ES2291332T3 - Mezclas de proteinas para curacion de heridas. - Google Patents
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Abstract
El uso de una composición que comprende un cóctel BP proteico derivado de hueso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas, en el que el cóctel BP proteico se puede preparar mediante la extracción proteica por hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas, siendo filtrada la disolución extracto y, a continuación, sometida a un proceso de ultrafiltración en dos etapas en el cual en la primera etapa de ultrafiltración se emplea una membrana de ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular (MWCO, del Inglés "Molecular Weight Cut Off") de 100 kD, siendo descartado el retenido y siendo sometido el filtrado a una segunda etapa de ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un MWCO nominal de aproximadamente 10 kD, siendo a continuación sometido el retenido a diafiltración, sustituyendo urea por guanidina, siendo a continuación sometida la disolución de urea que contiene proteína a cromatografía de intercambio iónico secuencial,que comprende primero la cromatografía de intercambio aniónico seguida de la cromatografía de intercambio catiónico, en la que las proteínas osteoinductivas producidas por el anterior proceso se somete, a continuación, a HPLC con una columna VYDAC tm preparativa y eluidas con gradiente creciente superficial de acetonitrilo, siendo juntadas fracciones de un minuto del eluato de la columna de HPLC para realizar el cóctel BP.
Description
Mezclas de proteínas para curación de
heridas.
La invención se refiere al uso de un cóctel
proteico derivado de hueso mediante la extracción proteica por
hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas para
el uso en el tratamiento de heridas.
La curación de herida es un proceso complejo que
implica varios tipos celulares y factores de crecimiento para un
cierre eficaz. El proceso de curación de herida normal se puede
clasificar en líneas generales en tres fases concretamente las
fases inflamatoria, proliferativa y de maduración. La fase
inflamatoria dura 0-2 días e implica un
reclutamiento ordenado de células a la zona de la herida. A esto le
sigue la fase proliferativa de 2-6 días, en la cual
los fibroblastos, queratinocitos y otras células en el lecho de la
herida comienzan a proliferar de forma activa para cerrar la
herida. La fase de maduración sigue a la fase proliferativa,
alcanzando su nivel máximo a los 21 días, tiempo durante el cual la
herida se cura completamente mediante la reconstrucción del tejido
cicatriz inicial.
Una herida problemática no sigue el programa
normal para el proceso curativo tal como se ha descrito
anteriormente. Una herida problemática podría dejar de seguir el
proceso curativo normal por cualquier número de razones, incluyendo
nutrición, estado vascular, factores metabolíticos, edad, estado
inmune, terapia de fármaco, estado neurológico y estado
psicológico, entre otros. Varios factores locales también juegan un
importante papel en la curación de herida, incluyendo la presencia
de tejido necrótico en la zona, infección, presencia de cuerpo
extraño, grado de desecación, presencia de edema, presión,
frotamiento, maceración del corte y dermatitis.
Se ha demostrado a partir de los estudios de
composición del fluido de herida que los factores de crecimiento
juegan un importante papel en las tres fases de la curación de
herida. Los tipos celulares que se reclutan para la zona de la
herida secretan factores de crecimiento que ayudan y estimulan el
proceso de curación de la herida. Las plaquetas, por ejemplo, son
el primer tipo celular que se recluta en el lugar de la herida e
inicia el proceso de curación de la herida mediante la secreción de
factores de crecimiento (es decir, factores de crecimiento
derivados de plaquetas, o PDGF, del Inglés "Platelet Derived
Growth Factor") que son quimiotácticos para otros tipos
celulares. Al hacerlo así, las plaquetas ayudan en el reclutamiento
y proliferación de tipos celulares adicionales que estimulan la
síntesis de tejidos nuevos. Además de las propiedades funcionales
anteriormente mencionadas, los factores de crecimiento también
tienen la capacidad de regular la síntesis proteica dentro de la
célula y controlar la señalización intracelular permitiendo así que
las células se comuniquen unas con otras.
Puesto que la curación de herida es un proceso
complejo, el cual implica la formación de tejido conectivo y nuevos
vasos sanguíneos para nutrir el lugar, es evidente que se ponen en
juego varios factores de crecimiento. En las heridas crónicas hay
un incremento en la actividad colagenasa y mayores niveles de
citoquinas inflamatorias. Además, hay una ausencia de factores de
crecimiento en el fluido de la herida, lo cual causa que las células
sean mitóticamente incompetentes. Todos estos factores causan
problemas de curación de la herida. Algunos de estos factores han
sido estudiados en los modelos animales preclínicos así como en los
clínicos. La mayoría de los estudios del factor de crecimiento
implicados en el proceso de curación de herida implican ensayos en
el intervalo de 20-25 días, que parece imitar
adecuadamente el proceso normal de curación de herida. Sin embargo,
ahora se han dado cuenta que para conseguir el cierre al 100% de las
heridas problemáticas, sería ventajoso periodos de estudios mayores
tan largos como 6 meses o más.
El único factor de crecimiento aprobado por FDA
para la curación de herida usado en lo clínico es el factor de
crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) comercializado por
Ortho-McNeil Pharmaceutical como REGRANEX®.
REGRANEX® contiene becaplermina, un factor de crecimiento derivado
de plaqueta humano y recombinante
(rhPDGF-BB) para la administración tópica. La becaplermina está producida por tecnología de ADN recombinante mediante la inserción del gen para la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) en levadura. La becaplermina tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y es un homodímero compuesto de dos cadenas polipeptídicas idénticas que se juntan mediante enlaces disulfuro. REGRANEX® es un gel tópico basado en carboximetilcelulosa (CMC) de sodio, conservado, de baja carga biológica y no estéril, que contiene el ingrediente activo becaplermina y los ingredientes inactivos cloruro de sodio, trihidrato de acetato de sodio, ácido acético glacial, agua para la inyección, y metilparaben, propilparaben y m-cresol como conservantes e hidrocloruro de L-lisina como estabilizador.
(rhPDGF-BB) para la administración tópica. La becaplermina está producida por tecnología de ADN recombinante mediante la inserción del gen para la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) en levadura. La becaplermina tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y es un homodímero compuesto de dos cadenas polipeptídicas idénticas que se juntan mediante enlaces disulfuro. REGRANEX® es un gel tópico basado en carboximetilcelulosa (CMC) de sodio, conservado, de baja carga biológica y no estéril, que contiene el ingrediente activo becaplermina y los ingredientes inactivos cloruro de sodio, trihidrato de acetato de sodio, ácido acético glacial, agua para la inyección, y metilparaben, propilparaben y m-cresol como conservantes e hidrocloruro de L-lisina como estabilizador.
Se han dirigido estudios de diversos factores de
crecimiento en el proceso de curación de herida. Algunos de las
conclusiones de estos estudios se resumen a continuación:
1) PDGF-BB (el factor de
crecimiento en REGRANEX®) es un quimioatrayente para los
neutrófilos, monocitos y fibroblastos. En las aplicaciones de
curación de herida se ha demostrado que se incrementa la deposición
de la matriz extracelular y aumenta la proliferación de
fibroblastos. Sin embargo, PDFG no es un angiógeno. Por tanto, se
requerirán factores de crecimiento adicionales para el
mantenimiento de la salud de la neodermis.
2) El factor de Crecimiento de Fibroblastos
(FGF, del Inglés "Fibroblast Growth Factor") incrementa la
densidad capilar y la proliferación de fibroblastos. Se ensayó una
aplicación tópica en forma de gel y se demostró que no había
absorción sistémica de la proteína (<1% de la dosis
detectada).
3) El factor de crecimiento transformante
\beta-2 (TGF \beta-2, del
Inglés "Transforming Growth Factor \beta-2")
es un factor de crecimiento que aumenta la proliferación de varios
tipos celulares tanto in vitro como in vivo y se ha
ensayado en la curación de úlcera venosa y en ensayos de úlcera de
pie diabético. En un estudio clínico de dos brazos se observó una
reducción del 40% del tamaño de la herida en comparación con la
herida control en 6 semanas cuando se usa a 0,5 \mug/cm^{2}.
Sin embargo, en un estudio clínico de 3 brazos cuando se ensayó 2,5
\mug/cm^{2} por comparación frente a vendaje de XEROFORM^{TM}
estándar, los resultados no fueron muy alentadores.
4) El factor de crecimiento epidérmico (EGF,
del Inglés "Epidermal Growth Factor") producido por plaquetas y
macrófagos es un mitógeno para las células epiteliales. Primero se
ensayó este factor de crecimiento en pacientes quemados y los
resultados iniciales fueron prometedores. Sin embargo, cuando se
ensayó en voluntarios no hubo diferencias entre los tratamientos
con el factor de crecimiento y el placebo. Esto se podría deber al
hecho de que EGF no es bueno para la migración de queratinocitos,
pero es un buen agente mitótico.
5) Se ensayó la capacidad para incrementar la
epitelialización del Factor de Crecimiento de
Keratinocitos-2 (KGF-2, del Inglés
"Keratinocyte Growth Factor-2"). Al día 6 se
cerraron los intersticios. KGF-2 estimula la
reepitelización en animales jóvenes y viejos sugiriendo mecanismos
indirectos para la formación de tejido de neogranulación. Xia Y.D.,
et al., J. Pathol. (1999)
188:431-438. Hay una resistencia incrementada al
estrés mecánico de las heridas curadas; por lo tanto,
KGF-2 puede ser útil para el tratamiento de heridas
quirúrgicas. Jiminez, P.A. & Rampy, M.A., (1999) J. Surg.
Res. 81:238-242.
6) El factor de crecimiento de tejido conectivo
(CTGF, del Inglés "Connective Tissue Growth Factor") es un
factor secretado, mitógeno, quimiotáctico e inducido por la matriz
celular codificado por un gen sensible de crecimiento temprano
inmediato. La implicación del CTGF en la ateroesclerosis humana y
los trastornos fibróticos sugiere un papel en la regeneración de
tejido como reparación de herida, pero también en la deposición
aberrante de la matriz extracelular. De hecho, los anticuerpos
anti-CTFG se han usado para bloquear la cascada
fibrótica.
Los estudios sobre las cinéticas de acción de
diversos factores de crecimiento demostraron que algunos factores
de crecimiento tales como el factor estimulante de la colonia
granulocito-macrófago (GMCSF, del Inglés
"Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating
Factor") y el FGF bovino actuaron secuencialmente. Se planteó la
hipótesis de que una combinación de factores de crecimiento sería
mejor que un tratamiento de un único factor de crecimiento. Sin
embargo, en modelos animales, una combinación de estos dos factores
realmente retardó el proceso regenerativo y la curación nunca
alcanzó el 100%. Por lo tanto, se intentó la liberación secuencial
de estos factores: primero se administró GMCSF seguido de la
liberación de FGF 25 días después. En un estudio sencillo, se
podría demostrar la no implicación sobre el control.
En otro estudio que combinaba
TGF-\beta, bFGF (FGF básico) y CTGF se encontró
que TGF-\beta1, TGF-\beta2 ó
TGF-\beta3 causaban fibrosis en la piel después de
3 días de inyección continua pero el cambio fue transitorio y
desapareció después de 7 días de inyección continua. A diferencia,
se observó fibrosis irreversible tras la inyección simultánea de
TGF-\beta y bFGF o TGF-\beta y
CTGF, o la inyección de TGF-\beta durante los 3
primeros días seguido por la inyección de bFGF o CTGF durante los
próximos 4 días. Estas observaciones sugieren que
TGF-\beta1 induce la fibrosis de la piel y bFGF o
CTGF lo mantiene en diversos trastornos fibróticos de piel.
Otro modo de obtener mezclas de factor de
crecimiento consideró el uso del liberado de plaqueta el cual
contiene una colección de factores de crecimiento liberados a
partir de las plaquetas derivadas de la sangre. Las ventajas de
este material son que es autólogo u homólogo y está fácilmente
disponible y es de suponer que contiene los factores requeridos en
la proporción apropiada. Para datar, aunque inicialmente se observó
alguna implicación en el proceso de curación, a las 24 semanas no
hubo diferencia entre los tratamientos con factor de crecimiento y
con placebo.
El documento
US-A-6054122 revela el uso de un
sellante de tejido o pegamento de fibrina que contiene una
composición que comprende al menos dos factores de crecimiento
tales como BMP-3, TGF-beta y
FGF-1 para el uso en la curación de herida. Además,
el documento revela el uso de un sellante de tejido o pegamento de
fibrina que contiene matriz ósea desmineralizada.
El documento
US-A-5116738 revela una composición
de BMP-3 para el uso en la curación de herida (y
reparación del tejido) que puede comprender otros factores de
crecimiento tales como las proteínas de BMP, el FGF y TGF.
El documento
US-A-5141905 revela una composición
de BMP-7 para el uso en la curación de herida (y
reparación del tejido) que puede comprender otros factores de
crecimiento tales como la BMP-3, el FGF y TGFbeta
(TGFbeta-1,-2,-3).
El documento
US-A-5187076 revela una composición
farmacéutica para el uso en la curación de herida que comprende
además de BMP-6, BMP-3,
TGF-beta y FGF.
El documento
WO-A-9641818 revela el uso de un
hidrogel derivado de quitina que contiene una composición que
comprende al menos un factor de crecimiento incluyendo
BMP1-8, FGF-1 y TGFbeta que estimula
la curación de herida. Además, el documento revela el uso del
hidrogel derivado de quitina que contiene matriz ósea
desmineralizada (DMB contiene BMP3, TGFbeta 2 y
FGF-1) para el uso en la curación de herida. Además,
se describe la formulación y liberación de TGFbeta 2 del sellante
de Fibrina para la curación de herida.
El documento
EP-A-0747066 revela el uso de
composiciones adhesivas biocompatibles basadas en colágeno que
contienen combinaciones o mezclas de dos o más factores de
crecimiento seleccionados entre el grupo de
TGF-beta-1,-2,-3,
BMP1-9 y FGFs para estimular la curación de
herida.
El documento
US-A-5356630 revela una mezcla de
proteínas osteogénicas solubles en agua (incluyendo
BMP1-8) derivadas de la matriz ósea
desmineralizada, TGF-beta y FGF para la curación de
herida.
Por tanto, está claro que aunque varios factores
de crecimiento polipeptídicos han mostrado significativa actividad
biológica en los modelos de reparación de herida preclínicos, el
único factor de crecimiento que ha demostrado ser eficaz en lo
clínico es el PDGF-BB recombinante humano. Esto
puede deberse a la escasa liberación, la inestabilidad del fármaco
o la incapacidad de un único factor de organizar el proceso complejo
de la curación de herida. Un tratamiento eficaz se debería dirigir
a cuestiones tales como la angiogénesis, la deposición eficaz de
colágeno y la epitelialización apropiada para cerrar la herida.
La invención comprende un cóctel proteico
derivado de hueso mediante la extracción proteica por hidrocloruro
de guanidina de partículas óseas desmineralizadas para mejorar el
proceso de curación de herida en animales vivos, incluyendo seres
humanos. En las realizaciones preferidas, la invención comprende una
mezcla de factores de crecimiento, los cuales mejoran el proceso de
curación de herida. En este contexto, los términos
"excluyendo", "exclusión" o "excluido" se refiere a
la supresión de sustancialmente todo un componente indicado, hasta
el punto de que dicho componente se puede suprimir de una mezcla
con cromatografía de inmunoafinidad o sino no se incluye en la
mezcla. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se
usa en la presente memoria en el sentido normal del término e
incluye todos los vehículos conocidos incluyendo el agua.
"BP" es un cóctel proteico derivado de
hueso tal como el descrito en los documentos de Patente Americana
Nº: 5.290.763, 5.371.191 y 5.563.124. En resumen, se preparó el
cóctel mediante la extracción proteica por hidrocloruro de
guanidina de partículas óseas desmineralizadas. Se filtró la
disolución del extracto y se sometió a un proceso de
ultrafiltración en dos etapas. En la primera etapa de
ultrafiltración se emplea una membrana de ultrafiltración que tiene
un corte de peso molecular nominal (MWCO, del Inglés "Molecular
Weight Cut Off") de 100 kD. El retenido se descarga y el
filtrado se somete a una segunda etapa de ultrafiltración usando una
membrana de ultrafiltración que tiene un MWCO nominal de
aproximadamente 10 kD. A continuación, el retenido se somete a
diafiltración para sustituir la urea por guanidina. A continuación,
la disolución de urea que contiene proteína se somete a
cromatografía de intercambio iónico secuencial, primero
cromatografía de intercambio aniónico seguida por cromatografía de
intercambio catiónico. A continuación, las proteínas osteoinductivas
producidas por el anterior proceso se someten a HPLC con una
columna VYDAC^{TM} preparativa y se someten a elución con
gradiente creciente superficial de acetonitrilo. Se juntan
fracciones de un minuto del eluato de la columna de HPLC para
producir el cóctel BP (el número de fracción puede variar
ligeramente con la composición del disolvente, el tamaño de la
resina, el volumen del lote de producción, etc.). Una realización
del cóctel BP se caracteriza tal como se muestra en la Figura
1-6. Se pueden variar las cantidades absolutas y
relativas de los factores de crecimiento presentes en el cóctel BP
recogiendo diferentes fracciones del eluato de HPLC. En una
realización particularmente preferida, se juntan las fracciones
29-34. También se contempla que ciertas proteínas
se pueden excluir de la mezcla BP sin afectar la actividad de la
curación de herida.
Originalmente BP se descubrió como una mezcla de
proteínas conocidas por tener actividad osteogénica. Sin embargo,
contiene una pluralidad de factores de crecimiento y es fuertemente
angiogénico. En particular, BP contiene un número de proteínas
morfogénicas óseas (BMPs, del Inglés "Bone Morphogenetic
Proteins"), incluyendo BMP-2,
BMP-3, BMP-4, BMP-5,
BMP-6 y BMP-7, así como
TGF-\beta1, TGF-\beta2 y
TGF-\beta3. FGF-1 también está
presente en la mezcla. Se detectó la presencia de cada una de las
anteriores proteínas usando técnicas de inmunotransferencia, tal
como se representa en la Figura 14. Cuando se ensayó BP en un modelo
animal para determinar si sería eficaz para ayudar al cierre de
herida, sorprendentemente se descubrió que BP estimulaba la
curación de herida, aunque fuese un proceso marcadamente diferente a
la osteogénesis.
Las composiciones proteicas de la invención se
pueden combinar de forma ventajosa con los vendajes de herida
tradicionales que incluyen los vendajes primarios y secundarios, los
vendajes del método
"wet-to-dry", los vendajes
absorbentes, los vendajes no adherentes, los vendajes
semipermeables, los vendajes transparentes, los vendajes
hidrocoloidales, hidrogeles, los vendajes en espuma , los vendajes
de alginato, cintas quirúrgicas y similares como sean apropiados
para el tipo de herida a tratar.
Las composiciones de acuerdo con la presente
invención también se puede combinar con una diversidad de otros
ingredientes activos, tales como aloe vera, arginina,
glutamina, zinc, cobre, vitamina C, vitaminas B y otros suplementos
nutricionales, antibióticos, antisépticos, antifúngicos,
desodorantes y similares. Las realizaciones de la invención también
se pueden combinar con una diversidad de agentes antiinflamatorios
que inhiben la acción de citoquinas proinflamatorias tales como
interleuquina-1, interleuquina-6 y
factor de necrosis tumoral alfa. Muchos de dichos inhibidores son
muy conocidos, tal como IL-1Ra, el receptor de
TGF-\beta soluble, corticoesteroides y se cree
que se descubrirán más en el futuro.
Se ha detectado la presencia de un número de
proteínas, que se cree que no tienen actividad de factor de
crecimiento en BP. Por consiguiente, estas proteínas, que incluyen
proteínas de histona, proteínas ribosómicas o ambas, se pueden
excluir de las composiciones de la presente invención. Si no, la
composición puede comprender la mezcla BP aislada tal como se
describe en los documentos de Patente Americana Nº 5.290.763,
5.371.191 y 5.563.124 tal como se muestra en las Figuras 2 y 3
(carriles dentro del recuadro juntados para producir BP). Las
histonas y los ribosomas se pueden excluir del BP mediante, por
ejemplo, la unión a anticuerpo u otras técnicas conocidas en la
técnica. Además, la composición en cuestión puede contener uno o más
de los componentes activos enumerados suministrados como proteína
producida de forma recombinante. Preferentemente, los componentes se
aíslan de una fuente natural y son al menos parcialmente
fosforilados y glicosilados.
En otra realización, las anteriores
composiciones se usan en las aplicaciones de curación de herida
junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo
farmacéuticamente aceptable incluye vendajes tales como vendajes
hidrocoloidales, hidrogeles, vendajes en espuma y vendajes de
alginato. Los ingredientes activos adicionales pueden incluir
arginina, glutamina, zinc, cobre, vitamina C, vitamina B1, vitamina
B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B12 y folato o factores de
crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, el
factor de crecimiento derivado de plaqueta, el factor de crecimiento
similar a la insulina, el factor de crecimiento de queratinocitos,
el factor de crecimiento endotelial vascular, el factor de
crecimiento transformante alfa, el factor de crecimiento nervioso,
el factor de crecimiento de tejido conectivo y el factor estimulante
de colonia granulocito-monocito. También se pueden
añadir a la composición un inhibidor de la inflamación tal como el
inhibidor de interleuquina-1, el inhibidor de
interleuquina-6 y el inhibidor del factor de
necrosis tumoral alfa. Por supuesto, también se pueden añadir
agentes de alivio del dolor, desinfectantes, antibióticos y otros
ingredientes activos adecuados para aplicaciones a herida
particulares.
La Figura 1 ilustra un SDS-PAGE
de una mezcla proteica de acuerdo con la presente invención, tanto
en formas reducidas como no reducidas.
La Figura 2 es un gel de
SDS-PAGE de las fracciones 27-36 de
la HPLC de una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la
presente invención.
La Figura 3 es un gel de
SDS-PAGE con bandas identificadas indicadas de
acuerdo con la leyenda de la Figura 4.
La Figura 4 es un gel de
SDS-PAGE de una mezcla proteica de acuerdo con una
realización de la presente invención con bandas identificadas
indicadas tal como se proporciona en la leyenda.
La Figura 5 es un gel de
SDS-PAGE en dos dimensiones (2-D) de
una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente
invención con patrones internos indicados por flechas.
La Figura 6 es un gel de
SDS-PAGE de una mezcla proteica de acuerdo con una
realización de la presente invención con proteínas rodeadas
identificadas como en la leyenda.
Las Figuras 7A-O son los
resultados de un espectrómetro de masas para los fragmentos
trípticos de geles de una dimensión (1-D) de una
mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente
invención.
La Figura 8 es una transferencia tipo
"Western" del gel 2-D de una mezcla proteica de
acuerdo con una realización de la presente invención marcada con
anticuerpo anti-fosfotirosina.
Las Figuras 9A-D son
transferencias tipo "Western" del gel en 2-D de
una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente
invención, marcadas con anticuerpos indicados. La Figura 9A indica
la presencia de BMP-3 y BMP-2. La
Figura 9B indica la presencia de BMP-3 y
BMP-7. La Figura 9C indica la presencia de
BMP-7 y BMP-2 y la figura 9D indica
la presencia de BMP-3 y
TGF-\beta1.
La Figura 10 es un gel de
SDS-PAGE teñido con PAS (ácido peryódico de schiff)
de las fracciones de la HPLC de una mezcla proteica de acuerdo con
una realización de la presente invención.
La Figura 11 es un gel de
SDS-PAGE teñido con
anti-BMP-7 de una mezcla proteica
tratada con PNGasa F de acuerdo con una realización de la presente
invención.
La Figura 12 es un gel de
SDS-PAGE teñido con
anti-BMP-2 de una mezcla proteica
tratada con PNGasa F de acuerdo con una realización de la presente
invención.
Las Figuras 13A-B son gráficos
de barras que muestran masa de explante de componentes glicosilados
en una mezcla proteica de acuerdo con una realización de la
presente invención (Figura 13A) y el resultado de ALP (Figura 13B)
de los mismos componentes.
La Figura 14 es un cuadro que muestra el listado
de anticuerpo y reactividad.
Las Figuras 15A-B comprenden
juntas un cuadro que muestra los datos de secuenciación de fragmento
tríptico para componentes de una mezcla proteica de acuerdo con una
realización de la presente invención.
Las Figuras 16A-F comprenden
juntas un cuadro que muestra los datos de la espectrometría de masas
de fragmento tríptico para componentes de una mezcla proteica de
acuerdo con una realización de la presente invención.
Las Figuras 17A-B son un gel con
SDS (Figura 17B) y un escaneo por densitómetro de barrido (Figura
17A) del mismo gel para una mezcla proteica de acuerdo con una
realización de la presente invención.
La Figura 18 es un cuadro que ilustra la masa
relativa, a partir de la cuantificación del densitómetro de
barrido, de los componentes proteicos en una mezcla proteica de
acuerdo con una realización de la presente invención.
Las Figuras 19A-D comprenden
juntas un cuadro que muestra los datos de la espectrometría de masas
de diversos fragmentos de proteína a partir de geles 2D de una
mezcla proteica de acuerdo con una realización de la presente
invención.
Se ha encontrado que una aplicación de dosis
única de BP a heridas de máximo grosor en ratones "nude"
cubiertos con injertos de piel humana del grosor de la hendidura
enredada cura la herida completamente y más rápido que las heridas
que no reciben la mezcla de factor de crecimiento. Aunque no se
entiende totalmente la manera específica en la cual los factores de
crecimiento en BP afectan al proceso de curación de herida, se
propone la hipótesis de que la acción sinérgica de los múltiples
factores de crecimiento presentes en BP ayuda a recuperar las
heridas mejor que aquellas en los animales control que han recibido
solamente el vehículo.
Se crearon heridas de máximo grosor en ratones
"nude" de modo que la zona de la herida comprendía
aproximadamente el 20% de la superficie corporal total. Se preparó
BP tal como en los documentos de Patente Americana Nº. 5.290.763,
5.371.191 y 5.563.124 y se suministró a la herida en un vehículo de
povidona. A continuación, se cubrió la herida con injertos de piel
humana del grosor de la herida enredada. El grupo control de
animales recibieron solamente el vehículo de povidona. Los lugares
del injerto se vendaron y se cerraron con
"band-aids" para mantener el vendaje seguro en
el sitio. Los primeros cambios de vendaje se llevaron a cabo el día
5 post operatorio y después cada tres días. El protocolo básico
también se describe en "Clinical and Experimetal Approaches to
Dermal and Epidermal Repair: Normal and Chronic Wounds", pp.
429-442 (1991) Wiley-Liss, Inc. y
Cooper M.L. et. al., "The Effects of Epidermal Growth
factor an basic Fibroblast Growth factor on Epithelialization of
Meshed Skin Graft Interstices", Prog. Clin. Biol. Res. (1991)
365:429-42. Dichos protocolos son conocidos por los
expertos en la técnica.
Los resultados fueron fuertemente alentadores.
Se ensayaron la aplicación única de dos concentraciones (o bien 100
\mug/lugar de herida o 200 \mug/lugar de herida) del factor de
crecimiento. No hubo diferencia ni en el índice ni en el grado de
curación de la herida entre los dos grupos. Sin embargo, había una
marcada diferencia entre el grupo de los animales que recibieron el
tratamiento con el factor de crecimiento y los animales control que
no recibieron el factor de crecimiento. Al día 11 POD (día post
operatorio), se observó un cierre de la herida del 95% en los
animales que recibieron el factor de crecimiento mientras que los
animales controles mostraron únicamente un cierre del 74%. Al día
14 POD todos los animales tratados con factor de crecimiento tenían
un cierre del 100% mientras que los animales control tenían
únicamente un cierre del 85% a partir del día 20 POD.
El grosor de la capa epitelial en las heridas
tratadas con BP fue significativamente mayor en los animales
tratados con BP en comparación con los animales control, tal como se
muestra en la Tabla 1. Los datos representan el grosor de la
neodermis en mm medido el día 11 para los animales tratados con BP y
el día 16 para los animales control de modo que las mediciones se
realizan a grados equivalentes de curación. Los análisis
histológicos revelaron que las heridas se cerraban por las células
humanas del material injertado y había deposición de colágeno en
las heridas cerradas tal como se reveló mediante tinción inmuno
histológica con involucrina y colágeno tipo 1 (los datos no se
muestran). La densidad de la capilaridad en el lecho de la herida
después del tratamiento con BP también fue significativamente mayor
en el momento del cierre de la herida en comparación con los
controles no tratados, tal como se muestra en la Tabla 1. Además, en
los animales tratados con la dosis de BP más baja, hay un
incremento significativo en el recuento de células de músculo liso
(SMC, del Inglés "Smooth Muscle Cell") en las heridas tratadas
con BP en comparación con los controles, tal como también se ve en
la Tabla 1.
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En resumen, una aplicación de dosis única de BP
era eficaz en reducir el tiempo de curación de la herida de grosor
máximo en ratones "nude" injertados con piel humana del grosor
de la herida enredada. Además, el grosor de la neodermis y la
densidad de los capilares en las heridas tratadas eran
significativamente mayores en comparación con el grupo control de
animales. A diferencia, se demostró que bFGF, también un factor de
crecimiento angiogénico, tiene un efecto perjudicial sobre la
epitelización cuando se ensaya en un modelo animal similar.
(Cooper, M.L. et al., 1991; "Clinical and experimental
approaches to dermal and epidermal repair: normal and chronic
wounds", pp. 429-442;
Weilly-Liss, Inc.)
Se trataron un pequeño número de animales (n=3)
con BP disuelto en un hidrogel (carboximetilcelulosa) en el mismo
modelo animal que se ha descrito anteriormente. En este estudio, se
observó que las heridas (n=2) tratadas con BP en el hidrogel
mostraron inicio de epitelización ya a los 5 días post operatorios
en comparación con las heridas tratadas con BP disuelto en povidona
al 1%, las cuales mostraron inicio de epitelización únicamente a
los 8 días post operatorio (los datos no se muestran). En ambos
ejemplos, los animales control que recibieron el vehículo solo no
mostraron inicio de epitelización hasta POD 8. Se está llevando a
cabo la histología detallada sobre las muestras de tejido para
determinar el grosor de la neodermis y el grado de angiogénesis en
las heridas tratadas con la formulación de hidrogel. Sin embargo, a
continuación, en la Tabla 2 se presentan los datos de cierre de
herida.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En resumen, los resultados eran muy prometedores
aunque preliminares, mostrando cierre de herida más grueso en
animales tratados con BP que en animales control. Por tanto, se
emprendieron experimentos más exhaustivos para confirmar los
resultados, tal como se describe a continuación.
REGRANEX® (PDGF-BB), el único
producto de factor de crecimiento aprobado en el mercado para tratar
úlceras de pie diabético, mostró curación completa en el 50% de la
población paciente en comparación con el 35% del tratamiento con
gel placebo que demostró curación completa después de repetir la
aplicación durante aproximadamente 20 semanas en pacientes
diabéticos (véase la completa información prescrita por REGRANEX®
U.S.-introducida en el paquete). Por lo tanto, se emprendió una
comparación de REGRANEX®(^{TM}) frente a BP en un estudio similar
al anteriormente descrito. Los resultados se presentan en las Tablas
3 y 4.
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\newpage
Los resultados de cierre en porcentaje se
resumen tal como sigue:
Por tanto, el tratamiento con BP es tan bueno
como con REGRANEX^{TM} en el cierre de heridas aunque inicialmente
se observa unos índices de curación ligeramente más bajos. El
tratamiento con BP también muestra un engrosamiento ligeramente
menor del epitelio y muestra angiogénesis considerablemente mejorada
en la zona de la herida.
Debido a que el BP ha prometido como agente de
curación de herida, próximamente se ensayará en aplicaciones donde
se sabe que la curación de herida es deficiente. Se realizarán
experimentos similares a los anteriormente descritos con animales
diabéticos para ensayar la curación de heridas de grosor máximo y
parcial. También se ensayará la respuesta de las úlceras por
estasis venosa y las úlceras diabéticas a BP.
En experimentos preliminares, ratas Sprague
Dawley Macho que pesaban más de 325 g se volvieron diabéticas
mediante tratamiento con estreptozotocina y se confirmó la
hiperglicemia mediante glucometría. Se introdujeron cuatro heridas
incisionales de grosor máximo en la superficie dorsal del eje
perpendicular al longitudinal de cada animal. Se cerraron las
heridas con suturas de seda y se aplicó el factor de crecimiento o
el placebo en el hueco de la herida o sobre la incisión después del
cierre. La aplicación se hizo en dos veces: 1) el día 0, el cual es
el día de inserción de la herida (cirugía) y una segunda aplicación
2) el día 3 después de la inserción de la herida. Se midió la
intensidad incisional el día 7 y el día 10 después de la cirugía.
En la Tabla 5 se dan los datos y es muy alentador que el tratamiento
con BP será particularmente útil para tratar una diversidad de
úlceras diabéticas u otras heridas caracterizadas por curación
retardada o escasa.
El BP se ha caracterizado parcialmente tal como
sigue: fracciones de cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC, del Inglés "High Performance Liquid Chromatography") se
han desnaturalizado, se han reducido con DTT y se han separado
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato
de sodio (SDS-PAGE, del Inglés "Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide-Gel Electrophoresis"). En
la Figura 2 se muestran las fracciones de la HPLC de un minuto
entre 27 y 36 minutos. Los patrones (ST) de tamaño de 14, 21, 31,
45, 68 y 97 kDa se obtuvieron como patrones de tamaño a Bajo Rango
de BIORAD^{TM} y se muestran en ambos finales del gel teñido con
azul de Coomassie. En el protocolo normal, se juntan las fracciones
29 hacia 34 de la HPLC para producir BP (véase los recuadros,
Figuras 2 y 3), tal como se muestra en un gel de
SDS-PAGE similarmente preparado en la Figura
17B.
Se caracterizaron los diversos componentes de BP
mediante espectrometría de masas y secuenciación de aminoácidos de
fragmentos trípticos donde había suficientes niveles de proteína
para el análisis. Se extrajeron las bandas principales en el gel 1D
(tal como se identifica numéricamente en la Figura 3), se sometieron
a elución, sometieron a digestión tríptica y los fragmentos se
purificaron con HPLC y se secuenciaron. Los datos de secuencia se
compararon frente a las secuencias conocidas y las mejores
correspondencias se muestran en las Figuras 15A-B.
Estas identificaciones son algo provisionales en el sentido de que
solamente se han secuenciado las porciones de las proteínas
completas y, en algunos casos, hay variación entre los análogos
humanos y bovinos para una proteína dada.
Se analizaron los mismos fragmentos de proteína
trípticos mediante espectrometría de masas y los espectrogramas de
masas se muestran en las Figuras 7A-O. Los
resultados tabulados y las homologías se muestran en las Figuras
16A-F que proporcionan información de identificación
para las bandas identificadas en las Figuras 3-4.
Tal como anteriormente, la asignación de identidad de la mancha
puede ser provisional en base a las diferencias de especie y las
modificaciones post-translación. Un resumen de todas
las identificaciones de proteína a partir de los geles 1D se
muestran en la Figura 4.
Los componentes proteicos identificados de BP,
tal como se describen en las Figuras 15A-B,
16A-F y 19A-D, se cuantificaron tal
como se muestra en las Figuras 17A y 17B. La Figura 17B es un gel de
SDS-PAGE teñido de BP y la Figura 17A representa un
rastro del densitómetro de barrido del mismo gel. Las proteínas
identificadas se marcaron y cuantificaron mediante la medición del
área bajo la curva. Estos resultados se presentan en la Figura 18
como un porcentaje del área de pico total.
Por tanto, hay 11 bandas principales en el gel
de SDS-PAGE de BP que representan aproximadamente el
60% de la proteína en BP. Las proteínas identificadas se dividen en
líneas generales en tres categorías: las proteínas ribosómicas, las
histonas y los factores de crecimiento, incluyendo factores
morfogénicos óseos (BMPs). Se espera que las proteínas ribosómicas
y las proteínas de histona se puedan suprimir del BP sin pérdida de
actividad, puesto que se sabe que estas proteínas no tienen
actividad de factor de crecimiento. Tras esta separación, se espera
que la actividad específica se incremente de manera
proporcionalmente.
Los experimentos se planean para confirmar la
hipótesis de que las proteínas de histona y ribosómicas se pueden
suprimir del BP sin pérdida resultante, o incluso un incremento, en
la actividad específica. Las histonas se suprimirán del cóctel BP
mediante cromatografía de inmunoafinidad usando o bien anticuerpos
específicos de proteína de histona o un anticuerpo de panhistona.
Se ensayará BP mermado de histona (BP-H) tal como se
ha descrito anteriormente para la curación de herida y/o actividad
osteogénica. Igualmente, se quitarán las proteínas ribosómicas
conocidas y se ensayará la mezcla restante
(BP-R).
También se analizó un gel de
SDS-PAGE de BP mediante inmunotransferencia tipo
"Western" con una serie de anticuerpos, como los enumerados en
la Figura 14. La visualización de la reactividad del anticuerpo fue
mediante peroxidasa de rábano picante conjugado con un segundo
anticuerpo y usando un sustrato quimioluminiscente. Además, se
cuantificó TGF-\beta1 usando
TGF-\beta1 comercialmente puro como patrón y se
determinó para representar menos del 1% de la proteína de BP. El
análisis del anticuerpo indicó que cada una de las proteínas
enumeradas en la Figura 14 están presentes en BP.
El BP se caracterizó más mediante electroforesis
en gel 2D, tal como se muestra en las Figuras 5-6.
Se separaron las proteínas en dirección horizontal de acuerdo con
la carga (pI) y en dirección vertical por el tamaño tal como se
describe en la electroforesis en dos dimensiones adaptada para la
resolución de proteínas básicas se realizó de acuerdo con el método
de O'Farrell et al. (O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M. y
O'Farrell, P.H., Cell, 12:1.133-1.142, 1977)
por el Kendrick Laboratory (Madison, WI). Las técnicas de
electroforesis en gel en dos dimensiones son conocidas por los
expertos en la técnica. Se llevó a cabo electroforesis en gradiente
de pH en condiciones de no equilibrio ("NEPHGE", de sus siglas
en Inglés) usando anfolinas a pH 3,5-10 al 1,5% y a
pH 9-11 al 0,25% (Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ) a 200 V durante 12 Horas. Se añadieron tropomiosina
purificada (mancha inferior, 33.000 kDa, pI 5,2) y lisozima
purificada (14.000 kDa, pI 10,5-11)(Merck Index) a
las muestras como marcadores de pI internos y están marcados con
flechas.
Después de la calibración durante 10 min en
tampón "0" (glicerol al 10%, ditiotreitol 50 mM, SDS al 2,3% y
Tris 0,0625 M, pH 6,8) se selló el gel en tubo a la superficie de un
gel apilado que está por encima de un gel de lámina en acrilamida
al 12,5% (0,75 mm de grosor). Se llevó a cabo electroforesis en gel
en lámina con SDS durante aproximadamente 4 horas a 12,5
mA/gel.
Después de la electroforesis en gel en lámina se
tiñeron dos de los geles con azul de Coomassie y los otros dos se
transfirieron al tampón de transferencia (Tris 12,5 mM, pH 8,8,
Glicina 86 mM, MeOH al 10%) sometido a transferencia sobre papel
PVDF durante toda la noche a 200 mA y aproximadamente 100
voltios/dos geles. Las siguientes proteínas (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) se añadieron como patrones del peso molecular a la
agarosa que sellaba el gel en tubo al gel en lámina: miosina
(220.000 kDa), fosforilasa A (94.000 kDa), catalasa (60.000 kDa),
actina (43.000 kDa), anhidrasa carbónica (29.000 kDa) y lisozima
(14.000 kDa). La Figura 5 muestra el gel 2-D teñido
con patrones de tamaño indicados a la izquierda. La tropomiosina
(flecha izquierda) y la lisozima (flecha derecha) también están
indicadas.
En la Figura 6 se muestra el mismo gel con
varias proteínas identificadas indicadas por los círculos
enumerados. Se identificaron las proteínas mediante espectrometría
de masas y secuenciación de aminoácidos de péptidos trípticos, tal
como se ha descrito anteriormente. La identidad de cada uno de los
círculos marcados está proporcionado en la leyenda de la Figura 6 y
los datos que identifican las diversas manchas de proteína se
presentan en las Figuras 19A-D.
Debido a la variedad de las proteínas migradas a
más de un tamaño (por ejemplo, BMP-3 que migra como
6 bandas) se emprendieron investigaciones para investigar el
alcance de la modificación post translación de los componentes de
BP. Se midió la fosforilación mediante inmunotransferencia
anti-fosfotirosina y mediante estudios de fosfatasa.
La Figura 8 muestra un gel 2D, sometido a electrotransferencia
sobre papel de filtro y sondando con un anticuerpo monoclonal de
ratón de fosfotirosina mediante SIGMA (Nº A-5964).
Por tanto, se demostró que varias proteínas son fosforiladas en uno
o más residuos de tirosina.
Se sondaron las electrotransferencias 2D
similares con anticuerpos específicos a componente de BP, tal como
se muestra en las Figuras 9A-D. Se sondaron los
filtros con BMP-2, BMP-3 (Fig. 9A),
BMP-3, BMP-7 (Fig. 9B),
BMP-7, BMP-2 (Fig. 9C) y
BMP-3 y TGF-\beta1 (Fig. 9D). Cada
uno muestra la migración de banda de tamaño único característica a
pI variante, como es típico de una proteína que existe en diversos
estados de fosforilación.
Para los estudios de fosfatasa, se incubó BP en
HCl 10 mM durante toda la noche a 37ºC con 0,4 unidades de
fosfatasa ácida (AcP, del Inglés "Acid Phosphatase"). Se
añadieron muestras tratadas y no tratadas a discos liofilizados de
colágeno tipo I y se evaluaron uno al lado del otro en el bioensayo
en rata de implante subcutáneo, tal como previamente se ha descrito
en los documentos de Patente Americana Nº: 5.290.763, 5.563.124 y
5.371.191. En resumen, se añadió 10 g de BP en disolución a discos
de colágeno liofilizados y los discos se implantaron
subcutáneamente en el cuello de una rata. A continuación, se
recuperaron los discos de la rata a las 2 semanas para el ensayo
con fosfatasa alcalina ("ALP"- un marcador para células
productoras de hueso y cartílago) o a las 3 semanas para el
análisis histológico. Para el análisis con ALP de las muestras, se
homogenizaron los explantes y se midieron los niveles de actividad
de ALP usando un kit comercial. Para la histología, se cortaron
secciones finas del explante con un microtomo y se tiñeron las
secciones y se analizó para la formación de hueso y cartílago.
Se ensayaron la actividad morfogénica mediante
la masa del implante subcutáneo (masa de explante) y el resultado
de ALP en muestras de BP tanto naturales como tratadas con
fosfatasa. Los resultados mostraron que el tratamiento con AcP
reducía la masa de explante y el resultado de ALP desde el 100% al
aproximadamente 60%. Por tanto, la fosforilación es importante para
la actividad de BP.
También se analizó la glicosilación en el BP. La
Figura 10 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con
ácido peryódico de schiff (PAS), un tinte de carbohidrato no
específico, que indica que varios de los componentes de BP son
glicosilados (proteína con asterisco identificada como
BMP-3). Las Figuras 11-12 muestran
la inmunodetección de dos proteínas específicas
(BMP-7, Figura 11 y BMP-2, Figura
12) tratadas con niveles crecientes de PNGasa F
(Péptido-N-Glicosidasa F). Tanto
BMP-2 como BMP-7 muestran algún
grado de glicosilación en BP, pero parece tener también algún nivel
de proteína resistente a PNGasa F (los signos más indican niveles
crecientes de enzima). Se ensayaron la actividad funcional de
muestras tratadas con PNGasa F y sialadasa mediante masa de
explante y mediante resultado de ALP, tal como se muestra en la
Figura 13A y 13B que demuestra que se requiere la glicosilación
para la actividad total.
En resumen, se modificaron los BMPs 2, 3 y 7
mediante fosforilación y glicosilación. Estas modificaciones
post-translación afectan a la actividad morfogénica
de la proteína, 33% y 50% respectivamente, y se debe tener cuidado
al preparar el BP para no degradar estos derivados funcionales.
Claims (6)
1. El uso de una composición que comprende un
cóctel BP proteico derivado de hueso en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de heridas, en el que el cóctel BP
proteico se puede preparar mediante la extracción proteica por
hidrocloruro de guanidina de partículas óseas desmineralizadas,
siendo filtrada la disolución extracto y, a continuación, sometida
a un proceso de ultrafiltración en dos etapas en el cual en la
primera etapa de ultrafiltración se emplea una membrana de
ultrafiltración que tiene un corte de peso molecular (MWCO, del
Inglés "Molecular Weight Cut Off") de 100 kD, siendo descartado
el retenido y siendo sometido el filtrado a una segunda etapa de
ultrafiltración usando una membrana de ultrafiltración que tiene un
MWCO nominal de aproximadamente 10 kD, siendo a continuación
sometido el retenido a diafiltración, sustituyendo urea por
guanidina, siendo a continuación sometida la disolución de urea que
contiene proteína a cromatografía de intercambio iónico secuencial,
que comprende primero la cromatografía de intercambio aniónico
seguida de la cromatografía de intercambio catiónico, en la que las
proteínas osteoinductivas producidas por el anterior proceso se
somete, a continuación, a HPLC con una columna VYDAC^{TM}
preparativa y eluidas con gradiente creciente superficial de
acetonitrilo, siendo juntadas fracciones de un minuto del eluato de
la columna de HPLC para realizar el cóctel BP.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un
hidrogel.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un vendaje
seleccionado ente el grupo que consiste en vendajes hidrocoloidales,
hidrogeles, vendajes en espuma y vendajes de alginato.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
incluyendo además la composición uno o más ingredientes activos
seleccionados entre: arginina, glutamina, zinc, cobre, vitamina C,
vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B12 y
folato.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
incluyendo además la composición uno o más factores de crecimiento
seleccionados entre: factor de crecimiento epidérmico, factor de
crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento similar a la
insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de
crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento transformante
alfa, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de
tejido conectivo y factor estimulante de colonia
granulocito-monocito.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
incluyendo además la composición uno o más inhibidores de
inflamación seleccionados entre: inhibidor de
interleuquina-1, inhibidor de
interleuquina-6 e inhibidor del factor de necrosis
tumoral alfa.
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