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Hintergrund der Technik
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Die
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Protein-Cocktails,
der aus Knochen gewonnen wird, durch eine Guanidinhydrochloridproteinextraktion
von entmineralisierten Knochenpartikeln, zur Verwendung bei der
Behandlung von Wunden.
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Die
Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der mehrere Zelltypen und
Wachstumsfaktoren für
ein effektives Verschließen
umfasst. Der normale Wundheilprozess kann grob in drei Stufen klassifiziert
werden, nämlich
die Entzündungs-,
Proliferations- und Maturations-Phasen. Die Entzündungs-Phase dauert 0-2 Tage und umfasst eine
ordnungsgemäße Rekrutierung
von Zellen an dem Wundbereich. Danach folgt die 2-6-Tage-Proliferationsphase,
in der Fibroblasten, Keratinozyten und andere Zellen in dem Wundenbett
beginnen, aktiv zu wuchern, um die Wunde zu schließen. Die
Maturationsphase folgt der Proliferationsphase, und hat ihre Spitze
bei 21 Tagen, zu welcher Zeit die Wunde vollständig durch Neustrukturieren
des anfänglichen
Narbengewebes verheilt ist.
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Eine
problematische Wunde folgt nicht dem normalen Zeitplan für den Heilungsprozess,
wie oben beschrieben wurde. Eine problematische Wunde folgt dem
normalen Heilungsprozess aus einer Anzahl von Gründen möglicherweise nicht, die unter
anderem Ernährung,
Gefäßzustand,
metabolische Faktoren, Alter, Immunzustand, Medikamententherapie,
neurologischen Zustand und psychologischen Zustand umfassen. Verschiedene
lokale Faktoren spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Wundheilung,
und umfassen das Vorhandensein von nekro tischem Gewebe in dem Bereich,
Infektion, Vorhandensein von Fremdkörper, Grad der Austrocknung,
Vorhandensein von Ödemen,
Druck, Reibung, Scher-Mazeration und Dermatitis.
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Aus
Wundflusszusammensetzungsstudien geht hervor, dass Wachstumsfaktoren
in allen drei Phasen der Wundheilung eine wichtige Rolle spielen.
Die Zelltypen, die an den Wundbereich hin erneuert werden, sezernieren
Wachstumsfaktoren, die bei dem Wundheilungsprozess helfen und denselben
fördern.
Blutplättchen sind
z. B. der erste Zelltyp, der an der Wundstelle erneuert wird, und
initiiert den Wundheilungsprozess durch Sezernieren von Wachstumsfaktoren
(d. h. aus Blutplättchen
gewonnene Wachstumsfaktoren, oder PDGF; platelet derived growth
factor), die für
andere Zellentypen chemotaktisch sind. Dadurch helfen die Blutplättchen bei
der Rekrutierung und Proliferation von zusätzlichen Zellentypen, die die
Synthese von neuem Gewebe fördern.
Zusätzlich
zu den oben erwähnten
funktionalen Eigenschaften haben Wachstumsfaktoren auch die Fähigkeit,
die Proteinsynthese innerhalb der Zelle zu regulieren und die intrazelluläre Signalisierung
zu steuern, wodurch sie es Zellen ermöglichen, miteinander zu kommunizieren.
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Da
die Wundheilung ein komplexer Prozess ist, der die Bildung von Bindegewebe
und neuen Blutgefäßen umfasst,
um den Wundort zu nähren,
ist es offensichtlich, dass verschiedene Wachstumsfaktoren ins Spiel
kommen. Bei chronischen Wunden besteht ein Anstieg an Kollagenaseaktivität und höhere Pegel
von Entzündungszytokinen.
Zusätzlich
dazu liegt eine Abwesenheit von Wachstumsfaktoren in der Wundflüssigkeit vor,
was verursacht, dass die Zellen mitotisch inkompetent sind. Alle
diese Faktoren verursachen eine beeinträchtigte Wundheilung. Einiger
dieser Faktoren wurden in vorklinischen Tiermodellen sowie in der
Klinik studiert. Die meisten Wachstumsfaktorstudien, die den Wundheilungsprozess
umfassen, umfassen Tests im Bereich von 20 bis 25 Tagen, was dem
normalen Wundheilungsprozess angemessen darzustellen scheint. Es wird
jedoch nun erkannt, dass längere
Studienperioden von bis zu sechs Monaten oder länger vorteilhaft wären, um
ein 100%iges Verschließen
von problematischen Wunden zu erzielen.
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Der
einzige FDA-anerkannte Wachstumsfaktor zur Verwendung bei der Wundheilung
in der Klinik ist der von Blutplättchen
abstammende Wachstumsfaktor (PDGF; platelet derived growth factor),
vertrieben von Ortho-McNeil Pharmaceutical als REGRANEX(r). REGRANEX(r)
enthält
Becaplermin, einen rekombinanten von menschlichen Blutplättchen abstammenden
Wachstumsfaktor (rhPDGF-BB; recombinant human platelet-derived growth
factor) zur lokalen Anwendung. Becaplermin wird erzeugt durch die
DNA-Rekombinationstechnik durch Einfügung des Gens für die B-Kette
des von Blutplättchen
abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF) in Hefe. Becaplermin weist
ein Molekulargewicht von ungefähr
25 KD auf und ist ein Homodimer, bestehend aus zwei identischen
Polypeptidketten, die durch Disulfidverbindungen aneinander gebunden
sind. REGRANEX(r) ist ein nichtsteriles topisches auf bewahrter
Natrium-Carboxymethylzellulose basierendes (auf CMC basierendes;
CMC = Carboxymethylzellulose) topisches Gel, das die aktive Substanz
Becaplermin und die inaktiven Substanzen Natriumchlorid, Natriumacetattrihydrat,
Eisessig, Wasser zur Injektion und Methylparaben, Propylparaben
und m-Cresol als Konservierungsmittel und 1-Lysin-Hydrochlorid als
Stabilisator enthält.
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Studien
verschiedener Wachstumsfaktoren im Wundheilungsprozess wurden ausgeführt. Einige
der Ergebnisse dieser Studien sind nachfolgend zusammengefasst:
- 1) PDGF-BB (der Wachstumsfaktor bei REGRANEX®)
ist ein Chemoattraktant für
Neutrophile, Monozyten und Fibroblasten. Bei Wundheilungsanwendungen
hat er die extrazelluläre
Matrixdeposition erhöht
und die Proliferation von Fibroblasten verbessert. PDGF ist jedoch
kein Angingen. Somit sind zusätzliche
Wachstumsfaktoren für
die Gesundpflege der Neodermis erforderlich.
- 2) Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF; Fibroblast Growth Factor)
erhöht
Kapillardichte und Proliferation von Fibroblasten. Eine lokale Anwendung
in Gelform wurde getestet und es hat sich gezeigt, dass keine systemische
Absorption des Proteins erfolgte (< 1
% der erfassten Dosis).
- 3) Transformations-Wachstumsfaktor β-2 (TGF β-2; TGF = transforming growth
factor) ist ein Wachstumsfaktor, der die Proliferation von verschiedenen
Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo verbessert und bei der
venösen
Geschwürheilung
und bei diabetischen Fußgeschwürversuchen
getestet wurde. Bei einer 2-Arm-Klinikstudie
wurde eine 40%ige Reduzierung der Wundengröße im Vergleich zu der Vergleichswunde
innerhalb von sechs Wochen beobachtet, bei Anwendung von 0,5 μg/cm2. Bei einer 3-Arm-Klinikstudie jedoch, als
2,5 μg/cm2 für
einen Vergleich gegenüber
einem standardmäßigen XEROFORMTM-Verband getestet wurde, waren die Ergebnisse
nicht sehr ermutigend.
- 4) Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF; epidermal growth factor),
erzeugt durch Blutplättchen
und Makrophagen, ist ein Mitogen für Epithelzellen. Dieser Wachstumsfaktor
wurde zuerst bei Verbrennungspatienten getestet und die anfänglichen
Ergebnisse waren viel versprechend. Bei Tests an Freiwilligen jedoch
bestand kein Unterschied zwischen Wachstums faktorbehandlungen und
Placebo. Dies könnte
an der Tatsache liegen, dass EGF nicht gut ist für die Migration von Keratinozyten,
aber ein gutes miotisches Mittel ist.
- 5) Keratinozyt-Wachstumsfaktor-2 (KGF-2; Keratinocyte Growth
Factor-2) wurde im Hinblick auf dessen Fähigkeit getestet, Ephithelialisation
zu verstärken.
An Tag 6 waren die Lücken
geschlossen. KGF-2 fördert eine
Re-Ephithelialisation bei jungen und alten Tieren, was indirekte
Mechanismen für
eine Neogranulations-Gewebebildung suggeriert. Xia Y. D. u. a.,
J. Pathol. (1999) 188: 431-438. Es besteht erhöhter Widerstand gegen mechanische
Belastung von geheilten Wunden; somit kann KGF-2 nützlich für die Behandlung von
Operationswunden sein. Jiminez, P. A. & Rampy, M. A., (1999) J. Surg. Res.
81: 238-242.
- 6) Bindegewebs-Wachstumsfaktor (CTGF; connective tissue growth
factor) ist ein sezernierter, mitogenischer, chemotaktischer und
zellmatrix-induzierender Faktor, codiert durch ein direktes Früh-Wachstums-ansprechendes
Gen. Die Beteiligung von CTGF an menschlicher Atherosklerose und
fibrotischen Störungen
suggeriert eine Rolle bei der Geweberegeneration wie der Wundwiederherstellung,
aber auch bei der aberranten Deposition von extrazellulärer Matrix.
Tatsächlich
wurden Anti-CTFG-Antikörper
verwendet, um die fibrotische Kaskade zu blockieren.
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Studien
an der Kinetik der Aktion von verschiedenen Wachstumsfaktoren haben
gezeigt, dass einige Wachstumsfaktoren, wie z. B. der Granulozyt-Monozyt-Kolonie-Stimulationsfaktor
(GMCSF; granulocyte-monocyte colony stimulation factor) und der
Rinder-FGF sequentiell agierten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass
eine Kombination aus Wachstumsfaktoren besser wäre als eine Behandlung mit
einem einzelnen Wachstumsfaktor. Bei Tiermodellen jedoch hat eine
Kombination dieser zwei Faktoren den regenerativen Prozess tatsächlich verlangsamt
und die Heilung hat nie 100 % erreicht. Somit wurde eine sequentielle
Lieferung dieser Faktoren angestrebt: GMCSF wurde zuerst verabreicht
gefolgt von der Lieferung von FGF 25 Tage später. In einer einzelnen Studie
konnte keine Verbesserung gegenüber
dem Vergleich demonstriert werden.
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Bei
einer wiederum anderen Studie, die TGF-β, bFGF (Basis-FGF) und CTGF kombiniert,
hat sich herausgestellt, dass TGF-β1, TGF-β2 oder TGF-β3 nach 3 Tagen durchgehender
Injektion eine Hautfibrose verursachten, die Änderung aber vorübergehend
war und nach 7 Tagen kontinuierlicher Injektion verschwand. Im Gegensatz
dazu wurde eine irreversible Fibrose nach einer gleichzeitigen Injektion
von TGF-β und
bFGF oder TGF-β und
CTGF beobachtet, oder einer TGF-β-Injektion für die ersten
3 Tage gefolgt von bFGF- oder CTGF-Injektion für die nächsten 4 Tage. Diese Beobachtungen
suggerieren, dass TGF-β1
Hautfibrose induziert und bFGF oder CTGF verschiedene haut-fibrotische
Erkrankungen beibehält.
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Eine
andere Art und Weise zum Erhalten von Wachstumsfaktormischungen
zog die Verwendung eines Blutplättchen-Releasats
in Betracht, das eine Sammlung aus Wachstumsfaktoren enthält, gelöst aus Blutplättchen,
gewonnen aus Blut. Die Vorteile dieses Materials sind, dass es autolog
oder homolog ist und ohne weiteres verfügbar ist und vermutlich die
erforderlichen Faktoren in dem richtigen Verhältnis enthält. Bis jetzt bestand, obwohl
eine gewisse Verbesserung in dem Heilungsprozess anfänglich beobachtet
wurde, nach 24 Wochen kein Unterschied zwischen Wachstumsfaktor-
und Placebo-Behandlungen.
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Die
US-A-6054122 offenbart
die Verwendung eines Gewebe-Dichtungsmittels
oder Fibrinklebers zur Verwendung bei der Wundheilung, der eine
Zusammensetzung enthält,
die zumindest zwei Wachstumsfaktoren aufweist, wie z. B. BMP3, TGF-beta und FGF-1. Ferner
offenbart das Dokument die Verwendung eines Gewebedichtungsmittels
oder Fibrinklebers, der eine entmineralisierte Knochenmatrix enthält.
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Die
US-A-5116738 offenbart
eine BMP-3-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung (und
Gewebereparatur), die andere Wachstumsfaktoren aufweisen kann, wie
z. B. die BMP-Ptroteine,
FGF und TGF.
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Die
US-A-5141905 offenbart
eine BMP-7-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung (und
Gewebereparatur), die andere Wachstumsfaktoren aufweisen kann, wie
z. B. den BMP-3,
FGF und TGFbeta (TGFbeta-1, -2, -3).
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Die
US-A-5187076 offenbart
eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung,
die zusätzlich
zu BMP-6 BMP-3, TGF-beta und FGF aufweist.
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Die
WO-A-9641818 offenbart
die Verwendung eines aus Chitin gewonnenen Hydrogels, das eine Zusammensetzung
enthält,
die zumindest einen Wachstumsfaktor aufweist, der BMP1-8, FGF-1
und TGFbeta aufweist, das eine Wundheilung fördert. Ferner offenbart das
Dokument die Verwendung eines aus Chitin gewonnenen Hydrogels, das
eine entmineralisierte Knochenmatrix enthält (DMB enthält BMP3,
TGFbeta-2 und FGF-1) zur Verwendung bei der Wundheilung. Ferner
wird die Formulierung und Lieferung von TGFbeta-2 aus Fibrin-Dichtungsmittel
zur Wundheilung beschrieben.
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Die
EP-A-0747066 offenbart
die Verwendung von auf Kollagen basierenden, biokompatiblen Haftmittel-Zusammensetzungen,
die Kombinationen oder Mischungen aus zwei oder mehr Wachstumsfaktoren
enthalten, ausgewählt
aus der Gruppe von TGF-beta-1,
-2, -3; BMP1-9 und FGFs zur Förderung
der Wundheilung.
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Die
US-A-5356630 offenbart
eine Mischung aus wasserlöslichen
Osteogenproteinen (einschließlich BMP1-8),
die aus entmineralisierter Knochenmatrix gewonnen werden, TGF-beta
und FGF zur Wundheilung.
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Es
ist somit offensichtlich, dass, obwohl verschiedene Polypeptidwachstumsfaktoren
eine wesentliche biologische Aktivität bei vor-klinischen Wundreparaturmodellen
zeigten, der einzige Wachstumsfaktor, der sich als effektiv in der
Klinik herausgestellt hat, der humane, rekombinante PDGF-BB ist.
Dies kann liegen an schlechter Lieferung, Medikamen teninstabilität oder der
Unfähigkeit
eines einzelnen Faktors, den komplexen Prozess der Wundheilung zu
orchestrieren. Eine effektive Behandlung sollte Punkte adressieren,
wie z. B. Angiogenese, effiziente Kollagendeposition und ordnungsgemäße Epithelisation
zum Schließen
der Wunde.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung weist einen Proteincocktail auf, der aus Knochen gewonnen
wird, durch eine Guanidinhydrochloridproteinextraktion aus entmineralisierten
Knochenpartikeln zum Verbessern des Wundheilungsprozesses bei lebenden
Tieren, die menschliche Versuchspersonen umfassen. Bei bevorzugten
Ausführungsbeispielen
weist die Erfindung eine Mischung aus Wachstumsfaktoren auf, die
den Wundheilungsprozess verbessern. In diesem Kontext beziehen sich
die Ausdrücke „ausschließend", „Ausschluss" oder „ausgeschlossen" auf die Entfernung
von im Wesentlichen der Gesamtheit einer angezeigten Komponente
zu dem Ausmaß,
dass eine solche Komponente aus einer Mischung mit Inmmunoaffinitäts-Chromatographie
entfernt werden kann oder anderweitig nicht in der Mischung enthalten
ist. Der Ausdruck „pharmazeutisch
akzeptabler Träger" wird hierin in dem
allgemeinen Sinn des Ausdrucks verwendet und umfasst alle bekannten
Träger,
einschließlich Wasser.
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Kurz
gesagt wird der Cocktail durch Guanidinhydrochloridproteinextraktion
aus entmineralisierten Knochenpartikeln vorbereitet. Die Extraktlösung wird
gefiltert und einem zweistufigen Ultrafiltrationsprozess unterzogen.
Bei dem ersten Ultrafiltrationsschritt wird eine Ultrafiltrationsmembran
verwendet, die eine Molekulargewichtssperre (MWCO; molecular weight
cut off) von 100 kD aufweist. Das Retenat wird verworfen und das
Filtrat wird einem zweiten Ultrafiltrationsschritt unter Verwendung
einer Ultrafiltrationsmembran unterzogen, die eine nominale MWCO
von etwa 10 kD aufweist. Das Retenat wird dann einer Diafiltration
unterzogen, wobei Guanidin durch Harnstoff ersetzt wird. Die Protein-enthaltende
Harnstofflösung
wird dann einer sequentiellen Ionenaustauschchromatographie unterzogen,
zuerst einer Anionenaustauschchromatographie gefolgt von einer Kationenaustauschchromatographie.
Die osteoinduktiven Proteine, die durch den obigen Prozess erzeugt
werden, werden dann einer HPLC mit einer präparativen VYDACTM-Säule unterzogen
und mit einem flachen ansteigenden Gradienten von Acetonitril eluiert.
Einminutenfraktionen des HPLC-Säuleneluats
werden gesammelt, um den BP-Cocktail zu erzeugen (die Fraktionanzahl
kann etwas im Hinblick auf Lösungszusammensetzung,
Harzgröße, Volumen
der Herstellungscharge etc. variieren). Ein Ausführungsbeispiel des BP-Cocktails
ist charakterisiert, wie in 1-6 gezeigt
ist. Absolute und relative Beträge
der Wachstumsfaktoren, die in dem BP-Cocktail vorhanden sind, können durch
Sammeln unterschiedlicher Fraktionen des HPLC-Eluats variiert werden.
Bei einem bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Fraktionen 29-34
gesammelt. Es wird ferner berücksichtigt,
dass bestimmte Proteine aus der BP-Mischung ausgeschlossen sein
können,
ohne die Wundheilungsaktivität
zu beeinträchtigen.
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BP
wurde ursprünglich
als eine Mischung aus Proteinen bekannt, die bekannterweise eine
osteogene Aktivität
aufweist. Es enthält
jedoch eine Mehrzahl von Wachstumsfaktoren und ist stark angingen.
Genauer gesagt enthält
BP eine Anzahl von Knochen-morphogenetischen Proteinen (BMPs; bone
morphogenetic proteins), die BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und
BMP-7 sowie TGF-β1,
TGF-β2 und
TGF-β3 einschließen. FGF-1
ist auch in der Mischung enthalten. Das Vorhandensein von jedem
der vorangehenden Proteine wurde unter Verwendung von Immunoblottechniken
erfasst, wie in 14 gezeigt ist. Als BP in einem
Tiermodell getestet wurde, um zu bestimmen, ob es bei der Unterstützung des
Wundschlusses wirksam ist, wurde überraschenderweise entdeckt,
dass BP die Wundheilung fördert,
obwohl es ein grundlegend unterschiedlicher Prozess zur Osteogenese
ist.
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Die
Proteinzusammensetzungen der Erfindung können vorteilhaft mit herkömmlichen
Wundverbänden kombiniert
werden, die primäre
und sekundäre
Verbände
umfassen, Nass-zu-Trocken-Verbände, absorbierende
Verbände,
nichthaftende Verbände,
semipermeable Verbände,
transparente Verbände,
Hydrocolloidverbände,
Hydrogele, Schaumverbände,
Alginatverbände,
Operationstapes und ähnliches,
wie es für
die jeweilige Art der behandelten Wunde geeignet ist.
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Zusammensetzungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
ferner mit einer Vielzahl von anderen aktiven Bestandteilen kombiniert
werden, wie z. B. Aloe Vera, Arginin, Glutamin, Zink, Kupfer, Vitamin
C, B-Vitaminen und andere Nahrungsergänzungen, Antibiotika, Antiseptika,
antifungalen Mitteln, desodorierenden Mitteln und ähnlichem.
Ausführungsbeispiele
der Erfindung können
ferner mit einer Vielzahl von entzündungshemmenden Mitteln kombiniert
werden, die die Aktion von entzündungsfördernden
Zytokinen hemmen, wie z. B. Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrose-Faktor-Alpha.
Viele solche Hemmstoffe sind weitläufig bekannt, wie z. B. IL-1Ra,
löslicher
TGF-β-Rezeptor,
Kortikosteroide, und es wird davon ausgegangen, dass in Zukunft
weitere entdeckt werden.
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Das
Vorhandensein einer Anzahl von Proteinen, von denen man ausgeht,
dass sie keine Wachstumsfaktoraktivität aufweisen, wurde in BP erfasst.
Dementsprechend können
diese Proteine, die Histon-Proteine, Ribosomal-Proteine oder beide
umfassen, aus Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen
werden. Alternativ kann die Zusammensetzung die BP-Mischung isoliert
aufweisen, wie in den
U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 ,
5,371,191 und
5,563,124 beschrieben ist, wie in
2 und
3 gezeigt
ist (Bahnen innerhalb des Kastens gesammelt, um BP zu ergeben).
Histone und Ribosome können
aus dem BP ausgeschlossen werden, z. B. durch Antikörperbindung
oder andere Techniken, die in der Technik bekannt sind. Zusätzlich dazu
kann die Zusammensetzung von Stoffen eine oder mehrere der aufgelisteten,
aktiven Komponenten enthalten, die als ein rekombinant erzeugtes
Protein geliefert werden. Vorzugsweise sind die Komponenten aus
einer natürlichen
Quelle isoliert und sind zumindest teilweise phosphoriliert und
glykosiliert.
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Bei
einem anderen Ausführungsbeispiel
werden die obigen Zusammensetzungen bei Wundheilungsanwendungen
zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet. Der pharmazeutisch
akzeptable Träger
umfasst Verbände,
wie z. B. Hydrocolloidverbände,
Hydrogele, Schaumverbände
und Alginatverbände.
Zusätzliche
aktive Bestandteile können
Arginin, Glutamin, Zink, Kupfer, Vitamin C, Vitamin B1, Vitamin
B2, Vitamin B3, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure oder Wachstumsfaktoren
umfassen, wie z. B. einen epidermalen Wachstumsfaktor, aus Plättchen gewonnenen
Wachstumsfaktor, isolinähnlichen
Wachstumsfaktor, Keratinozyten-Wachstumsfaktor,
vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor-Alpha,
Nervenwachstumsfaktor, Bindegewebswachstumsfaktor und Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierenden
Faktor. Entzündungshemmer,
wie z. B. Interleukin-1-Hemmer, Interleukin-6-Hemmer und Tumornekrosis-Faktor-Alpha-Hemmer
können
auch zu der Zusammensetzung hinzugefügt sein. Natürlich können auch
Schmerzmittel, Desinfektionsmittel, Antibiotika und andere aktive
Bestandteile, die für
bestimmte Wundanwendungen geeignet sind, ebenfalls hinzugefügt sein.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
eine SDS-PAGE einer Proteinmischung gemäß der vorliegenden Erfindung,
sowohl in reduzierter als auch nicht reduzierter Form.
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2 ist
ein SDS-PAGE-Gel aus HPLC-Fraktionen 27-36 einer Proteinmischung
gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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3 ist
ein SDS-PAGE-Gel mit identifizierten Bändern, angezeigt gemäß der Legende
aus 4.
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4 ist
ein SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, wobei die identifizierten Bänder angezeigt
sind, wie in der Legende vorgesehen ist.
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5 ist
ein zweidimensionales (2-D) SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, wobei interne Standards durch Pfeile
angezeigt sind.
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6 ist
ein 2-D-SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, wobei eingekreiste Proteine wie in der
Legende identifiziert sind.
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7A-O
sind Massenspektrometerergebnisse für typische Fragmente von eindimensionalen
(1-D) Gelen einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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8 ist
ein 2-D-Gel-Westernblot einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper.
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9A-D
sind 2-D-Gel-Westernblots einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet mit angezeigten Antikörpern. 9A zeigt
das Vorhandensein von BMP-3 und BMP-2 an. 9B zeigt
das Vorhan densein von BMP-3 und BMP-7 an. 9C zeigt
das Vorhandensein von BMP-7 und BMP-2 an und 9D zeigt
das Vorhandensein von BMP-3 und TGF-β1 an.
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10 ist
ein PAS- (periodisch Säure-Schiff-)
gefärbtes
SDS-PAGE-Gel von HPLC-Fraktionen einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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11 ist
ein Anti-BMP-7-gefärbtes
SDS-PAGE-Gel einer PNGase-F-behandelten Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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12 ist
ein Anti-BMP-2-gefärbtes
SDS-PAGE-Gel einer PNGase-F-behandelten Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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13A-B sind Balkendiagramme, die die Explantatmasse
von glykosilierten Komponenten in einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung (13A)
und ALP-Einstufung (13B) derselben Komponenten zeigen.
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14 ist
ein Diagramm, das eine Antikörper-Auflistung
und -reaktivität
zeigt.
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15A-B weisen zusammen ein Diagramm auf, das tryptische
Fragmentsequenzierungsdaten für Komponenten
einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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16A-F zeigen zusammen ein Diagramm, das tryptische
Fragmentmassenspektrometriedaten für Komponenten einer Proteinmischung
gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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17A-B sind ein SDS-Gel (17B)
und eine Abtast-Densitometer-Abtastung
(17A) desselben Gels für eine Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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18 ist
ein Diagramm, das die relative Masse, aus Abtast-Densitometer-Quantifizierung,
von Proteinkomponenten in einer Proteinmischung gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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19A-D zeigen zusammen ein Diagramm, das Massenspektrometriedaten
von verschiedenen Proteinfragmenten aus 2-D-Gelen einer Proteinmischung
gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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BEISPIEL 1. BP IN EINZELDOSISANWENDUNG
AN NACKTEN MÄUSEN
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Eine
Einzeldosisanwendung von BP an Wunden voller Dicke bei nackten Mäusen bedeckt
mit menschlichen vernetzten Hauttransplantaten in Teildicke ergab
eine vollständige
Wundheilung und schneller als Wunden, die die Wachstumsfaktormischung
nicht erhielten. Obwohl die spezifische Art und Weise, in der die
Wachstumsfaktoren bei BP den Wundheilungsprozess beeinflussen, nicht
vollständig
verständlich
ist, wird hypothetisch angenommen, dass die synergistische Aktion
der multiplen Wachstumsfaktoren, die in BP vorhanden sind, der Wunde
helfen, sich besser zu erholen als jene bei Vergleichstieren, die
nur den Träger
erhalten haben.
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Wunden
voller Dicke wurden bei nackten Mäusen derart erzeugt, dass der
Wundbereich ungefähr
20 % der Gesamtkörperoberfläche betrug.
BP wurde vorbereitet wie in den
U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 ,
5,371,191 und
5,563,124 und an die Wunde bei einem
Povidonträger
angewendet. Die Wunde wurde dann mit menschlichen vernetzten Hauttransplantaten
in Teildicke abgedeckt. Die Vergleichstiergruppe erhielt nur den Povidonträger. Die
Transplantatstellen wurden verbunden und mit Pflastern verschlossen,
um den Verband sicher an Ort und Stelle zu halten. Die ersten Verbandwechselungen
wurden an Tag 5 nach der Operation und danach jeden dritten Tag
ausgeführt.
Das Basisprotokoll ist ferner beschrieben in „Clinical and Experimental Approaches
to Dermal and Epidermal Repair: Normal and Chronic Wounds", S. 429-442 (1991)
Wiley-Liss, Inc. und Cooper M. L. u. a., The Effects of Epidermal
Growth factor and basic Fibroblast Growth factor an Ephithelialization
of Meshed Skin Graft Interstices, Prog. Clin. Biol. Res. (1991)
365: 429-42. Solche Protokolle sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
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Die
Ergebnisse waren sehr ermutigend. Einzelanwendungen von zwei Konzentrationen
(entweder 100 μg/Wundstelle
oder 200 μg/Wundstelle)
des Wachstumsfaktors wurden getestet. Es bestand kein Unterschied weder
in Geschwindigkeit noch Grad der Wundheilung zwischen den zwei Gruppen.
Es bestand jedoch eine starke Differenz zwischen der Gruppe aus
Tieren, die die Wachstumsfaktorbehandlung erhielt, und den Vergleichstieren,
die den Wachstumsfaktor nicht erhielten. An Tag 11 nach der Operation
wurde ein 95%iger Wundschluss bei den Tieren beobachtet, die den
Wachstumsfaktor erhielten, wohingegen die Vergleichstiere nur 74
% Wundschluss zeigten. An Tag 14 nach der Operation zeigten alle
mit Wachstumsfaktor behandelten Tiere 100 % Wundschluss, während die
Vergleichstiere nur 85 % Wundschluss bis Tag 20 nach der Operation zeigten.
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Die
Dicke der Epithelschicht bei BP-behandelten Wunden war wesentlich
höher bei
mit BP behandelten Tieren im Vergleich zu den Vergleichstieren,
wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Die Daten stellen die Dicke der Neodermis
in mm gemessen an Tag 11 für
die BP-behandelten Tiere und Tag 16 für die Vergleichstiere dar,
so dass Messungen bei entsprechenden Schritten der Heilung ausgeführt wurden.
Die histologische Analyse zeigte, dass die Wunden durch die menschlichen
Zellen aus dem transplantierten Material geschlossen wurden und
eine Kollagenablagerung in den geschlossenen Wunden vorlag, wie
gezeigt ist durch Involukrin- und Kollagen-Typ-1 Immuno-histologische Färbung (Daten
nicht gezeigt). Die Kapillardichte in dem Wundbett nach der BP-Behandlung
war ebenfalls wesentlich höher
zur Zeit des Wundschlusses im Vergleich zu unbehandelten Vergleichen,
wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Ferner bestand bei den mit der niedrigeren
BP-Dosierung behandelten
Tieren eine wesentliche Erhöhung
bei dem Zählwert
bei der glatten Muskelzelle (SMC; smooth muscle cell) bei BP-behandelten
Wunden im Gegensatz zu den Vergleichen, wie ebenfalls in Tabelle
1 gezeigt ist. Tabelle 1. Wunddicke, Kapillarzahl und
SMC-Zahl für
BP- und Vergleichs-behandelte
Wunden.
| | Behandlung
Vergleich |
| | 100 μg BP (n =
5) | 200 μg BP (n =
5) | Vergleich
(n = 10) |
| Epitheldicke
(mm) | 1,60 ± 0,12
(P < 0,001) | 1,55 ± 0,09
(P < 0,001) | 1,1 ± 0,25 |
| Kapillare/Feld | 37 ± 6 (P < 0,01) | 35 ± 7 (P < 0,01) | 25 ± 5,9 |
| SMC-Zahl
Feld | 53 ± 3,5 (P < 0,001) | 46,8 ± 4,4 (P < 0,05) | 46 ± 5,8 |
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Zusammenfassend
war eine Einzeldosisanwendung von BP effektiv beim Reduzieren der
Heilzeit einer Wunde voller Dicke bei nackten Mäusen, mit transplantierter
menschlicher vernetzter Haut in Teildicke. Zusätzlich dazu war die Dicke der
Neodermis und die Dichte der Kapillaren bei den behandelten Wunden
bedeutend höher
im Vergleich zu der Vergleichstiergruppe. Im Gegensatz dazu hat
sich gezeigt, dass bFGF, auch ein angiogener Wachstumsfaktor, eine
nachteil hafte Wirkung auf die Epithelisierung hatte, wie bei einem ähnlichen
Tiermodell getestet wurde. (Cooper, M. L. u. a., 1991; Clinical
and experimental approaches to dermal and epidermal repair: normal
and chronic wounds, S. 429-442; Weilly-Liss, Inc.)
-
BEISPIEL 2. BP BEI HYDROGEL
-
Eine
kleine Anzahl von Tieren (n = 3) wurde mit BP behandelt, gelöst ist einem
Hydrogel (Carboxy-Methyl-Zellulose), bei demselben Tiermodell, wie
oben beschrieben wurde. Bei dieser Studie wurde beobachtet, dass
die Wunden (n = 2), die mit BP in dem Hydrogel behandelt wurden,
schon 5 Tage nach der Operation eine Initiierung einer Epithelisierung
zeigten, im Vergleich zu den Wunden, die mit BP gelöst in 1
% Povidon behandelt wurden, die erst 8 Tage nach der Operation (POD
8; POD = post operation day = Tag nach der OP) eine Initiierung
der Epithelisierung zeigten (Daten nicht gezeigt). In beiden Fällen zeigten
Vergleichstiere, die den Träger
allein erhielten, bis Tag 8 nach der Operation keine Initiierung
einer Epithelisierung. Eine detaillierte Histologie wird an den
Gewebeproben ausgeführt,
um die Dicke der Neodermis und den Grad der Angiogenese in den Wunden
zu bestimmen, die mit der Hydrogel-Formulierung behandelt wurden.
Wundschlussdaten sind jedoch in Tabelle 2 unten angegeben. Tabelle 2. Prozent des Wundschlusses für mit BP
behandelte und Vergleichs-Wunden.
| | Prozent
Wundschluss (%) |
| | Tier
Nr. | POD 5 | POD 8 | POD 11 | POD 14 |
| *Vergleich (kein BP) | 1 | 0 | 50 | 70 | 70 |
| Vergleich
(Hydrogel, kein BP, keine Salze) | 2 | 25 | 70 | 70 | 100 |
| BP & Hydrogel, keine
Salze | 3 | 0 | 70 | 90 | 100 |
| BP & Hydrogel, keine
Salze | 4 | 25 | 80 | 90 | 90 |
| BP & Hydrogel, Salze
(etwas Precipitat gebildet, wahrscheinlich aufgrund der Einlagerung
von Salzen) | 5 | 0 | 80 | 90 | 100 |
- *Das Vergleichstier hatte zur Zeit der
Biopsie sehr dünne
und empfindliche Haut im Vergleich zu den Tieren, die BP erhielten.
-
Zusammenfassend
waren die Ergebnisse sehr viel versprechend wenngleich vorläufig, und
zeigten einen schnelleren Wundschluss bei mit BP behandelten als
bei Vergleichs-Tieren.
-
Somit
wurden ausführlichere
Experimente unternommen, um die Ergebnisse zu bestätigen, wie
nachfolgend beschrieben wird.
-
BEISPIEL 3. VERGLEICHSSTUDIE ZWISCHEN
REGRANEX® UND
BP
-
REGRANEX
® (PDGF-BB),
das einzige anerkannte Wachstumsfaktorprodukt auf dem Markt zum
Behandeln von diabetischen Fußgeschwüren, zeigte
eine vollständige
Heilung bei 50 % der Patientenpopulation im Vergleich zu 35 % der
Placebogelbehandlung, die eine vollständige Heilung nach wiederholter
Anwendung für
ungefähr
zwei Wochen bei Diabetikerpatienten zeigte (siehe REGRANEX(r) U.S.
volle Verschreibungsinformationen – Packungsbeilage). Somit wurde
ein Vergleich von REGRANEX(r) (tm) gegenüber BP in einer Studie ähnlich zu
der oben beschriebenen unternommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 und 4 gezeigt. Tabelle 3. mit BP, Hydrogel (HG) und Regranex
® behandelte
Wunden und Prozent des Wundschlusses (%), Epitheldicke (mm) und
Grad der Angiogenese (Anzahl geschätzter Kapillaren pro 20× Feld).
| Prozent
(%) Wundschluss | Epi-Dicke (μm) | Angio
(# ges. cap/hpf 20×) |
| Tier
Nr. | Behandlungsgruppe | POD
5 | POD
8 | POD
11 | POD
14 | POD
14 | POD
14 |
| 1 | BP | 10 | 25 | 85 | 100 | 17,5 | 28 |
| 2 | BP | 10 | | | | | |
| 3 | BP | 15 | | | | | |
| 4 | BP | 10 | | | | | |
| 5 | BP | 10 | 30 | 85 | 80 | 7,5 | 16 |
| 6 | BP | 10 | | | | | |
| 7 | BP | 10 | 10 | | | | |
| 8 | BP | 10 | 30 | 85 | 100 | 11,5 | 26 |
| 9 | BP | 30 | 50 | 85 | 100 | 16 | 21 |
| 10 | BP | 30 | 50 | 85 | 100 | 12 | 20 |
| 11 | BP | 20 | 45 | 85 | 100 | 18 | 18 |
| 12 | BP | 10 | 15 | 85 | 90 | 6 | 20 |
| 13 | BP | 10 | 20 | 95 | 100 | 5,5 | 23 |
| 14 | BP | 15 | 25 | 90 | 100 | 10 | 32 |
| 15 | BP | 5 | 50 | 90 | 95 | 14 | 25 |
| n | | 15 | 11 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Mittel | | 13,67 | 31,82 | 87,00 | 96,50 | 11,80 | 22,9 |
| SD | | 7,43 | 14,71 | 3,50 | 6,69 | 4,58 | 4,88 |
| SEM | | 0,54 | 0,46 | 0,04 | 0,07 | 0,39 | |
| 16 | HG | 15 | 35 | 75 | 55 | 12,5 | 28 |
| 17 | HG | 10 | 60 | 70 | 95 | 10,5 | 5 |
| 18 | HG | 5 | 25 | 60 | 95 | 9 | 34 |
| 19 | HG | 10 | 30 | 70 | 90 | 17,5 | 8 |
| 20 | HG | 20 | 40 | 80 | 95 | 17,5 | 20 |
| 21 | HG | 10 | 10 | 80 | 95 | 13 | 15 |
| 22 | HG | 30 | 80 | 70 | 90 | 10 | |
| 23 | HG | 10 | 80 | 80 | 90 | 20 | 10 |
| 24 | HG | 15 | 40 | 70 | 90 | 18 | 15 |
| 25 | HG | 20 | 35 | 70 | 90 | 10,5 | 16 |
| 26 | HG | 10 | 10 | 70 | 90 | 12,5 | 20 |
| 27 | HG | 10 | 35 | 70 | 90 | 8 | 32 |
| 28 | HG | 10 | 55 | | | | |
| 29 | HG | 5 | 40 | | | | |
| 30 | HG | 15 | 40 | 70 | | | |
| n | | 15 | 15 | 13 | 12 | 12 | 11 |
| Mittel | | 13,00 | 41,00 | 71,92 | 88,75 | 13,25 | 18,455 |
| SD | | 6,49 | 20,72 | 5,60 | 10,90 | 4,01 | 9,55 |
| SEM | | 0,50 | 0,51 | 0,08 | 0,12 | 0,30 | |
| 31 | Regranex | 20 | 30 | 55 | 75 | 16 | |
| 32 | Regranex | 15 | 80 | | | | 13 |
| 33 | Regranex | 20 | 80 | 100 | 100 | 8,5 | 4 |
| 34 | Regranex | 15 | 50 | 90 | 100 | 10 | |
| 35 | Regranex | 40 | 75 | | | | 6 |
| 36 | Regranex | 15 | 70 | 90 | 100 | 7,5 | 10 |
| 37 | Regranex | 15 | 70 | 90 | | 18 | |
| 38 | Regranex | 10 | 80 | | | | |
| 39 | Regranex | 40 | 80 | | | | |
| 40 | Regranex | 15 | 50 | 80 | 90 | 15 | 13 |
| 41 | Regranex | 15 | 10 | | | | |
| 42 | Regranex | 5 | 50 | 100 | 100 | 16 | 21 |
| 43 | Regranex | 40 | 70 | 100 | 100 | 22,5 | 10 |
| 44 | Regranex | 5 | 40 | 80 | 100 | 16,5 | 6 |
| 45 | Regranex | | | | | | |
| n | | 14 | 14 | 9 | 8 | 9 | 9 |
| Mittel | | 19,29 | 59,64 | 87,22 | 95,63 | 14,44 | 10,375 |
| SD | | 12,07 | 21,88 | 14,39 | 9,04 | 4,88 | 5,4 |
| SEM | | 0,63 | 0,37 | 0,16 | 0,09 | 0,34 | |
-
Die
Prozent-Verschluss-Ergebnisse können
wie folgt zusammengefasst werden: Tabelle 4. Zusammenfassung
| | POD's | BP
(Mittel) | HG
(Mittel) | REG
(Mittel) |
| Wundschluss (%) | 0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 5 | 13,67 | 13,00 | 19,29 |
| 8 | 31,82 | 41,33 | 59,64 |
| 11 | 87,00 | 71,92 | 87,22 |
| 14 | 96,25 | 89,17 | 95,63 |
| Epitheldicke
(mm) | 14 | 11,8 | 13,25 | 14,44 |
| Angiogenese (Nr./Feld) | 14 | 22,9 | 18,45 | 10,38 |
-
Somit
ist die BP-Behandlung so gut wie REGRENEXTM beim
Schließen
von Wunden, obwohl anfänglich
etwas langsamere Heilungsraten beobachtet wurden. Die BP-Behandlung
zeigt ferner etwas weniger Verdickung des Epithels und zeigt eine
beträchtlich
verbesserte Angiogenese im Wundbereich.
-
BEISPIEL 4. ZUKÜNFTIGE ANWENDUNGEN
-
Da
sich BP als viel versprechend als ein Wundheilmittel gezeigt hat,
wird es als nächstes
bei Anwendungen getestet, bei denen die Wundheilung bekanntermaßen ungenügend ist.
-
Experimente ähnlich zu
jenen, die oben beschrieben wurden, werden mit diabetischen Tieren
durchgeführt,
um die Heilung von Wunden ganzer und Teil-Dicke zu testen. Das Ansprechverhalten
Geschwüre
venöser
Stauungen und diabetischer Geschwüre auf BP wird ebenfalls getestet.
-
Bei
vorbereitenden Experimenten wurden männliche Sprague Dawley-Ratten
mit einem Gewicht von mehr als 325 g durch eine Behandlung mit Streptozotozin
zuckerkrank gemacht und die Hyperglykemie wurde durch Glukometrie
bestätigt.
Vier Schnittwunden voller Dicke wurden auf der Rückenoberfläche jedes Tiers senkrecht zu
der Längsachse
verursacht. Die Wunden wurden mit Seidenstrukturen geschlossen und
der Wachstumsfaktor oder das Placebo in die Wundlücke oder
auf den Schnitt nach dem Schließen
aufgebracht. Die Anwendung wurde zu zwei Zeitpunkten ausgeführt: 1)
an Tag 0, was der Tag der Verursachung der Wunde (Operation) ist
und eine zweite Anwendung 2) an Tag 3 nach der Verursachung der
Wunde. Die Schnittstärke wurde
an Tag 7 und Tag 10 nach der Operation gemessen. Die Daten sind
in Tabelle 5 angegeben und sind insofern sehr ermutigend, als die
BP-Behandlung besonders hilfreich ist beim Behandeln einer Vielzahl
von diabetischen Geschwüren
oder anderen Wunden, die durch verzögerte und/oder schlechte Heilung
gekennzeichnet sind. Tabelle 5. Zerreißfestigkeit von Wunden bei
diabetischen Ratten
| | Zerreißfestigkeit
(kg/mm) ± sem |
| | Vergleich | BP |
| Tag
7 | 3,6 ± 1 | 4,2 ± 0,7 |
| Tag
10 | 5,2 ± 0,7 | 9,1 ± 0,8 |
-
BEISPIEL 5: WEITERE CHARAKTERISIERUNG
VON BP
-
Das
BP wurde teilweise wie Folgt charakterisiert: Hochleistungsflüssigchromatographie-
(„HPLC-"; high performance
liquid chromatography) Fraktionen wurden denaturiert, mit DTT reduziert
und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
getrennt. Einminütige
HPLC-Fraktionen von Minute 27 bis 36 sind in 2 gezeigt.
Größenstandards
(ST) von 14, 21, 31, 45, 68 und 97 kDa wurden als Niedrigbereichs-Größenstandards
aus BIORADTM erhalten und sind an jedem
Ende des Coomassie-Blaugefärbten
Gels gezeigt. Bei dem üblichen
Protokoll sind HPLC-Fraktionen 29 bis 34 gesammelt, um BP zu erzeugen
(siehe Kästen, 2 und 3),
wie in einem ähnlich
vorbereiteten SDS-PAGE-Gel in 17B gezeigt
ist.
-
Die
verschiedenen Komponenten des BP wurden durch Massenspektrometrie
und Aminosäuresequenzierung
tryptischer Fragmente charakterisiert, wo ausreichende Pegel an
Protein zur Analyse vorlagen. Die Hauptbänder in dem 10-Gel (wie numerisch
in 3 angezeigt ist) wurden herausgeschnitten, eluiert,
einer tryptischen Zersetzung unterzogen und die Fragmente wurden
HPLC-gereinigt und sequenziert. Die Sequenzdaten wurden gegenüber bekannten
Sequenzen verglichen und die besten Übereinstimmungen sind in 15A-B gezeigt. Diese Identifikationen sind insofern
gewissermaßen
unverbindlich, als nur Abschnitte der Gesamtproteine sequenziert
wurden und in einigen Fällen
eine Abweichung zwischen Mensch- und Rind-Analogen für ein gegebenes
Protein vorliegt.
-
Dieselben
tryptischen Proteinfragmente wurden durch Massenspektrometrie analysiert
und die Massenspektrogramme sind in 7A-O gezeigt.
Die tabellarisierten Ergebnisse und Homologien sind in 16A-F gezeigt, die Identifikationsinformationen
für die
Bänder
liefern, die in 3-4 identifiziert
sind. Wie oben kann die Zuweisung einer Ortsidentität vorläufig sein,
basierend auf Spezies-Unterschieden
und Modifikationen nach der Translation. Eine Zusammenfassung aller
Proteinidentifikationen aus ID-Gelen ist in 4 gezeigt.
-
Die
identifizierten Proteinkomponenten von BP, die in 15A-B, 16A-F
und 19A-D beschrieben sind, wurden quantifiziert,
wie in 17A und 17B gezeigt
ist. 17B ist ein gefärbtes SDS-PAGE-Gel
von BP und 17A stellt eine Abtastdensitometerspur
desselben Gels dar. Die identifizierten Proteine wurden gekennzeichnet
und quantifiziert durch Messen des Bereichs unter der Kurve. Diese
Ergebnisse sind in 18 als ein Prozentsatz des Gesamtspitzenbereichs
dargestellt.
-
Somit
liegen 11 Hauptbänder
in dem BP SDS-PAGE-Gel vor, die ungefähr 60 % des Proteins in BP darstellen.
Die identifizierten Proteine fallen grob in drei Kategorien: die
Ribosomalproteine, die Histone und Wachstumsfaktoren, die morphogene
Knochenfaktoren (BMP; bone morphogenic factors) umfassen. Es wird erwartet,
dass die Ribosomalproteine und Histonproteine aus dem BP ohne Aktivitätsverlust
entfernt werden können,
da diese Proteine bekanntermaßen
keine Wachstumsfaktoraktivität
aufweisen. Nach dieser Trennung wird erwartet, dass sich die spezifische
Aktivität
entsprechend erhöht.
-
Experimente
sind in Planung, um die Hypothese zu bestätigen, dass die Histon- und
Ribosomalproteine aus dem BP ohne daraus folgenden Verlust entfernt
werden können
oder sogar mit einer Erhöhung
der spezifischen Aktivität.
Histone werden aus dem BP-Cocktail durch Immunoaffinitätschromatographie
entfernt, entweder unter Verwendung spezifischer Histonproteinantikörper oder
eines Pan-Histon-Antikörpers.
Das Histone-bereinigte BP (BP-H) wird wie oben beschrieben im Hinblick
auf Wundheilung und/oder osteogene Aktivität getestet. Auf ähnliche
Weise werden die bekannten Ribosomalproteine abisoliert und die
verbleibende Mischung (BP-R) wird getestet.
-
Ein
SDS-PAGE-Gel von BP wurde ebenfalls durch ein Western Immunoblot
mit einer Reihe von Antikörpern
analysiert, wie in 14 aufgelistet ist. Die Visualisierung
von Antikörperreaktivität erfolgte
durch Meerrettich-Peroxidase konjugiert mit einem zweiten Antikörper und
unter Verwendung eines chemilumineszierenden Substrats. Ferner wurde
TGF-β1 unter
Verwendung von handelsüblich
reinem TGF-β1
als Standard quantifiziert und wurde bestimmt, um weniger als 1
% des BP-Proteins darzustellen. Die Antikörperanalyse zeigte, dass jedes
der in 14 aufgelisteten Proteine in
BP enthalten ist.
-
Das
BP wurde weiter charakterisiert durch 2-D-Gel-Elektrophorese, wie in 5-6 gezeigt
ist. Die Proteine sind in horizontaler Richtung nach Ladung (pI)
und in der vertikalen Richtung nach Größe getrennt, wie in der zweidimensionalen
Elektrophorese beschrieben ist, angepasst für eine Auflösung von Basisproteinen, wurde
gemäß dem Verfahren
ausgeführt
von O'Farrell u.
a. (O'Farrell, P.
Z., Goodman, H. M. und O'Farrell,
P. H., Cell, 12: 1.133-1.142,
1977) durch das Kendrick Laboratory (Madison, WI). Zweidimensionale
Gelelektrophoresetechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Die Nonequilibrium-pH-Gradient-Elektrophorese
(„NEPHGE") unter Verwendung
von Ampholinen, 1,5 %, pH 3,5-10 und 0,25 %, pH 9-11 (Amersham Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ) wurde bei 200 V für 12 Stunden ausgeführt. Gereinigtes
Tropomyosin (unterer Fleck, 33.000 KDa, pI 5,2), und gereinigtes
Lysozym (14.000 KDa, pI 10,5-11)
(Merck-Index) wurden zu den Proben als interne pI-Marker hinzugefügt und sind
mit Pfeilen markiert.
-
Nach
der Equilibrierung für
10 Minuten in Puffer „0" (10 % Glycerol,
50 mM Dithiothreitol, 2,3 % SDS und 0,0625 M Tris, pH 6,8) wurde
die Tube Gel auf einem Stacking-Gel abgedichtet, das auf einem 12,5
% Acrylamid-Slab-Gel (0,75 mm dick) ist. SDS-Slab-Gel-Elektrophorese
wurde für
ungefähr
4 Stunden bei 12,5 mA/Gel ausgeführt.
-
Nach
der Slab-Gel-Elektrophorese wurden zwei der Gele Coomassie-Blau-gefärbt und
die anderen zwei wurden in den Transferpuffer übertragen (12,5 mM Tris, pH
8,8, 86 mM Glycin, 10 % MeoH), über
Nacht auf PVDF-Papier bei 200 mA und ungefähr 100 Volt/zwei Gele transblottiert.
Die folgenden Proteine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden
als Molekulargewichtstandards zu der Agarose hinzugefügt, die
die Tube Gel zu dem Slab-Gel abdichtete: Myosin (220.000 KDa), Phosphorylase
A (94.000 KDa), Katalase (60.000 KDa), Aktin (43.000 KDa), Karbonanhydrase
(29.000 KDa) und Lysozym (14.000 KDa). 5 zeigt
das gefärbte
2-D-Gel mit Größenstandards,
die auf der linken Seite angezeigt sind. Tropomyosin (linker Pfeil)
und Lysozym (rechter Pfeil) sind ebenfalls angezeigt.
-
Dasselbe
Gel ist in 6 gezeigt, wobei verschiedene
identifizierte Proteinen durch nummerierte Kreise angezeigt sind.
Die Proteine wurden durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung
tryptischer Peptide identifiziert, wie oben beschrieben ist. Die
Identität
von jedem der gekennzeichneten Kreise ist in der Legende von 6 angegeben
und die Daten, die die verschiedenen Proteinorte identifizieren,
sind in 19A-D angegeben.
-
Da
verschiedene der Proteine bei mehr als einer Größe migrierten (z. B. BMP-3
das als 6 Bänder
migriert), wurden Untersuchungen unternommen, um das Ausmaß einer
Modifikation nach der Translation der BP-Komponenten zu untersuchen.
Die Phosphorilierung wurde durch Anti-Phosphotyrosin-Immunoblot- und durch
Phosphatase-Studien gemessen. 8 zeigt
ein 2-D-Gel, elektrogeblottet auf Filterpapier und sondiert mit
einem Phosphotyrosin-Maus-Monoclonal-Antikörper durch SIGMA (# A-5964).
Verschiedene Proteine wurden somit als phosphoriliert an einem oder
mehreren Tyrosin-Resten gezeigt.
-
Ähnliche
2-D-Elektroblotte wurden mit BP-Komponentenspezifischen Antikörpern sondiert,
wie in 9A-D gezeigt ist. Die Filter
wurden sondiert mit BMP-2, BMP-3 (9A), BMP-3,
BMP-7 (9B), BMP-7, BMP-2 (9C)
und BMP-3 und TGF-β1
(9D). Jedes zeigt das charakteristische Ein-Größen-Band,
das bei variierendem pI migriert, wie für ein Protein, das in verschiedenen
Phosphorelierungszuständen
existiert, üblich
ist.
-
Für die Phosphatasestudien
wurde BP in 10 mM HCl über
Nacht bei 37°C
inkubiert mit 0,4 Einheiten sauerer Phosphatase (AcP). Behandelte
und unbehandelte Proben wurden lyophilisierten Platten aus Typ-I-Kollagen
hinzugefügt
und Seite an Seite in dem Subcutanimplantat-Ratten-Bioassay bewertet,
wie vorangehend in den
U.S.-Patenten
Nr. 5,290,763 ,
5,563,124 und
5,371,191 beschrieben wurde.
Kurz gesagt wurden 10 g BP in Lösung
zu lyophilisierten Kollagenplatten hinzugefügt und die Platten subkutan
in der Brust einer Ratte implantiert. Die Platten wurden dann nach
2 Wochen für
den Alkalinphosphotase- („ALP” – ein Marker
für Knochen-
und Knorpel-erzeugende Zellen) Test oder nach 3 Wochen zur histologischen
Analyse wieder entnommen. Für
die ALP-Analyse der Proben wurden die Explantate homogenisiert und
Pegel der ALP-Aktivität
unter Verwendung handelsüblicher
Ausrüstung
gemessen. Zur Histologie wurden dünne Abschnitte des Explantats
mit einem Mikrotom geschnitten und die Abschnitte gefärbt und
im Hinblick auf Knochen und Knorpelbildung analysiert.
-
Sowohl
nativ- als auch phosphatase-behandelte BP-Proben wurden im Hinblick
auf morphogene Aktivität
durch Masse des subkutanen Implantats (Explantatmasse) und ALP-Einstufung
getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine AcP-Behandlung die Explantatmasse
und die ALP-Einstufung von 100 % auf ungefähr 60 % reduzierte. Somit ist
die Phosphorilierung wichtig für
die BP-Aktivität.
-
Das
BP wurde ferner im Hinblick auf Glykosilierung analysiert. 10 zeigt
ein SDS-PAGE-Gel, gefärbt
mit Periodishce Säure-Schiff
(PAS; periodic acid schiff) – einer nichtspezifischen
Karbohydratfärbung,
die anzeigt, dass einige der BP-Komponenten glykosiliert sind (Stern-Protein
identifiziert als BMP-3). 11-12 zeigen
eine Immunodetektion von zwei spezifischen Proteinen (BMP-7, 11 und
BMP-2, 12), behandelt mit ansteigenden
Pegeln von PNGase F (Peptid-N-Glycosidase F). Sowohl BMP-2 als auch
BMP-7 zeigen einen gewissen Grad an Glykosilierung bei BP, scheinen
aber auch einen gewissen Pegel an Protein, das resistent gegen PNGase
F ist, aufzuweisen (Pluszeichen zeigen ansteigende Enzympegel). Die
funktionale Aktivität
von mit PNGase F und Sialadase behandelten Proben wurde im Hinblick
auf Explantatmasse und ALP-Einstufung getestet, wie in 13A und 13B gezeigt
ist, die zeigen, dass eine Glykosilierung für eine vollständige Aktivität erforderlich
ist.
-
Zusammenfassend
sind BMPs 2, 3 und 7 durch Phosphorilierung und Glykosilierung modifiziert.
Diese Nach-Translations-Modifikationen
beeinflussen die morphogene Proteinaktivität, 33 % bzw. 50 % und Vorsicht ist
geboten beim Vorbereiten von BP, um diese funktionalen Derivate
nicht zu beeinträchtigen.