ES2277462T3 - Purificacion de vacunas conjugadas de proteina-polisacarido mediante ultrafiltracion de soluciones de sulfato de amonio. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la separación de polisacárido no enlazado a partir de vacunas conjugadas de proteína-polisacárido en una mezcla de conjugado de proteína-polisacárido y polisacárido no enlazado, comprendiendo dicho procedimiento la adición de solución de sulfato de amonio a la mezcla, de tal modo que el sulfato de amonio esté presente en la mezcla en un nivel superior al 40% de saturación, seguida de la diafiltración de la mezcla a través de una membrana semipermeable contra un tampón que contiene sulfato de amonio en un nivel superior al 40% de saturación.

Description

Purificación de vacunas conjugadas de proteína-polisacárido mediante ultrafiltración de soluciones de sulfato de amonio.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la separación de polisacárido no enlazado a partir de vacunas conjugadas de proteína-polisacárido utilizando el procedimiento de ultrafiltración, conteniendo la solución de diafiltración niveles de saturación de sulfato de amonio.
En la presente solicitud se hace referencia a diversas publicaciones. La referencia completa de dichas publicaciones se encuentra en el lugar donde se citan, o al final de la memoria, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Estas publicaciones se refieren al estado de la técnica a la que pertenece la presente invención; sin embargo, no existe admisión de que cualquiera de estas publicaciones pertenezca efectivamente a la técnica anterior.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, se han desarrollado diversas vacunas conjugadas de proteína-polisacárido para su utilización en la protección contra infecciones bacterianas. Una vacuna de este tipo, la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B, ha demostrado ser bastante eficaz en la protección contra la enfermedad Haemophilus influenzae tipo B (Santosham, M., 1993). Las vacunas conjugadas de polisacárido-proteína se preparan enlazando covalentemente polisacáridos capsulares bacterianos purificados a moléculas de proteína utilizando una diversidad de procedimientos químicos. Una vez completadas las reacciones de conjugación, se separan las moléculas de polisacárido sin reaccionar de los conjugados de polisacárido-proteína utilizando un amplio espectro de técnicas de separación. Las técnicas que han demostrado ser más eficaces a efectos de purificar los conjugados de polisacárido-proteína incluyen la cromatografía de filtración por gel, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la ultracentrifugación, la extracción líquido-líquido y la precipitación/fraccionamiento con sulfato de amonio.
La razón del interés en desarrollar vacunas conjugadas es que dichas vacunas son capaces de provocar una respuesta inmune antipolisacárido específica que protege contra la enfermedad. Estas vacunas conjugadas de polisacárido protegen contra patógenos que contienen un caparazón exterior de polisacárido. Estas vacunas han demostrado ser eficientes en la protección de recién nacidos y niños pequeños contra la enfermedad. La razón de que estas vacunas sean eficaces en las poblaciones más jóvenes se debe a la conversión de los polisacáridos capsulares bacterianos purificados, que se clasifican como antígenos independientes de las células T, en antígenos tipo células T cuando se enlazan covalentemente a determinadas moléculas de proteína. Los antígenos de células T son capaces de provocar una respuesta inmune que puede estimularse mediante una vacunación subsiguiente, permitiendo establecer un nivel de protección en el sujeto vacunado. Normalmente, estos antígenos de células T proporcionan una inmunidad a largo plazo contra la enfermedad. Los polisacáridos capsulares bacterianos purificados son capaces de provocar una respuesta inmune en personas adultas, pero dicha respuesta inmune puede tener una duración limitada, particularmente en las poblaciones jóvenes. Generalmente, la respuesta inmune en poblaciones jóvenes es muy baja, y se considera que no presenta un nivel protector. Generalmente, las vacunaciones subsiguientes con polisacárido no dan lugar a una respuesta de anticuerpos mayor o estimulada, ya que no hay ayuda por parte de células T o anticuerpos de memoria. Por esta razón, no se ha recomendado la utilización de las vacunas de polisacárido en recién nacidos y en niños menores de 2 años.
Generalmente, en la preparación de vacunas conjugadas de polisacárido-proteína se llevan a cabo etapas para separar el polisacárido no enlazado de estas preparaciones, dado que el polisacárido no enlazado no aporta ningún beneficio al sujeto vacunado. Además, se ha llevado a cabo un esfuerzo más intenso para desarrollar vacunas bien caracterizadas con un grado de pureza mayor en vistas a su aprobación.
Objetivos y sumario de la invención
La ultrafiltración, tal como la diálisis, se basa en el principio de separar moléculas según el tamaño utilizando una membrana semipermeable con un intervalo definido de tamaños de poro. La ultrafiltración se utiliza ampliamente en la purificación de proteínas y polisacáridos a efectos de concentrar las moléculas de proteína y de polisacárido y a efectos de modificar la composición de la solución tampón. La ultrafiltración también se utiliza en la purificación de polisacáridos y proteínas a efectos de eliminar solutos de peso molecular bajo en estas soluciones de muestra. Esta técnica procedural se aplica rutinariamente en pequeños experimentos de laboratorio y en etapas de proceso a escala de fabricación.
El objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento de separación de polisacárido no reaccionado o no enlazado de preparaciones de conjugados de polisacárido-proteína basadas en la diferencia del tamaño molecular. El tamaño molecular del polisacárido no reaccionado o no enlazado, aunque es relativamente grande y está comprendido entre 1.000 y 50.000 Daltons, es mucho menor que el tamaño molecular de las moléculas de conjugado de polisacárido-proteína, que está comprendido entre 100.000 y 1.000.000 Daltons. Al desarrollar este procedimiento para la purificación de conjugados de polisacárido-proteína, la presente invención proporciona la oportunidad de aumentar fácilmente al tamaño industrial las preparaciones de reacción.
La invención da a conocer un procedimiento para la separación de polisacárido no enlazado a partir de vacunas conjugadas de proteína-polisacárido en una mezcla de conjugado de proteína-polisacárido y polisacárido no enlazado, comprendiendo dicho procedimiento la adición de solución de sulfato de amonio a la mezcla, de tal modo que el sulfato de amonio esté presente en la mezcla en un nivel superior al 40% de saturación, seguida de la diafiltración de la mezcla a través de una membrana semipermeable contra un tampón que contiene sulfato de amonio en un nivel superior al 40% de saturación.
Las formas de realización preferidas del procedimiento según la invención se definen en las reivindicaciones 2 a 8.
Las moléculas de polisacárido y de proteína no se comportan igual con respecto a su facilidad de atravesar membranas semipermeables. Una razón de ello es que los polisacáridos existen como distribuciones de peso molecular, mientras que generalmente las proteínas tienen un tamaño molecular definido. Las proteínas existen en solución como estructuras de tipo perla, mientras que los polisacáridos pueden adoptar una diversidad de conformaciones (por ejemplo, de espirales), o pueden existir en forma de estructuras aleatorias de tipo cuerda. Como consecuencia de las diversas formas geométricas que los polisacáridos pueden adoptar en solución, algunos polisacáridos pueden atravesar membranas semipermeables más fácilmente que otros. La composición química de la membrana semipermeable puede ser de naturaleza hidrofóbica (por ejemplo, poliéter sulfona) o hidrofílica (por ejemplo, celulosa regenerada). La composición química de la membrana semipermeable puede influenciar la facilidad con la que las proteínas y polisacáridos atraviesan los poros. Los polisacáridos con un tamaño molecular comprendido entre 1 y 50.000 pueden atravesar membranas semipermeables con tamaños de poro cuyo límite de tamaño molecular sea de 30.000 utilizando solución 0,15 M de cloruro sódico como tampón de diafiltración. Cuando se somete una mezcla del mismo polisacárido y conjugados de polisacárido-proteína a las mismas condiciones experimentales de ultrafiltración, muy poco polisacárido no enlazado atravesará la membrana semipermeable. Sin embargo, cuando se cambia el tampón de diafiltración hasta el 40% (de saturación) de sulfato de amonio, el polisacárido no enlazado atraviesa libremente los poros de la membrana.
El sulfato de amonio no modifica el tamaño de los poros de la membrana. El nivel de saturación juega un papel importante a la hora de permitir que el polisacárido no enlazado atraviese libremente la membrana semipermeable. Por debajo del 40% (de saturación), muy poco polisacárido no enlazado atraviesa la membrana. Sin embargo, por encima del 40% (de saturación), el polisacárido se eluye libremente a través de los poros de la membrana. La presente invención no requiere que el conjugado de polisacárido-proteína se separe de la solución por precipitación para que funcione. El procedimiento funciona igualmente bien tanto si el conjugado de polisacárido-proteína está totalmente disuelto como el mismo precipita en la solución. La selección adecuada del tamaño de poro de la membrana y el porcentaje de saturación de sulfato de amonio apropiados permite una recuperación de alto rendimiento del conjugado de polisacárido-proteína deseado, permitiendo a la vez la separación del polisacárido sin reaccionar.
La presente invención da a conocer un medio sencillo para la purificación de los conjugados de polisacárido-proteína que puede adaptarse fácilmente al tamaño de cualquier volumen de reacción. Un procedimiento de purificación que puede llevarse a cabo en volúmenes de gran escala es la precipitación del conjugado de polisacárido-proteína a partir de la solución utilizando sulfato de amonio. En este procedimiento, el polisacárido no enlazado permanece en la solución. Sin embargo, este enfoque adolece de determinados inconvenientes. A efectos de alcanzar el mismo nivel de pureza que proporciona la presente invención, deben repetirse diversas precipitaciones con sulfato de amonio debido a cierta partición del polisacárido con el conjugado de polisacárido-proteína precipitado. Algunos conjugados de polisacárido-proteína son difíciles de disolver nuevamente una vez que han precipitado de la soluciones. En la presente invención, el procedimiento no requiere que el conjugado de polisacárido-proteína se separe de la solución por precipitación. La solución de diafiltración de sulfato de amonio impide toda posible interacción o asociación entre el polisacárido no enlazado y el conjugado de polisacárido-proteína.
En una forma de realización preferida del procedimiento según la presente invención, los conjugados de polisacárido-proteína se purifican hasta un nivel tal que contienen menos del 1% en peso de polisacárido no enlazado.
En otra forma de realización preferida del procedimiento según la presente invención, se purifican conjugados de polisacárido-proteína preparados a partir de polisacáridos capsulares bacterianos de Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 3, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F y Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W-135 e Y.
Utilizando el procedimiento según la invención, se purifica un conjugado de polisacárido-proteína de tal modo que se conserva un epítope de interés, un modulador de respuesta biológica, y/o un factor de crecimiento, de tal modo que se proporciona un agente inmunológico y/o vacunal o terapéutico.
La vacuna de conjugado de polisacárido-proteína purificada obtenida mediante el procedimiento según la invención puede administrarse a un animal o humano a efectos de obtener una respuesta inmunológica o respuesta inmune protectora, o para el tratamiento o terapia.
Descripción detallada de la invención
La invención se ha aplicado a efectos de purificar diversos conjugados de polisacárido-proteína diferentes derivados de una variedad de polisacáridos capsulares bacterianos, aunque la invención no debe limitarse únicamente a estos conjugados de polisacárido-proteína. Los conjugados de polisacárido-proteína capsulares bacterianos que se han purificado mediante este procedimiento incluyen Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 3, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F y Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W-135 e Y.
Según el procedimiento de la presente invención, el polisacárido derivado que, por ejemplo, se prepara mediante el procedimiento descrito en el documento EP 0497525, se mezcla primeramente con el portador de proteína seleccionado en una solución de solución salina fisiológica (0,85% de cloruro sódico), y el pH de la mezcla se ajusta a 5,0 \pm 0,1. La reacción de conjugación se inicia añadiendo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC), que sirve para activar los grupos carboxilo en la proteína portadora, permitiendo la reacción en un lugar nucleofílico presente en la cadena de polisacárido. El pH de la reacción se mantiene a 5,0 \pm 0,1 durante el curso de la reacción, generalmente durante dos horas a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC. Después de completarse el tiempo de reacción, el pH de la mezcla de reacción se ajusta a 7,0 \pm 0,1 y se mantiene la reacción durante un periodo comprendido entre 12 y 18 horas a una temperatura comprendida entre 2 y 8ºC, a efectos de permitir la hidrólisis del EDAC sin reaccionar.
El conjugado de polisacárido-proteína se purifica permitiendo primeramente que la mezcla se equilibre a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC. La mezcla se conecta una unidad de ultrafiltración en espiral equipada con una membrana de celulosa regenerada Millipore® Prep/Scale 30.000MWCO. Se añade sulfato de amonio a la mezcla de reacción hasta un nivel determinado de saturación (generalmente, entre 50 y 60% de saturación). La mezcla de conjugado se diafiltra contra 20 intercambios volumétricos de solución de sulfato de amonio entre 50 y 60% (de saturación). El sulfato de amonio se separa de la solución de polisacárido-proteína por diafiltración contra 10 intercambios volumétricos de solución salina fisiológica (0,85% de cloruro sódico). El conjugado purificado se filtra a través de membranas de 1,2 y 0,45 micrones y, a continuación, se esterilizan por filtración a través de una membrana de 0,22 micrones.
La invención depende de la presencia de sulfato de amonio en el tampón de lavado de la diafiltración. La presente invención se descubrió a partir de la siguiente serie de experimentos, que se describen a continuación.
Se llevó a cabo una reacción de conjugación utilizando Neisseria meningitidis de serogrupo C derivado con dihidracida de ácido adípico con proteína toxoide diftérica. Se purificó una parte de esta mezcla de reacción mediante tres precipitaciones sucesivas de sulfato de amonio, utilizando niveles del 50% de saturación. Las precipitaciones se llevaron a cabo ajustando primeramente el pH de la mezcla a 7,0 \pm 0,1 utilizando hidróxido sódico diluido. Se añadió sulfato de amonio sólido lentamente durante un intervalo de 10 minutos a efectos de alcanzar una concentración final del 50% de saturación. Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 15 minutos. El conjugado de polisacárido-proteína precipitado se recogió por centrifugación utilizando un rotor Beckman® JA-20, a 10.000 rpm y a 4ºC. El sobrenadante que contenía polisacárido sin reaccionar disuelto se eliminó, y la pastilla de proteína se disolvió en solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. El pH se ajustó a 7,0 \pm 0,1 y el conjugado de polisacárido-proteína se precipitó igual que anteriormente. Después de la tercera precipitación con sulfato de amonio, el conjugado de polisacárido-proteína se dializó contra solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. El conjugado purificado se filtró a través de membranas de 1,2 y 0,45 micrones y, a continuación, se esterilizó por filtración a través de una membrana de 0,22 micrones. En esta muestra se analizó el contenido de proteína y ácido siálico, y el contenido de polisacárido no enlazado. La parte restante de la mezcla de reacción se sometió a una serie de procedimientos de purificación por ultrafiltración. El resumen de estos procedimientos de purificación se recoge en la tabla 1.
En el primer ensayo, la mezcla de reacción restante se conectó a una unidad de ultrafiltración minisette de canal de pantalla equipada con una membrana de poliéter sulfona Filtron® 30.000 MWCO. La mezcla de reacción de conjugación se diafiltró contra 10 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en ácido siálico y proteína de una muestra de este material. Ver tabla 1.
En un segundo ensayo, una parte del concentrado de la mezcla de reacción diafiltrada con solución salina fisiológica se conectó a una unidad de ultrafiltración minisette de canal de pantalla equipada con una membrana de poliéter sulfona Filtron® 30.000 MWCO. La mezcla de reacción de conjugación se diafiltró contra 10 volúmenes de solución de cloruro sódico 1 M, seguido de 10 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en proteína y ácido siálico de una muestra de este material. Ver tabla 1.
En un tercer ensayo, una segunda parte del concentrado procedente de la mezcla de reacción diafiltrada con solución salina fisiológica se conectó a una unidad de ultrafiltración minisette de canal de pantalla equipada con una membrana de poliéter sulfona Filtron® 30.000 MWCO. A esta mezcla se añadió sulfato de amonio sólido hasta una concentración del 20% de saturación. La mezcla se diafiltró contra 7 volúmenes de sulfato de amonio al 20% (de saturación), seguido de 6 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en proteína y ácido siálico de una muestra de este material. Ver tabla 1.
En un cuarto ensayo, el concentrado procedente de la mezcla de reacción diafiltrada con sulfato de amonio al 20% (de saturación) se conectó a una unidad de ultrafiltración minisette de canal abierto equipada con una membrana de poliéter sulfona Filtron® 30.000 MWCO. A esta mezcla se añadió sulfato de amonio sólido hasta una concentración del 50% de saturación. La mezcla se diafiltró contra 5 volúmenes de sulfato de amonio al 50% (de saturación), seguido de 6 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en proteína y ácido siálico de una muestra de este material. Ver tabla 1.
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En un quinto ensayo, el concentrado procedente de la mezcla de reacción diafiltrada con sulfato de amonio al 50% (de saturación) se conectó a una unidad de ultrafiltración en espiral equipada con una membrana de celulosa regenerada Millipore® Prep/Scale 30.000 MWCO. El cartucho de filtro en espiral Prep/Scale permite llevar a cabo esta operación con un flujo mayor del que se obtiene con el sistema de ultrafiltración minisette de lámina plana. La mezcla se diafiltró contra 10 volúmenes de sulfato de amonio al 50% (de saturación), seguido de 10 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en proteína, ácido siálico y el contenido de polisacárido no enlazado de una muestra. Ver tabla 1.
Los resultados de los experimentos cuarto y quinto mostraron que la inclusión de sulfato de amonio en la solución de lavado de diafiltración permite la eliminación por lavado del polisacárido no enlazado. Estos experimentos se confirmaron llevando a cabo un experimento de seguimiento utilizando una nueva mezcla de reacción de Neisseria meningitidis de serogrupo C con proteína toxoide diftérica. La mezcla de reacción de conjugación se llevó a cabo tal como se describe anteriormente. Después de la incubación durante toda la noche a entre 2 y 8ºC, la mezcla de reacción se conectó a una unidad de ultrafiltración en espiral equipada con una membrana de celulosa regenerada Millipore® Prep/Scale 30.000 MWCO. La mezcla se diafiltró contra 10 volúmenes de sulfato de amonio al 50% (de saturación). Se analizó el contenido en ácido siálico del permeado en cada lavado volumétrico. El perfil cinético del polisacárido no enlazado separado se muestra en la figura 1. después de la diafiltración contra sulfato de amonio al 50% (de saturación), el conjugado de polisacárido-proteína se diafiltró contra 10 volúmenes de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. Se analizó el contenido en proteína, ácido siálico y el contenido de polisacárido no enlazado de la muestra. Ver tabla 2.
La presente invención se ha aplicado en la purificación de una serie de vacunas de conjugado de polisacárido-proteína diferentes, una lista no inclusiva de las cuales se muestra en la tabla 3. Se comprenderá mejor la presente invención y sus muchas ventajas a partir de los siguientes ejemplos no limitativos, que se exponen a título de ejemplo.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación por ultrafiltración de conjugado de proteína toxoide diftérica de Neisseria meningitidis de serogrupo A
Los materiales utilizados en la reacción de conjugación y la purificación por ultrafiltración del conjugado de polisacárido-proteína incluyen polisacárido de serogrupo A derivado de dihidracida de ácido adípico, proteína toxoide diftérica, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC), solución salina fisiológica (0,85% de cloruro sódico), ácido clorhídrico 0,1 N, hidróxido sódico 0,1 N y sulfato de amonio.
El polisacárido de serogrupo A derivado de dihidracida de ácido adípico (a 6,5 mg/ml) se mezcló con proteína toxoide diftérica (a 5 mg/ml), y el pH de la mezcla se ajustó a 5,0 \pm 0,1 utilizando ácido clorhídrico 0,1 N. La reacción se inició añadiendo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) hasta una concentración de 3 mg/ml. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 5,0 \pm 0,1 durante dos horas. Después de dos horas, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 7,0 \pm 0,1 utilizando hidróxido sódico 0,1 N. La mezcla de reacción se incubó a entre 2 y 8ºC durante 18 horas.
Después de la incubación a entre 2 y 8ºC, se dejó equilibrar la mezcla de reacción a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC, y el pH se ajustó a 7,0 \pm 0,1 si era necesario. A la mezcla de reacción se añadió sulfato de amonio sólido durante un intervalo de 10 minutos a efectos de alcanzar una concentración del 60% de saturación. La mezcla se conectó a una unidad de ultrafiltración en espiral equipada con una membrana de celulosa regenerada Millipore® Prep/Scale 30.000MWCO. La mezcla de conjugado se diafiltró contra 20 volúmenes de solución de sulfato de amonio al 60% (de saturación). El sulfato de amonio se separó de la solución de polisacárido-proteína por diafiltración contra 10 intercambios volumétricos de solución salina fisiológica, con 0,85% de cloruro sódico. El conjugado purificado se filtró a través de membranas de 1,2 y 0,45 micrones, y a continuación se esterilizó por filtración a través de una membrana de 0,22 micrones.
La cantidad de polisacárido se determinó analizando el fósforo mediante el procedimiento de Bartlett, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry, 234, 466. La cantidad de proteína se determinó mediante el procedimiento de Lowry, O.H., et al., (1951) Journal of Biological Chemistry 193, 265. La cantidad de polisacárido no enlazado se midió haciendo pasar el conjugado de polisacárido-proteína a través de una resina phenyl sepharose® CL-6B utilizando solución de sulfato de amonio 1 M, y cuantificando la cantidad de polisacárido no enlazado y de polisacárido enlazado por el procedimiento del fósforo.
Se utilizó el mismo procedimiento para purificar conjugados de polisacárido-proteína preparados a partir de Neisseria meningitidis serogrupos C, W-135 e Y y a partir de Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 6B, 7F, 14 y 18C. La diferencia en los procedimientos utilizados para estos otros conjugados de polisacárido-proteína es la cantidad de sulfato de amonio que se añade a la mezcla de reacción de conjugado, y la concentración de sulfato de amonio en el tampón de lavado de diafiltración.
Referencias
1. Santosham, M. (1993) Vaccine 11: 552-557.
2. Bartlett, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry 234: 466.
3. Lowry, O.H., et al., (1951) Journal of Biological Chemistry 193: 265.
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TABLA 1 Determinación de purificación de conjugados de polisacárido-proteína Neisseria meningitidis serogrupo C por ultrafiltración frente a procedimiento de precipitación con sulfato de amonio
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TABLA 2 Purificación de un conjugado polisacárido-proteína Nesseria meningitidis serogrupo C utilizando una unidad de ultrafiltración en espiral equipada con una membrana de celulosa regenerada Milllpore® Prep/Scale 30,000 MWCO
2
TABLA 3 Resultados de purificación en conjugados de polisacárido-proteína utilizando una unidad de ultrafiltración en espiral con una membrana de celulosa regenerada Millipore® Prep/Scale 30,000 MWCO contra 20 volúmenes de soluciones de sulfato de amonio saturadas, seguido de 10 intercambios volumétricos contra solución salina fisiológica, 0,85% de cloruro sódico
3

Claims (10)

1. Procedimiento para la separación de polisacárido no enlazado a partir de vacunas conjugadas de proteína-polisacárido en una mezcla de conjugado de proteína-polisacárido y polisacárido no enlazado, comprendiendo dicho procedimiento la adición de solución de sulfato de amonio a la mezcla, de tal modo que el sulfato de amonio esté presente en la mezcla en un nivel superior al 40% de saturación, seguida de la diafiltración de la mezcla a través de una membrana semipermeable contra un tampón que contiene sulfato de amonio en un nivel superior al 40% de saturación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la membrana semipermeable es hidrofóbica.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la membrana hidrofóbica está compuesta por poliéter sulfona.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la membrana de poliéter sulfona presenta un límite de peso molecular de 30.000.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la membrana semipermeable es hidrofílica.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la membrana hidrofílica está compuesta por celulosa regenerada.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la celulosa regenerada presenta un límite de peso molecular de 30.000.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el sulfato de amonio está presente en un nivel comprendido entre el 50 y el 60% de saturación.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína es toxoide diftérico.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polisacárido es polisacárido capsular procedente de bacterias seleccionadas de entre el grupo constituido por Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 3, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F y Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W-135 e Y.
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