ES2275890T3 - Composicion que presenta actividad bacteriostatica y bactericida contra esporas bacterianas y celulas vegetativas y procedimiento para el tratamiento de alimentos con la misma. - Google Patents

Composicion que presenta actividad bacteriostatica y bactericida contra esporas bacterianas y celulas vegetativas y procedimiento para el tratamiento de alimentos con la misma. Download PDF

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Abstract

Composición para el tratamiento de alimentos, que presenta actividad bacteriostática y bactericida contra bacterias perjudiciales en los alimentos, que comprende por lo menos un metabolito propionibacteriano en combinación con: a) un lantibiótico; b) un enzima lítico; y c) un ácido orgánico o su sal.

Description

Composición que presenta actividad bacteriostática y bactericida contra esporas bacterianas y células vegetativas y procedimiento para el tratamiento de alimentos con la misma.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición que presenta actividad bacteriostática y bactericida contra bacterias no deseables presentes en los alimentos, y a un procedimiento para el tratamiento de alimentos con dicha composición con el fin de que el alimento resulte más resistente al deterioro y más seguro para el consumo.
2. Descripción de la técnica relacionada
Los procedimientos y las composiciones para el tratamiento de productos alimenticios para la prevención o para la inhibición del deterioro por bacterias y/o del desarrollo de bacterias perjudiciales se utilizan ampliamente. En la esterilización comercial de los alimentos poco ácidos (es decir, pH>4,5) es una práctica habitual aplicar a alimentos enlatados o envasados una combinación de calor y presión suficiente para conseguir por lo menos una reducción de 12 decimales (12D) de las esporas de Clostridium botulinum, consideradas las más resistentes al calor de entre las bacterias peligrosas que se encuentran en los alimentos, por su capacidad de formar esporas altamente resistentes al calor que sobreviven a procedimientos menos agresivos. Por desgracia, los procedimientos típicos de esterilización 12D pueden alterar el aspecto y el sabor de los alimentos, haciéndolos menos deseables que los alimentos que se procesan a temperaturas que resultan menos letales (subletales) para las esporas de C. botulinum.
En los últimos años, se han sometido más alimentos al tratamiento con dosis subletales de calor, presión, irradiación, ultrasonido, o de combinaciones de los mismos, que pueden reducir los niveles bacterianos de un producto alimenticio, proporcionando simultáneamente un producto alimenticio organolépticamente más atractivo. Estos tratamientos de procesamiento subletales alteran los productos alimenticios menos drásticamente que los tratamientos térmicos tradicionales 12D utilizados para la esterilización de productos alimenticios, pero la mayoría de los alimentos procesados de esta manera, deben refrigerarse a continuación para protegerlos frente a la posible extensión de bacterias formadoras de esporas.
Mientras que los tratamientos de procesamiento subletales eliminan la mayoría de las células bacterianas patogénicas y de deterioro vegetativo, típicamente eliminan solamente una fracción de las esporas bacterianas potenciales, que presentan una resistencia elevada al calor, a la irradiación y a otros tratamientos. Dichas esporas pueden sobrevivir a los tratamientos de procesamiento subletales y crecer posteriormente en el alimento procesado, causando el deterioro, enfermedades y, en los peores casos, la muerte. Por ello, la mayoría de los alimentos tratados de esta manera se refrigeran para retrasar o prevenir el crecimiento de dichas esporas.
Son numerosos los productos alimenticios infectados por estas bacterias formadoras de esporas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, platos principales y entrantes listos para consumir, ensaladas delicatessen, productos lácteos, aliños y condimentos, carnes procesadas o curadas, aves, y frutos del mar, así como frutas y verduras procesadas, productos derivados de frutas y de verduras, cereales y productos derivados de cereales, pastas, sopas, y alimentos envasados asépticamente. La larga vida de almacenamiento refrigerado de los alimentos listos para consumir, especialmente de los productos alimenticios envasados al vacío, envasados en atmósfera modificada (MAPA), y enlatados, puede resultar especialmente problemática debido a que podría permitir que las esporas de algunas bacterias, tales como Clostridium Botulinum, germinen y crezcan en el alimento, produciendo toxinas letales. Dicho riesgo puede ser más elevado en los alimentos procesados subletalmente debido a que los procedimientos subletales típicamente destruyen la especie vegetativa no patogénica de las bacterias que, de otra manera, dañaría o competiría con la especie formadora de esporas. Un riesgo exacerbante adicional en esta clase de alimentos es la utilización de procedimientos de envasado al vacío o de envasado en atmósfera modificada, que producen las condiciones anaeróbicas necesarias para el desarrollo y el crecimiento de esporas clostridiales.
Se ha llevado asimismo a cabo una amplia investigación en el campo de la seguridad de los alimentos para de-
sarrollar composiciones de grado alimentario que puedan funcionar como agentes antibacterianos. Se pueden encontrar antecedentes de la técnica relevantes en las patentes US nº 5.096.718 y US nº 5.260.061, y en las referencias citadas en las mismas. Estas patentes dan a conocer la utilización de metabolitos de las bacterias del ácido propiónico en algunos alimentos para el incremento de la vida útil de los productos resultantes. Estos metabolitos demuestran eficacia contra bacterias gram negativas pero típicamente no resultan tan efectivos contra las bacterias gram positivas o sus
esporas.
La patente JP nº 07-115950 da a conocer la combinación de las bacteriocinas producidas por las bacterias del ácido láctico del género Propionibacteria conjuntamente con ácidos orgánicos y sus sales, ésteres de ácido graso de alcoholes polihídricos, aminoácidos, péptidos y proteínas antibacterianas, polisacáridos que comprenden azúcares, ácidos sacáricos y aminoazúcares y sus productos de descomposición parcial, especias y sus aceites esenciales, y componentes vegetales y alcoholes.
La patente US nº 5.217.250 da a conocer la utilización de composiciones de nisina como bactericidas. La nisina es un lantibiótico, más específicamente, un polipéptido con propiedades antimicrobianas producido en la Naturaleza por diversas cepas de la bacteria Streptococcus Lactis. La nisina principalmente resulta efectiva contra bacterias gram positivas. Dicha patente da a conocer que la combinación de un agente quelante, tal como EDTA u otras sales acetato o sales citrato, con la nisina puede dar lugar a un bactericida de amplio espectro.
La patente US nº 5.458.876 da a conocer la combinación de un lantibiótico con lisozima como composición antibacteriana.
La patente EP nº 0 466 244 da a conocer una composición con características antibacterianas mejoradas, que es una mezcla de por lo menos uno de cada uno de los grupos de compuestos siguientes: (I) una sustancia que provoca la lisis de la pared celular o una sal de la misma, (II) un compuesto antibacteriano, y (III) un adyuvante seleccionado de entre los ácidos orgánicos aceptables para la utilización en productos alimenticios, preparados para uso cosmético o la higiene personal, o sales de estos ácidos; fosfatos y fosfatos condensados o sus ácidos correspondientes; y otros agentes secuestrantes. Preferentemente (I) es lisozima, (II) puede ser una bacteriocina (por ejemplo la nisina o la pediocina), y (III) puede ser ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido tartárico, ortofosfatos, hexametafosfatos, tripolifosfatos, otros polifosfatos, o agentes inhibidores que contengan grupos amino sustituidos o no sustituidos, por ejemplo EDTA.
La patente EP nº 0 453 860 da a conocer la combinación de la nisina con un tampón de fosfato efectivo a un pH de entre 5,5 y 6,5 para ayudar a erradicar las bacterias gram negativas de superficies.
La patente US nº 5.989.612 da a conocer la combinación de un metabolito propionibacteriano, no solamente el ácido propiónico, con una sustancia potenciadora, incluyendo quelantes, aceites esenciales, o ácidos orgánicos (con excepción del ácido propiónico, del ácido acético, del ácido láctico, y de sus sales respectivas).
La patente US nº 6.207.210 da a conocer la combinación de un metabolito propionibacteriano, no solamente el ácido propiónico, un lantibiótico, y una o más sales fosfato que actúan como agentes quelantes.
Todavía resultaría beneficioso desarrollar una composición antibacteriana efectiva tanto frente a las bacterias gram positivas como frente a las bacterias gram negativas, así como frente a las esporas gram positivas, especialmente en alimentos sometidos a un tratamiento de procesamiento subletal (inferior a 12D).
Sumario de la invención
Se ha descubierto, de manera bastante inesperada, que una composición para el tratamiento de alimentos que contiene por lo menos un metabolito propionibacteriano en combinación con (a) antibióticos, (b) enzimas líticos, y (c) ácidos orgánicos y/o sales de ácido orgánico, demuestra excelente actividades bacteriostática y bactericida contra las bacterias vegetativas gram positivas y gram negativas, así como frente a las bacterias formadoras de esporas gram positivas que típicamente se encuentran sobre o dentro de los alimentos. Esta composición resulta especialmente efectiva, al ser tanto bacteriostática como bactericida contra bacterias patogénicas potencialmente perjudiciales transportadas por los alimentos cuando se utiliza conjuntamente con unos o más tratamientos de procesamiento subletales.
En formas de realización particularmente preferidas, el lantibiótico (a) de la composición de la presente memoria es nisina o lacticina; el enzima lítico (b) es lisozima o quitinasa; y el ácido orgánico y/o la sal del ácido orgánico (c) se selecciona de entre el grupo constituido por ácido acético, una sal del ácido acético, tal como acetato sódico, diacetato sódico, o acetato potásico, ácido láctico, una sal del ácido láctico, tal como lactato sódico o lactato potásico, ácido propiónico, propionatos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, propionato sódico y propionato potásico, ácido cítrico, una sal del ácido cítrico, tal como citrato sódico o citrato potásico, o mezclas de los mismos.
Todavía en otra forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la reducción del recuento de bacterias totales o la población bacteriana en el interior de o sobre un alimento mediante la aplicación en el alimento de una cantidad bacteriostática efectiva y una cantidad bactericida efectiva de la composición indicada anteriormente.
En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un producto alimenticio que presenta una población bacteriana viva reducida como resultado de haber aplicado sobre el mismo una cantidad bacteriostática efectiva y bactericida efectiva de la composición indicada anteriormente.
En la práctica, la composición de materia según la presente invención se puede aplicar en un alimento conjuntamente con uno o más tratamientos de procesamiento subletales, tales como, por ejemplo, el tratamiento térmico subletal.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
La composición antibacteriana de la presente invención contiene por lo menos un metabolito propionibacteriano conjuntamente con (a) lantibióticos, (b) enzimas líticos y (c) ácidos orgánicos y/o sales de ácido orgánico. La composición antibacteriana demuestra actividades bacteriostática y bactericida mejoradas contra las bacterias vegetativas gram positivas y gram negativas, así como frente a las esporas gram positivas que típicamente se encuentran sobre o en el interior de los alimentos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "metabolito" se refiere a una sustancia orgánica, con excepción del agua o del dióxido de carbono, producida por la propionibacteria. Las expresiones "bacteriostática" o "bacteriostática efectiva" se refieren a la capacidad de una sustancia o de una composición de impedir la extensión o la multiplicación de bacterias. Las expresiones "bactericida" o "bactericida efectiva" se refieren a la característica de una sustancia o de una composición para destruir, es decir, eliminar, bacterias. Las expresiones "metabolito activo" y "el metabolito inhibitorio", se refieren ambas a un metabolito bacteriostático.
La expresión "enzima lítico" incluye cualquier sustancia capaz de degradar la pared celular bacteriana que resulta en la lisis (y la muerte) de la célula.
La expresión "bacterias perjudiciales" incluye todos los organismos bacterianos presentes en un alimento que causan, aceleran, participan, o de otra manera, desempeñen un papel en el deterioro del alimento y/o que puedan resultar perjudiciales para la salud, especialmente para la salud humana, si se ingieren las bacterias o sus subproductos (por ejemplo, las toxinas).
El término "alimento" o la expresión "producto alimenticio" comprenden todas las sustancias y composiciones nutritivas comestibles, especialmente las destinadas al consumo humano, e incluye composiciones y sustancias nutritivas tanto no procesadas como procesadas, por ejemplo, cocinadas. La expresión "presente en alimento" se refiere a todas las superficies externas e interiores y/o a las porciones de un alimento que alojan bacterias perjudicia-
les.
Para los fines de la presente invención, se define la expresión "tratamiento subletal" como cualquier operación que resulte suficiente para reducir significativamente la población bacteriana de un alimento pero que resulta insuficiente para efectuar una reducción de 12 decimales (12D) de las esporas de C. botulinum. Entre los tratamientos subletales que se contemplan en la presente memoria se incluyen calor, irradiación, presión, ultrasonidos, ozono, nitrito, etc., que, cuando se aplican a un alimento, reducen significativamente su recuento de bacterias pero que resultan insuficientes para efectuar una reducción de 12 decimales (12D) de las esporas de C. botulinum.
El primer componente de la composición para el tratamiento de alimentos de la presente invención es una cantidad bacteriostática efectiva de por lo menos un metabolito propionibacteriano. Estos metabolitos se dan a conocer a las patentes US nº 5.096.718 y nº 5.260.061, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia. Estos metabolitos pueden inhibir el crecimiento o la multiplicación bacteriana, particularmente en el caso de las bacterias gram negativas. Este efecto se puede conseguir sin resultar en un sabor, olor o apariencia no deseables, incluso en los alimentos "de sabor delicado", que perjudicaría a su aceptación.
El metabolito se puede obtener cultivando la propionibacteria, por ejemplo Propionibacterium shermanii, P. freudenreichii, P. pentosaceum, P. thoenii, P. arabinosum, P. rubrum, P. jensenii, P. peterssonii, y especies relacionadas (tal como se identifican en Malik et al., Can. J. Microbiol. 14:1185, 1968). Las cepas de Propionibacterium identificadas por número se encuentran disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC). Otros cultivos se encuentran ampliamente disponibles o se pueden obtener de Oregon State University, Corvallis, Oregon, sin coste alguno. Por ejemplo, la subespecie shermanii de Propionibacterium freudenreichii, cepa de la ATCC nº 9.616, se puede utilizar de acuerdo con la presente invención.
Aunque el ácido propiónico se puede utilizar en la presente invención, es generalmente conocido por los expertos en la materia que proporciona un sabor fuerte a los alimentos. Aunque dichos sabores resultan deseables en algunos alimentos, tales como el queso suizo, en muchos alimentos resultan no deseables. Las composiciones fermentadas de fracción completa que contienen otros metabolitos propionibacterianos en una mezcla demuestran actividad antibacteriana sin los sabores fuertes que se asocian al ácido propiónico. Entre los ejemplos de dichas composiciones que contienen estos metabolitos se incluyen los comercializados por la empresa Rhodia Inc. bajo la marca comercial MICROGARD®.
Los cultivos de Propionibacterium se pueden utilizar para producir un ingrediente alimenticio, incluyendo unos o más metabolitos, que pueden inhibir las bacterias gram negativas al pH normal de muchos alimentos. Los metabolitos, que se pueden obtener como subproductos de la fermentación del cultivo propionibacteriano de la leche desnatada u otro medio de fermentación adecuado, pueden servir como aditivos saborizantes y también pueden ser inhibitorios de varios microorganismos tras finalizar la fermentación. El grado de inhibición alcanzado para las mezclas de los metabolitos estudiados es mayor que con sólo ácido propiónico, favoreciendo la utilización de, por ejemplo, las composiciones de MICROGARD®. La vida de almacenamiento de un producto alimenticio se alarga proporcionando en el interior de o sobre el producto uno o más de dichos metabolitos activos conjuntamente con los demás componentes de la composición de la presente invención.
El medio de cultivo para las especies de Propionibacterium se puede formular con leche, suero, o dextrosa, más extractos de levadura, hidrolizados de proteínas, o cualquier otro estimulante que contenga proteínas. Se pueden incorporar diversos tampones, sales, ácidos, y otros adyuvantes de procesamiento para incrementar la producción de metabolito y para mejorar la manipulabilidad de la composición final. El líquido de cultivo, tras el desarrollo de las propionibacterias hasta aproximadamente 10^{6} a 10^{10} células por ml, puede someterse a un tratamiento térmico (pasterización) para eliminar las bacterias inoculadas y oportunistas antes de la utilización de medios de cultivo que contienen metabolitos, en forma líquida, condensada, deshidratada, o congelada.
Para facilitar el almacenamiento y transporte, la mezcla de cultivo de propionibacterias se puede evaporar y congelar, o concentrar y deshidratar, por ejemplo mediante deshidratación por aspersión o liofilización, para formar unos polvos. Los metabolitos se pueden separar o purificar, o utilizarse en forma de mezcla. Los metabolitos naturales pulverizados o líquidos de propionibacterias se pueden incorporar en diversos alimentos y piensos para que resulten menos susceptibles al deterioro por el crecimiento y/o la actividad enzimática de bacterias gram negativas. La actividad antideterioro también se puede obtener incorporando propionibacterias viables directamente en el
alimento.
En la mayoría de los casos, se puede obtener mejorar sustancialmente la reducción bacteriana mediante la inclusión en la composición antibacteriana de materia de la presente invención de una cantidad de metabolitos propionibacterianos suficientemente reducida para no presentar efectos perjudiciales sobre el sabor o el aroma del producto alimenticio. Más específicamente, el producto líquido, condensado o deshidratado, que típicamente comprende sólidos o líquidos cultivados pasterizados que contienen los metabolitos propionibacterianos además de los demás componentes de la composición antibacteriana de materia de la presente invención, generalmente se añade al producto alimenticio de manera que las cantidades de los metabolitos propionibacterianos se encuentren comprendidas entre aproximadamente 0,01 por ciento y aproximadamente 2,0 por ciento en peso del producto, preferentemente entre aproximadamente 0,05 por ciento y aproximadamente 1,0 por ciento en peso del producto, y más preferentemente entre aproximadamente 0,1 por ciento y aproximadamente 0,75 por ciento en peso del producto. En el caso de que la composición de materia se añada a una mezcla seca a la que se añaden ingredientes líquidos y se cocine a continuación, como por ejemplo un pastel, la cantidad se añade en peso de mezcla seca antes de la
cocción.
Los materiales comercialmente disponibles, más específicamente, los sólidos o líquidos cultivados pasterizados que incluyen metabolitos propionibacterianos, son comercializados por Rhodia Inc. bajo la marca comercial MICROGARD®. Estos productos son fermentados de fracción completa sin purificar de la leche o de productos similares. MICROGARD® MG 100 es una leche desnatada cultivada pasterizada que se estandariza con sólidos de leche desnatada y deshidratada por aspersión. MICROGARD® MG 200 es una dextrosa cultivada pasterizada estandarizada con maltodextrina y deshidratada por aspersión. MICROGARD® MG 250 es una versión condensada (congelada o líquida) del producto de dextrosa cultivada.
Las composiciones para el tratamiento de alimentos de la presente invención pueden incluir asimismo una cantidad bactericida efectiva de por lo menos un lantibiótico como segundo componente. El término "lantibióticos" fue acuñado por Schnell et al. (Nature 333:276-278, 1988) para describir un grupo de sustancias bactericidas que contienen el aminoácido lantionina y otros aminoácidos no proteicos. Las propiedades comunes de estos bactericidas se revisan en Kellner et al. (Eur. Jo. Biochem 177:53-59 (1988)) en el que apuntan que "... los antibióticos polipeptídicos policíclicos poseen un contenido elevado de aminoácidos insaturados (deshidroalanina, deshidrobutirina y aminoácidos tioéter (mesolantionina, (2S, 3S, 6R)-3-metilantionina). Además, en algunos se encuentran presentes la lisinoalanina, el ácido 3-hidroxiaspártico y la S-(2-aminovinil)-D-citosina". Entre los lantibióticos se incluyen nisina, subtilina, pep 5, epidermina, galidermina, cinamicina, Ro09-0198, duramicina y ancovenina. Los antibióticos peptídicos sintetizados ribosómicamente contienen entre 19 y 34 aminoácidos y son producidos por diversos microorganismos, incluyendo especies de Staphylococcus, de Bacillus y de Streptomyces. Además de su composición única de aminoácidos no proteicos, pueden distinguirse de otros antibióticos polipeptídicos según su especificidad. Las bacteriocinas en general, y los lantibióticos en particular, se caracterizan por un espectro de acción muy estrecho. De esta manera, solamente algunas especies de bacterias son sensibles a una bacteriocina particular a concentraciones prácticas. Esto contrasta con otros antibióticos polipeptídicos de amplio espectro que son activos contra la mayoría de bacterias, y de los "péptidos líticos" comentados por Jaynes et al. en la solicitud de patente internacional publicada WO nº 89/00194, que son activos contra la mayoría de bacterias, levaduras, e incluso de células de
mamífero.
La nisina, una de las bacteriocinas mejor caracterizadas, es un péptido cifrado ribosómicamente que se halla ocasionalmente en forma de dímero, con un peso molecular de aproximadamente 7.000. "Nisina" es el término colectivo que describe varias sustancias estrechamente relacionadas que muestran composiciones de aminoácidos similares, y un espectro limitado de actividad antibiótica. Este fenómeno es comentado por E. Lipinska en "Antibiotics and Antibiosis in Agriculture" (M. Woobine, editor), páginas 103-130. La nisina contiene varios aminoácidos poco habituales, incluyendo la beta-metilantionina, la dehidroalanina, y la lantionina entre el total de sus 34 aminoácidos. En el péptido existen cinco enlaces tioéter poco habituales que contribuyen a su estabilidad en soluciones ácidas. La nisina comparte con otros lantibióticos una homología de estructura y de acción notables, por ejemplo con la subtilina y la epidermina (Buchman et al. J. Bio. Chem 263(31): 16260-16266, 1988). Entre las últimas revisiones de la nisina, de sus propiedades físicas y de sus usos se incluyen: "Bacteriocins of Lactic Acid bacteria", T.R. Klaenhammer, Biochimie 70:337-349 (1988), "Nisina", A. Hurst, Avd. Appl. Microbiol. 27:85-121 (1981), y la patente US nº
4.740.593.
La utilización de la nisina para combatir la L. monocytogenes ha sido dada a conocer por M. Doyle; "Effect of Environmental and Processing Conditions of Listeria Monocytogenes", Food Technolgy, 42(4):169-171, 1988. Este artículo describe la inhibición inicial del crecimiento del organismo (durante aproximadamente 12 horas) e informa que la L. monocytogenes puede crecer a un nivel de pH de tan sólo 5,0 y que es resistente al pH alcalino, con capacidad para crecer a un pH de 9,6.
Por sí misma, la nisina no es un antimicrobiano tan efectivo en medios complejos, tales como los alimentos. Por ejemplo, es conocido que la actividad de la nisina contra C. botulinum decrece típicamente en medios complejos, tales como los alimentos (Rogers y Montbile, J. Food Sci. 59(3):663-668, 1994).
La nisina se encuentra disponible comercialmente de Rhodia Inc. en una preparación estandarizada de porcentaje en peso de 2,5 bajo la marca comercial Novasim™. Cuando se añade la nisina como componente de la composición antibacteriana de la presente invención, puede encontrarse presente en cantidades de entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 10% en peso de la composición antibacteriana.
Los lantibióticos que contienen proteínas pueden pueden asimismo encontrarse presentes en forma de subproducto de fermentación de bajo nivel en determinadas variedades de queso cheddar y de queso americano, y en el producto fermentado de leche desnatada conocido como MICROGARD® MG300. Cuando se añade un lantibiótico a una composición antibacteriana de la presente invención en forma de un producto de leche fermentada tal como MICROGARD® MG300, las cantidades utilizadas de MICROGARD® MG300 pueden encontrarse comprendidas entre aproximadamente 75% y aproximadamente 96% en peso de la composición antibacteriana.
En la práctica, cuando se utiliza un lantibiótico como componente de la composición antibacteriana de la presente invención, el lantibiótico se añade al producto alimenticio de manera que se encuentre presente en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1 ppm y aproximadamente 100 ppm (en peso de producto alimenticio) de ingrediente activo (es decir, de nisina), con niveles preferidos comprendidos entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12,5 ppm, basados en la seguridad y la conveniencia de utilización en diferentes alimentos.
Como alternativas a los lantibióticos indicados anteriormente, un metabolito bacteriano de Pediococcus, específicamente la pediocina, puede proporcionar resultados eficaces en la composición de la presente invención. Además, la nueva clase de bacteriocinas estreptocócicas denominadas lacticinas, específicamente la lacticina 3147, tal como se describe en la patente WO nº 96/32482, debería producir una actividad similar contra las bacterias gram positivas. Tanto las pediocinas como las lacticinas presentan actividad bacteriostática principalmente contra un espectro limitado de bacterias gram positivas.
En una forma de realización preferida, se utiliza la nisina o la lacticina como el lantibiótico en la composición de materia de la presente invención.
Otro componente de la composición antibacteriana de la presente invención puede ser una sustancia de lisis de la pared celular, tal como un enzima lítico. Estas enzimas se pueden utilizar para controlar o para prevenir el crecimiento de microorganismos diana. Para que un enzima lítico resulte útil como componente o agente antibacteriano en la industria alimentaria, debe ser capaz de degradar un amplio espectro de bacterias, particularmente las que provocan el deterioro de los alimentos y/o resultan patógenas.
En una forma de realización preferida, se utiliza una lisozima como enzima lítico. Las lisozimas (muramidasa; mucopéptido N-acetilmucamoilhidrolasa; 1-4-beta-N-acetilhexosaminodasa, E.C. 3.2.1.17) son enzimas líticos bien conocidos que han sido aislados de diversas fuentes y que han sido bien caracterizados. Más comúnmente, las lisozimas se derivan de la albúmina de huevo en un procedimiento de extracción de grado alimentario, aunque se encuentran asimismo disponibles a partir de crustáceos del Ártico, de leche humana, de lágrimas, y de otras fuentes naturales. Descubierto en 1922 por W. Flemming, la lisozima de clara de huevo fue de las primeras proteínas secuenciadas, la primera para la que se propuso una estructura tridimensional utilizando cristalografía de rayos X, y la primera para la que se propuso un mecanismo detallado de acción. Su actividad antimicrobiana contra las bacterias gram positivas ha sido bien documentada, por ejemplo por V.N. Procter et al., en: CRC Crit. Reviews in Food Science and Nutrition, 26(4):359-395, 1988. El peso molecular de la lisozima de clara de huevo es de aproximadamente 14.300 a 14.600, el punto isoeléctrico se encuentra a un pH entre 10,5 y 10,7. Se compone de 129 aminoácidos interconectados mediante 4 puentes disulfuro. Se han aislado y caracterizado enzimas similares de otras fuentes, incluyendo productores tan diversos como Escherichia coli y las lágrimas humanas. A pesar de las leves diferencias (por ejemplo, la lisozima humana presenta 130 aminoácidos), la capacidad para la hidrólisis de los polímeros de acetilhexosamina esencialmente es la misma. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, para los fines de la presente invención, el término lisozima pretende incluir los enzimas degradantes de las paredes celulares o de los peptidoglicanos, con la capacidad de hidrolizar la acetilhexosamina y polímeros relacionados.
Es sabido que la lisozima elimina o inhibe el crecimiento de bacterias y hongos, y se utiliza en Europa para controlar el crecimiento del organismo contaminante Clostridium tyrobutyricum en una extensa variedad de quesos. También ha sido propuesta para la utilización en una diversidad de otras aplicaciones de conservación de los alimentos y se ha dado a conocer que inhibe el crecimiento (y en algunos casos elimina) de Listeria monocytogenes (Hugey et al., Appl. Environ. Microbiol 53:2165-2170, 1987). La lisozima derivada de albúmina de huevo con una actividad de aproximadamente 20.000 unidades Shugar/mg se encuentra comercialmente disponible de Rhodia bajo la marca comercial NovaGARD™.
Cuando la lisozima se utiliza como antimicrobiano en los alimentos, se añade al producto alimenticio en cantidades comprendidas entre aproximadamente 20 ppm y aproximadamente 500 ppm en peso de la solución utilizada para el tratamiento, más preferente entre aproximadamente 50 ppm y aproximadamente 200 ppm, principalmente para inhibir Clostridum tyrobutyricum en los quesos curados. A estos niveles la lisozima no es bactericida contra otras bacterias gram positivas, aunque se ha utilizado a niveles superiores (superiores a 100 ppm, típicamente de 2.000 ppm o superiores) para eliminar la pared celular de un amplio espectro de bacterias gram positivas.
Cuando la lisozima se añade como componente de la composición antibacteriana de la presente invención, puede encontrarse presente en cantidades comprendidas entre aproximadamente 0,25% y aproximadamente 10% en peso de la composición antibacteriana. Preferentemente, cuando la lisozima se utiliza como componente de la composición antimicrobiana de la presente invención, se encuentra presente en cantidades comprendidas entre aproximadamente 50 ppm y aproximadamente 150 ppm en peso de producto alimenticio tratado con la composición de la presente invención.
Otro enzima lítico preferido que se puede utilizar en la composición de materia de la presente invención es la quitinasa.
La composición antibacteriana de materia puede asimismo contener ácidos orgánicos aceptables para la utilización en productos alimenticios o sales de estos ácidos. La composición antibacteriana de materia puede contener ácidos o sales individuales, o mezclas de los mismos. Entre los ácidos o sales preferidos para la utilización en la composición de materia se incluyen ácido acético, acetato sódico, diacetato sódico, acetato potásico, ácido láctico, lactato sódico, lactato potásico, ácido propiónico, propionatos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, propionato sódico y propionato potásico, ácido cítrico o sus sales, tales como citrato sódico o citrato potásico, o mezclas de los mismos. En una forma de realización preferida, se utiliza diacetato sódico en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1% y aproximadamente 25% en peso de la composición antibacteriana. Preferentemente, el producto alimenticio resultante tratado con la composición antibacteriana de la presente invención presenta entre aproximadamente 500 ppm y aproximadamente 1.500 ppm de diacetato sódico.
Entre otros aditivos que pueden encontrarse presentes en la composición de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los materiales siguientes: agentes antibacterianos y/o quelantes adicionales, condimentos y/o saborizantes naturales o sintéticos, tintes y/o colorantes, vitaminas, minerales, nutrientes, enzimas, y agentes ligantes, tales como la goma guar, la goma xantano, y similares. La adición de estos materiales no se considera crítica para el éxito de la presente invención y se considera que se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia.
En una forma de realización particularmente preferida, la composición antimicrobiana de materia comprende un metabolito propionibacteriano mezclado con una diversidad de ácidos orgánicos, o sus sales, incluyendo acetato sódico, conjuntamente con una bacteriocina lantibiótica, tal como nisina o lacticina, y con un enzima lítico, tal como lisozima, para controlar el crecimiento de una amplio espectro de agentes contaminantes gram positivos y gram negativos y/o bacterias formadoras de esporas en los productos alimenticios.
La composición antimicrobiana de la presente invención se puede utilizar con cualquier producto alimenticio que sea susceptible al crecimiento de bacterias o a la degradación. Entre estos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, productos lácteos, frutas y verduras, productos derivados de frutas y de verduras, cereales y productos derivados de cereales, carnes, aves, y frutos del mar. Una forma de realización preferida comprende el tratamiento de productos alimenticios procesados subletalmente, entre los que se incluyen alimentos listos para consumir, entrantes, y carnes, ensaladas, delicatessen, aliños (incluyendo aliños para ensalada), salsas y condimentos, pastas, sopas, y alimentos envasados asépticamente, así como mezclas de los mismos.
La composición antimicrobiana de acuerdo con la presente invención se utiliza con mayor facilidad mezclándola y/o aplicándola en un producto alimenticio que se pueda mezclar, aunque también podría resultar efectivo para tratar la superficie de productos alimenticios sólidos mediante inmersión, enjuague, o pulverización, o mediante aplicación en el interior de dichos productos, es decir, mediante inyección. En otras formas de realización, la composición antibacteriana se puede aplicar como escabeche, empanado, condimentación, glaseado, mezcla de colorante, y similares, o como un ingrediente que debe mezclarse e incorporarse en el producto alimenticio, siendo el criterio clave que la composición antimicrobiana se encuentre disponible para las superficies (incluyendo superficies internas) expuestas al crecimiento bacteriano y/o a la degradación. Todavía en otras formas de realización, la composición antimicrobiana se puede poner en contacto con la superficie del alimento indirectamente mediante la aplicación de la composición a materiales de envasado de alimentos y aplicarse seguidamente el envasado a la superficie del alimento de manera que la composición antibacteriana entre en contacto con la superficie exterior del alimento. La cantidad óptima que se debe utilizar depende de la composición antibacteriana del producto alimenticio particular que debe tratarse y del procedimiento utilizado para la aplicación de la composición antibacteriana en la superficie del alimento, aunque se puede determinar mediante experimentación simple.
Las composiciones antimicrobianas de la presente invención resultan efectivas contra bacterias gram positivas, entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las bacterias anaeróbicas formadoras de esporas, incluyendo especies clostridiales, tales como Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum, y Clostridium putrefasciens; bacterias aeróbicas formadoras de esporas incluyendo especies de Bacillus tales como Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, y Bacillus coagulans; patógenos vegetativos gram positivas, incluyendo especies de estafilococos, tales como Sthaphylococcus aureus; especies de listeriales, tales como Listeria monocytogenes; y, finalmente, bacterias vegetativas contaminantes de los grupos Micrococcus, Streptococcus y del ácido láctico, entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, especies de Lactobacillus y de
Leuconostoc.
Las composiciones antimicrobianas de la presente invención resultan asimismo efectivas contra bacterias gram negativas, entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las bacterias Escherichia, tales como, por ejemplo, E. coli H7:0157; bacterias tales como Campylobacter, por ejemplo Campylobacter jejuni; bacterias tales como Vibrio, por ejemplo Vibrio parahaemolytica; Pectobacteria, tales como Pectobacterium carotovorum; bacterias Pseudonomas, tales como Pseudonomas fluorescens; y especies de Salmonella.
Además, se ha descubierto que la composición de materia según la presente invención resulta efectiva para la reducción del contenido de bacterias vivas en productos alimenticios que contienen cantidades superiores a aproximadamente 1% de grasas, lípidos o materiales solubles en aceites, así como productos alimenticios que son emulsiones grasas. Cuando el producto alimenticio consiste en una emulsión de grasa en agua, resulta particularmente ventajoso incorporar la composición de materia en la fase acuosa del producto alimenticio con el fin de minimizar la partición en la fase lipídica, en la que la composición no se encontraría disponible para la protección antibacteriana del producto alimenticio.
Los productos alimenticios que se tratan con la composición de materia según la presente invención pueden tratarse asimismo con tratamientos de procesamiento subletal, tales como calentamiento, irradiación, presión, ultrasonidos, congelación, campos eléctricos pulsantes, ozono, nitrito, etc. Se ha descubierto que la composición de materia conjuntamente con un tratamiento de procesamiento subletal resulta más efectiva para reducir el contenido bacteriano vivo de los productos alimenticios que cualquiera de los tratamientos por sí solo. Estos productos alimenticios se mantienen estables a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 días o más. A temperaturas de refrigeración, estos productos alimenticios se mantienen estables durante aproximadamente 7 días o más.
Los ejemplos no limitativos siguientes son una ilustración de la amplia gama de composiciones antimicrobianas que pueden utilizarse para la conservación de productos alimenticios de acuerdo con la presente exposición.
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Ejemplos
Los ejemplos siguientes comparan la efectividad de una composición antibacteriana, denominada CB-1, en leche descremada deshidratada (NFDM) con nisina (Novasin™) como control. CB-1 contenía Novasin™, MICROGARD® MG 200, diacetato sódico, y lisozima. Los componentes de estas composiciones se muestran en la Tabla 1 a continuación.
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TABLA 1 Composiciones antibacterianas
1 
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Ejemplo 1
Inhibición de la composición antibacteriana contra Bacillus cereus en leche entera y en leche desnatada a 30ºC
Se esterilizó leche entera y leche desnatada, se añadió cloruro de 2,3,5,-triferiltetrazol (TTC) (para indicar el crecimiento por cambio de color), y se inoculó la mezcla resultante con esporas de Bacillus cereus (un formador de esporas aeróbico) a aproximadamente 4-5 log células/ml. Se añadieron la composición antibacteriana (CB-1) y un control de Novasin™ (Control) en forma de soluciones madre al 10% (el Control contenía 4 veces más de nisina que CB-1). La inhibición se indica como la concentración mínima con la que no se produce crecimiento durante un tiempo determinado, y se muestra en la Tabla 2 a continuación.
TABLA 2 Efectividad de las composiciones
2
*MIC = concentración de inhibición mínima
El recuento en placa de B. cereus para estas composiciones se obtuvo a continuación de placas de ágar TSA incubadas a 30ºC durante 24 horas, y los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.
TABLA 3
Recuento en placas
Inhibición de B. cereus en leche entera
3
Ejemplo 2 Inhibición de la composición antibacteriana contra L. monocytogenes en leche entera y en leche desnatada a 25ºC
Se esterilizó leche entera y leche desnatada, se añadió cloruro de 2,3,5,-triferiltetrazol (TTC) (para indicar el crecimiento por cambio de color), y se inoculó la mezcla resultante con L. monocytogenes ATCC 19115 (un patógeno vegetativo gram positivo) a aproximadamente 4-5 log células/ml. Se añadió la composición antibacteriana (CB-1) y un control de Novasin™ (Control) en forma de soluciones madre al 10% (el Control contenía 4 veces más de nisina que CB-1). La inhibición se indica como la concentración mínima con la que no se produce crecimiento durante un tiempo determinado y se muestra en la Tabla 4 a continuación.
TABLA 4 Efectividad de las composiciones
4
*MIC = concentración de inhibición mínima
El recuento en placas de L. monocytogenes para estas composiciones se obtuvo a continuación de placas de ágar TSA incubadas a 30ºC durante 24 horas, y los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuación.
TABLA 5 Recuento en placas
5
*CB-1 al 2% contiene la misma concentración de nisina que el Control al 0,5%
**CFU = unidades (nº de células) formadoras de colonias
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Ejemplo 3
Inhibición de la composición antibacteriana contra C. sporogenes en leche entera a 30ºC
Se esterilizó leche entera, se añadió cloruro de 2,3,5,-triferiltetrazol (TTC) (para indicar el crecimiento por cambio de color), y se inoculó la mezcla resultante con C. sporogenes (un formador de esporas anaeróbico no patogénico) a aproximadamente 4-5 log células/ml. Se añadió la composición antibacteriana (CB-1) y un control de Novasin™ (Control) en forma de soluciones madre al 10% (el Control contenía 4 veces más de nisina que CB-1). El recuento en placas de C. sporogenes para estas composiciones se obtuvo de las placas de ágar TSA incubadas a 30ºC durante 24 horas, y los resultados se muestran en la Tabla 6 a continuación.
TABLA 6
6
Ejemplo 4 Eficacia de la composición antibacteriana en el retraso de la producción de toxinas en productos alimenticios
Se sometieron a choque de calor a 88ºC durante 10 minutos, 10 cepas diferentes de esporas C. Botulinum proteolíticas (patógenos anaeróbicos formadores de esporas), que presentan aproximadamente 100 esporas/gramo, con alimentos. Algunos de los alimentos presentaban un elevado contenido de grasa, e incluían una salsa Alfredo, una comida lista para consumir (pechuga de pollo guisada en salsa), una sopa lista para consumir, y una pasta fresca. Se incubaron las muestras de alimento inoculado a 15ºC o a 27ºC. Se añadió la composición antibacteriana (CB-1), el Novasin™, y en un caso, CB-1 sin lisozima, en forma de soluciones madre al 10% (el tratamiento con Novasin™ contenía la misma cantidad de nisina que CB-1 y que CB-1 sin lisozima). Se utilizaron muestras de alimentos sin tratar como control (Control). Se sometieron a ensayo muestras por triplicado tanto en el tiempo 0 como en cada intervalo de muestreo, que variaba en función del alimento en particular sometido a tratamiento, del pH, de su temperatura, etc. Se utilizaron ensayos estándar con ratas para someter a ensayo para la presencia de toxina botulínica, que se confirmó con la antitoxina botulínica trivalente ABE. La eficacia de estas composiciones antibacterianas en el retraso de la producción de toxinas en estos productos alimenticios se muestra en las Tablas 7 a 10.
TABLA 7 Eficacia de la composición antibacteriana en el retraso de la producción de toxinas en salsa Alfredo a pH 5,2, 27ºC
7 
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TABLA 8 Eficacia de la composición antibacteriana en el retraso de la producción de toxinas en comida lista para consumir, a pH 5,6, 27ºC
8
\text{*}
La muestra tratada con Novasin presentaba la misma cantidad de nisina que la muestra tratada con CB-1.
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TABLA 9 Eficacia de la composición antibacteriana en el retraso de la producción de toxinas en sopa lista para consumir, a pH 6,5, 15ºC
9
\text{**}
La muestra tratada con Novasin presentaba la misma cantidad de nisina que la muestra tratada con CB-1 y que la muestra tratada con CB-1 sin lisozima.
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TABLA 10 Eficacia de la composición antibacteriana en el retraso de la producción de toxinas en pasta fresca a pH 6,0, 27ºC
10
Se apreciará que se pueden introducir diversas modificaciones en las formas de realización dadas a conocer en la presente memoria. Por lo tanto, la exposición anterior no debe interpretarse en modo alguno como limitativa, sino únicamente como ejemplificaciones de formas de realización preferidas. Por ejemplo, resultarán evidentes o serán razonablemente sugeridas por la descripción anterior de la presente invención, diversas combinaciones de los componentes de la composición antibacteriana descrita en la presente memoria, así como su utilización en diversos productos alimenticios.

Claims (26)

1. Composición para el tratamiento de alimentos, que presenta actividad bacteriostática y bactericida contra bacterias perjudiciales en los alimentos, que comprende por lo menos un metabolito propionibacteriano en combinación con:
a)
un lantibiótico;
b)
un enzima lítico; y
c)
un ácido orgánico o su sal.
2. Composición de materia según la reivindicación 1, en la que dicho lantibiótico se selecciona de entre el grupo constituido esencialmente por nisina y lacticina.
3. Composición de materia según la reivindicación 1, en la que el enzima lítico se selecciona de entre el grupo constituido esencialmente por lisozima y quitinasa.
4. Composición de materia según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico o su sal se selecciona de entre el grupo constituido esencialmente por ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido propiónico, diacetato sódico, acetato sódico, acetato potásico, lactato sódico, lactato potásico, citrato sódico, citrato potásico, propionato sódico, propionato potásico, y mezclas de los mismos.
5. Composición de materia según la reivindicación 4, en la que el ácido orgánico o su sal es diacetato sódico.
6. Composición de materia según la reivindicación 1, que comprende además uno o más componentes seleccionados de entre el grupo constituido por agentes antibacterianos adicionales, agentes quelantes, condimentos naturales, condimentos sintéticos, sabores, tintes, colorantes, vitaminas, minerales, nutrientes, enzimas, y agentes ligantes.
7. Procedimiento para la inhibición del crecimiento y la eliminación de bacterias en un producto alimenticio mediante la aplicación en una o más superficies de dicho producto alimenticio de una cantidad efectiva inhibidora y de efecto bactericida del crecimiento bacteriano efectiva de una composición de materia, que demuestra eficacia inhibitoria del crecimiento y bactericida contra bacterias tanto gram positivas como gram negativas, que comprende un metabolito propionibacteriano en combinación con:
a)
un lantibiótico;
b)
un enzima lítico; y
c)
un ácido orgánico o su sal.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia reduce la cantidad de bacterias gram positivas en el producto alimenticio.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la bacteria gram positiva se selecciona de entre los géneros constituidos por Bacillus, Clostridia, Staphyloccus, Listeria, Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus y Leuconostoc.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la bacteria se selecciona de entre el grupo constituido por Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium putrefasciens, Staphylococcus aereus, y Listeria monocytogenes.
11. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia reduce la cantidad de bacterias gram negativas en el producto alimenticio.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que las bacterias gram negativas se seleccionan de entre los géneros constituidos por Escherichia, Campylobacter, Vibrio, Pectobacteria, Pseudomonas y Salmonella.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que las bacterias se seleccionan de entre el grupo constituido por E. coli H7:0157, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolytica, Pectobacteria carotovorum, y Pseudomonas flurescens.
14. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el producto alimenticio se selecciona de entre el grupo constituido por productos lácteos, frutas, verduras, productos derivados de frutas, productos derivados de verduras, cereales, productos derivados de cereales, carnes, aves, frutos del mar, alimentos listos para consumir, ensaladas delicatessen, aliños para ensalada, condimentos, pastas, 
\hbox{sopas, alimentos envasados
asépticamente,  y mezclas de los mismos.}
15. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el producto alimenticio contiene más de aproximadamente 1% de grasa, lípidos, o materiales solubles en aceite.
16. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el producto alimenticio comprende una emulsión grasa.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la composición de materia se incorpora en la fase acuosa de la emulsión grasa.
18. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia se aplica en una superficie del producto alimenticio o se aplica en un material de envasado de alimentos que se pone a continuación en contacto con la superficie del producto alimenticio.
19. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia se aplica a un producto alimenticio mediante inmersión, enjuague, inyección, pulverización o mezcla.
20. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia se aplica al producto alimenticio como componente de escabeche, empanado, condimentación, glaseado, o mezcla de colorante.
21. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la composición de materia se utiliza en combinación con un tratamiento de procesamiento subletal del producto alimenticio.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el tratamiento de procesamiento subletal se selecciona de entre el grupo constituido por calentamiento, irradiación gamma, presión alta, ultrasonidos, ozono, nitrito y combinaciones de los mismos.
23. Producto alimenticio que presenta una población bacteriana viva reducida como resultado de haber aplicado una composición de tratamiento de alimentos sobre una o más superficies del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que demuestra eficacia contra bacterias tanto gram positivas como gram negativas.
24. Producto alimenticio según la reivindicación 23, seleccionado de entre el grupo constituido por productos lácteos, frutas, verduras, productos derivados de frutas, productos derivados de verduras, cereales, productos derivados de cereales, carnes, aves, frutos del mar, alimentos listos para consumir, ensaladas delicatessen, aliños para ensalada, condimentos, pastas, sopas, alimentos envasados asépticamente, y mezclas de los mismos.
25. Producto alimenticio según la reivindicación 23, en el que la composición de materia se utiliza conjuntamente con un tratamiento de procesamiento subletal del producto alimenticio.
26. Producto alimenticio según la reivindicación 23, en el que el tratamiento de procesamiento subletal se selecciona de entre el grupo que esencialmente constituido por calentamiento, irradiación gamma, presión alta, ultrasonidos, ozono, nitrito y combinaciones de los mismos.
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