KR102223544B1 - 골질환 예방 및 치료용 세리신 단백질 분리 방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세리신 단백질 분리 방법 및 이에 의해 분리된 세리신 단백질의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 방법인 특정 온도 조건하에서 초음파 처리에 의한 추출 및 분자량에 따른 분리 방법의 병용 처리를 통해, 실크로부터 분리된 세리신-1/-3 단백질 분획인 분자량 30kDa 이상 크기의 세리신 단백질은, 천연 물질로부터 유래된 단백질이므로 안전하고 변성이 적으며 생체적합할 뿐만 아니라 골 재생 효과가 탁월하다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 실크로부터 분리된 세리신-1/-3 단백질 분획인 분자량 30kDa 이상 크기의 세리신 단백질은 종래 골질환/손상 치료 관련 제제를 대체할 수 있는 훌륭한 대안이 될 수 있을 뿐만 아니라, 실크 단백질의 부산물로 폐기되고 있는 세리신을 재활용함으로써 경제적 성장 및 사회적 이익에도 기여할 수 있다.

Description

골질환 예방 및 치료용 세리신 단백질 분리 방법 및 이의 용도{Method for Separating Sericin Protein for Preventing or Treating Bone Diseases and Uses Thereof}

본 발명은 골질환 예방 및 치료용 세리신 단백질 분리 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

뼈는 인체를 지탱하며 동작을 수행하는 기계적 기능 이외에 체내의 칼슘이온 농도를 조절하는 역할을 하며, 골수에서 인체에 필요한 적혈구 및 백혈구를 생산하는 중요한 생리적 기능을 한다. 뼈는 높은 기계적 강도를 가진 조밀한 구조인 피질골과 내부 스펀지와 같은 구조인 지주골로 이루어진다. 연령이 증가함에 따라 골밀도가 떨어져 작은 충격에도 쉽게 골절을 일으키게 되며, 골다공증, 관절염으로 손상되고, 이와 같은 생리적, 물리적 손상으로 골절이 발생되면 골 재생이 어려워진다.

또한, 뼈 재생의 치료 방법은 자연적인 치료나 약물 또는 물리적 요법에 의한 치료방법, 정형외과 수술에 의한 치료 방법 등이 존재하며, 골에 대한 손상 정도가 커서 회복이 어려운 경우, 정상조직은 보호하고 손상된 조직은 제거한다.

최근에는 손상된 골조직을 정상적인 골조직으로 대체하거나 재생시키려는 시도를 하고 있으며, 이에 따라 체내 이식을 위한 골조직 또는 이의 골재생 촉진 제제의 개발에 관심이 증대되고 있다.

이에, 손상된 골조직의 보완을 위하여 골수유래줄기 세포와 같은 세포를 이용하여 골 형성 효과를 증대시키려는 생체 조직 인공 뼈를 개발하려는 연구가 진행 중에 있기도 하며, 타인이나 동물의 뼈를 이식하는 방법이나 환자 자신의 조직을 이식하는 방법도 있으나, 타의 조직을 이식함으로써 면역학적 거부반응이 발생되거나 손상 부위가 커서 환자 몸에서 사용할 수 있는 재료가 충분하지 않는 등의 문제점이 있다.

한편, 실크는 보통 누에로부터 얻는 섬유상의 단백질 소재를 말하는데, 의류용 소재로 널리 이용되어 왔으며, 최근에는 새로운 천연 고분자 자원으로 이용하려는 연구가 진행 되고 있다. 실크 단백질의 조성이 인체 피부를 구성하고 있는 콜라겐 단백질의 아미노산 조성과 매우 유사하여 피부 친화성에 기초한 식품 및 화장품 소재에 사용되고 있으며, 효소 고정화 담체, 세포 배양 지지체 등 생물 공학용 소재 및 창상 피복재, 인공 혈관 등 의료용 소재로 사용되고 있다.

이러한 실크는 섬유의 내·외층의 배향정도와 아미노산 구성 물질의 함량과 분자량 및 결정성이 달라 크게 2 종류의 단백질로 분류할 수 있다. 그 비율은 대략 25:75로서 세리신과 피브로인으로 규정하고 있으며, 세리신은 용해성이 높아 일반적으로 정련 공정에서 제거되어 피브로인만 남게 되는데 이를 일반적으로 명주라 하여 주로 의류용으로 사용한다. 과거 실크를 의류용으로만 사용할 때는 세리신은 정련과정에서 폐수로 버려지게 되었지만 최근 세리신이 생체적합성이 우수하고 생체재료로서 사용할 수 있는 가능성이 확인 된 뒤 많은 연구가 수행되고 있다. 실크로부터 세리신을 분리하는 방법으로는 주로 알칼리 용액에서 고온처리하거나, 물을 넣고 고온 고압에서 오랜시간 처리하는 방법을 사용한다.

세리신은 생사 상태에서 외층으로부터 내층으로 갈수록 아미노산 함량이나 용해성 정도가 달라지는데 이러한 특징들로 인하여 여러 학자들은 세리신의 종류를 구분하기도 한다.

Watanabe(1959)는 세리신의 용해도에 따라 세리신을 A, B로 나누고, Komatsu(1966)는 세리신을 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ으로 나누어 중량비를 4:4:2라고 하였으나, 최근에는 4단계로 구분하여 외층으로부터 세리신 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ라 하고 여러 특징들에 의해 세리신 Ⅰ, Ⅱ는 이용성 세리신이라 하고, 세리신 Ⅱ의 일부와 Ⅲ, Ⅳ는 난용성으로 구분하기도 하나, 그 근본적인 특징은 내층으로 갈수록 용해성이 낮다는 것이다.

세리신 Ⅰ, Ⅱ에는 친수성 아미노산기가 많고, 누에의 토사 시에 가장 외층에 위치하여 수분증발이 가장 빠른 위치에 있으므로 기공의 생성이 많아 분자간 수소결합과 같은 결합력이 떨어져 비결정성을 이루기 쉽다. 내부로 갈수록 외부에 비해 친수성 아미노산 함량이 낮으며 피브로인의 성질과 가까워지게 된다. 세리신 Ⅳ 부분과 피브로인 사이에는 약간의 왁스층이 존재하고 있어 피브로인을 보호하고 있으며 이것을 경계로 세리신과 피브로인을 구분하기도 한다.

실크를 구성하는 구성요소로서 정련과정에서 부산물로 발생되는 세리신은 천연 성분임에도 상대적으로 섬유나 각종 기능성 식품 및 의약용도로서 가치를 인정받은 피브로인와 달리 다양한 용도에 사용되지 못하고 폐기물로서 별도의 과정을 통해 처분하고 있는 실정이다.

따라서, 이러한 문제점 등을 보완하고 골 손상을 복구하기 위해서는 수급이 용이하고 생체적합하여 안전한 천연물의 활성 성분을 이용한 대체요법이 현실적으로 요구되고 있으며, 적정한 크기의 세리신 단백질은 골 재생에 도움을 줄 수 있을 천연물로서 대안이 될 수 있을 뿐만 아니라, 실크 단백질의 부산물로 폐기되고 있는 세리신이 재활용된다면 현저한 경제적 성장과 사회적 이익에 기여할 수 있을 것이다.

본 발명자들은 골 재생을 촉진할 수 있는 물질로서 인체에 부작용 없이 안전하게 적용될 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 특정 온도 조건하에서 초음파 처리에 의한 추출 및 분자량에 따른 분리 방법의 병용 처리를 통해 실크로부터 분리된 세리신-1/-3 단백질 분획인 분자량 30kDa 이상 크기의 세리신 단백질을 확보하였고, 상기 30kDa 세리신 단백질이 대식세포주에서 골 재생을 증가시키는 것으로 알려진 BMP(bone morphogenic protein)의 발현을 상향 조절하여 골 재생을 촉진할 뿐만 아니라, 골 손상 모델에서 골 결손 부위에 충진되는 경우 골 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 실크로부터 유래된 세리신(Sericin) 단백질의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 실크로부터 유래된 세리신 단백질을 포함하는 골 재생용 치료제의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 실크로부터 유래된 세리신 단백질을 유효 성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 누에고치(Cocoon) 또는 평면견 (plain spun silk mat)에 초음파를 처리하여 수용성 실크 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 분획된 단백질 분획으로부터 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신 단백질을 분리수득하는 단계;를 포함하는, 실크로부터 유래된 세리신(Sericin) 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 세리신 단백질은 실크에서 유래된 것이다.

본 명세서에서 용어 "실크"는 견사 곤충이 토사하여 만든 섬유를 의미하며, 바람직하게는 누에(Bombyx mori)가 토사하는 가잠사를 의미한다. 실크 단백질은 피브로인 및 세리신으로 이루어져 있고, 피브로인과 세리신은 각각 평균 75%와 25%의 비율로 존재한다.

본 명세서에서 용어 "세리신"은 10 kDa부터 300 kDa 까지의 넓은 분자량 대와 18개의 아미노산으로 구성된 고분자 단백질을 의미한다. 세리신은 생사 상태에서 외층으로부터 내층으로 갈수록 아미노산 함량이나 용해성 정도가 달라진다. 이러한 용해도에 따라 세리신을 4 단계로 구분하여 외층으로부터 세리신 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ로 구분하고, 특성에 따라 세리신 Ⅰ, Ⅱ는 이용성 세리신, 세리신 Ⅱ의 일부와 Ⅲ, Ⅳ는 난용성으로 구분하기도 하나, 그 근본적인 특징은 내층으로 갈수록 용해성이 낮다는 것이다. 세리신 Ⅰ, Ⅱ에는 친수성 아미노산기가 많고, 누에의 토사 시에 가장 외층에 위치하여 수분증발이 가장 빠른 위치에 있으므로 기공의 생성이 많아 분자간 수소결합과 같은 결합력이 떨어져 비결정성을 이루기 쉽다. 내부로 갈수록 외부에 비해 친수성 아미노산 함량이 낮으며 피브로인의 성질과 가까워지게 된다. 세리신 Ⅳ 부분과 피브로인 사이에는 약간의 왁스층이 존재하고 있어 피브로인을 보호하고 있으며 이것을 경계로 세리신과 피브로인을 구분하기도 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신 단백질 분획은 BMP(Bone morphogenic protein)-2 및 BMP(Bone morphogenic protein)-4의 발현을 증가시킨다. 특히 본 발명의 30kDa 이상의 평균 분자량을 갖는 세리신 단백질 분획은 평균 분자량 30 kDa 미만의 세리신 단백질 분획과 비교하여 현저하게 우수한 BMP-2 및 BMP-4 발현 증대 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세리신 단백질은 세리신-1 단편 및 세리신-3 단백질 단편이다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 초음파 처리는 30℃ 내지 70℃ 온도, 바람직하게는 65℃ 온도에서 실시하나, 목적 단백질을 분리할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 초음파 처리는 0.1 내지 1000 KHz의 초음파, 바람직하게는 10 내지 50 KHz의 초음파, 보다 바람직하게는 40 KHz의 초음파로 실시하나, 목적 단백질의 분획을 추출할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세리신 단백질은 실크로부터 초음파를 이용하여 세리신을 추출한 후 분자량에 따라 분획함으로써 제조된다.

또한, 본 명세서에서 목적 단백질을 언급하면서 사용되는 용어 "세리신 단백질"은 실크로부터 초음파를 이용하여 세리신을 추출한 후 분자량에 따라 분획된 세리신 펩타이드를 의미하며, 이와 혼용된다. 또한, 세리신 단백질은 실크 유래 세리신의 생리학적 활성을 가지는 한, 임의의 천연 또는 합성 펩타이드를 포함할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 세리신 단백질인 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 및 세리신-3 단백질 단편들은 천연 단백질에서 유래해 기본적으로 안전하고, 고온 처리 단계가 없으므로, 단백질의 거의 변성이 없으며, 생체적합할 뿐만 아니라, 골 재생을 증가시키는 것으로 알려진 BMP의 발현 수준을 증강시키는 효능 테스트를 거쳐 선별되어 기능성이 우수하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 누에고치(Cocoon) 또는 평면견(plain spun silk mat)에 초음파를 처리하여 수용성 실크 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 분획된 단백질 분획으로부터 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신 단백질을 분리수득하는 단계를 포함하는, 세리신 단백질을 포함하는 골 재생용 치료제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 골 재생용 치료제에 포함되는 세리신 단백질은 거대 분자인 실크 단백질이 분해되어 생성된 단백질로서, BMP(Bone morphogenic protein)-2 및 BMP(Bone morphogenic protein)-4의 발현을 증가시키는 효과가 발휘되는 한, 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 평균 분자량 30 kDa 내지 300 kDa의 세리신 단백질, 보다 바람직하게는 30 kDa 내지 50 kDa의 세리신 단백질일 수 있다.

본 발명의 골 재생용 치료제는 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진할 수 있으며 뼈의 결손 부위에 충진되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시킨다.

본 명세서에서 용어 "골 재생" 또는 "뼈의 재생"은 뼈가 파골세포에 의해 파괴 및 흡수되고 이어서 조골세포에 의해 뼈가 다시 형성되는 과정을 의미한다. 용어 "뼈의 무기질화"는 뼈 세포 또는 세포외 기질에 칼슘 등의 무기질이 침착되는 현상을 의미한다.

본 발명의 골 재생용 치료제는 생체 적합성이 뛰어난 세리신 단백질이 손상된 골 부위에 작용함으로써 BMP(Bone morphogenic protein)-2 및 BMP(Bone morphogenic protein)-4의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 골 세포에 영향을 미쳐 골세포의 탈락을 방지할 수 있다. 따라서, 목적에 따라 적합한 물성의 골 시멘트를 제조하는 데에도 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 골 재생용 치료제는 추가적으로 생체적합성 결합제, 항생제, 비타민, 글루코사민, 사이토카인 및 성장인자로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.

상기 생체적합성 결합제는 젤라틴, 히알루론산(hyaluronic acid), 수산화인회석(hydroxyapatite), 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 머슬(mussel) 접착 단백질, 엘라스틴, 카제인, 알부민, 케라틴, 키틴 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 생체적합성 결합제는 전분, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리디옥사논, 폴리카프로락톤, 폴리카보네이트, 폴리옥소에스테르, 폴리아미노산, 폴리무수물, 폴리히드록시부틸레이트, 폴리히록시발리레이트, 폴리(프로필렌 글리콜-코-퓨마릭산), 티로신계-폴리카보네이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈 및 카르복시 메틸 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 골 재생용 치료제는 골 결손 부위에 직접 주입하거나 생체주입가능한 형태의 이식재에 충진하여 주입하여 목적의 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 골 손상 모델에 본 발명의 세리신 단백질을 젤라틴 스폰지에 처리하여 이식하는 경우 BMP 단백질의 수준이 월등히 높은 것이 관찰되었다. 이 결과를 통해 젤라틴 스펀지의 미세기공구조에 채워진 세리신 단백질이 생체액에 의해 녹아나오고, 인접 골조직으로부터 생성되는 새로운 생체골과 상호작용하여 높은 BMP 수준을 유지함으로써 골 재생 효능이 향상된 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 세리신 단백질을 포함하는 골 이식재(bone graft)를 제공할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 세리신 단백질은 골 이식재에 대하여 0.01-1000 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1-600 ㎍/㎖이며, 보다 더 바람직하게는 0.5-300 ㎍/㎖이고, 가장 바람직하게는 1-100 ㎍/㎖이다.

본 발명의 유효성분인 세리신 단백질은 골 이식재의 총 중량에 대하여 0.01-40 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1-30 중량%이며, 가장 바람직하게는 1-20 중량%이다.

본 명세서의 용어 "골 이식재"는 다양한 질환 또는 사고에 의해 뼈 조직의 일부가 손상되거나 결손된 경우, 이러한 부위를 대체하여 뼈 조직 내의 공간을 충진시키고, 뼈 신생을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 총칭하는 의미로 정의된다.

상기 골 이식재는 골 성장을 촉진하는 성장인자, 피브린, 골 형태 형성인자, 골성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 활성물질을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 성장인자로는 PDGF(Platelet-derived growth factor), TGF-beta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor) 및 BGDF-II(beta-2-microglobulin) 등을 이용할 수 있다. 상기 골 조직 형성 증진 펩타이드와 단백질로는 RGD 서열을 포함하는 각종 펩타이드와 콜라겐 및 피브로노젠과 같은 각종 단백질 등을 이용할 수 있다. 상기 골 형태 형성인자로는 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein) 또는 오스테오제닌(osteogenin) 등을 이용할 수 있다. 상기 골 성장제는 인체에 무해하고 골 성장을 촉진하는 물질이라면 제한 없이 사용이 가능하며, 골 형성을 증진시키는 핵산, 골 형성을 억제하는 물질의 길항제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 이식재를 제형화하기 위한 화합물로서, 히알루론산(hyaluronic acid), 수산화인회석(hydroxyapatite), 콜라겐, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 모노칼슘인산, 트리칼슘인산 및 실리카로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 추가적으로 포함하고, 가장 바람직하게는 수산화인회석(hydroxyapatite)이다.

특히, 수산화인회석은 사람의 뼈 및 치아의 에나멜질과 동일한 성분으로 치아의 에나멜질의 결손부분에 대한 수복에 큰 효과가 있으며, 이 수복효과로 인해 치아의 원래 빛깔을 회복시켜주기 때문에 최근 치아 미백제로도 각광을 받고 있다.

본 발명의 골 이식재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있고, 상기 화합물을 이용하여 겔, 분말, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형 하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 골 이식재가 적용될 수 있는 뼈 부위는 특별히 한정되지는 않는다.

따라서, 본 발명의 세리신 단백질 단독 또는 본 발명의 세리신 단백질과 적절한 생체적합성 결합제, 항생제, 비타민, 글루코사민, 사이토카인 및/또는 성장인자가 포함된 골 재생용 치료제를, 골 결손 부위에 직접 단독 주입하거나 생체주입가능한 형태의 이식재에 충진하여 주입하는 경우, 뼈의 손상 또는 결손 부위에서의 뼈의 신생 효과가 우수하다.

상기한 바에 기초하여, 본 발명의 골 재생용 치료제는 각종 골절, 골괴사 질환 또는 골 재생에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세리신 단백질을 유효 성분으로 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 골질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성골질환 및 뼈의 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종일 수 있으며, 골 재생 효과가 발휘하는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용되는 담체"는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적 유효량을 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 억제제의 양이 치료하고자 하는 질환인 골 질환의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서, 약학적 유효량은, (1) 골 질환의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 골 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 정지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 골 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 세리신 단백질을 유효 성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법인 특정 온도 조건하에서 초음파 처리에 의한 추출 및 분자량에 따른 분리 방법의 병용 처리를 통해, 실크로부터 분리된 세리신-1/-3 단백질 분획인 분자량 30kDa 이상 크기의 세리신 단백질은, 천연 물질로부터 유래된 단백질이므로 안전하고 변성이 적으며 생체적합할 뿐만 아니라 골 재생 효과가 탁월하다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 실크로부터 분리된 세리신-1/-3 단백질 분획인 분자량 30kDa 이상 크기의 세리신 단백질은 종래 골질환/손상 치료 관련 제제를 대체할 수 있는 훌륭한 대안이 될 수 있을 뿐만 아니라, 실크 단백질의 부산물로 폐기되고 있는 세리신을 재활용함으로써 경제적 성장 및 사회적 이익에도 기여할 수 있다.

도 1은 개략적인 단백질 추출법을 보여준다. 도 1a는 종래 열수 추출법에 의한 세리신 단백질 추출 방법; 도 1b는 누에고치 또는 평면견으로부터 섭씨 37도에서 초음파 처리 및 분자량 분리에 의한 세리신 단백질 추출 방법; 및 도 1c는 누에고치 또는 평면견으로부터 65℃에서 초음파 처리 및 분자량 분리에 의한 세리신 단백질 추출 방법을 개략적으로 보여준다. 누에고치에 비해 평면견의 경우 세리신 함량이 2~3배 높기 때문에 같은 조건에서 세리신 추출 시 수율이 증가되는 장점이 있으며, 온도를 올릴 때 수율이 더 좋아지지만 지나치게 온도가 높으면 기존의 정련방법과 차이가 없어질 뿐 아니라 단백질이 변성되기 때문에 분리된 세리신 단백질의 BMP와 같은 골형성 촉진 단백질의 유도 능력이 현저하게 저하된다. 따라서, 세리신 수율을 극대화하고 골재생에 도움이 되지 않는 단백질을 변성시켜 제거하는 조건으로 도 1C와 같은 방법이 가장 효율적임을 알 수 있다.
도 2는 2 차원(2D) 전기 영동(도 2A 내지 2C) 및 BMP-2/-4에 대한 웨스턴 블롯 결과(도 2D 내지 2F)를 보여준다:
종래 정련 방법에 의한 산물의 (A) 2D 전기 영동 결과 및 (D) 웨스턴 블롯 결과; 누에고치로부터의 산물의 (B) 2D 전기 영동 결과 및 (E) 웨스턴 블롯 결과; 평면견으로부터의 산물의 (C) 2D 전기 영동 결과 및 (F) 웨스턴 블롯 결과.
이때, 마킹된 스팟들은 식별을 위해 MALDI-TOF를 실시하여 (B)의 경우 10 개 스팟을 획득하여 이에 대한 결과를 표 1에 나타내었고; (C)의 경우 3 개 스팟을 획득하여 이에 대한 결과는 표 2에 나타내었다.
(D) 정련 산물의 단백질은 BMP-2/-4의 매우 약한 증가를 보였다.
(E) (B)의 두 분획을 분자량 (30 kDa)으로 나누었다. 높은 분자량 분획(평균 분자량 30 kDa 이상)은 저 분자량 분획(평균 분자량 30 kDa 미만)보다 높은 수준의 BMP-2/-4 증가를 보였다.
(F) 평면견(평균 분자량 30 kDa 이상)에서 더 높은 분자량 분획(평균 분자량 30 kDa 미만)은 BMP-2/-4 발현의 증가된 수준을 보였다.
도 3은 마이크로 CT의 결과를 보여준다. 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군(Gelatin with sericin)은 젤라틴 스폰지를 넣지 않은 대조군(unfilled control) 또는 젤라틴-단독 스폰지 군(Gelatin only)에 비해 더 높은 골 재생률을 보였다. 뼈의 양(BV; bone volume)을 비교했을 때, 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (P <0.001). post hoc test에서 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군과 다른 군과의 차이는 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(* 젤라틴 스폰지를 넣지 않은 대조군 및 젤라틴-단독 스폰지 군의 경우 *P <0.001 및 = 0.015).
도 4는 조직학적 결과를 보여준다. 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군에서 새로운 뼈 형성이 두드러졌다. BMP-2/-4의 면역 염색 결과는 다른 그룹에 비해 본 발명의 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군에서 더 높은 발현을 보였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

세포 배양 및 실크 단백질 처리

RAW264.7 마우스 대식 세포(한국 세포주 은행 번호 40071)를 배양 배지에서 배양하였다.

비교 대조 실험 방법으로서, 종래 열수추출법에 의한 산물로서 증류수에서 누에고치를 가열하여 추출한 세리신(Sericin) 1을 이용하였다.

또 다른 비교 대조 실험 방법으로서, 37℃의 증류수에서 누에 고치에 초음파(40 KHz)를 처리하여 내층으로부터 가용성 실크 단백질 분획을 추출하였다.

또한, 본 발명의 방법으로서, 65℃의 증류수에서 평면견(plain spun silk) 에 초음파(40 KHz)를 처리하여 가용성 단백질 실크 분획을 추출하였다. 추출된 실크 단백질은 필터(Microcon®-30, Merk Millipore Ltd., Tullagreen, Ireland)에 의해 분리되었다. 필터링은 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다.

평면견의 경우 세리신 1/3가 통상적인 누에고치에 비하여 높은 비율로 존재한다. 이를 분자량에 따라 분리하여 30 kDa 이상의 분자량을 가지는 분획을 추후 실험에 이용하였다.

RAW264.7 세포를 6-웰 배양 플레이트에 분주하고, 여기에 1, 5 및 10㎍/mL의 정련 산물 또는 상기 방법으로 분리된 가용성 실크 단백질 분획을 처리하였다. 배양 2, 8 또는 24 시간 후, 세포를 수득하였다. 대조군으로 배양된 세포는 세리신(sericin)에 필요한 것과 동량의 용매로 처리하였다.

샘플 준비 및 2-DE

샘플을 7M 우레아, 2M 티오우레아, 4%(w/v) CHAPS, 2.5%(w/v) DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)에 현탁시켰다. 용해물을 균질화하고 15,000 x g에서 20 분간 원심분리한 후 -80℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 결정되었다. 2-DE 분석을 위해, 7M 우레아, 2M 티오우레아, 2.5%(w/v) DTT 및 4% CHAPS를 함유한 팽창 완충액에서 pH 4-7 IPG 스트립(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 재수화하였다. IPGphor III (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 상기 재수화된 IPG 스트립에 단백질 용해물 (600㎍)을 로딩하고 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) 상에서 2-D 분리를 실시하였다. 5%(v/v) 인산을 함유한 40%(v/v) 메탄올 용액에서 1 시간 동안 겔을 고정시킨 후, 상기 겔을 콜로이드성 쿠마시 블루 G-250 용액 (ProteomeTech, Seoul, Korea)으로 염색하였다. 겔을 탈이온수를 사용하여 탈염색하고 이미지를 이미지 스캐너(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 획득하였다. 이미지 분석은 ImageMasterTM 2D Platinum 소프트웨어 (Amersham Biosciences, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 단백질 스팟의 비교를 위해, 모든 겔에서 25 개 이상의 스팟을 랜드마킹하여 표준화하였다.

트립신을 이용한 겔 내 소화 및 단백질 추출

SDS-PAGE 겔로부터 단백질 밴드를 잘라내어 기존의 절차에 따라 트립신으로 겔을 분해하였다. 요약하면, 단백질 밴드는 염색된 겔에서 잘라내어 조각으로 절단시켰다. 겔 조각을 50%(v/v) 아세토니트릴(ACN)을 함유하는 25 mM 암모늄 바이카보네이트 완충액(pH 7.8)으로 실온에서 1 시간 동안 세척하였다. 원심분리 농축기 (Biotron, Inc., Incheon, Korea)에서 10 분 동안 겔 조각을 탈수시킨 후, 50ng의 sequencing grade trypsin 용액 (Promega, Madison, WI, USA)에서 겔 조각을 재수 화하였다. 37℃에서 밤새 25 mM 암모늄 바이카보네이트 완충액 (pH 7.8)으로 항온 배양한 후, 50%(v/v) ACN을 함유하는 0.5% 포름산(FA) 5㎕로 40 분 동안 초음파 처리하여 트립신에 의한 분해 펩타이드를 추출하였다. 추출된 용액을 원심분리 농축기를 사용하여 농축시켰다. 질량 분광 분석 전에, 펩타이드 용액을 역상 컬럼을 사용하여 탈염시켰다. 요약하면, 10㎕의 5%(v/v) 포름산으로 평형화 단계 후에, 펩타이드 용액을 컬럼에 로딩하고 10㎕의 5%(v/v) 포름산으로 세척하였다. 결합된 펩타이드를 5%(v/v) 포름산과 함께 5㎕의 70% ACN으로 용출시켰다.

LC-MS/MS에 의한 단백질의 동정

LC-MS/MS 분석은 ACQUITY UPLC 및 LTQ-orbitrap-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA)를 통해 수행되었다. 컬럼은 BEH C18 1.7 μm, 100 μm x 100 mm 칼럼 (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 탈이온수 중 0.1 % 포름산이었고, 이동 상 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 크로마토그래피 구배는 21 분 동안 10% B 내지 40% B, 7 분 동안 40% B 내지 95%B, 10 분 동안 90% B 내지 10% B로 직선적으로 증가하도록 설정되었다. 유속은 0.5 μL/min이었다. 탠덤 질량 분석을 위해, 전체 질량 스캔 (300-2000 m/z) 후 MS /MS 스캔으로 데이터-의존적 획득을 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하였다. 획득 한 각 MS/MS 스캔은 LTQ에서 평균 1 마이크로스캔이었다. 이온 전달 관의 온도는 275℃로 조절하였고 분무는 1.5-2.0 kV로 하였다. 정규화된 충돌 에너지는 MS/MS의 경우 35%로 설정되었다. MS/MS의 개별 스펙트럼은 SEQUEST 소프트웨어 (Thermo Quest, San Jose, CA, USA)를 사용하여 처리하였으며, 생성된 피크 리스트는 MASCOT 프로그램 (Matrix Science Ltd., London, UK)을 이용하는 하우스 데이터베이스에서 쿼티하는 데 이용하였다. 본 발명자들은 MS 분석을 위해 메티오닌, 시스테인의 변형, 아르기닌의 메틸화, 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화를 설정하고 펩티드 질량의 허용은 10 ppm이었다. MS/MS 이온 질량 허용은 0.8Da이었고 절단 누락 허용치는 1이었고 데이터 분석을 위해 충전 상태(+2, +3)를 고려하였다. 본 발명자들은 MASCOT 확률 분석에 의해 정의된 유의한 히트만을 취하였다.

웨스턴 블롯팅

본 발명의 방법으로 분리된 가용성 실크 단백질 분획에 의해 유도된 BMP-2/-4의 발현을 분석하기 위해, 세포에 실크 단백질 분획을 1, 5, 10 μg/mL 처리하였다. 단백질을 수득하여 SDS 완충액과 혼합하였다. 열 변성 후, 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 옮겼다. 차단 후, 멤브레인을 1 차 항체(BMP-2/-4, Santa Cruz Biotech)(희석 비=1:500)로 탐침하였다. 블롯을 이미지화하고 ChemiDoc XRS 시스템 (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 정량화하였다.

동물 실험 디자인

본 실시예에서는 8 주령의 Crl:CD(Sprague-Dawley) SPF(specific pathogen-free)/VAF 랫트(Orientbio Inc., Sungnam, Korea)를 사용하였다. 모든 절차는 실험실 동물 관리 지침에 따라 수행되었으며 강릉 원주 대학교 동물 실험 연구소 (GWNU-2018-14)의 승인을 받았다.

실험 전에 20-22℃ 및 습도 40%로 조절된 환경에서 일주일 동안 12 시간 명암 주기하에 22 마리의 랫트(케이지 당 2-3 마리의 쥐)를 사육하였다. 랫트는 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었고 통상적인 권고에 따라 조절 반합성 사료(콩 식물성 기름의 74% 탄수화물, 카세인의 14% 단백질, 표준 비타민과 미네랄 혼합물 보충)를 섭취하였다.

두개관 결손 모델을 제작하기 위하여, 0.4 mL 케타민(ketamine)(100 mg/mL; Ketara; Yuhan, Seoul, 대한민국)과 0.3 mL 자일라진(xylazine)(10 mg/kg body weight; Rompun; Bayer Korea, Seoul, 대한민국)의 조합물을 랫트에게 근육 내 투여하여 일반 마취를 유도하였다. 랫트의 두개골 부위를 제모하고, 포비딘-요오드(povidine-iodine)로 소독하였다. 두개골을 비골(nasal bone)로부터 후두융기(occipital protuberance)까지 종방향으로 절개하고, 골막내에서 정중선 절개를 행하였다. 날카로운 골막하 절개를 행하여 두개골막을 나타나게 하여 두정골을 노출시켰다. 다량의 염수를 흘려보내면서 치과용 관상톱(dental-trephine bur) (직경: 8.0 mm)을 사용하여 양쪽 부위에 전체-두께의 두개골 손상을 유도하였다. 정중선의 각 측면에 하나씩 2개의 9 mm 두께의 심각한 손상을 생성시켰다.

랫트는 세 그룹으로 나누었다. 두개관 결손 외과 수술의 높은 사망률을 고려하여, 각 그룹별로 추가 랫트를 배정하였다. 이식편 물질은 본 발명의 방법에 따라 분리된 세리신-1/3을 함유한 젤라틴 스폰지 (Cutanplast Dental®, Uniplex, Sheffield, 영국) 또는 젤라틴 스폰지 (Cutanplast Dental®)로 구성하였다. 각 이식편에서 세리신-1/-3의 양은 약 50㎍이었다. 그룹 1(대조군)은 마취 및 절개를 받았으나 이식편은 이식받지 않은 6 마리의 동물로 구성되었다. 그룹 2는 젤라틴 스폰지를 처리하였고, 그룹 3은 세리 신을 함유한 젤라틴 스폰지로 처리하였다. 그룹 2는 6 마리, 그룹 3은 10 마리였다. 이식편을 이식한 후 3-0 블랙 실크로 피부와 골막을 동시에 봉합하였다. 수술 후 항생제와 진통제를 투여하였다. 처음 24시에는 그룹 2에서 1 마리, 그룹 3에서 2 마리가 죽었다. 따라서, 그룹 1은 6 마리, 그룹 2는 5 마리, 그룹 3은 8 마리를 수술 후 8 주까지 추적 관찰하였다. 8 주 후, 모든 쥐를 희생시키고, 마이크로-CT 및 조직학적 분석을 수행하였다.

마이크로-컴퓨터 단층 촬영

마이크로-CT 분석을 위해 두개관 샘플(10 x 10 x 0.5 mm)을 한국 기초 과학 연구소(오창, 한국)에 보냈다. 후속 절차는 이전 공개 문헌의 설명에 따라 수행되었다. 요약하면, 동물 PET/CT/ SPECT 시스템 (Inveon Siemens, Malvern, PA, USA)을 분석에 사용하였다. 스캔 이미지는 제공된 소프트웨어 (Inveon Siemens)를 사용하여 재구성되었다. 초기 수술 결손의 크기를 기준으로하여 관심 영역 (ROI)을 결정하였다. ROI에서 뼈의 양(BV)은 25%의 뼈 기준의 한계 수준을 설정하여 계산되었다.

조직 샘플에서의 면역조직화학적 확인 및 웨스턴 블롯 분석

BMP-2/-4의 발현을 평가하기 위해, 항-BMP-2/-4 항체(CAT #: sc-137087, Santa Cruz Biotech)를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 면역조직화학 분석을 위한 절차는 이전 공개 문헌에 개시되어 있다. 간략하게, 절편을 준비하고 단백질 분해 효소(1 mg 돼지 트립신, Sigma-Aldrich)를 사용하여 효소적 분해하였다. 그 다음, 절편을 과산화수소로 처리하였다. 세척 및 차단 단계 후, 절편을 1 차 항체(BMP-2/-4, 1:100)로 처리하였다. 유니버셜 2 차 항체(Dako REAL ™ EnVision™/ HRP, 토끼/마우스, Dako North America Inc.)와 접합시킨 후, 슬라이드를 디아미노벤지딘 발색소 및 하이드로겐 퍼옥시다아제(Dako REAL™ DAB+ Chromogen 및 Dako REAL™ 기질 완충액; Dako North America Inc)의 혼합물로 염색하였다.

실시예 1. 실크 유래 세리신 단백질의 BMP 상향 조절

누에고치 또는 실크는 크게 피브로인과 세리신이라는 두 가지 물질로 구성되어 있다. 그 중에서 피브로인을 둘러싸고 있는 세리신을 제거하는 공정을 정련이라고 한다. 통상적인 정련 방법에는 마르세이유 비누와 탄산나트륨을 등 알칼리성 수용액에 넣고 끓이는 방식, 아스파질러스 등의 단백질 분해효소를 사용하는 정련방법 또는 고온고압솥을 이용하는 고온고압법 등이 있으나, 이러한 통상적인 실크의 알칼리 정련 방법에서는 세리신을 제거한 피브로인을 섬유로 사용하고 나머지 세리신이 포함된 액은 폐수로 버린다.

또한, 이때 폐수로부터 세리신을 추출하기 위해서는 세리신과 다른 물질들을 분리하는 데 상당한 기술과 노력이 필요하고 경제적으로도 그 효율이 낮은 편이어서 일반적으로 행해지고 있는 실크의 알칼리 정련방법으로는 순수한 세리신을 회수하기 용이하지 않을 뿐만 아니라, 분자량 조절 및 난용성 세리신을 용해하기 어려워 수용성 세리신 수거율이 낮고, 처리 시약들로 인해 단백질인 세리신에도 영향을 미친다는 문제점이 있다.

또한, 종래 열수 추출법의 경우, 고온에 의해 단백질이 변성된다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해소하면서, 본 발명의 병용처리를 통해, 세리신 단백질 분획물을 획득하고 이 중, BMP-2/4를 유도하는 능력이 탁월한 고분자량(평균 분자량 30 kDa 이상)의 최소 변성된 세리신 단백질만을 획득할 수 있는 신규한 세리신 단백질 추출 방법으로서, 추출 온도를 제한하면서 초음파에 의한 추출법과 분자량에 따른 분리법을 병용하는 방법을 구축하였다.

이에 따라, 상기 '세포 배양 및 실크 단백질 처리' 방법에서 설명한 방법으로 열에 의한 변성이 거의 되지 않은 단백질 형태의 실크 유래 세리신 단백질을 수득하였고 2D 전기영동 결과를 통해 확인하였다.

즉, 상기 방법을 통해 수득되는 결과물들을 분석하기 위해 2D 전기 영동 및 BMP-2/4에 대한 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.

그 결과, 도 2B 및 2C에 나타낸 바와 같이, 종래 방법으로서 초음파 처리 없이 열수 추출법에 의해서만 정련한 산물을 2D 전기 영동한 것(도 2A)과 비교하여, 추출 온도가 제한된 초음파 처리에 의해 추출된 본 발명의 가용성 분획은 훨씬 더 많은 단백질 스팟을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 도 2A에서의 단백질 분획은 세리신 1인 것으로 확인되었다.

초음파 처리 및 분자량에 따른 분리에 의해 누에고치로부터 수득된 세리신 단백질에 관한 도 2B에서는 10 개의 스팟이 선택되었고 이들에 대한 MALDI-TOF 분석 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대부분이 프로테아제 억제제인 것으로 확인되었다. 또한, 세리신 1과 세리신 3의 위치에 존재하는 밴드는 확인되었으나, 이것들 외에도 다른 단백질 역시 다수 존재하여 골형성 유도 단백질이 어떤 것인지 명확하게 확인할 수 없었다.

반면, 초음파 처리 및 분자량에 따른 분리에 의해 평면견(plain spun silk) 으로부터 수득된 세리신 단백질에 관한 도 2C에서 스팟의 수는 3 개의 스팟으로 감소되었고 이들에 대한 MALDI-TOF 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

즉, 도 2C의 스팟 1은 세리신 1과 세리신 3의 혼합물로 확인되었다. 도 2C의 스팟 3은 세리신 3으로 동정되었다. 스팟 1 및 스팟 3은 원래의 분자량을 고려해 볼 때 세리신 1 및 3 단백질의 단편임을 알 수 있다. 스팟 2는 각질로 밝혀졌으며 오염에 인한 것으로 추정된다.

이러한 결과를 토대로, 본 발명의 방법에 따라 분리된 실크 단백질 유래 세리신 단백질은 세리신-1 및 세리신-3인 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 상술한 바와 같이 추출된 단백질 분획을 RAW264.7 세포에 적용하여 BMP-2/-4 발현을 증가시키는 능력을 조사하였다.

그 결과, 도 2D 내지 2F에 나타낸 바와 같이, 정련 산물의 단백질은 BMP-2/-4의 매우 약한 증가(도 2D)를 보인 반면, 분자량에 따라 초음파 분해 산물을 분리한 경우 분자량이 큰 분획(평균 분자량 30 kDa 이상)은 저 분자량 분획(평균 분자량 30 kDa 미만)보다 높은 수준의 BMP-2/-4 증가를 보였다(도 2E). 또한, 일반 방사 실크의 단백질 분획물(평균 분자량 30 kDa 이상)도 BMP-2/-4 발현 수준이 증가하였다(도 2F).

즉, 본 발명의 방법에 따라 분리된 실크 유래의 고분자량 세리신-1/-3 단백질이 일반적인 정련 산물 처리와 비교하였을 때 BMP-2/-4의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있었으며, 이러한 작용은 뼈 생성작용을 촉진할 것으로 판단된다.

번호	NCBI Blast	단백질명	스코어	종
1	NP_001139719.1	serine protease inhibitor 28	77	Bombyx mori
2	XP_004930020.1	serine/threonine-protein kinase	17	Bombyx mori
3	NP_000217.2	keratin	457	Homo sapiens
4	NP_000217.2	keratin	73	Homo sapiens
5	P00761.1	trypsin	55	Homo sapiens
6	XP_004930446.1	peptidyl-prolyl cis-trans isomerase H	22	Bombyx mori
7	XP_004930446.1	peptidyl-prolyl cis-trans isomerase H	16	Bombyx mori
8	NP_006112.3	keratin	180	Homo sapiens
9	NP_000412.3	keratin	281	Homo sapiens
10	NP_000412.3	keratin	147	Homo sapiens

번호	NCBI Blast	단백질명	스코어	종
1	NP_001108116.1	Sericin 3	161	Bombyx mori
	XP_012547623.1	Sericin 1	148	Bombyx mori
2	NP_000412.3	Keratin	85	Homo sapiens
3	NP_001108116.1	Sericin 3	151	Bombyx mori

실시예 2. 골 손상 모델에서의 본 발명의 방법에 따라 분리된 고분자량(평균 분자량 30 kDa 이상) 세리신-1/-3 단백질에 의한 골 재생 효과

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 확인된 고분자량(평균 분자량 30 kDa 이상)의 세리신-1/-3 단백질의 골 재생 효과를 입증하기 위하여, 골 손상 모델을 제작하여 처리하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군(Gelatin with sericin)은 젤라틴 스폰지를 넣지 않은 대조군(unfilled control) 또는 젤라틴-단독 스폰지 군(Gelatin only)에 비해 더 높은 골 재생률을 보였다. 뼈의 양(BV; bone volume)은 각각 젤라틴 스폰지를 넣지 않은 대조군의 경우 0.51 ± 0.40; 젤라틴-단독 스폰지 군의 경우 3.13 ± 2.27; 및 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군의 경우 8.48 ± 3.97 mm³이었다. 이러한 뼈의 양(BV)을 비교했을 때, 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P <0.001). 또한, post-hoc test에서 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군과 다른 군의 차이는 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(젤라틴 스폰지를 넣지 않은 대조군 및 젤라틴-단독 스폰지 군의 경우 P <0.001과 0.015).

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군에서 새로운 뼈 형성이 두드러졌으며, BMP-2/-4의 면역 염색 결과는 다른 그룹에 비해 본 발명의 방법에 의해 분리된 세리신 분획이 함유된 젤라틴 스폰지 군에서 더 높은 발현을 보였다.

즉, 본 발명의 방법에 따라 분리된 실크 유래의 고분자량 세리신-1/-3 단백질을 골 손상 모델의 골 결손 부위에 이식하는 경우, 탁월한 골 재생 효과를 발휘하여 골 손상 및 결손 부위를 빠르게 회복시켰다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 다음 단계를 포함하는, 실크로부터 유래된, 골 재생용 세리신-1 단백질 단편 및 세리신-3 단백질 단편의 제조 방법:
   (a) 누에고치(cocoon) 또는 평면견(plain spun silk mat)에 65℃ 온도에서 40 KHz의 초음파를 처리하여 수용성 실크 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 분획된 단백질 분획으로부터 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 단백질(XP_012547623.1) 단편 및 세리신-3 단백질(NP_001108116.1) 단편을 분리수득하는 단계로서,
   상기 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 단백질(XP_012547623.1) 단편 및 세리신-3 단백질(NP_001108116.1) 단편은, BMP(Bone morphogenic protein)-2 및 BMP(Bone morphogenic protein)-4의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 단백질(XP_012547623.1) 단편, 세리신-3 단백질(NP_001108116.1) 단편 및 생체적합성 결합제인 젤라틴;을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 치료제로서,
   상기 골 재생용 치료제는 BMP(Bone morphogenic protein)-2 및 BMP(Bone morphogenic protein)-4의 발현을 증가시키며;
   상기 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 단백질(XP_012547623.1) 단편 및 세리신-3 단백질(NP_001108116.1) 단편은 다음 단계에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는, 골 재생용 치료제:
   (a) 누에고치(cocoon) 또는 평면견(plain spun silk mat)에 65℃ 온도에서 40 KHz의 초음파를 처리하여 수용성 실크 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 분획된 단백질 분획으로부터 평균 분자량 30 kDa 이상의 세리신-1 단백질(XP_012547623.1) 단편 및 세리신-3 단백질(NP_001108116.1) 단편을 분리수득하는 단계.
   
8. 삭제
9. 제7항에 있어서,
   상기 골 재생용 치료제는 골 결손 부위에 직접 주입하거나 생체주입가능한 형태의 이식재에 충진하여 주입할 수 있는 것을 특징으로 하는, 골 재생용 치료제.
10. 삭제

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