ES2267662T3 - Ensayo de deteccion de anticuerpos anti-transglutaminasa. - Google Patents
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Abstract
Un ensayo para detectar anticuerpos anti-transglutaminasa de IgA o de IgG en una muestra líquida, comprendiendo el método: a) proporcionar un sistema que comprende: (i) un soporte poroso inerte en el que se deposita y se seca un antígeno de transglutaminasa de tejido conjugado con una sustancia colorea- da, y en el que el soporte permite la liberación y el flujo lateral del an- tígeno conjugado cuando se pone en contacto con una muestra líqui- da; y (ii) una membrana que comprende una zona reactiva que comprende antígeno de transglutaminasa de tejido inmovilizado; b) proporcionar una muestra líquida procedente de un humano; c) añadir la muestra líquida al soporte poroso inerte que contiene el antígeno de transglutaminasa de tejido conjugado con una sustancia coloreada, en el que el antígeno conjugado y/o los inmunocomplejos formados entre los anti- cuerpos de la muestra y el antígeno conjugado migran hacia la zona reacti- va mediante flujo lateral; y d) detectar la unión de los inmunocomplejos descritos en la etapa c) con el an- tígeno inmovilizado; en el que la unión de los inmunocomplejos con el antígeno inmovilizado indica la pre- sencia de anticuerpos anti-transglutaminasa de IgA o de IgG en la muestra.
Description
Ensayo de detección de anticuerpos
anti-transglutaminasa.
La presente invención se refiere al campo
biotecnológico, particularmente a la diagnosis biomédica. El
objetivo técnico de la invención es desarrollar un ensayo visual
rápido, sencillo y fiable en una sola etapa para la detección de
anticuerpos anti transglutaminasa, tanto del isotipo IgA como del
IgG, en muestras de suero, plasma o sangre humanos. Hasta ahora, la
detección de anticuerpos anti transglutaminasa se ha realizado
mediante métodos instrumentales como el ensayo inmunosorbente
ligado a enzima (ELISA) o como el ensayo de radioligando (RLA).
Estos ensayos han demostrado ser útiles en la diagnosis de la
enfermedad celiaca.
La enfermedad celiaca (EC) es una enfermedad
gastrointestinal grave que afecta a individuos genéticamente
susceptibles. La EC se caracteriza por una intolerancia permanente a
las proteínas procedentes de trigo, cebada, arroz y avenas. Aunque
la patología de la EC no se comprende completamente, es evidente que
la presencia de las proteínas tóxicas en la dieta del paciente
provoca un daño total o parcial en la mucosa intestinal (Brandtzaeg,
P. 1997. Mechanisms of gastrointestinal reactions to food.
Environmental Toxicology and Pharmacology 4; 9-24)
que conduce a síndromes graves de mal absorción y que provoca
diarrea, vómitos, dolor abdominal, anorexia, retraso en el
crecimiento, desnutrición y anemia. La EC se ha asociado a un mayor
riesgo de padecer cáncer intestinal en pacientes no diagnosticados
y no tratados (Colmes GKT, 1989. Malignancy in coeliac
disease-effect of a gluten-free
diet, Gut 30, 333-338). La EC afecta principalmente
a niños por debajo de tres años, pero también es común en adultos,
y a veces es clínicamente atípica o asintomática (Ferguson A, y
col., 1992. Definitions and diagnostic criteria of latent and
potential coeliac disease. Editado por Aurricchio S, Visakorpi JK,
en Epidemiology of CD. Dyn Nutr Res, Basel, Karger 2;
119-127). La EC es más frecuente en pacientes con
otras enfermedades genéticas o autoinmunes, como la diabetes
mellitus dependientes de insulina, el síndrome de Down, la
deficiencia de IgA selectiva y la dermatitis herpetiformis. (Sirgas
N y col., 1993. Prevalence of coeliac disease in diabetic children
and adolescents in Sweden. Acta Pediatr 66; 491-494;
Zubillaga P y col., 1993. Down syndrome and coeliac disease. J.
Pediatr Gastroenterol Nutr 16: 168-171; Boyce N.
1997. Testing for celiac disease may be soon on the rise. LabMedica
Internat 14 (4): 8.
Los síntomas clínicos de la EC podrían
confundirse con los producidos por otras enfermedades
gastrointestinales. En ese caso la EC se diagnostica mal y los
pacientes no reciben el tratamiento específico, es decir, una
eliminación completa del gluten en sus dietas. Por otro lado, si un
paciente no celiaco es diagnosticado erróneamente como celiaco, se
sometería innecesariamente a una dieta libre de gluten durante el
resto de su vida. Por ello es esencial tener una diagnosis precisa
de la EC.
Actualmente, la clave de la diagnosis de EC es
la biopsia intestinal, repetida tres veces:
- -
- al inicio de los síntomas clínicos.
- -
- tras varios meses con una dieta libre de gluten.
- -
- tras ser expuesto a gluten.
Debido a que la biopsia intestinal es un método
invasivo y a que se han desarrollado ensayos serológicos precisos,
se han revisado los criterios anteriores
(Walter-Smith y col., 1990. Revised criteria for
diagnosis of coeliac disease. Report of Working group of European
Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child
65: 909-911). Hoy día los ensayos serológicos se
pueden realizar al inicio de los síntomas clínicos y, cuando son
positivos, se indica una biopsia intestinal confirmatoria. La
respuesta al tratamiento con una dieta libre de gluten también
puede seguirse mediante ensayos serológicos. Si se producen
discrepancias entre la respuesta clínica al tratamiento y el
resultado de los ensayos serológicos, entonces se indicaría una
segunda biopsia intestinal.
Se han desarrollado diversos ensayos serológicos
para la diagnosis de enfermedad celiaca, tal como la detección de
anticuerpos de antígenos celulares, o de anticuerpos de antígenos
alimentarios, como las gliadinas. Existen kits de diagnóstico para
la detección de:
- \bullet
- Anticuerpos anti-endomisiales.
- \bullet
- Anticuerpos anti-reticulina.
- \bullet
- Anticuerpos anti-gliadina.
Los anticuerpos
anti-endomisiales (EMA) han demostrado ser la más
específica de las diagnosis sexológicas de la EC (Kapuschinska A y
col., 1987. Disease specificity and dynamics of changes in IgA class
anti-endomysial antibodies in celiac disease. J.
Pediatric Gastroenterol 6: 529-534; Rossi TM y col.,
1988. Relationship of endomysial antibodies to jejunal mucosal
pathology: specificity towards both symptomatic and asymptomatic
celica. J Pediatr Gastroenterol Nutr 7: 858-863).
Los anticuerpos anti-endomisiales se detectan
mediante inmunofluorescencia (IF) usando láminas de endomisio de
mono o de cordón umbilical humano, que son incubados con muestras de
suero. El ensayo requiere elevados conocimientos técnicos para
realizar la prueba y para una correcta interpretación de los
resultados debido a su subjetividad intrínseca.
Pero el EMA no es un buen método para el
análisis de un amplio número de muestras en la monitorización de EC
en grupos de riesgo debido a su complejidad y su coste elevado. Otra
desventaja es que sólo detecta anticuerpos
anti-endomisiales del isotipo IgA y se sabe que
algunos pacientes de EC presentan un déficit selectivo de IgA.
Dichos pacientes darían negativo en el ensayo.
Por otro lado, también se han usado ampliamente
los anticuerpos anti-gliadina (AGA) para la
diagnosis serológica de EC (Stern M y col., 1996. Validation and
standardization of serological screening tests for coeliac disease
in 1996. 3^{rd} EMRC/ESPGAN Workshop, Dic. 5-8,
1996, Molsheim, Francia, pág. 9-24; Catassi C y
col., 1999. Quantitative antigliadin antibody measurement in
clinical practice: an Italian multicentre study. Ital J
Gastroenterol Hapatol 31; 366-370). Los AGA se
detectan principalmente mediante ELISA, un método más sencillo que
la IF, y se puede usar para el análisis de un número elevado de
muestras. No obstante, los AGA son menos específicos para la EC que
los EMA, y la detección de anticuerpos de los isotipos IgA ó IgG
requiere dos ensayos independientes. Recientemente se ha publicado
un inmunoensayo visual para la detección de AGA, que resuelve
algunos de estos problemas (Garrote JA, Sorell L, Alfonso P y col.,
1999. A simple visual immunoassay for the screening of coeliac
disease. Eur. J. Clin. Invest. 29; 697-699; Oficina
Española de Patentes y Marcas Nº 9801067).
En 1997, Dietrich y col. identificaron
transglutaminasa de tejido (tTG), una proteína de 85 kDa, como auto
antígeno principal, si no el único, detectado mediante anticuerpos
anti-endomisiales (Dietrich W y col., 1997.
Identification of tissue transglutaminase as the auto antigen of
celiac disease. Nat Med. 3: 797-801). Recientemente
se ha publicado la detección de anticuerpos anti-tTG
en formato ELISA o de radioligando (RLA) basada en tTG procedente
de extractos de hígado de conejillo de indias o en tTG recombinante
humana clonada a partir de diferentes tejidos (Sulkanen S y col.,
1998. Tissue transglutaminase autoantibody
enzyme-linked immunosorbent assay in detecting
celiac disease. Gastroenterology 115: 1322-1328;
Siessler J y col., 1999. Antibodies to human recombinant tissue
transglutaminase measured by radioligand assay: Evidence for high
diagnostic sensitivity for celiac disease. Horm Metab Res 31;
375-379).
Los ensayos de
anti-transglutaminasa han mostrado una sensibilidad
y especificidad similares o superiores para la diagnosis de la
enfermedad celiaca que el EMA (Bazzigaluppi A y col., 1999.
Comparison of tissue transglutaminase-specific
antibody assays with established antibody measurement for coeliac
disease. Journal of Autoimmunity 12: 51-56; Amin M
y col., 1999. Correlation between tissue transglutaminase antibodies
and endomysium antibodies as diagnostic markers of celiac disease.
Clin Chim Acta 282: 219-225). Como se ha mencionado
anteriormente, los ensayos EMA han sido considerados hasta ahora
como el mejor método serológico para la diagnosis de EC.
No obstante, la detección de anticuerpos anti TG
mediante ELISA o RLA presenta algunas limitaciones.
Son técnicas instrumentales que requieren un
espectrofotómetro o un contador radioactivo, unos conocimientos
técnicos elevados, y son métodos laboriosos que requieren mucho
tiempo con múltiples operaciones. Además, se requieren dos ensayos
independientes para detectar anticuerpos anti TG de IgG y de
IgA.
Se han desarrollado diferentes ensayos
inmunocromatográficos (ICA) para la diagnosis del embarazo y de
enfermedades infecciosas y no infecciosas. Los principios generales
del ICA están protegidos por la propiedad intelectual de, entre
otros los documentos Shanfun Ching y col., EP 0 299 428 B1,
Rosenstein R. EP 0 284 232 B1, que están relacionados con la
presente invención.
Otras patentes reivindican la utilización de
estos ensayos en la detección de diferentes
bio-moléculas (Campbell R. Patente de EE.UU. Nº
4.703.017), fármacos y antígenos no proteicos (Sung M., Patente de
EE.UU. Nº 5.238.652), y para antígenos asociados a tumores (Manita
Hideaki y col., EP 0396801).
El principal propósito de la presente invención
es desarrollar un ensayo visual sencillo, para la detección de
anticuerpos anti TG. Este método, fácil de llevar a cabo, no
requiere ningún equipamiento de laboratorio y los resultados se
obtienen en aproximadamente 15 minutos mediante una operación de una
única etapa. El ensayo permite la detección en una prueba sencilla
de anticuerpos anti-TG de IgG y de IgA en sangre,
suero o plasma humanos, simplemente colocando la muestra en el
lugar indicado y esperando al resultado de la prueba. Por lo que
sabemos, este método es el ensayo más sencillo y más rápido
desarrollado hasta el momento para detectar anticuerpos anti TG
para la diagnosis de la enfermedad celiaca. El ensayo se puede
llevar a cabo en laboratorios con un apoyo técnico mínimo, en el
despacho de un médico, tanto en áreas urbanas como rurales, o
incluso se puede usar como una auto-prueba.
De acuerdo con la presente invención se ha
desarrollado una tercera generación de ensayos inmunocromatográficos
para detectar anticuerpos anti-TG de IgG y de IgA
en una única etapa en sangre, suero o plasma humanos para la
diagnosis de la enfermedad celiaca.
El sistema presenta los siguientes componentes
básicos (Figura 1):
- 1.
- Antígeno: transglutaminasa de tejido (tTG), obtenida a partir de fuentes naturales o de tecnología de ADN recombinante. El antígeno conjugado con una sustancia coloreada, como oro coloidal o partículas de látex coloreadas, sirve de trazador en el sistema.
- 2.
- Un soporte poroso inerte, en el que se deposita y seca el antígeno conjugado. Este soporte permite la liberación del conjugado cuando se entra en contacto con una muestra líquida.
- 3.
- Una membrana de nitrocelulosa o de nylon con un tamaño de poro de 5 a 10 \mum que permite la migración de los reactivos como un flujo lateral a través de la membrana.
- 4.
- El antígeno (tTG) inmovilizado en una "zona reactiva" de la membrana de nitrocelulosa o de nylon, donde queda firmemente ligado mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas.
- 5.
- Un reactivo de control capaz de reaccionar con el antígeno conjugado (por ejemplo, anticuerpos anti-TG, o un reactivo capaz de unirse a oro coloidal), adsorbido sobre la misma membrana en una zona de control posterior, que sirve para controlar la evolución del ensayo.
- 6.
- Una almohadilla absorbente en el extremo de la membrana, en contacto con ella. La almohadilla adsorbente permite la eliminación del exceso de reactivos tras la migración.
El principio del ensayo se basa en la bivalencia
de las moléculas de IgG y de IgA humanas por el antígeno específico.
Basándose en esta propiedad es posible que la misma molécula de
anticuerpo anti-TG reaccione mediante una posición
de unión con el antígeno de la disolución, en este caso
transglutaminasa de tejido conjugada con la sustancia coloreada,
mientras que la otra posición de unión reacciona con el antígeno
fijo sobre la membrana de nitrocelulosa o de nylon. La reacción se
hace evidente a través de la formación de una señal coloreada en la
"zona reactiva" de la membrana (Figura 2).
En la práctica, cuando se añade un volumen de
100 a 300 \muL de una muestra líquida al antígeno conjugado secado
sobre el soporte inerte, se disuelve y migra a través de la
membrana. Si la muestra contiene anticuerpos anti-TG
específicos, reaccionan con el antígeno marcado desarrollando un
inmunocomplejo estable. Más tarde, los inmunocomplejos migran a la
"zona reactiva", donde son capturados por el mismo antígeno
(transglutaminasa) fijado sobre la membrana. El resultado de esta
reacción es una señal visible coloreada en la "zona reactiva"
como resultado de la deposición de los inmunocomplejos marcados en
este lugar. En las muestras negativas en cuanto a presencia de
anticuerpos anti TG, el inmunocomplejo no se desarrollará, y por
tanto no se observará ninguna señal coloreada en la "zona
reactiva" de la membrana (Figura 2).
Para controlar la realización del ensayo, se
adsorbe sobre la misma membrana un reactivo que reacciona con el
antígeno conjugado en una "zona de control" posterior (Figura
2). De este modo, se observará una señal coloreada en la "zona de
control" tanto en las muestras positivas como en las negativas
(Figura 2). Esta segunda señal coloreada sirve para controlar la
funcionalidad de la prueba.
Finalmente, una almohadilla adsorbente colocada
en el extremo de la membrana, y en contacto con ella, permite la
eliminación del exceso de reactivos y mejora las condiciones de
flujo (Figura 1).
Se conjuga transglutaminasa de tejido, obtenida
a partir de una fuente natural o mediante tecnología recombinante
de ADN, con partículas de oro coloidales (de 20 a 40 \mum de
diámetro), de acuerdo con Oliver C. (Oliver C., 1994. Conjugation
of colloidal gold to proteins, Capítulo 38 En: Javois LC, Human
Press Inc., ed. Method Mol Biol, 34: 303-307).
Cuando se añade una muestra de suero, plasma o
sangre al soporte inerte sobre el que se deposita el conjugado, los
anticuerpos anti-TG reaccionan con el antígeno
conjugado desarrollando un inmunocomplejo (IC) que migra a través
de la membrana de nitrocelulosa (NC) (4 mm de ancho,
5-10 \mum de tamaño de poro). En unos pocos
minutos el IC reacciona con el antígeno inmovilizado (tTG) en la
"zona reactiva" de la NC, formando una señal coloreada en este
lugar. En las muestras negativas sin anticuerpos
anti-TG específicos, el IC no se desarrollará y por
tanto no se observará ninguna señal coloreada en la "zona
reactiva" de la NC.
Para evaluar la realización del ensayo, se
adsorbe un anticuerpo monoclonal anti-TG sobre la
misma membrana de NC es una posterior "zona de control", por
encima de la "zona de reacción" en relación con la zona de
aplicación de la muestra. Cuando el exceso de antígeno conjugado
alcanza esta zona, reacciona con el anticuerpo monoclonal
proporcionando una señal coloreada.
\newpage
De acuerdo con los dos anteriores Ejemplos, los
resultados de la prueba se pueden interpretar mediante examen visual
de las zonas de reacción y de control 15 minutos después de la
aplicación de la muestra. Los posibles resultados son los siguientes
(Figura 3):
- \sqbullet
- Presencia de dos señales coloreadas: muestra positiva.
- \sqbullet
- Presencia de sólo una señal coloreada en la "zona de control": muestra negativa.
- \sqbullet
- Ninguna señal coloreada: resultado no válido. Repetir la prueba.
- 1.
- Es una prueba en una sola etapa.
- 2.
- El ensayo no requiere ningún equipo instrumental.
- 3.
- Facilidad para interpretar los resultados.
- 4.
- Resultados en menos de 15 minutos.
- 5.
- Detección de anticuerpos anti TG de IgG y de IgA en la misma prueba.
- 6.
- Método eficaz para la diagnosis de la enfermedad celiaca en pacientes con déficit de IgA.
- 7.
- El ensayo se puede llevar a cabo con muestras de suero, plasma o sangre.
Figura 1. Esquema general del ensayo. El
antígeno conjugado (transglutaminasa de tejido conjugada con un
trazador coloreado) se seca sobre un soporte fibroso inerte. El
mismo antígeno (transglutaminasa de tejido) se adsorbe sobre una
"zona reactiva" de la membrana de nitrocelulosa o de nylon. Se
adsorbe un anticuerpo monoclonal
anti-transglutaminasa sobre la misma membrana en una
"zona de control" posterior. En el extremo del lado derecho
hay una almohadilla adsorbente que permite la emanación del exceso
de reactivos tras la migración. La flecha ancha indica la dirección
del flujo lateral. También se muestra la zona correspondiente a la
aplicación de la muestra.
Figura 2. Principio del ensayo. Cuando el
soporte conjugado es sumergido en una muestra líquida, los
anticuerpos anti transglutaminasa de tejido reaccionan con el
antígeno conjugado, desarrollando un inmunocomplejo que migra a
través de la tira de membrana. La transglutaminasa de tejido
inmovilizada de la nitrocelulosa reacciona con los inmunocomplejos,
debido a la bivalencia de las moléculas de anticuerpos, formando una
señal coloreada en la "zona reactiva". El exceso de antígeno
conjugado y de inmunocomplejos continúa su migración y finalmente
reaccionan con el anticuerpo monoclonal anti tTG formando una
segunda señal coloreada de la tira. Un resultado positivo, que
indica la presencia de anticuerpos anti-tTG en la
muestra, se verá como dos señales detectables visualmente
posteriores en la tira. Un ensayo negativo muestra únicamente una
señal coloreada en la "zona de control" debido a que no se
desarrollaron los inmunocomplejos.
Figura 3. Interpretación de los
resultados. Quince minutos después de la adición de la muestra:
Sólo una señal coloreada en la zona de control: indica un resultado
negativo. Dos señales coloreadas: indica un resultado positivo.
Ninguna señal coloreada: indica un resultado no válido, por lo que
el ensayo debería repetirse.
Claims (6)
1. Un ensayo para detectar anticuerpos
anti-transglutaminasa de IgA o de IgG en una muestra
líquida, comprendiendo el método:
- a)
- proporcionar un sistema que comprende:
- (i)
- un soporte poroso inerte en el que se deposita y se seca un antígeno de transglutaminasa de tejido conjugado con una sustancia coloreada, y en el que el soporte permite la liberación y el flujo lateral del antígeno conjugado cuando se pone en contacto con una muestra líquida; y
- (ii)
- una membrana que comprende una zona reactiva que comprende antígeno de transglutaminasa de tejido inmovilizado;
- b)
- proporcionar una muestra líquida procedente de un humano;
- c)
- añadir la muestra líquida al soporte poroso inerte que contiene el antígeno de transglutaminasa de tejido conjugado con una sustancia coloreada, en el que el antígeno conjugado y/o los inmunocomplejos formados entre los anticuerpos de la muestra y el antígeno conjugado migran hacia la zona reactiva mediante flujo lateral; y
- d)
- detectar la unión de los inmunocomplejos descritos en la etapa c) con el antígeno inmovilizado;
en el que la unión de los
inmunocomplejos con el antígeno inmovilizado indica la presencia de
anticuerpos anti-transglutaminasa de IgA o de IgG en
la
muestra.
2. Un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la membrana comprende además una zona de
control, en el que la zona de control comprende un reactivo de
control que se une al antígeno conjugado.
3. Un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el método comprende además la detección
de la unión del antígeno conjugado con el reactivo de control, en el
que la unión del antígeno conjugado con el reactivo de control
indica la realización del método.
4. Un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra es sangre.
5. Un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra es plasma.
6. Un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra es suero.
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