta de ratones expuestos a dosis subletales
de LPS. Se midieron los niveles de citoquina en el suero y se
contaron las células blancas de sangre periférica (WBC). Los niveles
de TNF\alpha e IL-1\beta son significativamente
más altos en ratones TM^{LeD/LeD} y
TM^{LeD-neo/LeDneo}. n = 18, para cada grupo.
Tabla
4
Actividad mieloperoxidasa (MPO) en BALF tras la
inhalación de LPS. La actividad MPO es significativamente más alta
en pulmones de ratones TM^{LeD/LeD} tras la exposición a LPS. Los
resultados son representativos de un experimento realizado dos
veces.
Tabla
5
Niveles plasmáticos de proteína C humana (hPC) y
proteína C activada humana (hAPC) tras la infusión de hPC como se
describe en procedimientos. Los resultados reflejan uno de los dos
experimentos representativos, cada uno de los cuales tiene 5 ratones
por grupo.
Tabla
6
Se evaluó la adhesión de PMN derivados de médula
ósea de ratones de ambos genotipos a células fEND.5 en un modelo de
cámara de flujo. Los resultados reflejan los resultados de 5
experimentos independientes. Para cada experimento, se contaron 15
campos del microscopio como se detalla en procedimientos.
Tabla
7
Se evaluó la adhesión de PMN derivados de médula
ósea de ratones de ambos genotipos a células fEND.5 en un modelo de
cámara de flujo. Los resultados reflejan los resultados de 5
experimentos independientes. Para cada experimento, se contaron 15
campos del microscopio como se detalla en procedimientos.
Tabla
8
Ensayo de adhesión estática. La adhesión de PMN y
de linfocitos fue significativamente mayor para células endoteliales
de TM^{LeD/LeD} sin tratar con TNF que para células endoteliales
de TM^{ts/ts} (p < 0,005). Los antisueros (ac)
anti-TM incrementaban la adhesión de PMN a células
endoteliales de TM^{ts/ts} (p < 0,005) pero no tenían efecto
adicional en la adhesión de PMN a células endoteliales de
TM^{LeD/LeD}. Este es un experimento representativo realizado 3
veces, cada vez en 3 clones diferentes. Para cada experimento, se
usaron 5 pocillos para cada condición y se contaron los leucocitos
adherentes en 15 campos del microscopio.
Tabla
9
Efecto de TM_{lec155} recombinante en la
adhesión de PMN. Los PMN procedían de ratones de tipo silvestre.
TM_{lec155} disminuye significativamente la adhesión de PMN a las
células endoteliales TMLeD/LeD.
Tabla
10
Efecto de TM_{lec155} recombinante en la
respuesta de citoquinas in vivo. Los ratones de tipo
silvestre se trataron con 20 \mug/g de LPS i.p., seguido 5
min después del tratamiento indicado. Los niveles plasmáticos de
IL-1b se midieron 3 horas después.
La trombomodulina es un receptor glicoproteico
ampliamente expresado que desempeña un papel fisiológicamente
importante en el mantenimiento del balance homeostático normal
postnatal. En estudios previos, se ha demostrado que la inactivación
del gen de TM en ratones da lugar a letalidad embrionaria sin
trombosis. En la presente invención se estudió el papel in
vivo del dominio de tipo lectina N-terminal de
TM usando recombinación homóloga en células ES para crear ratones
que carecían de esta región de TM (TM^{LeD/LeD}). El
entrecruzamiento de ratones TM^{ts/LeD} de la F1 (1 alelo de tipo
silvestre y 1 alelo mutante) daba lugar a aproximadamente 300
descendientes sanos con un patrón de herencia Mendeliana normal, lo
que indicaba que el dominio de tipo lectina de TM no es necesario
para el desarrollo normal del feto. Hemos demostrado que los ratones
TM^{LeD/LeD} respondían de forma idéntica que sus compañeros de
camada de tipo silvestre tras exposiciones procoagulantes lo que
significaba que la activación de la proteína C no estaba alterada
por la mutación específica en TM. Sin embargo, tras la estimulación
con LPS, los ratones TM^{LeD/LeD} respondían con niveles
plasmáticos de TNF\alpha e IL-1\beta
significativamente elevados (p < 0,001) en comparación con sus
homólogos de tipo silvestre. El nivel basal de acumulación de
neutrófilos en pulmón, hígado y riñones estaba elevado en los
ratones TM^{LeD/LeD}, mientras que los recuentos de leucocitos
periféricos eran normales. Usando una cámara de flujo y modelos de
adhesión estática, la adhesión de leucocitos derivados de la médula
ósea de ratones TM^{LeD/LeD} o TM^{ts/ts} a las células
endoteliales vasculares de ratones TM^{LeD/LeD}, \pm expuestos a
TNF\alpha, estaba potenciadas de 3-5 veces (p <
0,05) en comparación con la adhesión a células endoteliales de
ratones de tipo silvestre. La adhesión podía inhibirse añadiendo el
dominio lectina recombinante. Se detectó la potenciación del ARNm y
proteína de ICAM-1 tanto en las células endoteliales
vasculares como en los pulmones de ratones TM^{LeD/LeD}. De ese
modo, en la presente invención demostramos que el dominio de tipo
lectina de TM tiene propiedades antiinflamatorias directas que son
relevantes para la progresión de una diversidad de procedimientos de
enfermedades inflamatorias.
En una primera realización la invención
proporciona un polipéptido compuesto esencialmente de una secuencia
de aminoácidos correspondiente con la SEC ID Nº 1 o fragmentos de la
misma que comprenden al menos 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID
Nº 1 y capaz de suprimir la adhesión de leucocitos a las células
endoteliales en un ensayo de adhesión estática, para la preparación
de un medicamento para prevenir y/o tratar la inflamación. La SEC ID
Nº 1 representa una secuencia de aminoácidos correspondiente con 224
aminoácidos de la trombomodulina humana. En una realización
adicional, la invención proporcionar fragmentos de la SEC ID Nº 1,
tales como las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 para su uso como
medicamento. La SEC ID Nº 2 está compuesto de los aminoácidos
1-157 de la SEC ID Nº 1, la SEC ID Nº 3 está
compuesta de los aminoácido 3-33 de la SEC ID Nº 1,
La SEC ID Nº 4 está compuesta de los aminoácidos
33-159 de la SEC ID Nº 1, la SEC ID Nº 5 está
compuesta de los aminoácidos 18-40 de la SEC ID Nº
1, la SEC ID Nº 6 está compuesta de los aminoácidos
47-56 de la SEC ID Nº 1, la SEC ID Nº 7 está
compuesta de los aminoácidos 84-97 de la SEC ID Nº 1
y la SEC ID Nº 8 está compuesta de los aminoácidos
81-118 de la SEC ID Nº 1. Para aclarar las
secuencias para las que se busca protección en esta solicitud de
patente, nos remitimos a la figura 1. La figura 1 muestra un
alineamiento de los primeros 269 aminoácidos del extremo
aminoterminal de la trombomodulina humana (hTM) con los primeros 268
aminoácidos del extremo amino terminal de la trombomodulina murina
(mTM).
De forma alternativa, en base a las predicciones
por ordenador de la estructura tridimensional del dominio de tipo
lectina N-terminal de TM (J. Mol. Model.
(1998) 4, 310), también pueden generarse fragmentos de la SEC ID Nº
1 que comprendan un dominio de tipo lectina mínimo de
trombomodulina. Las secuencias polipeptídicas pueden hacerse por
síntesis química de polipéptidos según se conoce en la técnica o, de
forma alternativa, por medio de recombinación.
El TM_{lec223} murino es idéntico al 67%, a
nivel de aminoácidos, a la región correspondiente de la TM humana.
Se considera similar el 9% adicional de los restos. El TM_{lec155}
es idéntico al 69%, a nivel de aminoácidos a la región
correspondiente de la TM humana. Se considera similar el 8%
adicional de los restos. El supuesto péptido señal (sitio de
escisión mostrado en la figura 1 con una flecha punteada) de TM
humana probablemente abarca los primeros 18 restos de aminoácidos de
la "pre-proteína" deducida a partir de la
secuencia de ADNc. Esto también se basa en la secuenciación del
extremo N-terminal de las formas solubles de TM
detectadas en plasma y en orina humanos. En consecuencia, la
numeración se ha basado generalmente en esta información,
correspondiendo el número 1 con el aminoácido 19 de la
"pre-proteína" (incluyendo el péptido señal),
es decir, empezando a partir de APAEP... Se carece de información
similar para la TM murina. En base a los análisis por ordenador
(PSORT http://psort.nibb.ac.jp/form.html), el supuesto
péptido señal de TM murina abarca los primeros 17 aminoácidos de la
"pre-proteína" (sitio de escisión mostrado en
la figura 1 con una flecha rellena). De este modo, los
investigadores generalmente han fijado que el primer aminoácido de
la proteína empieza en el aminoácido 18, es decir, a partir de
SALAKL...
La expresión "fragmentos" como se usa en
este documento significa polipéptidos de al menos 10, al menos 15,
al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al
menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60 o al menos 65
aminoácidos contiguos que derivan de la SEC ID Nº 1.
El término "homólogos" significa homología a
nivel de aminoácidos. Los homólogos han de ser al menos el 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90% o 95% homólogos con las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7 u 8. La homología se determina usando los parámetros por
defecto de un paquete de software de análisis de secuencia de ADN
desarrollado por Genetic Computer Group (GCG) de la
Universidad de Wisconsin.
Está claro que es probable que la estructura
terciaria del dominio de tipo lectina completo sea críticamente
importante para su función antiinflamatoria. Por lo tanto, puede
purificarse el dominio de tipo lectina recombinante para realizar
una cristalografía de rayos X y esta información puede ser evaluada
por un experto en la materia para introducir mutaciones o deleciones
que potencien la función inflamatoria del dominio de tipo lectina o
para obtener fragmentos del dominio de tipo lectina con función
inflamatoria.
En la presente invención, hemos determinado que
los ratones transgénicos carentes del dominio
N-terminal de TM, todavía con niveles antigénicos
normales de TM (ratones TM^{Led/Led}), tienen una respuesta
potenciada a lipopolisacáridos (LPS), reduciendo los tiempos
de supervivencia y elevando de forma significativa los niveles de
citoquina en el suero. Se ha encontrado que los ratones
TM^{Led/Led} aparentemente no tienen trastorno hipercoagulable, lo
que indica que la vía anticoagulante de la proteína C está intacta.
Sin embargo, para distinguir definitivamente los efectos
antiinflamatorios de la APC de aquellos relativos a la pérdida del
dominio N-terminal de TM, fue necesario excluir
completamente la posibilidad de que la activación de la proteína C
estuviera alterada en los ratones TM^{Led/Led}. Con este fin,
confirmamos que en los ratones de tipo silvestre y en
TM^{Led/Led}, la antigenicidad y la expresión funcional en la
superficie celular de TM, esta última con respecto a la activación
de la proteína C dependiente de trombina, eran similares por: (1) la
cuantificación de los niveles tisulares de TM, (2) el ensayo de los
niveles funcionales en la superficie celular de TM en células
linfáticas y endoteliales vasculares derivadas de los ratones y (3)
determinando cuantitativamente la capacidad de TM endotelial
vascular intacta para activar la proteína C humana exógena antes y
después de la exposición a LPS. Estas medidas establecieron
que las propiedades anticoagulantes dependientes de TM y,
específicamente, la función de los dominios 3-6 de
tipo EGF en los ratones TM^{Led/Led} estaban intactos y que los
niveles de APC no se alteraban significativamente por la deleción
del dominio N-terminal. Aunque los ratones
TM^{Led/Led} carecen tanto del dominio de tipo lectina como de la
región hidrófoba adyacente, está claro que la función
antiinflamatoria reside en el dominio de tipo lectina de TM, ya que
demostramos que en los ensayos de adhesión estática, puede inhibirse
la adhesión de PMN por la adición de TM_{lec155} recombinante que
no contiene la región hidrófoba.
Por tanto, en otra realización está claro que las
SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, u homólogos o fragmentos de los
mismos pueden usarse de forma eficaz para la fabricación de un
medicamento para prevenir y/o tratar la inflamación. Ha de
entenderse que los homólogos o fragmentos que se han definido antes
estructuralmente, cuando se usan para la fabricación de un
medicamento, han de ser capaces de prevenir y/o de tratar la
inflamación. La actividad de los fragmentos puede medirse de forma
eficaz por ejemplo, en experimentos de cámara de flujo o en ensayos
de adhesión estática como se ha descrito en este documento. También
ha de entenderse que pueden usarse peptidomiméticos especialmente de
los péptidos más pequeños (SEC ID Nº 3, 5, 6 y 7) para la
fabricación de un medicamento para prevenir y/o para tratar la
inflamación. El término "peptidomimético" significa una
molécula capaz de mimetizar la actividad biológica de un péptido,
pero ya no tiene naturaleza química peptídica. Por definición
estricta, un peptidomimético es una molécula que ya no contiene
ningún enlace peptídico (esto es, enlaces amida entre aminoácidos).
Sin embargo, el término péptidomimético se usa algunas veces para
describir moléculas que ya no tienen naturaleza completamente
peptídica, tales como pseudopéptidos, semipéptidos y peptoides. Los
peptidomiméticos, bien completa o parcialmente no peptídicos, de
acuerdo con esta invención proporcionan un reordenamiento espacial
de los restos químicos reactivos que recuerda mucho al
reordenamiento tridimensional de grupos activos en el péptido en el
cual se base el peptidomimético. Como resultado de esta geometría
similar a sitio activo, el peptidomimético tiene efectos en
sistemas biológicos que son similares a la actividad biológica del
péptido. Preferiblemente, el peptidomimético de esta invención es
sustancialmente similar tanto en la forma tridimensional como en la
actividad biológica a los péptidos explicados anteriormente. La
similitud sustancial significa que se mantiene la relación
geométrica de los grupos en el péptido que reaccionan con, por
ejemplo, una proteína transmembranal de tipo I. Hay ventajas claras
en el uso de un mimético de un péptido determinado antes que el
péptido en sí, ya que los péptidos normalmente muestran dos
propiedades no deseadas: (1) poca biodisponibilidad y (2) acción de
corta duración. Los peptidomiméticos ofrecen una vía obvia a estos
dos obstáculos principales, ya que las moléculas en cuestión son
suficientemente pequeñas para ser tanto activas por vía oral como
para tener una acción de larga duración. También hay un ahorro
considerable del costo y mejora de la adherencia al tratamiento
asociada con peptidomiméticos, ya que pueden administrarse por vía
oral en comparación con la administración parenteral de péptidos.
Además, los peptidomiméticos son mucho más baratos de producir que
los péptidos. Finalmente, hay problemas asociados con la
estabilidad, almacenamiento e inmunoreactividad de los péptidos que
no se experimentan con peptidomiméticos. Los péptidos descritos en
la presente invención son útiles en el desarrollo de estos pequeños
compuestos químicos con actividades biológicas similares y, por
tanto, con utilidades terapéuticas similares. Las técnicas de
desarrollo de peptidomiméticos son convencionales. De este modo, los
enlaces peptídicos pueden sustituirse por enlaces no peptídicos que
permiten al peptidomimético adoptar una estructura y, por tanto, una
actividad biológica similares a las del péptido original. También
pueden hacerse modificaciones adicionales sustituyendo grupos
químicos de los aminoácidos por otros grupos químicos de estructura
similar. Puede ayudar al desarrollo de peptidomiméticos la
determinación de la estructura terciaria del péptido original, bien
libre o unido a un sustrato, por espectroscopia de RMN,
cristalografía y/o modelado de moléculas asistido por ordenador.
Estas técnicas ayudan al desarrollo de nuevas composiciones de
potencia más alta y/o mayor biodisponibilidad y/o mayor estabilidad
que el péptido original (Dean (1994), BioEssays,
16:683-687; Cohen y Shatzmiller (1993), J. Mol.
Graph., 11: 166-173; Wiley y Rich (1993) Med. Res.
Rev., 13:327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol.
Sci, 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers,
33:1073-1082; Bugg y col. (1993), Sci. Am.,
269:92-98, todas incorporadas en este documento como
referencia). Una vez que se identifica un compuesto peptidomimético
potencial, puede sintetizarse y ensayarse usando el procedimiento
descrito en este documento para evaluar su actividad. De este modo,
por medio del uso de los procedimientos descritos anteriormente, la
presente invención proporciona compuestos que muestran actividad
terapéutica potenciada en comparación con los péptidos descritos
anteriormente. Esta invención abarca el uso de los polipéptidos o
de los fragmentos de los mismos, como se describe en este documento,
para diseñar compuestos peptidomiméticos como se describe en los
procedimientos anteriores, que tienen la actividad biológica de los
péptidos mencionados anteriormente y similar estructura
tridimensional. Será fácilmente aparente para un experto en la
materia que puede generarse un peptidomimético a partir de
cualquiera de los péptidos descritos en este documento o a partir de
un péptido portador de más de una de las modificaciones descritas en
la sección previa. Además, será aparente que los peptidomiméticos de
esta invención adicionalmente pueden usarse para el desarrollo de
compuestos no peptídicos incluso más potentes, además de su utilidad
como compuestos terapéuticos.
"Inflamación", según se usa en este
documento significa la reacción local al daño de tejidos vivos,
especialmente la reacción local de los pequeños vasos sanguíneas,
sus contenidos, y sus estructuras asociadas. El paso de los
componentes sanguíneos a través de las paredes de los vasos
(extravasación) a los tejidos es la marca distintiva de la
inflamación. Generalmente, la inflamación se inicia con una
potenciación de la adhesión de leucocitos a la pared endotelial que
da lugar a la extravasación del leucocito a tejidos o a órganos. De
hecho, cualquier proceso nocivo que daña tejido vivo infectado con
bacterias, calor excesivo, frío, daño mecánico, tal como
aplastamiento, ácidos, álcalis, irradiación o infección con virus
pueden causar inflamación independientemente del órgano o tejido
implicado. Debe quedar claro que las enfermedades de animales y del
hombre clasificadas como "enfermedades inflamatorias"
comprenden la artritis, inflamación de la piel, peritonitis, daño
asociado con isquemia/reperfusión (por ejemplo, corazón, hígado,
riñón cerebro), enfermedades pulmonares inflamatorias (incluyendo,
por ejemplo, asma, bronquitis, síndrome de distrés respiratorio
adulto (SDRA)), vasculitis, aterosclerosis, nefritis, cicatrización
de heridas de la piel, sepsis e infecciones locales y
sistémicas.
Con la palabra "leucocitos" se quiere decir
células blancas de la sangre que comprenden basófilos, neutrófilos,
eosinófilos, granulocitos, monocitos, macrófagos y similares. Puesto
que los pulmones de ratones TM^{Led/Led}, tras la inhalación de
LPS, acumulan significativamente más leucocitos que los ratones de
tipo silvestre, consideramos la posibilidad de que la carencia del
dominio N-terminal pudiera afectar directamente al
tráfico de leucocitos. Se determina que más del 95% de estas células
son neutrófilos, siendo el resto monocitos/macrófagos. TM no se
restringe a las células endoteliales vasculares sino que también se
expresa en PMN y en monocitos^{66,67}. De hecho, ambas fuentes de
estas células son únicas porque la TM derivada de PMN es en gran
medida intracelular y no se ha recuperado en forma activa,
probablemente debido a la oxidación de una metionina crítica,
mientras que los monocitos son resistentes al TNF\alpha con
respecto a la regulación negativa de la expresión de TM^{68}.
Usando un modelo de cámara de flujo in vitro, los PMN
derivados de médula ósea de ratones TM^{Led/Led} o de sus
homólogos de tipo silvestre, mostraban patrones similares de
rodamiento, velocidad y adhesión a una línea celular endotelial
vascular clonada, lo que indicaba que cualquier alteración en el
tráfico de PMN probablemente no sería debido principalmente a la
mutación en la TM expresada por el PMN. Por el contrario, sin
embargo, los PMN y linfocitos de cualquier fuente de ratones
mostraban una adhesión aumentada a células endoteliales vasculares
derivadas de los ratones carentes del dominio
N-terminal. Podía suprimirse más del 90% de la
adhesión de PMN por la adición de una combinación de anticuerpos
neutralizantes anti-P-selectina y
anti-ICAM-1, lo que indicaba que los
sucesos tempranos de la adhesión estaban intactos. Sin embargo,
tanto la expresión basal de ICAM-1 como la inducida
por TNF-\alpha eran significativamente más altas
en las células endoteliales de TM^{Led/Led}, como lo era la
acumulación de ARNm de ICAM-1 en estos ratones.
VACM-1 estaba regulado positivamente de forma
similar en los ratones TM^{Led/Led}. Aunque estos hallazgos puede
ser la explicación más significativa para el aumento de la adhesión
y extravasación de PMN en los ratones TM^{Led/Led}, no pudo
lograrse la supresión total de la adhesión de PMN cuando se usaron
combinaciones de anticuerpos
anti-ICAM-1, lo que sugiere que
probablemente otras moléculas de adhesión contribuyen al
proceso.
Por tanto, aún en otra realización pueden usarse
los polipéptidos de la presente invención para prevenir y/o tratar
la adhesión de leucocitos seguida de la extravasación de leucocito.
Aún en otra realización pueden usarse los polipéptidos de la
presente invención y las moléculas de la presente invención para
prevenir específicamente la extravasación de neutrófilos.
En estudios de isquemia/reperfusión miocárdica
los tamaños de los infartos, relativos al área de riesgo y al tamaño
del ventrículo izquierdo, eran significativamente mayores (p <
0,005) en los ratones TM^{LeD/LeD}, un hallazgo que se
correlacionaba con la extravasación de células polimorfonucleares
(PMN) al tejido miocárdico dañado. De este modo, a pesar de la
importancia de la reperfusión seguido de isquemia miocárdica, el
flujo de neutrófilos activados da lugar al daño del tejido. Se
conoce en la técnica que el sistema de coagulación tiene un impacto
directo en la infiltración de leucocitos y en el daño miocárdico que
sigue a la isquemia/reperfusión, ya que la inhibición del factor
tisular o trombina reducirá la región de necrosis e
inflamación^{75}. Anteriormente no se ha evaluado de forma directa
el papel de TM en I/RM, pero se ha implicado a TM en la alteración
del riesgo de enfermedad cardiaca coronaria en humanos. El hallazgo
de la presente invención de que un aumento significativo del tamaño
del infarto en los ratones TM^{Led/Led} en respuesta a I/RM, apoya
un papel cardioprotector directo del dominio de tipo lectina
N-terminal, más probablemente en base a la
interferencia con la extravasación de PMN al tejido.
Se piensa que el daño por isquemia/reperfusión
implica un proceso multicomponente, con un estallido de la
producción de radicales libres, que tiene lugar tras la reperfusión
y un segundo suceso de daño inflamatorio, que tiene lugar en una
segunda etapa. El daño por isquemia/reperfusión puede ocurrir en una
diversidad de tejidos, que comprenden el corazón, pulmón, riñón,
tracto gastrointestinal, cerebro y enfermedad inflamatoria de las
articulaciones tales como la artritis reumatoide (Korthius y
Granger, 1986, en "Physiology of Oxygen Radicals", Taylor,
Matalos y Ward Editores; Allen y col., 1989, Lancet ii,
282-283). El tratamiento del daño inducido por
isquemia/reperfusión requiere el desarrollo de compuestos que
suprimen los efectos nocivos de los radicales de oxígeno tanto
durante la fase de reperfusión como durante la fase inflamatoria.
Debido a la naturaleza multifactorial del daño inducido por
isquemia, ha sido un problema encontrar compuestos que puedan usarse
para el tratamiento. En una realización en particular, pueden usarse
los polipéptidos de la presente invención para tratar y/o prevenir
la inflamación que tiene lugar como resultado del daño de
isquemia-reperfusión.
La expresión "medicamento para tratar" se
refiere a una composición que comprende polipéptidos como los
descritos anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable (ambos términos pueden usarse indistintamente) para tratar
enfermedades como las descritas en este documento. La administración
de un polipéptido como los descritos anteriormente o una sal
farmacéuticamente aceptable de los mismos puede ser por vía oral,
inhalado o administración parenteral. El compuesto activo puede
administrarse sólo o preferiblemente formulado como una composición
farmacéutica. Una cantidad eficaz para tratar los trastornos
inflamatorios descritos en este documento depende de los factores
usuales tales como la naturaleza y gravedad de los trastornos
tratados y el peso del mamífero. Sin embargo, una unidad de dosis
normalmente contendrá de 0,01 a 50 mg, por ejemplo, de 0,01 a 10 mg,
o de 0,05 a 2 mg del fragmento de tipo lectina de la trombomodulina
(o un fragmento u homólogo del mismo) o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo. Las unidades de dosis normalmente se
administrarán una o más veces al día, por ejemplo 2, 3 ó 4 veces al
día, más normalmente de 1 a 3 veces al día, de modo que la dosis
diaria total normalmente esté en el intervalo de 0,0001 a 1 mg/kg;
de este modo, una dosis diaria adecuada para un adulto de 70 kg es
de 0,01 a 50 mg, por ejemplo, de 0,01 a 10 mg, o más normalmente de
0,05 a 10 mg. Se prefiere especialmente que el compuesto o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo se administre en forma de una
composición de unidad de dosis, tal como una unidad de dosis de
composición oral, parenteral o inhalada. Estas composiciones se
preparan por mezcla y se adaptan de forma adecuada para la
administración oral, inhalada o parenteral y como tal puede estar en
forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales,
polvos, gránulos, pastillas, polvos para reconstitución, soluciones
inyectables e infundibles, suspensiones, supositorios o aerosoles.
Los comprimidos y las cápsulas para administración oral normalmente
se presentan en una unidad de dosis y contiene excipientes
convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, diluyentes,
agentes de compresión, lubricantes, disgregantes, colorantes,
aromatizantes y agentes humectantes. Los comprimidos pueden estar
recubiertos de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la
técnica. Las cargas adecuadas para su uso incluyen celulosa,
manitol, lactosa y otros agentes similares. Los disgregantes
adecuados incluyen almidón, polivinilpirrolidona y derivados de
almidón tales como almidón glicolato sódico. Los lubricantes
adecuados incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio. Los agentes
humectantes farmacéuticamente aceptables incluyen lauril sulfato
sódico. Estas composiciones orales sólidas pueden prepararse por
procedimientos convencionales de mezclado, carga, compresión o
similares. Pueden usarse operaciones de mezcla repetidas para
distribuir el agente activo a través de las composiciones empleando
grandes cantidades de cargas. Estas operaciones son, por supuesto,
convencionales en la técnica. Las preparaciones líquidas orales
pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u
oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o puede
presentarse como un producto en seco para reconstitución con agua u
otro vehículo adecuado antes de su uso. Estas preparaciones líquidas
pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de
suspensión, por ejemplo sorbitol, almíbar, metilcelulosa, gelatina,
hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de
aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes,
por ejemplo, lecitina, monooleato de sorbitan, o goma arábiga;
vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por
ejemplo, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres
oleosos tales como ésteres de glicerina, propilénglicol o alcohol
etílico; conservantes, por ejemplo metil o propil
p-hidroxibenzoato o ácido sórbico, y si se desea
agentes convencionales aromatizantes o colorantes. Las formulaciones
orales también incluyen formulaciones de liberación mantenida
convencional, tales como comprimidos o gránulos que tienen un
recubrimiento entérico. Preferiblemente, las composiciones para
inhalación se presentan para administración por el tracto
respiratorio como un inhalador o un aerosol, o solución para un
nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en
combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En este caso,
las partículas del compuesto activo adecuado tienen diámetros de
menos de 50 micrómetros, preferiblemente menos de 10 micrómetros,
por ejemplo entre 1 y 5 micrómetros, tal como entre 2 y 5
micrómetros. Una dosis inhalada favorecida estará en el intervalo de
0,05 a 2 mg, por ejemplo de 0,05 a 0,5 mg, 0,1 a 1 mg o de 0,5 a 2
mg. Para administración parenteral, las formas de unidad de dosis
fluida se preparan con un compuesto de la presente invención y un
vehículo estéril. El compuesto activo, dependiendo del vehículo y de
la concentración, puede suspenderse o disolverse. Las soluciones
parenterales normalmente se preparan disolviendo el compuesto en un
vehículo, esterilizándolo por filtración antes de cargarlo en un
vial o ampolla adecuado y sellándolo. De forma ventajosa, en el
vehículo también se disuelven adyuvantes tales como agentes
anestésicos locales, conservantes y tamponadores. Para potenciar la
estabilidad, la composición puede congelarse después de cargarse en
el vial y eliminar el agua al vacío. Las suspensiones parenterales
se preparan fundamentalmente de la misma manera excepto porque el
compuesto se suspende en el vehículo en lugar de disolverse y se
esteriliza por exposición a óxido de etileno antes de la suspensión
en el vehículo estéril. De forma ventajosa, se incluye en la
composición un agente tensioactivo o humectante para facilitar la
distribución uniforme del compuesto activo. Cuando sea apropiado,
pueden incluirse pequeñas cantidades de broncodilatadores, por
ejemplo, aminas simpatomiméticas tales como isoprenalina,
isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de
xantina tales como teofilina y aminofilina y corticosteroides tales
como prednisolona y estimulantes adrenales tales como ACTH. Como en
la práctica común, las composiciones normalmente se acompañarán de
instrucciones escritas o impresas para su uso en el tratamiento
medico de interés.
La presente invención además proporciona una
composición farmacéutica para su uso en el tratamiento y/o
profilaxis de los trastornos descritos en este documento que
comprenden un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y, si se
requiere, un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otro aspecto de la administración para el
tratamiento es el uso de terapia génica para suministrar los
polipéptidos funcionales mencionados anteriormente. Terapia génica
significa el tratamiento por el suministro de ácidos nucleicos
terapéuticos a las células del paciente. Esta se revisa ampliamente
en Lever y Goodfellow 1995, Br. Med Bull. 51, 1-242;
Culver 1995; Ledley, F.D. 1995, Hum. Gene Ther. 6, 1129. Para
conseguir la terapia génica debe haber un procedimiento para
suministrar genes a las células del paciente y procedimientos
adicionales para asegurar la producción eficaz de cualquier gen
terapéutico.
Hay dos aproximaciones generales para conseguir
el suministro de genes; hay suministro de genes no virales y
suministro mediado por virus. Como un ejemplo no limitante puede
generarse un vector adenoviral recombinante que comprenda un
fragmento funcional u homólogo de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
u 8.
En otra realización de la invención puede usarse
un polipéptido para prevenir y/o tratar la inflamación como se
describe anteriormente, en combinación con moléculas conocidas en la
técnica para prevenir y/o tratar la inflamación.
De acuerdo aún con características adicionales en
las realizaciones preferidas descritas se proporciona un vector
recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que
codifica un polipéptido funcional como se describe anteriormente. Un
"polipéptido funcional" es un polipéptido u homólogo derivado
de la SEC ID Nº 1 capaz de suprimir la inflamación. El vector puede
ser de cualquier tipo adecuado incluyendo, pero no de forma
limitante, un fago, virus, plásmido, fagémido, cósmido, bácmido o
incluso un cromosoma adicional. La secuencia polinucleotídica que
codifica un polipéptido capaz de suprimir la inflamación puede
incluir cualquiera de los fragmentos polipeptídicos descritos
anteriormente. La expresión "vector de ADN recombinante" según
se usa en este documento se refiere a secuencias de ADN que
comprenden una secuencia codificadora deseada y secuencias de ADN
apropiadas unidas de forma operativa, necesarias para la expresión
de la secuencia codificadora en un organismo hospedador adecuado
(por ejemplo, un mamífero). Las secuencias de ADN necesarias para la
expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operador, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente
otras secuencias. Se sabe que las células eucarióticas utilizan
promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
De acuerdo aún con características adicionales en
las realizaciones preferidas descritas se proporciona una célula
hospedadora que comprende un fragmento polinucleotídico exógeno
incluyendo una secuencia polinucleotídica que codifica un
polipéptido como se describe anteriormente que tiene la posibilidad
de suprimir la inflamación.
El fragmento polinucleotídico exógeno puede ser
cualquiera de los fragmentos descritos anteriormente.
De acuerdo aún con características adicionales,
en las realizaciones preferidas descritas se proporciona el uso de
una proteína recombinante que incluye un polipéptido como se
describe capaz de suprimir la inflamación. La proteína recombinante
puede purificarse casi a homogeneidad por cualquier procedimiento de
purificación de proteínas convencional y/o mezclarse con aditivos.
La proteína recombinante puede fabricarse usando sistemas de
expresión recombinante que comprenden células bacterianas, células
de levaduras, células de animales, células de insectos, células
vegetales o animales o plantas transgénicas.
El papel del dominio de tipo lectina de TM murino
se evaluó por deleción del dominio completo usando PCR recombinante,
mientras que se mantenía el supuesto péptido señal. Se transfectaron
células COS con ADNc de TM murina que codificaba tanto el TM de tipo
silvestre como mutado. Los análisis de inmunotransferencia de ARN
derivado de las células que expresaban TM y células control
transfectadas sólo con el vector de expresión (pcDNA3.1),
confirmaron la especificidad y el procesamiento esperado del ARNm de
TM. La inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos
anti-TM específicos de conejo reveló que las TM de
tipo silvestre y mutada podían ser transportadas a través de la
célula para su expresión estable en la superficie celular. La
activación de la proteína C dependiente de trombina aumentaba de
forma específica y similar en la superficie de las células COS que
expresan la TM de tipo silvestre o mutada. Usando un número igual de
células confluentes, se usó la tasa de cambio en la absorbancia del
sustrato cromogénico S2238 a 405 nm para determinar la función
cofactora de TM en la activación de la proteína C dependiente de
trombina. En las células COS transfectadas sólo con el vector, la
tasa de cambio en la absorbancia fue de 0,01 unidades/min, mientras
que fue de 0,21 \pm 0,04 (n = 3) unidades/min y 0,23 \pm 0,04 (n
= 3) unidades/min para las células transfectadas con TM de tipo
silvestre o mutada, respectivamente, indicando que ambas formas de
TM son funcionales de forma similar con respecto a la activación de
la proteína C.
Se construyó un vector dirigido en el que la
región codificadora de tipo silvestre del gen TM murino se sustituyó
por una región de TM que codifica TM que carece de los restos de
aminoácidos del extremo N-terminal entre el supuesto
péptido señal y la primera repetición similar a EGF, reteniendo aún
el gen marcador de selección neomicina en la región no
traducida 3' (UTR) del gen. Tras la electroporación de células ES
R1, se eligieron más de 350 clones, en 4 de los cuales se determinó
que el vector de sustitución se había recombinado de forma homóloga
en una única copia, según se evaluó por transferencia de tipo
Southern. Se usó PCR y secuenciación de ADN para confirmar que la
región codificadora completa del alelo mutado con la deleción
apropiada estaba intacta. Se expandieron dos de los clones de
células ES positivos y se agregaron para la generación de ratones
quiméricos, dos de los cuales se transmitieron a la línea
germinal.
El entrecruzamiento de la F1, ratones
TM^{LeDneo/ts} (con un alelo de tipo silvestre y 1 alelo mutante,
el segundo con el gen neomicina en la 3'-UTR)
dio lugar a una descendencia de más de 250 ratones. Se realizó el
tipaje genético del ADN de la cola mediante análisis por PCR y
ocasionalmente se confirmó por transferencia de tipo Southern. Los
genotipos de la progenie F2 se distribuían al nacimiento según un
patrón de herencia mendeliana de 26,1% (TM^{ts/ts}), 48,7%
(TM^{LeDneo/ts}) y 25,2% (TM^{LeDneo/LeDneo}) lo que indicaba
que no se daba muerte intrauterina. Hubo una distribución igual de
nacimientos de machos y de hembras, y no hubo diferencias aparentes
en peso, tamaño, desarrollo o fertilidad hasta los 18 meses de edad.
Consideramos la posibilidad de que el gen neomicina en la
región 3'UTR pudiera afectar a la regulación de la TM mutada y, por
esta razón, se escindió éste por entrecruzamiento de ratones
TM^{LeDneo/ts} con ratones que expresan de forma ubicua
Cre-recombinasa bajo el control del promotor
PGK^{26} (estrategia en la figura 2). La escisión del gen
neomicina flanqueado por loxP se confirmó por PCR del
ADN genómico y por RT-PCR del ARN derivado de
diversos tejidos derivados de la descendencia. Los ratones
TM^{LeD/ts} resultantes (con 1 alelo de tipo silvestre y 1 alelo
mutante, el segundo carente del gen neomicina) se cruzaron entre sí
y los genotipos de la progenie F2 (más de 300) también se
distribuían según un patrón de herencia mendeliana, lo que indicaba
de nuevo que la deleción del domino de tipo lectina
N-terminal no causaba letalidad embrionaria.
Probablemente los resultados comunicados no reflejan un artefacto
específico de cepa, ya que en estudios limitados, el
retrocruzamiento con las cepas originales contextos genéticos 129
sv/se y C57/B16 da lugar a fenotipos similares.
La deleción in vivo del dominio de tipo
lectina de TM no afectó a la distribución celular de la molécula
durante el desarrollo. La tinción por inmunoperoxidasa de secciones
sagitales de embriones de 11,5 a 14,5 dpc mostraba TM en todos los
tejidos. La cantidad total de TM en el tejido pulmonar se cuantificó
de forma indirecta usando un radioinmunoensayo. Cuando se compararon
los ratones TM^{LeD/LeD} con sus homólogos de tipo silvestre, no
hubo diferencias en los niveles del antígeno TM (p < 0,01),
mientras que los niveles de antígeno TM en los ratones
TM^{LeDneo/LeDneo} se suprimía en aproximadamente el 20% de los de
los ratones de tipo silvestre y TM^{LeD/LeD}.
La hipoxia durante 16-18 horas da
lugar a la deposición de trombos de fibrina y de plaquetas en la
vasculatura pulmonar, con aumento de la trombogenicidad en ratones
heterocigotos para el gen TM^{17} y en ratones que expresan
TM que tiene una actividad marcadamente reducida como cofactor de la
proteína C^{16}. Los niveles basales de fibrina en el tejido
pulmonar^{16} y de FPA en plasma^{24} eran similares en los
ratones TM^{ts/ts} y TM^{LeD/LeD} (Tabla 1). La exposición a
hipoxia no afectó de forma significativa a estos marcadores (p >
0,1). La eficacia del modelo se corroboró por la observación de que
7 de los 18 ratones TM^{LeDneo/LeDneo}(con niveles de
antígeno TM de -20%) murieron durante el estrés hipóxico con
evidencias postmortem de trombosis pulmonar masiva, mientras que no
murió ningún ratón TM^{LeD/LeD} y sólo murió 1 ratón TM^{ts/ts}.
En general, los resultados de estos experimentos sugieren que (1) la
supresión de la expresión de TM a niveles por debajo del 20%
predispone a los ratones a la deposición de fibrina en este estrés
en particular, (2) el dominio de tipo lectina
N-terminal de TM no tiene papel en la alteración del
sistema de coagulación en respuesta a la hipoxia y (3) la integridad
de los dominios similares a EGF de TM conocidos porque están
implicados en la coagulación, no se alteran significativamente por
la deleción del dominio N-terminal en los ratones
TM^{LeD/LeD}.
Para evaluar la respuesta a endotoxina, se
administraron dosis letales de LPS (40 \mug/g de peso
corporal) a ratones TM^{LeD/LeD} y TM^{ts/ts} (n = 22 para cada
grupo). Más del 50% de los ratones TM^{LeD/LeD} murieron antes de
las 26 primeras horas tras la exposición al LPS, mientras que en el
mismo periodo, murieron menos del 10% de los ratones de tipo
silvestre. También se administraron 20 \mug/g de LPS i.p. a
ratones de cada genotipo y 6 horas más tarde se sacrificaron y se
examinó la deposición de fibrina en pulmones, cerebro y riñón
histológicamente seccionados usando procedimientos como los
informados previamente^{24}. Cuando se compararon con sus
homólogos de tipo silvestre, no pudimos detectar alteración en la
deposición de fibrina en los tejidos de ratones TM^{LeD/LeD} en
respuesta al LPS (Tabla 2). Se midieron los niveles de
TNF\alpha, IL-1\beta e IL-10 en
plasma obtenidos 6 horas después de la inyección i.p. de 20 \mug/g
de LPS (Tabla 3). Los niveles basales de estas citoquinas
eran indetectables en todos los grupos de ratones. En particular,
sin embargo, los niveles plasmáticos de TNF-\alpha
e IL-1\beta estaban significativamente elevados en
los ratones carentes del dominio lectina (p < 0,05, n = 18),
mientras que los niveles de IL-10 e
IL-6 no estaban afectados por la mutación en TM. El
nivel absoluto del antígeno TM no parece afectar a esta respuesta,
es decir, no había diferencia significativa en la respuesta de
citoquina entre los ratones TM^{LeD/LeD} y TM^{LeDneo/LeDneo} (p
> 0,5). Aunque el recuento de células blancas de sangre
periférica y el recuento absoluto de neutrófilos circulantes
aparecen algo superiores en el ratón mutante tras la exposición a
LPS, estas diferencias no eran estadísticamente
significativas (p > 0,1). En los ratones carentes del dominio de
tipo lectina (TM^{LeD/LeD}), las tinciones con hematoxilina y
eosina y con mieloperoxidasa de los cortes de tejido pulmonar
obtenidos antes del estrés subletal con LPS, sugieren que
había un moderado aumento de la acumulación de neutrófilos y/o
macrófagos en el intersticio pulmonar. La tinción de los cortes de
pulmón con el anticuerpo Mac3 específico de monocitos/macrófagos
confirmaba que más del 95% de las células teñidas con la
mieloperoxidasa eran neutrófilos. Estas células se distribuían
ampliamente a través del intersticio, en localizaciones
peribronquiales y, de forma ocasional, en los espacios alveolares.
Los cortes de pulmón de ratones tanto con los niveles de antígeno TM
disminuidos como con la mutación, estaban infiltradas de forma
similar con neutrófilos, cuando se comparaban con ratones de tipo
silvestre (pero no más que los ratones TM^{LeD/LeD}). La
arquitectura del pulmón, tanto en los ratones mutantes como en los
de tipo silvestre, no estaba alterada significativamente. No había
evidencias de inflamación crónica o de hiperplasia epitelial
bronquial ni anomalías en los vasos sanguíneos, hallazgos
consecuentes con el grado moderado de infiltración de leucocitos.
Debido a las dificultades inherentes a la cuantificación de células
distribuidas de forma irregular en estos cortes de pulmón, elegimos
evaluar más exactamente la respuesta de los ratones a un estímulo
inflamatorio local. Por tanto, los ratones TM^{ts/ts} y
TM^{LeD/LeD} se expusieron durante 10 minutos a LPS administrado
por medio de un nebulizador. Tres horas después del tratamiento, se
realizaron análisis del fluido de lavado broncoalveolar (BALF), y se
cuantificó la actividad mieloperoxidasa (Tabla 4). Aunque las
medidas basales entre los ratones de tipo silvestre y TM^{LeD/LeD}
no eran significativamente diferentes, la inhalación de LPS inducía
un incremento de \sim3,5 veces en la actividad mieloperoxidasa del
BALF en los ratones mutantes (p < 0,005), mientras que los
recuentos absolutos de neutrófilos en el BALF de ratones
TM^{LeD/LeD} aumentaba aproximadamente 2 veces. De forma similar a
nuestros hallazgos con la administración de LPS i.p., los niveles en
circulación de neutrófilos aumentaban en respuesta a LPS inhalado,
pero no en un grado significativo en estas condiciones
experimentales. La evaluación ultraestructural de los pulmones
mostraba evidencias de la acumulación de neutrófilos especialmente
en sitios peribronquiales, en concordancia con la exposición local a
LPS, además de cierta acumulación intersticial más allá de los
vasos. Por otra parte, no destacaban evidencias de daño pulmonar
aparente. En general, estos estudios apoyan una función in
vivo del dominio N-terminal de TM en la
regulación de la extravasión de neutrófilos.
Puesto que APC tiene propiedades
antiimflamatorias directas, las alteraciones en la expresión
funcional de TM podría dar lugar a la disminución de la actividad de
la proteína C y a la pérdida de su efecto antiinflamatorio, llevando
a un aumento de la activación y adhesión/migración del neutrófilo
así como una respuesta de citoquinas más marcada. A la vista de
nuestra observación de que la respuesta de citoquinas en ratones
carentes del dominio lectina N-terminal era más
pronunciada que en los ratones de tipo silvestre, buscamos confirmar
además que la expresión en la superficie celular de TM no se veía
afectada por la deleción del dominio de tipo lectina
N-terminal. Cuantificamos directamente la expresión
funcional de TM en las paredes de los vasos sanguíneos in
vivo, administrando proteína C humana por vía intravenosa, y
midiendo la generación de APC. Como se ve en la Tabla 5, 15 minutos
después de la infusión de 100 \mug de proteína C humana purificada
en ratones TM^{ts/ts}, TM^{LeD/LeD} y TM^{LeDneo/LeDneo}, las
concentraciones plasmáticas tanto de la forma inactivada como de la
forma activada de proteína C no estaban significativamente
alteradas. No sorprende la ausencia de efecto en la activación de la
proteína C en los ratones TM^{LeDneo/LeDneo} que tienen niveles de
antígeno TM de -20%, ya que probablemente se requieren niveles mucho
menores de TM para que se den alteraciones, especialmente sin
estrés. Para cada genotipo, también se expuso a los ratones a 10
\mug/g de LPS, 4 horas después de que se infundiera proteína C
humana como anteriormente. Una vez más, la generación de proteína C
activada era similar en todos los grupos, aunque los niveles de APC
eran significativamente mayores cuando se comparaban los ratones
expuestos a LPS con los ratones del mismo genotipo no expuestos (p
< 0,05). En general, sin embargo, estos estudios confirman que la
función de TM in vivo, con respecto a la activación de
proteína C, no disminuía significativamente en los ratones carentes
del dominio de tipo lectina N-terminal. Debido a la
importancia de excluir la posibilidad de que la expresión de TM en
la superficie celular disminuyera en los ratones TM^{LeD/LeD},
también obtuvimos células endoteliales de ratones TM^{LeD/LeD} y
de sus homólogos de tipo silvestre para la evaluación de su
capacidad para mantener la activación de la proteína C dependiente
de trombina. Esto se hizo de dos formas. En la primera, se
obtuvieron células endoteliales linfáticas cultivadas a partir de
linfangiomas intraperitoneales inducidos por adyuvante^{34}. Este
procedimiento facilita la derivación de poblaciones de células
endoteliales altamente purificadas, caracterizadas por la expresión
de Flk-1 y Flt4 como linfáticas en origen,
directamente a partir de ratones transgénicos. Evaluamos de cada
genotipo los niveles de ARNm y la expresión funcional de TM en la
superficie celular. La acumulación de ARNm de TM en los células
endoteliales linfáticas derivadas de ratones de tipo silvestre y de
TM^{LeD/LeD} era similar, mientras que la activación en la
superficie celular de proteína C dependiente de trombina tampoco
era significativamente diferente en varios clones diferentes.
También generamos varias líneas celulares endoteliales transformadas
a partir de tumores vasculares intraperitoneales induciendo su
crecimiento en los ratones tras la inyección de retrovirus
portadores del antígeno T mediano del poliomavirus murino
(PymT)^{32,33}, y las células de los ratones de tipo
silvestre y de TM^{LeD/LeD} que expresaban cantidades similares de
TM, como se evaluó por transferencias de tipo Northern y por
activación de la proteína C en la superficie celular. En general,
nuestros datos apoyan la conclusión de que los cambios en la
activación de la proteína C no son el mecanismo principal que altera
la respuesta inflamatoria en ratones TM^{LeD/LeD}.
Puesto que la expresión de TM no se restringe a
las células endoteliales vasculares, sino que también se sintetiza
en otras células incluyendo neotrófilos y monocitos, consideramos la
posibilidad de que el aumento del flujo de leucocitos en los
pulmones pudiera ser resultado de alteraciones de TM en los
neutrófilos y/o en el endotelio vascular. Las células fEND.5 son una
línea celular endotelial murina transformada con PymT establecida
que expresa TM funcional de longitud completa en la superficie
celular. En un modelo de cámara de flujo, se determinó que la
adhesión y rodamiento de neutrófilos (PMN) derivados de las médulas
óseas de ratones TM^{ts/ts} y TM^{LeD/LeD} a células fEND.5 sin
alterar y tratadas con TNF-\alpha, no se alteraba
por la presencia o ausencia del dominio de tipo lectina de
N-terminal de TM en neutrófilos (Tabla 6), evidencia
de que el defecto principal no implicaba a los PMN. Posteriormente
se evaluaron la adhesión y el rodamiento de neutrófilos a células
endoteliales transformadas derivadas de los ratonas TM^{ts/ts} y
TM^{LeD/LeD}. Como puede verse en la Tabla 7, la estimulación con
TNF-\alpha de las células endoteliales de
cualquier fuente de ratones potenciaba significativamente la
adhesión de los neutrófilos, de forma similar a los experimentos con
las células fEND.5. La adhesión de los neutrófilos de ratones de
cualquier genotipo a células endoteliales estimuladas con
TNF\alpha derivadas de ratones TM^{LeD/LeD} aumentaba
significativamente, en comparación con la adhesión a células
endoteliales de homólogos de tipo silvestre. Se determinó que esto
no era un artefacto específico del clon de célula endotelial, ya que
se evaluaron 3 clones diferentes de células endoteliales con
similares resultados. También hubo un aumento significativo de 3
veces en la adhesión de PMN y de linfocitos a células endoteliales
de TM^{LeD/LeD} en reposo en comparación con células endoteliales
de TM^{ts/ts} (Tabla 8). Los efectos fueron similares, sin
distinción de la fuente de leucocitos, es decir, si los leucocitos
derivaban de las médulas óseas de ratones TM^{LeD/LeD} o de tipo
silvestre. La adición de antisueros policlonales
anti-TM (que identifica regiones dentro y fuera de
la región N-terminal de TM) a las células
endoteliales de TM^{ts/ts} dieron lugar al aumento de la adhesión
de PMN (p < 0,005), mientras que los sueros preinmunes no tenían
efecto. Además, la adhesión de PMN a las células endoteliales de
TM^{LeD/LeD} no se veían afectadas por los antisueros
anti-TM; estos datos sugieren que de hecho, el
dominio N-terminal media en la potenciación de la
adhesión de leucocitos. Finalmente, la posibilidad poco probable de
que la trombina pudiera afectar en los ensayos a la adhesión se
excluyó por el hallazgo de que la adición de PPACK no tenía efecto
en los resultados. Para evaluar el mecanismo por el cual se
potenciaba la adhesión de PMN a las células endoteliales de los
ratones TM^{LeD/LeD}, tratamos de inhibir la adhesión en el modelo
de flujo usando anticuerpos bloqueantes
anti-ICAM-1. En células epiteliales
en reposo de tipo silvestre, donde la adhesión era mínima, hubo un
ligero descenso no significativo de la adhesión de neutrófilos. Los
anticuerpos anti-ICAM-1 interferían
con más del 75-80% de la adhesión de neutrófilos a
las células endoteliales de tipo silvestre que se estimulaban con
TNF-\alpha. Por el contrario, la adhesión de
neutrófilos a células endoteliales de TM^{LeD/LeD} en reposo se
suprimía en aproximadamente el 50% con anticuerpos
anti-ICAM-1. El tratamiento con
TNF\alpha aumentaba adicionalmente la adhesión, y una vez más, el
anticuerpo anti-ICAM-1 era sólo
parcialmente eficaz para bloquear la adhesión, causando un descenso
de sólo aproximadamente el 30%. La adhesión de PMN a células
endoteliales tratadas con TNF-\alpha de ratones
TM^{LeD/LeD} o de tipo silvestre se suprimió en más del 90% cuando
se añadían tanto anticuerpos
anti-ICAM-1 como
anti-P-selectina. Los resultados
sugieren que 1. las células endoteliales de TM^{LeD/LeD} habían
aumentado la expresión en superficie de ICAM-1
funcional y 2. que se activan otras vías para aumentar la adhesión
de los PMN a estas células endoteliales.
En el plasma de individuos normales se encuentran
niveles constitutivos de TM soluble en circulación, compuestos de
componentes proteolíticos de los dominios extracelulares, mientras
que se dan cambios cuantitativos en diferentes patologías. La
TM_{lec155} recombinante purificada se preparó usando el sistema
de expresión de Pichia pastoris y se purificó adicionalmente
por una serie de pasos cromatográficos como se detalla en los
procedimientos. En un ensayo de adhesión estática en células
endoteliales de TM^{Led/Led}, los PMN se incubaron conjuntamente
con TM_{lec155} a dos concentraciones. La adhesión de los PMN a
las células endoteliales en reposo se incrementó, como
anteriormente, en comparación con la adhesión a células endoteliales
de tipo silvestre (Tabla 9). La adición de TM_{lec155}
recombinante dio lugar a un descenso significativo en la adhesión (p
< 0,001), con una aparente respuesta a dosis. El grado de
supresión de la adhesión estaba casi al nivel de adhesión de las
células endoteliales de tipo silvestre. La adhesión de los PMN a
células endoteliales de TM^{LeD/LeD} activadas con
TNF-\alpha también se redujo significativamente
con TM_{lec155} recombinante (p < 0,001), pero no al nivel de
las células endoteliales en reposo. El papel de TM_{lec155}
recombinante in vivo se ensayó inyectando ratones de tipo
silvestre con 20 \mug/g de LPS i.p., seguido 5 minutos
después con un bolo intravenoso de TM_{lec155} recombinante o con
tampón sólo. Tras 3 horas más, se determinó la respuesta de
citoquina en suero. Como se ve en la Tabla 10, los niveles de
IL-1\beta estaban significativamente suprimidos
por la administración de TM_{lec155} recombinante cuando se
comparaba con el control (p = 0,02).
Para evaluar la función del dominio de tipo
lectina de TM humana, se expresaron en el sistema de Pichia
pastoris los fragmentos 1, 2 y 4 (SEC ID Nº 1, 2 y 4,
respectivamente) que representaban los intervalos de aminoácidos del
1 al 224, 1 al 157 y 33 a 159 de la proteína madura,
respectivamente. La proteína recombinante se purificó a través de
una serie de pasos cromatográficos en columna incluyendo
fenil-sefarosa, Q-sefarosa y
fraccionamiento por tamaño, y/o por cromatografía de afinidad usando
anticuerpos monoclonales murinos inmovilizados
anti-TM_{lec155} murina que se obtuvieron en
ratones TM^{LeD/LeD} y se demostró que reaccionaban de forma
cruzada con el dominio de tipo lectina de TM derivado de ratones o
de humanos. Se demostró por SDS-PAGE e
inmunotransferencia de tipo Western que los fragmentos purificados
eran homogéneos, apareciendo con el peso molecular aparente
apropiado de monómeros o dímeros y, ocasionalmente, multímeros.
Los ensayos de adhesión estática usando
neutrófilos humanos (50.000 por pocillo) y células fEND.5
confluentes en placas de 24 pocillos se realizaron exactamente como
se describe (véase a continuación, la sección 11 de Procedimientos).
Donde se indica, se usaron TNF-\alpha (200 U/ml) o
20 \mug/ml de LPS para activar las células fEND.5 durante 3 h. Los
PMN se incubaron conjuntamente con uno de los fragmentos
recombinantes de TM humana 1, 2 ó 4 (SEC ID Nº 1, 2 y 4) o con
péptidos purificados por HPLC que representan los fragmentos de TM
humana 3, 6 ó 7 (SEC ID Nº 3, 6 y 7). Las tablas
11-17 muestran los resultados, donde la cantidad de
fragmento recombinante en \mug se muestra en los gráficos de
barras y * indica p < 0,05 cuando se compara con el control de
tampón (es decir, sin proteína recombinante) en las mismas
condiciones. En todos los casos, se usaron controles apropiados
para las comparaciones.
El fragmento 1 (SEC ID Nº 1) que comprende el
dominio N-terminal completo de la TM humana
(aminoácidos 1 a 226 de la proteína madura) suprimía de forma
significativa la adhesión inducida por LPS y TNF de
neutrófilos humanos a las células fEND.5 (p < 0,001) de una forma
dosis-respuesta (Tablas 11 y 12). De forma similar,
el fragmento 2 suprimía significativamente la adhesión de
neutrófilos inducida por LPS (p < 0,001) (Tabla 13). El
fragmento 4 (SEC ID Nº 4) también suprimía la adhesión de
neutrófilos inducida por LPS y TNF (p < 0,05) (Tablas 14 y
15).
También se evaluó la capacidad de los péptidos
(fragmentos 3, 6 y 7) (SEC ID Nº 3, 6 y 7). A la concentración más
alta ensayada, el fragmento 3 (SEC ID Nº 3) suprimía
significativamente la adhesión de neutrófilos inducida por
LPS (p < 0,001). El fragmento 7 de TM humana (SEC ID Nº 7)
parecía ser más potente y suprimía significativamente la adhesión de
neutrófilos a las células fEND.5 (p < 0,001) (Tabla 17).
En general, los datos sugieren que varios
fragmentos del dominio de tipo lectina de TM pueden interferir con
la adhesión de neutrófilos o leucocitos al endotelio vascular y
puede formar de este modo la base para terapias antiinflamatorias.
Estos están siendo ensayados en una diversidad de modelos de
inflamación in vivo.
La vía de señalización intracelular de la quinasa
MAP está implicada en la regulación de la expresión de moléculas de
adhesión. Hemos examinado la activación de ERK_{1/2} en lisados de
corazones de ratones antes y después de la exposición a LPS.
Los niveles totales de ERK_{1/2} se mantenían estables. En ratones
tratados con PBS, los niveles basales de ERK_{1/2} fosforilada
eran similares entre genotipos. Tras LPS, los lisados de
corazones de ratones TM^{ts/ts} mostraban una fosforilación
pequeña de ERK_{1/2}. Por el contrario, se detectaba un aumento
significativo en la activación de ERK_{1/2} en lisados de corazón
de los ratones TM^{LeD/LeD}. Estos datos sugieren que el dominio
de tipo lectina de TM suprime la fosforilación de ERK_{1/2}
inducida por LPS.
Se previó que el dominio de tipo lectina soluble
de TM suprime la adhesión de PMN alterando la regulación de las vías
de la quinasa MAP en CE. Por tanto, las HUVE se expusieron a
TNF\alpha (200 U/ml) durante 20 minutos. La acumulación de
pERK_{1/2} y de NF\kappaB se suprimía notablemente por la
adición de GST-TM_{lec155}, aunque no por
completo, mientras que GST sola no tenía efecto. Los niveles de
ERK_{1/2} totales permanecían sin cambios. De forma similar,
TM_{lec155} interfería con la regulación positiva de pERK_{1/2}
inducida por TNF-\alpha y con la expresión de
NF\kappaB por HUVEC, lo que sugiere que el dominio de tipo lectina
de TM suprime la adhesión de PMN a las CE por medio de la
señalización de la quinasa MAP.
Debido a que la muerte de células endoteliales es
una vía de daño tisular mantenido, evaluamos si TM_{lec155} era
capaz de rescatar a las HUVEC de la muerte celular inducida por
privación del suero. Después de 3 días de privación de suero, morían
más del 95% de HUVEC. La privación de suero con la adición de
TM_{lec155} a concentraciones de 1, 10 y 20 \mug/ml recataba el
2 \pm 0,6%, 18 \pm 7% y 34 \pm 14% de las células (p = 0,69, p
< 0,05, p < 0,05, respectivamente comparado con controles
privados de suero), mostraban que TM soluble también puede tener
propiedades a favor de la supervivencia.
El daño por isquemia/reperfusión miocárdica
(I/RM) se caracteriza por la extravasación de PMN y la liberación de
citoquinas con el consiguiente daño tisular. Evaluamos el papel del
dominio de tipo lectina N-terminal de TM en este
procedimiento utilizando un modelo murino bien establecido. Las
arterias coronarias LAD de ratones TM^{LeD/LeD} y TM^{ts/ts} se
ocluyeron de forma transitoria durante 30 minutos, seguido de 3
horas de reperfusión, tras las cuales se midieron los tamaños de los
infartos, tamaños de LV y áreas de riesgo (AAR). Las tasas de
mortalidad durante el procedimiento quirúrgico eran similares en
todos los grupos. El tamaño del infarto en ratones TM^{Led/Led}
frente a ratones TM^{ts/ts} como función del tamaño de LV era de
28,8 \pm 4,1 (n = 10) y 21,7 \pm 4,6 (n = 11) o como función de
AAR era de 47,8 \pm 5,2 (n = 10) y 35,8 \pm 5,8 (n = 11),
respectivamente, ambas medidas reflejan un área de necrosis
significativamente más grande en los ratones TM^{Led/Led} (p <
0,002). Para confirmar que el aumento en el tamaño del infarto en
los ratones mutantes estaba asociada con el aumento de la
extravasación de PMN, se realizaron ensayos de "localización
tisular" de PMN en donde se infundían en la arteria coronaria PMN
derivados de médula ósea purificados y marcados con fluorescencia en
el momento de la reperfusión y 3 horas después, se cuantificó el
número de PMN seguido de los cortes histológicos. Para cada
experimento se usó la misma fuente de PMN de un ratón de tipo
silvestre y de un ratón TM^{Led/Led}, en orden alterno. En 2
experimentos independientes, las proporciones
TM^{Led/Led}:TM^{ts/ts} de PMN en el ventrículo derecho (RV),
fuera del AAR, en el LV y en el AAR eran de 1,35 \pm 0,4, 1,4
\pm 0,6, 3,2 \pm 0,6 y 4,2 \pm 0,6, respectivamente, indicando
que la extravasación de PMN tras la I/RM en los TM^{Led/Led}
aumentaba significativamente.
Se ha demostrado que la expresión de TM por
queratinocitos suprabasales se regula positivamente durante la
diferenciación epidérmica y tras el daño, especialmente en los
bordes de migración de una herida de piel en proceso de
cicatrización^{42}, aunque se ha informado de que ratones con
niveles de TM < 1% tiene velocidades de cicatrización de heridas
de piel normales^{43}. En ratones TM^{Led/Led}, la velocidad de
cicatrización no era significativamente diferente por encima de un
periodo de 9 días (Tabla 11). Sin embargo, en los ratones
TM^{LeDneo/LeDneo} había un retraso significativo en la
cicatrización evidente los días 4 y 7 (p < 0,05), cuando se
comparaba con ratones de tipo silvestre o ratones carentes del
dominio citoplásmico de TM. A día 9 tras la incisión, la
cicatrización no era diferente de lo normal (tanto en apariencia
como en tamaño de la herida restante). De este modo, mientras que
sólo la ausencia del dominio de tipo lectina del
N-terminal de TM no parece alterar de forma
significativa la cicatrización de heridas de piel, la falta de esta
estructura en combinación con bajos niveles antigénicos de TM
(<20%) tiene al menos un efecto pasajero en la cicatrización de
heridas.
El ADNc que codifica diversos fragmentos del
dominio de tipo lectina de TM (por ejemplo, secuencias de
nucleótidos que codifican, por ejemplo, polipéptidos de las SEC ID
Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, o una secuencia nucleotídica que
codifica la TM_{lec223} murina) se clona entre el potente
potenciador/promotor inmediato de genes tempranos del
citomegalovirus (CMV) y la señal de poliadenilación de SV40 del
plásmido bacteriano pACCMVpLpA (Gomez-Foix A. y col.
(1992) J. Biol. Chem. 267, 25129 y Janssens S.P. y col.
(1996) J. Clin. Invest. 98(2)317). En algunas
construcciones, se inserta un ADNc de fusión de modo que se genera
una proteína TM-lacZ, de modo que puede seguirse la
localización de la TM administrada. También el plásmido contiene
secuencias delecionadas de E1A del tipo 5 de adenovirus incluyendo
el origen de replicación, la señal de empaquetamiento y un
polienlazador. El adenovirus recombinante se genera por medio de
recombinación homóloga con pJM17, un plásmido bacteriano que
contiene el genoma adenoviral de longitud completa, seguido de la
cotransfección en células de riñón embrionario humano (293)
transformadas con E1A. La presencia del ADNc de TM en el virión de
ADN aislado de células 293 infectadas se confirma por análisis por
PCR. El aislado viral que contiene TM (AdCMV.TM) se amplifica en
células 293 confluentes y, tras la aparición de efectos citopáticos,
se aísla, se precipita y se concentra por gradiente discontinuo de
CsCl. Los valores virales se determinan por infección de monocapas
de células 293 con diluciones seriadas del adenovirus recombinante.
Para estudios in vivo, los valores del virus se ajustan a 5 x
10^{9} unidades formadoras de placas (ufp)/ml. La respuesta del
adenovirus recombinante se sigue en 2 modelos in vivo. En
ambos casos, anticipamos que la administración del dominio de tipo
lectina de TM disminuye la extravasación de leucocitos al tejido,
disminuye la inflamación y disminuye el daño. Modelo 1: ratones con
daño por isquemia/reperfusión miocárdica. Usando el modelo descrito
anteriormente, los ratones se tratan previamente con AdCMV.TM o con
el control AdCMV a dosis crecientes como se cuantifica por ufp/ml.
Las dosis se inician a 10^{7} ufp y se elevan dependiendo de la
respuesta. El tratamiento se administra por vía intravenosa 3 días
antes de I/RM. Se miden los tamaños del infarto como función del
área de riesgo. La expresión de AdCMV.TM en el corazón se evalúa por
RT-PCR. En aproximaciones alternativas, puede usarse
en la construcción del adenovirus un promotor específico cardíaco,
tal como el de la cadena pesada de la miosina, de modo que puede
asegurarse la expresión localizada del dominio de tipo lectina.
Además, la expresión regulada como se ha desarrollado en otros
grupos, puede facilitar la expresión del dominio de tipo lectina de
TM en el corazón, de modo que puede proporcionarse la expresión
potenciada de TM durante periodos de isquemia/reperfusión,
previniendo de este modo la extravasación de leucocitos y
previniendo el daño adicional. Modelo 2: se evalúa la respuesta a la
administración de AdCMV en ratones con artritis inducida por
antígeno (Rabinovich, GA y col. (1999) J. Exp. Med. 190,
385). En este caso, antes o poco después de exponer los ratones al
antígeno, se da a los ratones una única dosis de AdCMV.TM o de
controles (empezando a 10^{7} ufp) por vía intraperitoneal,
intravenosa o intraarticular. A los intervalos en los que la
artritis generalmente es máxima en los ratones control, y en otras
ocasiones a intervalos regulares, se evalúan clínica e
histológicamente los cambios de la inflamación de las
articulaciones, es decir, infiltración celular en el fluido sinovial
y niveles de citoquinas, daño del condrocartílago y proliferación y
crecimiento vascular intraarticular
(pannus).
(pannus).
Administramos en un modelo en ratón de
isquemia/reperfusión miocárdica, una hora antes del tiempo de
reperfusión, dosis crecientes (0 \mug, 1 \mug, 5 \mug, 10
\mug y 50 \mug) del dominio de tipo lectina recombinante,
fragmentos u homólogos del mismo (denominados Tmlec), por vía
intravenosa. Tras 30 minutos de isquemia de la arteria coronaria
LAD, se inicia la reperfusión en cuyo punto se administra una
segunda dosis de TMlec (incrementada en los experimentos posteriores
dependiendo de la respuesta) directamente en la arteria coronaria
LAD. Después de 3 horas, se evalúa el tamaño relativo del infarto en
el área de riesgo en los corazones de los ratones y la
extravasación de leucocitos en diferentes partes del corazón, es
decir, dentro y fuera de la zona de infarto. Se realizan estudios
control sin la administración de TMlec. Se usan en estos estudios
tanto ratones de la cepa silvestres como TM^{Led/Led}. También se
sigue la función miocárdica. Esperamos que el tratamiento con la
dosis apropiada de TMlec sea cardioprotectora y disminuya la
extravasación de leucocitos al tejido miocárdico. Además, no se
prevén efectos secundarios por este tratamiento.
El gen de TM murina, derivado de una biblioteca
genómica PAC murina de 129Sv (Genoma Systems, IN), y que contenía
una partícula provírica intracisternal de tipo A (IAP) en la región
no traducida 5' (5'-UTR)^{23}, se aisló
como se ha informado previamente^{24}. Un fragmento Kpn1 de 12 kb
que contenía la región codificadora completa, se subclonó en pBS
(Stratagene Inc., Mississauga, Canada) dando como resultado
Kpn12/BS.
Para reemplazar la región codificadora de tipo
silvestre de TM por una que codifica TM carente del dominio de tipo
lectina, se usó mutagénesis basada en PCR con los oligonucleótidos,
que contenían regiones solapantes complementarias, TM.s1957i
(sentido 5'-GGGCTCTCCGCACTATGCAGCGTGGAGAATGGTGGCTGT)
y TM.as287i (antisentido
5'-ATTCTCCACGCTGCATAGTGCGGAGAGCCCCAGGCTAGC). Se
realizaron dos reacciones de la polimerasa en cadena. En la primera,
se emparejó el cebador oligonucleotídico TMs-240
(sentido 5'-TTCTGTGGTGGCGC
CTGCAGGCCACGCCCG) se emparejó con el cebador antisentido TMas287i, dando lugar a un fragmento de 541 pb. En la segunda, el cebador oligonucleótido sentido TM.s1957i se emparejó con el cebador antisentido TM.as2613EO (5'-TGGACTAGTTAATTAAGATCTTCCTCGAGGCGCGCCGTTCAGCTGAAATATTTTAGC), produciendo un
fragmento de 1633 pb. Estos productos se purificaron y se usaron para PCR recombinante con los cebadores oligonucleotídicos TM.s-240 y TM.as2613EO. El amplicón de 2206 pb recombinado se subclonó en el vector de clonación de TA, pCR2.1 (Invitrogen, CA) y la presencia de la deleción deseada se confirmó secuenciando el ADN. Este fragmento de ADN se extiende desde un sitio para la enzima de restricción Nar1 a 230 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción, a través de la región codificadora del gen y hasta 643 pb de la región no traducida 3' (3'-UTR). El cebador oligonucleotídico TM.as2613EO dio lugar a la adición de sitios de restricción para Asc1, Xho1, BglII, Pac1 y Spe1 en el extremo 3' del producto recombinado, usados para la subclonación y selección de ADN de células ES. El producto proteico traducido final representa la proteína TM intacta, que retiene el supuesto péptido señal de 20 restos aminoacídicos y carece de los consiguientes 223 restos aminoacídicos del extremo NH_{2}-terminal del dominio de tipo lectina (HN_{2}-AKLQPTGSQCVEHECFALFQGPATFLDASQACQRLQGHLMTVRSSVAADVISL
LLSQSSMDLGPWIGLQLPQGCDDPVHLGPLRGFQWVTGDNHTSYSRWARPN {}\hskip0.2cm DQTAPLCGPLCVTVSTAT
EAAPGEPAW {}\hskip0.2cm EEKPCETETQGFLCEFYFTASCRPLT {}\hskip0.2cm VNTRDPEAAHISSTYNTPFGVSGADFQTLPVGSSA
AVEPLGLELVCRAPPGTSE {}\hskip0.2cm GHWAWEATGAWN) {}\hskip0.2cm (figura 2).
CTGCAGGCCACGCCCG) se emparejó con el cebador antisentido TMas287i, dando lugar a un fragmento de 541 pb. En la segunda, el cebador oligonucleótido sentido TM.s1957i se emparejó con el cebador antisentido TM.as2613EO (5'-TGGACTAGTTAATTAAGATCTTCCTCGAGGCGCGCCGTTCAGCTGAAATATTTTAGC), produciendo un
fragmento de 1633 pb. Estos productos se purificaron y se usaron para PCR recombinante con los cebadores oligonucleotídicos TM.s-240 y TM.as2613EO. El amplicón de 2206 pb recombinado se subclonó en el vector de clonación de TA, pCR2.1 (Invitrogen, CA) y la presencia de la deleción deseada se confirmó secuenciando el ADN. Este fragmento de ADN se extiende desde un sitio para la enzima de restricción Nar1 a 230 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción, a través de la región codificadora del gen y hasta 643 pb de la región no traducida 3' (3'-UTR). El cebador oligonucleotídico TM.as2613EO dio lugar a la adición de sitios de restricción para Asc1, Xho1, BglII, Pac1 y Spe1 en el extremo 3' del producto recombinado, usados para la subclonación y selección de ADN de células ES. El producto proteico traducido final representa la proteína TM intacta, que retiene el supuesto péptido señal de 20 restos aminoacídicos y carece de los consiguientes 223 restos aminoacídicos del extremo NH_{2}-terminal del dominio de tipo lectina (HN_{2}-AKLQPTGSQCVEHECFALFQGPATFLDASQACQRLQGHLMTVRSSVAADVISL
LLSQSSMDLGPWIGLQLPQGCDDPVHLGPLRGFQWVTGDNHTSYSRWARPN {}\hskip0.2cm DQTAPLCGPLCVTVSTAT
EAAPGEPAW {}\hskip0.2cm EEKPCETETQGFLCEFYFTASCRPLT {}\hskip0.2cm VNTRDPEAAHISSTYNTPFGVSGADFQTLPVGSSA
AVEPLGLELVCRAPPGTSE {}\hskip0.2cm GHWAWEATGAWN) {}\hskip0.2cm (figura 2).
Se construyó un vector dirigido (figura 2)
sustituyendo el ADN de TM mutado anteriormente en Kpn12/BS digerido
con Nar1-Spe1, generando Kpn12LeD/BS. El
fragmento Spe1-Spe1 de 3,5 kb de homología 3'
se escindió de Kpn12LeD/BS y se religó el vector restante. Se retiró
un fragmento Kpn1/BglI de 1,5 kb del último extremo 5' del gen, y
tras la digestión con nucleasa de judia mungo, también se religaron
los extremos del vector, dando lugar a 3,4 kb de homología en 5'.
Tras la digestión de la construcción anterior con Xho1 y
BglII, posteriormente se insertó en la 3'-UTR
el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) flanqueado por
loxP. El vector resultante se cortó con Pac1 y se
insertó en la orientación correcta el fragmento
Spe1-Spe1 de 3,5 kb previamente purificado,
que representa la homología en 3'. Finalmente, para la selección
negativa, se insertó el gen que codifica la citosina desaminasa
(cda) en el extremo 3' del vector dirigido entre los sitios
Sal1 y Not1.
El ADN del vector dirigido (20 \mug) se
linearizó con Not1 y se introdujo en células ES R1 por
electroporación, tras lo cual las células se sembraron sobre placas
con capas confluentes de fibroblastos embrionario resistentes a
neomicina en presencia de G418 y 5-fluorocitosina
(5-FC). Se analizó la recombinación homóloga en el
ADN de las colonias supervivientes por transferencia de tipo
Southern usando una sonda E externa 3' (como se muestra en la figura
2). Se excluyeron integraciones aleatorias por transferencia tipo
Southern con una sonda del ADN de neomicina y sondas
internas. Usando ADN de los clones de células ES recombinadas de
forma homóloga, se confirmó la deleción esperada por PCR con la
pareja de cebadores TM.s99
(5'-GTCTAGGTTGTGATAGAGGCT) y TM.as1005
(5'-GGCAGAGGCATCTGGGTTCATT), seguido de la
secuenciación de ADN del producto de PCR de 257 pb.
Las células ES objetivo se agregaron^{25} con
embriones en fase de mórula derivados de ratones C57Bl6/J, y se
introdujeron en ratones Swiss blancos hembras pseudopreñadas del
National Institutes of Health (NIH). El establecimiento de la
transmisión por línea germinal del alelo TM mutante
(TM^{LeDneo/ts}) se dio en dos machos quiméricos de la progenie.
Se entrecruzaron un gran número de descendientes de F1 y F2,
evitando apareamientos hermano-hermana. El tipaje
genético se realizó en el ADN de la cola tanto por transferencia de
tipo Southern como por PCR. Los machos quiméricos también se
retrocruzaron con ratones de las estirpes C57Bl/6 y 129sv/ev con
fines comparativos.
Los ratones con un único alelo sustituido por el
mutante TM^{LeDneo} (ratones TM^{LeDneo/ts}) se cruzaron con
ratones homocigóticos para la expresión ubicua de
cre-recombinasa bajo el control del promotor
de la fosfoglucoquinasa (ratones
PGK-Cre)^{26}. La escisión in vivo
de neo flanqueado por loxP de los ratones TM^{LeDneo/ts} se
confirmó por PCR en el ADN genómico de varios tejidos de la
progenie. El par de cebadores oligonucleotídicos TM.s2520 (sentido
5'GGCTTTGGGTATTTAGTCAGA) y TM.as2700 (antisentido 5'
CATAAAACCCAGGCTCACCC) producían un amplicón de 256 pb cuando se
lograba la escisión, mientras que el producto del alelo de tipo
silvestre tenía una longitud de 174 pb. Los ratones TM^{LeD/ts}
resultantes se entrecruzaron para generar ratones con la mutación TM
en ambos alelos. Se usaron como controles hermanos de tipo silvestre
de estos apareamientos (ratones TM^{ts/ts}) de modo que los
contextos genéticos fueron idénticos.
Los ADNc que codificaban TM de tipo silvestre y
mutada se subclonaron en el vector de expresión pcDNA3.1
(Invitrogen, CA) para la transfección en células COS. La dilución
seriada de las células en condiciones de selección con G418 dio
lugar a clones aislados de células que expresaban TM. También se
generó una línea de células COS control sólo con el vector. La
expresión de TM en la superficie celular se confirmo mediante
inmunofluorescencia indirecta^{27} usando antisuero de conejo
específico anti-TM de rata^{28}. La actividad
cofactora de TM recombinante expresada en la superficie celular se
evaluó por activación de proteína C bovina purificada con trombina
bovina añadida de forma exógena^{29}. Las cantidades relativas de
TM en tejido pulmonar y en plasma se cuantificaron usando un
radioinmunoensayo de tipo sandwich^{30} y los anticuerpos
policlonales anti-TM de rata.
El ARN total se aisló a partir de tejido por el
procedimiento de Chomczynski y Sacchi^{31}. Para la
RT-PCR, se sintetizó ADNc a partir de ARN total por
transcripción inversa usando la transcriptasa inversa del virus de
la leucemia murina (M-MLV) y un kit de síntesis de
ADNc (NV Life Technologies, Bélgica). La síntesis de la primera
cadena se cebó usando hexanucleótidos aleatorios. Para confirmar por
RT-PCR la deleción del dominio lectina de TM en los
ratones dirigidos con el gen, se usaron los cebadores
oligonucleotídicos TM.s99 y TM.as1005 que flanqueaban la región
delecionada y se secuenció el amplicón.
Se indujo el crecimiento de tumores endoteliales
en ratones de 7 días de edad tras la inyección intraperitoneal
(i.p.) de retrovirus portador del antígeno T mediano del
poliomavirus murino (PymT). Tras 10-14 días, los
tumores se escindieron y se aislaron las células
endoteliales^{32,33}. Los cultivos primarios de células
endoteliales linfáticas se aislaron a partir de linfangiomas
intraperitoneales, cuyo crecimiento se indujo por inyección de
adyuvante incompleto de Freund exactamente como se ha
descrito^{34}. Las células se cultivaron en placas recubiertas con
colágeno o gelatina en medio M199 suplementado con suero fetal
bovino al 20%, heparina porcina a 0,1 mg/ml, mitógeno de célula
endotelial a 5 \mug/ml (Biomedical Technologies Inc., Stoughton,
MA), penicilina a 100 \mug/ml y estreptomicina a 100 \mug/ml.
Los cultivos celulares se incubaron a 37ºC en una atmósfera
humidificada de CO_{2} al 5% y aire al 95% y los experimentos se
realizaron en los pases 3-8. Más del 95% de las
células se inmunoteñían positivamente para TM y vWF, lo que
confirmaba el origen y la pureza endotelial.
Los neutrófilos y linfocitos se aislaron a partir
de médula ósea de acuerdo con el procedimiento de Lowell y
Berton^{35}. Se valoró que la pureza de cada población era
superior al 95% por análisis microscópico tras la tinción de
Wright.
Los experimentos para evaluar la adhesión y el
rodamiento de los leucocitos derivados de la médula ósea sobre
monocapas de células endoteliales en una cámara de flujo se
realizaron como se ha descrito previamente^{36}. Brevemente, las
células endoteliales crecidas en cubres de vidrio recubiertos de
colágeno se montaron en una cámara de flujo paralelo y se
superfusionaron con suspensiones de leucocitos (2 x 10^{5}
células/ml). Las interacciones de leucocitos marcados con
BCECF-AM (Molecular Probes) con células endoteliales
se observó con un microscopio invertido de epifluorescencia y las
imágenes se analizaron con Image1.6 del NIH. El rodamiento de
neutrófilos o linfocitos se contó en 5 superposiciones de fotogramas
de video que ocupaban en total 50 seg. de un experimento de 5 min.
La adhesión firme se determinó en 15 campos de alta potencia (0,9
mm^{2}) tras lavar durante 5 min.
Las células endoteliales se sembraron en placas
de cultivo de 24 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia. Tras
2 lavados de las monocapas celulares con HBSS, se añadieron
neutrófilos derivados de sangre periférica humana, PMN derivados de
médula ósea murina o linfocitos recién preparados marcados con
BCECF-AM a razón de 50.000 por pocillo en un volumen
final de 1 ml durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se decantó
el medio y las monocapas celulares se lavaron suavemente tres veces
con HBSS, tras lo cual se contaron los leucocitos adheridos marcados
con fluorescencia con un microscopio invertido de epifluorescencia,
como se ha descrito anteriormente.
Se inyectaron 100 \mug de proteína C humana por
vía intravenosa en ratones y 15 minutos después se obtuvo plasma
citratado. Para detectar los niveles en plasma de proteína C humana
activada, se usó un inmunoensayo de captura específico y sensible
con el AcM 7D7B10^{16,37}. Los niveles en plasma de proteína C
humana en el plasma murino se midieron usando el kit Coamatic
Protein C Assay (Chromogenix, Molndal, Suecia) según las
instrucciones del fabricante, excepto porque la curva patrón se
generó diluyendo cantidades conocidas de proteína C humana
purificada en plasmas murinos combinados. Los resultados de ambos
ensayos reflejan las medidas realizadas por duplicado en un mínimo
de 5 ratones de cada genotipo en diferentes condiciones.
Se usaron los kits de ELISA tipo sándwich con
doble anticuerpo, adquiridos de R&D Systems Europe (Abingdon,
UK) para cuantificar los niveles en plasma murino de
TNF-\alpha, IL-1\beta,
IL-6 e IL-10. Se proporcionaron
controles. Se realizó un radioinmunoensayo sensible y específico
para cuantificar los niveles en plasma de FPA murino como se ha
informado previamente^{24}.
Los ratones se expusieron a oxígeno al 5,5%
durante 16-18 horas en una cámara
normobárica^{38}, tras lo cual se anestesiaron inmediatamente. Se
abrió el esternón para retirar la sangre por punción cardiaca con
anticoagulantes apropiados para ensayos posteriores. Las vasculatura
se prefundió con PBS a través del corazón. Los tejidos se
diseccionaron rápidamente y se fijaron para análisis histológico o
se pusieron en nitrógeno líquido para estudios de proteínas o de
ARN. Los niveles titulares de fibrina se determinaron como se
informó^{16}. Se cortaron secciones transversales de los pulmones
y se tiñeron con mieloperoxidasa para detectar neutrófilos y
monocitos, o se tiñeron con inmunoperoxidasa usando anticuerpos
específicos para TM o fibrinógeno.
Se inyectó lipopolisacárido (LPS) de
Escherichia coli de serotipo 0111:B4 (Sigma) por vía
intraperitoneal en ratones de 10-12 semanas de edad.
Para los estudios de letalidad, se siguieron de cerca los animales
cada día hasta la recuperación o el cese de la respiración. Para
estudiar los efectos de la inflamación del pulmón inducida por
endotoxina, se nebulizó una solución de endotoxina a 1 mg/ml en las
jaulas de los ratones durante 10 minutos, 3 horas después los
ratones se sacrificaron por sobredosis de uretano. Se tomaron
muestras de sangre y los pulmones se lavaron 5 veces por medio de un
catéter traqueal con 1 ml de PBS con BSA al 5% a 37ºC. El lavado
broncoalveolar (BAL) se centrifugó a 4000 g durante 5 minutos, se
lavó y se resuspendió en 200 \mul de PBS y se usaron fracciones de
éstos para el recuento diferencial de células y para el ensayo de
actividad mieloperoxidasa con una ligera modificación de la técnica
de Bradley y col.^{39}. Se diseccionaron los pulmones, se fijaron
durante una noche para su inclusión en parafina y se hicieron
análisis histológicos.
Se indujo isquemia miocárdica quirúrgicamente
como se ha informado^{40}. Brevemente, los ratones se entubaron y
se ventilaron usando un Minivent (Hugo Sachs Electronic,
March-Hugstetten, Alemania). Se mantuvo la
temperatura corporal a 36ºC durante todo el experimento. Se dejó al
descubierto la arteria coronaria descendente anterior (LAD) a través
de una toracotomia izquierda limitada y se ligó con un entubado
PE-10. La isquemia del ventrículo izquierdo (LV),
evidente por la palidez y falta de movimiento, se mantuvo durante 30
minutos, tras los cuales se retiró el entubado
PE-10, dejando la sutura en el lugar mientras se
permitía la reperfusión. Tres horas después, se cateterizó la aorta
abdominal y se infundió solución salina heparinizada hasta que no se
recogió más sangre por una venotomia de la cava a nivel de los vasos
renales. La LAD se ocluyó de nuevo y se inyectaron 3 ml de azul de
Evans en el catéter aórtico para delimitar el área de riesgo. Se
extirpó el corazón con cuidado, se cortó en láminas de 1 mm de
espesor y se sumergió en cloruro de tetrazolio al 2% durante 20
minutos^{41}. Se determinan el área de riesgo, el área de infarto
y el área de LV por planimetría de imágenes digitalizadas de las
láminas usando el software 1.62 de Imgage del NIH.
Se hicieron incisiones circulares con anestesia
de 2 cm de diámetro en la espalda, desde la piel hasta la dermis
profunda. Después los ratones se alojaron en jaulas separadas para
evitar que se rascaran y durante los consiguientes 9 días, las
heridas se inspeccionaron de forma regular, y se determinó el área
de cada herida.
Se generaron dos "miniproteínas" derivadas
del dominio N-terminal de TM murina por el sistema
de expresión de Pichia pastoris (Invitrogen, CA). Para la
primera (TM_{lec223}), se subclonó en marco en el vector de
expresión de Pichia pastoris pICZ-\alphaA
el fragmento de ADNc generado por PCR que codificaba los aminoácidos
1-223 de la proteína madura (carente del supuesto
péptido señal) y que, de ese modo, representaba el dominio de tipo
lectina más la región hidrófoba adyacente. Para la segunda
(TM_{lec155}) se subclonó en pICZ\alphaA el ADNc generado por
PCR que codificaba los 155 primeros aminoácidos de TM murina, es
decir, restringida a la región de tipo lectina. En ambos casos,
estaba presente una etiqueta de polihistidina en el extremo
carboxi-terminal de la proteína recombinante. La
expresión se confirmó por inmunotransferencia de tipo Western con
antisueros policlonales anti-TM de rata. La
purificación de las proteínas expresadas en alto grado, según se
evaluó por tinción de plata, se realizó como sigue: Se añadió
sulfato amónico a una concentración final de 1 M a aproximadamente 1
litro de medio de cultivo de Pichia pastoris que contenía la
proteína expresada, que se pasó después por una columna de
fenil-sefarosa de 1,6 cm x 10 cm. El gel se lavó con
un tampón que contenía fosfato sódico 10 mM, pH 7,0 y sulfato
amónico 1 M. La proteína parcialmente purificada se eluyó
posteriormente por etapas con fosfato sódico 10 mM, pH 7,0 y se
eliminó el exceso de sales del pico en una columna G25 de 2,5 cm x
30 cm, se lavó con un tampón que contenía fosfato sódico 10 mM, pH
7,0 y Tween 80 al 0,01%. Se combinaron las fracciones de proteína
sin sales y se cargaron en una columna de Q-sefarosa
de flujo rápido de 1,0 cm x 2,0 cm, se lavó a fondo con fosfato
sódico 10 mM, pH 7,0 y Tween 80 al 0,01% y la proteína se eluyó
usando un gradiente de NaCl de 0 a 1,0 M en 20 ml de tampón que
contenía fosfato sódico 10 mM pH 7,0 y Tween 80 al 0,01%. Las
fracciones que contenían la proteína deseada, identificadas por
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western, se
combinaron, se liofilizaron, se resuspendieron en un volumen total
de 3 ml de H_{2}O y se fraccionó por tamaño en una columna de
Superdex 75, de 1,6 x 94 cm, usando un tampón de desarrollo de PBS +
Tween 80 al 0,01%. Se mezclaron las fracciones que rendían el peso
molecular aparente apropiado de la proteína deseada por análisis en
SDS-PAGE y por inmunotransferencia de tipo Western y
se congelaron para estudios posteriores.
En una segunda aproximación, se subclonó el ADNc
que codificaba los primeros 155 aminoácidos de TM en el vector
pGEX-4T-3 para generar una proteína
GST de fusión en Escherichia coli. Tras la expresión, el
medio que contenía la proteína de fusión
(TM_{lec155}-GST) se incubó con
glutatión-sefarosa, se lavó y se eluyó
TM_{lec155}-GST de las perlas de sefarosa con un
exceso de glutatión libre. La pureza se evaluó por tinción con plata
e inmunotransferencia de tipo Western.
Todos los experimentos con animales fueron
aprobados por el Institucional Animal Care and Use Committee
de la Universidad de Leuven.
Los análisis estadísticos de los datos usando
procedimientos convencionales se realizó con el programa de
ordenador StartView (Abacus Concepts Inc., CA) o con InStat 2.03
(GraphPad Software, San Diego, CA). Se proporcionan las medias con
los errores típicos asociados (SD). Los valores p se determinaron
usando la prueba t no pareado y las comparaciones por grupos se
realizaron con la prueba de las sumas ordenadas de Wilcox.
| Ratones | Fibrina (\mug/gm) (n = 10) | FPA (nmol/l) (n = 10) |
| TM^{ts/ts} | 25 \pm 17 | 3,2 \pm 2,1 |
| TM^{ts/ts} + hipoxia | 46 \pm 28 | 3,3 \pm 2,3 |
| TM^{LeD/LeD} | 36 \pm 24 | 4,6 \pm 2,5 |
| TM^{LeD/LeD} + hipoxia | 28 \pm 21 | 5,2 \pm 4,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Ratones | Fibrina (\mug/gm) (n = 8) |
| TM^{ts/ts} | 32 \pm 28 |
| TM^{ts/ts} + hipoxia | 42 \pm 23 |
| TM^{LeD/LeD} | 56 \pm 20 |
| TM^{LeD/LeD} + hipoxia | 26 \pm 37 |
| Ratones | TNF\alpha | IL-1\beta | IL-10 | WBC |
| (ng/ml) | (ng/ml) | (ng/ml) | (x10^{3}/\mul) | |
| TM^{ts/ts} + LPS | 63 \pm 21 | 87 \pm 32 | 110 \pm 68 | 0,6 \pm 0,4 |
| TM^{LeD/LeD} + LPS | 255 \pm 91 | 213 \pm 68 | 138 \pm 42 | 1,2 \pm 0,5 |
| TM^{LeDneo/LeDneo} + LPS | 318 \pm 85 | 404 \pm 116 | 116 \pm 40 | 0,9 \pm 0,4 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Ratones | hPC (\mug/ml) | hAPC (ng/ml) | hAPC tras LPS (ng/ml) |
| TM^{ts/ts} | 8,6 \pm 1,3 | 7,8 \pm 2,0 | 14,0 \pm 0,4 |
| TM^{LeD/LeD} | 9,2 \pm 1,8 | 5,4 \pm 1,8 | 12,9 \pm 5,1 |
| TM^{LeDneo/LeDneo} | 7,9 \pm 2,2 | 6,0 \pm 0,4 | 16,2 \pm 4,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Células endoteliales | Fuente de PMN | Adhesión de PMN (N° por 15 CAP) |
| Células fEND.5-en reposo | Ratones TM^{ts/ts} | 62 \pm 6 |
| Ratones TM^{LeD/LeD} | 63 \pm 8^{#} | |
| Ratones TM^{ts/ts} | 101 \pm 6^{\amp{1}} | |
| Células fEND.5 + TNF\alpha | Ratones TM^{LeD/LeD} | 121 \pm 7^{\amp{1}#} |
| \textamp p < 0,01 frente a células fEND.5 en reposo | ||
| # p > 0,5 frente a PMN de ratones TM^{ts/ts} en las células fEND.5 correspondientes. |
| Fuente de células endoteliales | Adhesión de PMN | |||
| (Genotipo de los ratones) +/- | (N° por 15 CAP) | Valores p para el resultado correspondiente | ||
| tratadas con TNF | ||||
| TM^{ts/ts}+TNF | TM^{Led/Led} | TM^{Led/Led} + TNF | ||
| TM^{ts/ts} | 36 \pm 31 | <0,05 | <0,02 | <0,001 |
| TM^{ts/ts}+TNF | 246 \pm 216 | >0,5 | <0,001 | |
| TM^{LeD/LeD} | 283 \pm 231 | <0,001 | ||
| TM^{LeD/LeD} + TNF | 767 \pm 166 |
| Fuente de células endoteliales (Genotipo de | Adhesión de PMN | Adhesión de linfocitos |
| los ratones) +/- tratadas con TNF | (N° por 15 CAP) | (N° por 15 CAP) |
| TM^{ts/ts} | 15 \pm 4 | 3 \pm 1 |
| TM^{ts/ts} + TNF | 171 \pm 37 | 31 \pm 12 |
| TM^{LeD/LeD} | 52 \pm 18 | 8 \pm 3 |
| TM^{LeD/LeD} + TNF | 182 \pm 38 | 35 \pm 13 |
| TM^{ts/ts} + ac anti-TM | 44 \pm 8 | |
| TM^{ts/ts} + ac preinmune | 9 \pm 6 | |
| TM^{LeD/LeD} + ac anti-TM | 69 \pm 14 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 54 | 52,315 | 30,372 | 4,133 |
| 5 \mug de prot. 680 pb | 72 | 29,403 | 32,707 | 3,855 |
| 8 \mug de prot. 680 pb | 72 | 24,292 | 22,404 | 2,040 |
| 15 \mug de prot. 680 pb | 69 | 18,333 | 18,033 | 2,171 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 5 \mug de prot. 680 pb | 22,912 | 9,340 | <0,0001 | S |
| Tampón del ensayo, 8 \mug de prot. 680 pb | 28,023 | 9,340 | <0,0001 | S |
| Tampón del ensayo, 15 \mug de prot. 680 pb | 33,981 | 9,427 | <0,0001 | S |
| 5 \mug de prot. 680 pb, 8 \mug de prot. 680 pb | 5,111 | 8,647 | 0,2455 | |
| 5 \mug de prot. 680 pb, 15 \mug de prot. 680 pb | 11,069 | 8,741 | 0,0133 | S |
| 8 \mug de prot. 680 pb, 15 \mug de prot. 680 pb | 5,958 | 8,741 | 0,1807 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 65 | 98,723 | 100,098 | 12,416 |
| 5 \mug de prot. 680 pb | 32 | 85,656 | 79,996 | 14,141 |
| 10 \mug de prot. 680 pb | 33 | 24,303 | 27,845 | 4,847 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 5 \mug de prot. 680 p | 13,067 | 35,256 | 0,4647 | |
| Tampón del ensayo, 10 \mug de prot. 680 pb | 74,420 | 34,896 | <0,0001 | S |
| 5 \mug de prot. 680 pb, 10 \mug de prot. 680 pb | 61,353 | 40,504 | 0,0033 | S |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 54 | 52,31 | 30,37 | 4,13 |
| 5 \mug de prot. 480 pb | 54 | 27,68 | 16,04 | 2,18 |
| 8 \mug de prot. 480 pb | 54 | 25,50 | 14,84 | 2,02 |
| 15 \mug de prot. 480 pb | 52 | 19,01 | 14,00 | 1,94 |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 5 \mug de prot. 480 pb | 24,63 | 7,598 | <0,0001 | S |
| Tampón del ensayo, 8 \mug de prot. 480 pb | 26,815 | 7,598 | <0,0001 | S |
| Tampón del ensayo, 15 \mug de prot. 480 pb | 33,296 | 7,670 | <0,0001 | S |
| 5 \mug de prot. 480 pb, 8 \mug de prot. 480 pb | 2,185 | 7,598 | 0,5713 | |
| 5 \mug de prot. 480 pb, 15 \mug de prot. 480 pb | 8,666 | 7,670 | 0,0270 | S |
| 8 \mug de prot. 480 pb, 15 \mug de prot. 480 pb | 6,48 | 7,670 | 0,0973 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 53 | 44,887 | 30,905 | 4,245 |
| 5 \mug de prot. 400 pb | 53 | 33,642 | 25,119 | 3,450 |
| 8 \mug de prot. 400 pb | 51 | 29,725 | 19,183 | 2,686 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 5 \mug de prot. 400 pb | 11,245 | 9,822 | 0,0251 | S |
| Tampón del ensayo, 8 \mug de prot. 400 pb | 15,161 | 9,918 | 0,00300 | S |
| 5 \mug de prot. 400 pb, 8 \mug de prot. 400 pb | 3,916 | 9,918 | 0,4366 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 65 | 98,723 | 100,098 | 12,416 |
| 8 \mug de prot. 400 pb | 36 | 53,417 | 45,182 | 7,530 |
| 20 \mug de prot. 400 pb | 32 | 63,500 | 54,004 | 9,547 |
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 8 \mug de prot. 400 pb | 45,306 | 32,306 | 0,0063 | S |
| Tampón del ensayo, 20 \mug de prot. 400 pb | 35,223 | 33,580 | 0,0399 | S |
| 8 \mug de pr. 400 pb, 20 \mug de prot. 400 pb | -10,083 | 37,780 | 0,05984 |
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 53 | 44,887 | 30,905 | 4,245 |
| 1 \mug de pept. N° 24 | 53 | 38,830 | 26,390 | 3,625 |
| 5 \mug de pept. N° 24 | 53 | 44,019 | 31,623 | 4,344 |
| 8 \mug de pept. N° 24 | 52 | 22,000 | 19,164 | 2,658 |
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo, 1 \mug de pept. N° 24 | 6,057 | 10,534 | 0,2583 | |
| Tampón del ensayo, 5 \mug de pept. N° 24 | 0,868 | 10,534 | 0,8711 | |
| Tampón del ensayo, 8 \mug de pept. N° 24 | 22,887 | 10,585 | <0,0001 | S |
| 1 \mug de pept. N° 24, 5 \mug de pept. N° 24 | -5,189 | 10,534 | 0,3326 | |
| 1 \mug de pept. N° 24, 8 \mug de pept. N° 24 | 16,830 | 10,534 | 0,0020 | S |
| 5 \mug de pept. N° 24, 8 \mug de pept. N° 24 | 22,019 | 1,585 | <0,0001 | S |
| Recuento | Media | Des. Tip. | Err. Tip. | |
| Tampón del ensayo | 71 | 44,394 | 25,781 | 3,060 |
| 1 \mug de pept. N° 23 | 68 | 31,015 | 23,525 | 2,853 |
| 5 \mug de pept. N° 23 | 71 | 21,535 | 13,302 | 1,579 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Dif. Media | Dif. Crit. | Valor p | ||
| Tampón del ensayo | 13,380 | 7,204 | 0,0003 | S |
| Tampón del ensayo, 5 \mug de pept. N° 23 | 22,859 | 7,125 | <0,0001 | S |
| 1 \mug de pept. N° 23, 5 \mug de pept. N° 23 | 9,479 | 7,204 | 0,0102 | S |
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<141>
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<150> EP01201979.0
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2001-05-25
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<160> 17
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 224
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 1 de la trombomodulina
humana
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<400> 1
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 2 de la trombomodulina
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 3 de la trombomodulina
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 4 de la trombomodulina
humana
\newpage
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<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 5 de la trombomodulina
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
Ser Gln Ile Cys Asp}
\sac{Gly Leu Arg Gly His Leu Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 6 de la trombomodulina
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento 7 de la trombomodulina
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Atg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp
Asn Asn Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 38
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Fragmento 8 de la trombomodulina
humana
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<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val
Thr Gly Asp Asn Asn}
\sac{Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu
Asn Gly Ala Pro Leu}
\sac{Cys Gly Pro Leu Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador sentido TM.s1957i
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgggctctccg cactatgcag cgtggagaat ggtggctgt
\hfill39
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<210> 10
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador antisentido TM.as287i
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattctccacg ctgcatagtg cggagagccc caggctagc
\hfill39
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<210> 11
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador sentido TM.s240
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipttctgtggtg gcgcctgcag gccacgcccg
\hfill30
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<210> 12
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<211> 57
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador antisentido TM.as2613EO
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggactagtt aattaagatc ttcctcgagg cgcgccgttc agctgaaata ttttagc
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Restos de aminoácidos aminoterminales
del dominio de tipo lectina
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<400> 13
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador sentido TM.s99
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctaggttg tgatagaggc t
\hfill21
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<210> 15
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador antisentido TM.as1005
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagaggca tctgggttca tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador sentido TM.s2520
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipggctttgggt atttagtcag a
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador antisentido TM.as2700
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcataaaaccc aggctcaccc
\hfill20
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Claims (7)
1. Uso de un polipéptido como el descrito por la
SEC ID Nº 1, o un fragmento del mismo que comprende al menos 10
aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 1 y capaz de suprimir la
adhesión de leucocitos a células endoteliales en un ensayo de
adhesión estática, para la preparación de un medicamento para
prevenir y/o tratar la inflamación.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que dicho fragmento se elige entre el grupo compuesto por las SEC ID
Nº 2 a 8.
3. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicha inflamación es resultado del
daño por isquemia-reperfusión.
4. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 para prevenir la adhesión y/o la invasión de
leucocitos.
5. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que dicho leucocito es un neutrófilo.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido o fragmento del
mismo es un polipéptido recombinante o fragmento recombinante,
respectivamente.
7. Uso de una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido o fragmento del mismo como se define en la
reivindicación 6, en el que dicha secuencia de ADN se inserta en un
vector, para la preparación de un medicamento para prevenir y/o
tratar la inflamación.
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