ES2277451T3 - Procedimiento para detectar la fosfatasa alcalina eliminando las interferencias de la hemoglobina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina en una muestra por medición óptica del p-nitrofenol, caracterizado porque se emplea una longitud de onda principal a medir de 450 ñ 10 nm y como longitud de onda secundaria por lo menos una de las siguientes longitudes de onda: de 480 ñ 10 nm, de 546 ñ 10 nm o de 575 ñ 10 nm.
Description
Procedimiento para detectar la fosfatasa
alcalina eliminando las interferencias de la hemoglobina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina en una
muestra por medición óptica, en el que se eliminan las
interferencias de la hemoglobina mediante combinaciones
determinadas de longitudes de onda, a un método para la eliminación
de interferencias provocadas por la hemoglobina libre o por
sustituidos de la sangre en la determinación de la fosfatasa
alcalina así como al uso de determinadas combinaciones de
longitudes de onda para la eliminación de las interferencias
provocadas por la hemoglobina o los sustitutivos de sangre.
Ya es sabido que la hemólisis interfiere en
algunos casos de forma considerable en los procedimientos de
diagnóstico para determinar los analitos. Se entiende por hemólisis
cualquier tipo de destrucción de los eritrocitos, por ejemplo por
una intervención mecánica, osmótica, química o enzimática sobre la
membrana celular de los eritrocitos. Como consecuencia de la
hemólisis se desprende el colorante de la sangre, la hemoglobina
(Hb), y ya no se puede sacar de la muestra.
La presencia de la hemoglobina es problemática
por un lado por el espectro de absorción de la hemoglobina que en
parte se solapa de forma considerable con los espectros de las
sustancias e indicadores (cromógenos) a detectar, lo cual puede
provocar errores de medición en el ensayo fotométrico. Por otro
lado, la hemoglobina puede incluso reaccionar químicamente con
componentes de la muestra, formándose nuevas sustancias que pueden
provocar errores de medición.
En los últimos tiempos, se preparan con
frecuencia creciente sustitutivos de la sangre, basados en la
hemoglobina, con fines terapéuticos, por ejemplo después de una
pérdida de sangre abundante. La hemoglobina de los sustitutivos de
la sangre puede ser de índole nativa o sintética. A menudo se
emplean incluso compuestos análogos de la Hb. A diferencia de la
hemólisis, en el caso de una terapia con sustitutivos de la sangre
hay que contar con un contenido de Hb en el suero o en el plasma
sanguíneo de más de 2000 mg/dl. Por lo tanto, las interferencias en
las muestras, que contienen sustitutivos de la sangre, suelen ser
mucho más acusadas que en las muestras hemolíticas, porque la
hemoglobina o el análogo sintético están presentes en forma libre
desde el principio.
Es especialmente acusada la interferencia de la
hemoglobina libre en la determinación fotométrica de la fosfatasa
alcalina. Para la determinación de la fosfatasa alcalina se mide la
formación del 4-nitrofenol a 415 nm (aumento de
extinción). La hemoglobina absorbe también a 415 nm. La presencia de
la hemoglobina interfiere en la determinación de la fosfatasa
alcalina en dos aspectos: por un lado se altera en medio básico el
espectro de la Hb en función del tiempo (disminución de la
extinción), por otro lado, a partir de una determinada concentración
de Hb se alcanza el límite fotométrico del aparato de medición.
Para eliminar las influencias química y
espectral que pueda tener la hemoglobina en el análisis de muestras
de suero o de plasma se han publicado diversos procedimientos en el
estado de la técnica.
Debido al fácil manejo de los aparatos
analíticos automatizados, además de la primera longitud de onda a
medir (longitud de onda principal) se utiliza a menudo una segunda
longitud de onda (longitud de onda secundaria), con la cual puede
eliminarse o por lo menos minimizarse la influencia de sustancias
interferentes, como son la hemoglobina, la bilirrubina y la
lipemia. En Clin. Chem. 25/6, 951-959, 1979,
Hahn y col. proponen elegir la longitud de onda secundaria de
manera que esta se halle en las cercanías del máximo de absorción
del cromógeno y cerca del máximo de absorción de la sustancia
interferente. Pero con los procedimientos de medición aquí
indicados no se puede eliminar las interferencias de la
determinación de la fosfatasa alcalina.
Jay y Provasek describen en Clin. Chem.
39/9, 1804-1810, 1993, que la interferencia
de la hemoglobina en la determinación de la fosfatasa alcalina se
debe a una alteración del espectro de la Hb que es función del
tiempo. Esta interferencia puede eliminarse con algoritmos
matemáticos de corrección (determinación de la concentración de la
Hb en la muestra y corrección del valor de fosfatasa alcalina medido
en una cuantía determinada, que es equivalente a la cantidad de Hb
medida).
Es verdad que la corrección matemática propuesta
por Jay y Provasek elimina la influencia de la Hb hasta por lo
menos 800 mg/dl de Hb, pero para el usuario resulta engorrosa de
aplicar, porque requiere una medición adicional del contenido de la
Hb y después una operación matemática de corrección.
Jay y Provasek (lugar citado) describen otro
método para eliminar las interferencias con la medición llamada de
Rate-Blank. La corrección de las interferencias de
la hemólisis mediante las mediciones de Rate-Blank
se describe también en el documento
EP-A-0 695 805. En este caso, antes
de la determinación fotométrica propiamente dicha de un componente
contenido en la muestra, se somete la muestra a una reacción previa,
que determina el grado de hemólisis de la muestra. El valor medido
que se obtiene a continuación se corrige en un valor, que se halla
por la correlación entre el grado de hemólisis y la aportación de
error de medición que tienen los componentes interferentes.
Con las mediciones de Rate-Blank
puede eliminarse la interferencia de la Hb, en cualquier caso solo
hasta un contenido de Hb de unos 1200 mg/dl, porque cuando el
contenido de Hb es mayor, entonces se rebasan los límites del
fotómetro. Es cierto que esto puede ser suficiente para la
eliminación de las interferencias de la hemólisis, pero en ningún
caso será suficiente para eliminar las interferencias causadas por
los sustitutivos de la sangre.
Otra posibilidad de eliminación de las
interferencias de la hemoglobina se ha publicado para la
determinación de la albúmina (solicitud PCT WO 97/45728), que
mediante combinaciones especiales de longitudes de onda principal y
secundarias se consigue la eliminación de las interferencias de la
hemoglobina. Sin embargo, las combinaciones de longitudes de onda
mencionadas no pueden utilizarse para la determinación de la
fosfatasa alcalina, porque con estas longitudes de onda no se
obtiene ninguna señal medible del 4-nitrofenol.
En la publicación del documento WO 97/45733 se
describe que con las longitudes de onda secundarias de 546 y 570 nm
pueden eliminarse las interferencias de la hemoglobina en los
ensayos UV individuales. Pero este procedimiento solo es aplicable
a ensayos UV enzimáticos con una longitud de onda principal a medir
de 340 nm. Una eliminación total de las interferencias de la Hb
solamente puede conseguirse con las longitudes de onda secundarias
de 546 ó 570 nm, pero esto no es posible en el caso de un ensayo
colorimétrico enzimático, por ejemplo para la determinación de la
fosfatasa alcalina, en el que la longitud de onda principal a medir
se sitúa en torno a 415 nm.
En la patente US-5,766,872 se
menciona que en la determinación de la amilasa, la longitud de onda
secundaria de 577 nm conduce a una reducción de la interferencia de
la hemólisis. Sin embargo, de los datos de medición presentados se
deduce que basta un contenido de Hb de 500 mg/dl para que surja una
desviación significativa de los valores medidos que puede situarse
hasta en un 8%. Esto es suficiente para suprimir la interferencia
de la hemólisis, pero en razón de la longitud de onda principal a
medir que se emplea, a saber 415 nm, es de esperar que un contenido
más elevado de Hb (que se presenta en la terapia con sustitutivo de
la sangre) esta desviación de los valores medidos puede ser también
mayor y entonces ya no se garantiza una eliminación suficiente de
las interferencias provocadas por la Hb.
En el documento
DE-A-196 28 484 se describe un
procedimiento para la eliminación de las interferencias provocadas
por la presencia de la hemoglobina libre. La interferencia de la
hemoglobina en las mediciones fotométricas, por ejemplo en la
determinación de la fosfatasa alcalina, se elimina añadiendo
compuestos de tipo peróxido a la muestra a analizar. Con ello se
produce un rápido blanqueo de la coloración debida a la hemoglobina
y la eliminación de las interferencias espectrales asociadas. La
medición de la muestra tratada con peróxido se realiza en
longitudes de onda comprendidas entre 380 y 450 nm y/o entre 520 y
590 nm. La determinación de la fosfatasa alcalina sin tratamiento
con peróxido no se ha publicado ni sugerido.
En el estado de la técnica no se conoce ningún
procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina sin
adición de peróxido que pueda realizarse sin interferencia en
presencia de concentraciones elevadas de Hb, por ejemplo las que
ocurren en las muestras que contienen sustitutivos de sangre.
Es, pues, un objetivo de la invención el
desarrollo de un procedimiento mejorado para la determinación de la
fosfatasa alcalina en una muestra, que permita superar en su mayor
parte los inconvenientes del estado de la técnica. Debería
facilitarse en especial un procedimiento sencillo y fácil de aplicar
para la determinación de la fosfatasa alcalina que permita eliminar
la interferencias causadas por la hemoglobina y los sustitutivos de
la sangren basados en la hemoglobina.
Este objetivo se alcanza con el procedimiento
que se define con detalle en las reivindicaciones para la
determinación de la fosfatasa alcalina en una muestra por medición
óptica. El procedimiento está caracterizado porque se emplea una
longitud de onda principal a medir de 450 \pm 10 nm y como
longitud de onda secundaria se emplea por lo menos una de las
longitudes de onda siguientes: de 480 \pm 10 nm, de 546 \pm 10
nm o de 575 \pm 10 nm. Se emplea con preferencia solamente una de
las longitudes de onda secundarias mencionadas.
Ahora se ha puesto de manifiesto de modo
sorprendente es posible una eliminación de las interferencias de la
Hb para la determinación de la fosfatasa alcalina cuando por un lado
se cambia la longitud de onda principal y por otro lado también una
longitud de onda secundaria. Para la eliminación suficiente de las
interferencias de la Hb no basta con cambiar la longitud de onda
principal o solamente la longitud de onda secundaria.
Gracias al espectro de absorción del
4-nitrofenol, la fosfatasa alcalina puede medirse no
solo a 415 nm, sino también a 450 \pm 10 nm. Es cierto que de
este modo la longitud de onda principal a medir no se halla en el
máximo de absorción empleado habitualmente para la reacción de
detección, sino en uno de sus flancos, pero la señal a medir que se
obtiene es suficiente para efectuar una determinación exacta de la
fosfatasa alcalina.
Con la elección de la nueva longitud de onda
principal a medir 450 \pm 10 nm se consigue ya una ligera
reducción de las interferencias de la a hemoglobina, pero la
eliminación total de las interferencias solamente se consigue, de
modo sorprendente, con la combinación de la longitud de onda
principal 450 \pm 10 nm y por lo menos una de las longitudes de
onda secundarias de 480 \pm 10 nm, de 546 \pm 10 nm o de 575
\pm 10 nm. Ha dado buenos resultados en especial una longitud de
onda segundaria de 570 nm. Para la determinación de la fosfatasa
alcalina por el método de la IFCC ha dado buenos resultados en
especial la longitud de onda secundaria de 480 \pm 10 nm para
eliminar las interferencias debidas a la Hb (ejemplo 2).
Se ha constatado que no son adecuadas para la
eliminación de las interferencias de la hemoglobina las siguientes
longitudes de onda secundarias: 340, 376, 505, 600, 660 y 700
nm.
Mediante el procedimiento de la invención es
posible por primera vez eliminar de manera sencilla las
interferencias causadas por la hemoglobina o los compuestos
análogos de la Hb en la determinación de la fosfatasa alcalina
hasta un contenido de Hb por lo menos de 3000 mg/dl. El límite
superior para la eliminación de las interferencias de la Hb se
sitúa en el límite determinado por la capacidad del fotómetro
empleado. Por lo tanto, hasta 6500 mg/dl de contenido de
hemoglobina cabe pensar que el procedimiento de la invención
permitirá una buena eliminación de las interferencias. La invención
es aplicable además para los diversos reactivos de determinación de
la fosfatasa alcalina, como puede deducirse de los ejemplos de 1 a
3.
El procedimiento de la invención es idóneo para
la determinación de cualquier tipo de muestras, que contengan
hemoglobina libre. El término "hemoglobina libre" en el sentido
de la invención se emplea para delimitar la hemoglobina al tipo que
existe en los eritrocitos intactos. Son ejemplos de muestras que
contienen hemoglobina libre las muestras de suero o plasma
hemolíticos o las muestras que contienen sustitutivos de la sangre.
Son ejemplos de sustitutivos de la sangre, contemplados en el
sentido de la presente invención dentro del término "hemoglobina
libre", los derivados de hemoglobinas derivatizados,
polimerizados, modificados o reticulados, en especial la
hemoglobina humana y la hemoglobina bovina, p.ej. la hemoglobina DCL
(diaspirin-crosslinked hemoglobin), así como la
hemoglobina obtenida por métodos recombinantes.
Es también objeto de la invención un método para
eliminar las interferencias causadas por la hemoglobina libre en un
procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina basado
en la medición óptica del p-nitrofenol. Este método
está caracterizado porque se emplea una longitud de onda principal a
medir de 450 \pm 10 nm y como longitud de onda secundaria por lo
menos una de las longitudes de onda siguientes: de 480 \pm 10 nm,
de 546 \pm 10 nm o de
575 \pm 10 nm.
575 \pm 10 nm.
Otro objeto de la invención es el uso de una
longitud de onda principal a medir de 450 \pm 10 nm en combinación
con por lo menos una de las longitudes de onda secundarias
siguientes: de 480 \pm 10 nm, de 546 \pm 10 nm o de
575 \pm 10 nm para eliminar la interferencias causadas por la hemoglobina libre o por sustitutivos de la sangre obtenidos a partir de hemoglobina en un procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina.
575 \pm 10 nm para eliminar la interferencias causadas por la hemoglobina libre o por sustitutivos de la sangre obtenidos a partir de hemoglobina en un procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina.
En los ejemplos siguientes se ilustra la
invención con mayor detalle.
Una parte de una recogida de suero se mezcla con
una solución que contiene Hb, de tal manera que el contenido de Hb
se sitúe por lo menos en 3000 mg/dl. Otra parte de igual tamaño de
la misma recogida de suero se mezcla con una cantidad equivalente
de una solución de NaCl (154 mmoles/l). Después se mezclan ambas
partes entre sí en diferentes proporciones de manera que se obtenga
una serie de concentraciones de Hb con las 11 muestras, en la que
la muestra más baja no contiene Hb y la muestra más alta contiene
por lo menos 3000 mg/dl de Hb.
Determinación siguiendo las recomendaciones de
la Société Française de Biologie Clinique, publicadas en Ann. Biol.
Clin. vol. 35, 271, 1977.
La determinación de la fosfatasa alcalina se
efectúa en aparato analítico Boehringer Mannheim/Hitachi 911.
Se emplean los reactivos siguientes:
Reactivo
1
930 mmoles/l de tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol,
pH 10,5; 1,03 mmoles/l de aspartato magnésico.
Reactivo
2
930 mmoles/l de tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol,
pH 10,5; 1,03 mmoles/l aspartato magnésico; 98 mmoles/l de fosfato
de 4-nitrofenilo.
El ensayo se realiza del modo siguiente: a 11
\mul de muestra se les añaden 250 \mul del reactivo 1 y después
de 5 min 50 \mul del reactivo 2. La determinación del analito se
realiza para las mediciones comparativas después de pasados otros
50 s, a lo largo de un período de 4 min, midiéndose los cambios de
la extinción durante estos 4 min. Para la medición se emplean
combinaciones de las siguientes longitudes de onda principal a medir
(\lambda_{1}) y longitudes de onda secundarias
(\lambda_{2}): \lambda_{1}/\lambda_{2} = 415/546 nm,
415/570 nm, 415/660 nm y 450/660 nm (comparación) así como 450/546
nm y 450/570 nm (invención).
\newpage
Para la comparación adicional se realiza la
determinación de la fosfatasa alcalina mediante la medición de
Rate-Blank propuesta por Jay y Provasek (denominada
"415/660 nm RB").
Los resultados se recogen en la siguiente tabla
1. Se observa que cuando se emplean combinaciones de longitudes de
onda de la invención de 450/546 nm o bien 450/570 nm se reduce
significativamente la influencia de la hemoglobina si se compara
con otras combinaciones de longitudes de onda a medir o con la
medición de Rate-Blank.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación se realiza con arreglo a las
recomendaciones de la International Federation of Clinical
Chemistry, publicadas en J. Clin. Chem. Clin. Biochem. vol.
21, 731-748, 1983.
La determinación se realiza en un aparato
analítico Boehringer Mannheim/Hitachi 911.
Se emplean los reactivos siguientes:
Reactivo
1
360 mmoles/l de tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol,
pH 10,4 (30ºC); 2,04 mmoles/l de acetato magnésico; 1,02 mmoles/l
de sulfato de cinc; 2,04 mmoles/l de ácido
N-(2-hidroxietil)-etilendiaminotriacético).
Reactivo
2
360 mmoles/l de tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol,
pH 10,4 (30ºC); 2,04 mmoles/l de acetato magnésico; 1,02 mmoles/l
de sulfato de cinc; 2,04 mmoles/l de ácido
N-(2-hidroxietil)-etilendiaminotriacético);
104 mmoles/l de fosfato de 4-nitrofenilo.
El ensayo se realiza del modo siguiente: a una
muestra de 7 \mul se le añaden 250 \mul del reactivo 1 y después
de 5 min 60 \mul del reactivo 2. La determinación del analito se
efectúa al cabo de otros 50 s durante un tiempo de 4 min,
midiéndose el cambio de extinción durante estos 4 min. Para la
medición se emplean combinaciones de las siguientes longitudes de
onda principal (\lambda_{1}) y secundaria (\lambda_{2}):
\lambda_{1}/\lambda_{2} = 415/700 nm (comparación) y 450/480
nm (invención).
Los resultados se recogen en la tabla 2. Se
observa que empleando la combinación de las longitudes de onda de
la invención de 450/480 nm se reduce significativamente la
influencia de la hemoglobina si se compara con la anterior
combinación de longitudes de onda de 415/700 nm y que en el caso de
contenido muy alto de Hb aparecen incluso valores negativos.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación se realiza con arreglo a las
recomendaciones de la Sociedad Alemania de Química Clínica,
publicadas en Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. vol. 10, 290,
1972.
La determinación se realiza en un aparato
analítico Boehringer Mannheim/Hitachi 911.
Se emplean los reactivos siguientes:
Reactivo
1
1,02 mmoles/l de tampón de dietanolamina, pH
9,8; 0,51 mmoles/l de cloruro magnésico.
Reactivo
2
1,02 mmoles/l de tampón de dietanolamina, pH
9,8; 0,51 mmoles/l de cloruro magnésico; 61 mmoles/l de fosfato de
4-nitrofenilo.
El ensayo se realiza del modo siguiente: a una
muestra de 4 \mul se le añaden 250 \mul del reactivo 1 y después
de 5 min 50 \mul del reactivo 2. La determinación del analito se
efectúa al cabo de otros 50 s durante un tiempo de 4 min,
midiéndose el cambio de extinción durante estos 4 min. Para la
medición se emplean combinaciones de las siguientes longitudes de
onda principal (\lambda_{1}) y secundaria (\lambda_{2}):
\lambda_{1}/\lambda_{2} = 415/700 nm (comparación) y 450/546
nm (invención).
Los resultados se recogen en la tabla 3. Se
observa que empleando la combinación de las longitudes de onda de
la invención de 450/546 nm se reduce significativamente la
influencia de la hemoglobina si se compara con la anterior
combinación de longitudes de onda de 415/700 nm y que en el caso de
contenido muy alto de Hb aparecen incluso valores negativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Procedimiento para la determinación de la
fosfatasa alcalina en una muestra por medición óptica del
p-nitrofenol, caracterizado porque se emplea
una longitud de onda principal a medir de 450 \pm 10 nm y como
longitud de onda secundaria por lo menos una de las siguientes
longitudes de onda: de 480 \pm 10 nm, de 546 \pm 10 nm o de 575
\pm 10 nm.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como longitud de onda secundaria se
emplea la de 480 \pm 10 nm.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como longitud de onda secundaria se
emplea la de 546 \pm 10 nm.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como longitud de onda secundaria se
emplea la de 575 \pm 10 nm.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como longitud de onda secundaria se
emplea la de 570 nm.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
determinación se efectúa en una muestra de suero o de plasma.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analiza
una muestra que contiene hemoglobina libre o un sustitutivo de
sangre obtenido a partir de hemoglobina.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el sustitutivo de la sangre es una
hemoglobina humana derivatizada, modificada o reticulada o una
hemoglobina bovina o una hemoglobina obtenida por métodos
recombinantes.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra
tiene un contenido de hemoglobina de hasta 6500 mg/dl.
10. Método para la eliminación de interferencias
provocadas por la hemoglobina libre o por sustitutivos de la
sangre, en un procedimiento para la determinación de la fosfatasa
alcalina según la reivindicación 1, caracterizado porque se
emplea una longitud de onda principal a medir de 450 \pm 10 nm y
como longitud de onda secundaria por lo menos una de las siguientes
longitudes de onda: de 480 \pm 10 nm, de 546 \pm 10 nm o de 575
\pm 10 nm.
11. Uso de una longitud de onda principal a
medir de 450 \pm 10 nm en combinación por lo menos con una
longitud de onda secundaria elegida entre las siguientes: de 480
\pm 10 nm, de 546 \pm 10 nm o de 575 \pm 10 nm para la
eliminación de las interferencias provocadas por la hemoglobina o
por sustitutivos de la sangre en un procedimiento según la
reivindicación 1 para la determinación de la fosfatasa alcalina.
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