PT1164375E - Ensaio para anticorpos anti-transglutaminase - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ENSAIO PARA ANTICORPOS ΑΝΤΙ—TRANSGLUTAMINASE" A presente invenção está relacionada com o campo de diagnóstico biotecnológico, particularmente com diagnóstico biomédico. 0 objectivo técnico da invenção é desenvolver um ensaio visual num passo único, rápido, simples e fiável para a detecção de anticorpos anti-transglutaminase, de ambos os isotipos IgA e IgG, em amostras de soro, plasma ou sangue humano. Até agora a detecção de anticorpos anti-transglutaminase foi realizada por métodos instrumentais como o ensaio adsorvente imunológico de enzima ligada (ELISA) ou por ensaio de ligando radiológico (RLA). Estes ensaios mostraram ser úteis para o diagnóstico de doença celíaca. A doença celíaca (CD) é uma doença gastrointestinal grave que afecta indivíduos predispostos geneticamente. A CD é caracterizada por uma intolerância permanente de proteínas de trigo, cevada, centeio, e aveia. Embora a fisiopatologia da CD não esteja completamente compreendida é claro que a presença das proteínas tóxicas na dieta do paciente causa um dano total ou parcial da mucosa intestinal (Brandtzaeg, P. 1997. Mechanisms of gastrointestinal reactions to food. Environmental

Toxicology and Pharmacology 4;9-24) conduzindo a síndromes de má absorção graves e causando diarreia, vómitos, dor abdominal, anorexia, atraso no crescimento, subnutrição e anemia. A CD foi associada a um risco mais elevado de cancro intestinal em pacientes não diagnosticados e não tratados (Holmes GKT, 1989. Malignancy in celiac disease-effect of a gluten-free diet, Gut 30;333-338). A CD afecta principalmente crianças antes dos três anos de idade, mas é 2 também comum em adultos, e por vezes é clinicamente atípica ou assintomática (Ferguson A, et al., 1992. Definitions and diagnostic criteria of latent and potential celiac disease. Ed por Aurricchio S, Visakorpi JK, in Epidemiology of CD. Dyn Nutr Res, Basel, Karger 2; 119-127) . A CD é mais frequente em pacientes com outra doença genética ou autoimune, como diabetes mellitus dependente de insulina, síndrome de Down, deficiência de IgA selectiva, e dermatite herpetiforme. (Sirgus N et al., 1993. Prevalence of celiac disease in diabetic children and adolescents in Sweden. Acta Pediatr 66;491-494; Zubillaga P et al., 1993. Down syndrome e celiac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 16:168-171; Boyce N. 1997. Testing for celiac disease may be soon on the rise. LabMedica Internat 14(4): 8).

Os sintomas clínicos da CD poderão ser confundidos com aqueles produzidos por outras doenças gastrointestinais. Nestes casos a CD é diagnosticada erroneamente e os pacientes do não recebem o tratamento específico, que é, uma eliminação completa de glúten da sua dieta. Por outro lado, se um paciente não celíaco é diagnosticado erradamente como celíaco, irá ser sujeito a uma dieta isenta de glúten desnecessária durante a sua vida inteira. É por isso que um diagnóstico de CD preciso é essencial.

Correntemente o padrão de ouro para o diagnóstico de CD é a biopsia intestinal, repetida três vezes: no inicio dos sintomas clínicos, após vários meses de dieta isenta de glúten, após um desafio com glúten.

Devido à biopsia intestinal ser um método invasivo e terem sido desenvolvidos testes serológicos precisos, os 3 critérios atrás foram revistos (Walker-Smith et ai., 1990. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Report of Working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child 65: 909- 911) . Hoje em dia os testes serológicos podem ser realizados no início dos sintomas clínicos e se forem positivos, será indicada uma biopsia intestinal confirmatória. A resposta ao tratamento com uma dieta isenta de glúten pode também ser seguida por testes serológicos. Se ocorrerem discrepâncias entre a resposta clínica ao tratamento e o resultado dos testes serológicos deverá ser indicada uma segunda biopsia intestinal.

Foram desenvolvidos vários testes serológicos para o diagnóstico de doença celíaca, como a detecção de anticorpos para antígenos celulares, ou anticorpos para antígenos alimentares, como gliadinas. Existem kits (conjuntos) de diagnóstico para a detecção de: • Anticorpos anti -endomisiais • Anticorpos anti -reticulina • Anticorpos anti -gliadina

Os anticorpos anti-endomisiais (EMA) mostraram ser os mais específicos para o diagnóstico serológico da CD (Kapuschinska A et al., 1987. Disease specificity and dynamics of changes in IgA class anti-endomysial anticorpos in celiac disease. J Pediatric Gastroenterol 6: 529-534;

Rossi TM et al., 1988. Relationship of endomysial anticorpos to jejunal mucosal pathology: specificity towards both symptomatic and asymtomatic celiac. J Pediatr Gastroenterol Nutr 7:858-863). Os anticorpos anti-endomisiais são detectados por imunofluorescência indirecta 4 (IF) usando células de endomísio de macaco ou de cordão umbilical humano, as quais são incubadas com as amostras de soro. 0 ensaio requer perícia técnica elevada para realizar o teste e para uma interpretação correcta dos resultados devido à sua subjectividade intrínseca.

Mas o EMA não é um bom método para a análise de grande número de amostras no rastreio de CD em grupos de risco devido à sua complexidade e custos elevados. Outra desvantagem é que apenas detecta anticorpos anti-endomisiais do isotipo IgA e é conhecido que alguns CD pacientes possuem um défice selectivo de IgA. Estes pacientes serão negativos pelo teste.

Por outro lado os anticorpos anti-gliadina (AGA) foram também extensivamente utilizados para diagnósticos serológicos de CD (Stern M et al., 1996 . Validation and standardization of serological screening tests for celiac disease in 1996. 3rd EMRC/ESPGAN Workshop, Dec 5-8, 1996, Molsheim, France, pp:9-24; Catassi C et al. 1999. Quantitative antigliadin antibody measurement in clinicai practice: an Italian multicentre study. Ital J Gastroenterol Hapatol 31; 366-370). Os AGA são principalmente detectados por ELISA, um método mais simples que IF, e pode ser utilizado para a análise de um grande número de amostras. No entanto os AGA são menos específicos para CD que os EMA e a detecção de anticorpos dos isotipos IgA ou IgG requer dois ensaios independentes. Recentemente foi relatado um ensaio imunológico visual for a detecção de AGA, que resolve alguns destes problemas, (Garrote JA, Sorell L, Alfonso P et al., 1999. A simple visual immunoassay for the screening of celiac disease. Eur. J. 5

Clin Invest 29; 697-699; Spanish Office for Patents e Marks No. 9801067).

Em 1997, Dietrich et al identificaram tecido transgluaminase (tTG), uma proteína de 85 kDa, como o auto antígeno principal, se não o único, detectado por anticorpos anti-endomisiais (Dietrich W et al. 1997. Identification of tissue transglutaminase as the auto antigen of celiac disease. Nat Med. 3:797-801). A detecção de anticorpos anti-tTG foi relatada ultimamente em formatos ELISA ou de radioligando (RLA) baseada em tTG de extractos de fígado de porquinho-da-índia ou tTG humano recombinante clonado a partir de tecidos diferentes (Sulkanen S et al. 1998. Tissue transglutaminase autoantibody enzyme-linked immunosorbent assay in detecting celiac disease. Gastroenterology 115: 1322-1328; Siessler J et al. 1999 .

Antibodies to human recombinant tissue transglutaminase measured by radioligand assay: Evidence for high diagnostic sensitivity for celiac disease. Horm Metab Res 31; 375- 379) .

Os ensaios de anti-transglutaminase mostraram uma sensibilidade e especificidade semelhante ou melhor para o diagnóstico da doença celíaca que EMA (Bazzigaluppi A et al., 1999 . Comparison of tissue transglutaminase-specific antibody assays with established antibody measurement for celiac disease. Journal of Autoimmunity 12:51-56; Amin M et al., 1999. Correlation between tissue transglutaminase antibodies and endomysium antibodies as diagnostic markers of celiac disease. Clin Chim Acta 282: 219-225) . Como mencionado antes, os ensaios EMA foram considerados até agora o melhor teste serológico para o diagnóstico de CD. 6

No entanto a detecçao de anticorpos anti-TG por ELISA ou RLA possui algumas limitações. São técnicas instrumentais que requerem um espectrofotómetro ou um contador radioactivo, uma pericia altamente técnica, e são métodos laboriosos e consumidores de tempo com operações múltiplas. Além disso, são requeridos dois ensaios independentes para detectar os anticorpos anti-TG IgG e IgA.

Foram desenvolvidos diferentes ensaios cromatográficos imunológicos (ICA) para o diagnóstico de gravidez, e doenças infecciosas e não infecciosas. Os princípios gerais ICA estão sob propriedade intelectual, entre eles, Shanfun Ching et al. EP 0 299 428 Bl, Rosenstein R. EP 0 284 232 Bl, que estão relacionadas com a presente invenção.

Outras patentes reivindicaram a utilização destes ensaios na detecção de diferentes moléculas biológicas (Campbell R. Patente dos Estados Unidos da América N° 4 703017), fármacos e antígenos não proteicos (Sung M. Patente dos Estados Unidos da América N° . 5 238 652), e para antígenos associados a tumor (Manita Hideaki et al. EP 0396801). O principal fim da presente invenção é desenvolver um ensaio visual simples, para a detecção de anticorpos anti-TG. Este método fácil de realizar não requer qualquer equipamento de laboratório e os resultados são atingidos em cerca de 15 minutos por uma operação num passo único. O ensaio permite a detecção num teste simples de anticorpos anti-TG IgG e IgA em sangue, soro ou plasma humano, apenas por colocação da amostra no local indicado e esperar pelo 7 resultado do teste. Do nosso conhecimento este método é o ensaio mais fácil e mais rápido já desenvolvido para detectar anticorpos anti-TG para o diagnóstico da doença celiaca. 0 ensaio pode ser realizado em laboratórios com um suporte técnico mínimo, no consultório do clínico, em ambas as áreas urbanas ou rurais, ou mesmo ser usado como um auto-teste.

DETALHES DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção foi desenvolvido um ensaio cromatográfico imunológico da terceira geração para detectar anticorpos anti-TG IgG e IgA num só passo em sangue, soro ou plasma humano para diagnóstico de doença celíaca. 0 sistema possui os seguintes componentes básicos (Figura 1): 1. Antígeno: transglutaminase tisular (tTG), obtida a partir de fonte natural ou por tecnologia de ADN recombinante. 0 antígeno conjugado com uma substância corada, como partículas de ouro coloidal ou de látex corado, serve como um traçador no sistema. 2. Um suporte poroso inerte, onde o antígeno conjugado é depositado e seco. Este suporte permite a libertação do conjugado guando entra em contacto com uma amostra líquida. 3. Uma membrana de nitrocelulose ou nylon com um tamanho de poro entre 5 e 10 pm que permite a migração dos reagentes como um fluxo lateral através da membrana. 8 4. 0 antígeno (tTG) imobilizado numa "zona reactiva" da membrana de nitrocelulose ou nylon onde está firmemente ligado por interacções electrostáticas e hidrofóbicas. 5. Um reagente de controlo capaz de reagir com o antígeno conjugado (por exemplo, anticorpos anti-TG, ou um reagente capaz de ligar ouro coloidal), adsorvido na mesma membrana numa zona de controlo subsequente, que serve para controlar a eficiência do ensaio. 6. Uma compressa absorvente colocada na extremidade, e em contacto com, a membrana. A compressa absorvente permite a eliminação do excesso de reagentes após a migração. 0 princípio do teste é baseado na bivalência das moléculas de IgG e IgA humano para o antígeno específico. Baseado nesta propriedade é possível que a mesma molécula anticorpo anti-TG reaja por um sítio de ligação com o antígeno em solução, neste caso o tecido de trans-glutaminase conjugado com a substância corada, enquanto que pelo outro sítio de ligação reage com o antígeno fixado na membrana de nitrocelulose ou nylon. Esta reacção é evidente por formação de um sinal corado na "zona reactiva" da membrana (Figura 2).

Na prática, quando um volume de 100 a 300 μΐ de uma amostra líquida é adicionado ao antígeno conjugado seco num suporte inerte é dissolvido e migra através da membrana. Se a amostra contém anticorpos anti-TG específicos estes reagem com o antígeno marcado desenvolvendo um complexo imunológico estável. Mais tarde, os complexos imunológicos migram para a "zona reactiva" onde são capturados pelo 9 mesmo antígeno (transglutaminase) fixado na membrana. 0 resultado desta reacção é um sinal corado visível na "zona reactiva" como um resultado da deposição dos complexos imunológicos marcados neste local. Em amostras negativas para a presença de anticorpos anti-TG, o complexo imunológico não será desenvolvido, portanto nenhum sinal corado será visível na "zona reactiva" da membrana (Figura 2) .

Para controlar a eficiência do ensaio, é adsorvido um reagente que reage com o antígeno conjugado na mesma membrana numa "zona de controlo" subsequente (Figura 2). Deste modo, será visível um sinal corado na "zona de controlo" em ambas as amostras, positiva e negativa (Figura 2) . Este segundo sinal corado serve para controlar a funcionalidade do teste.

Finalmente, uma compressa absorvente colocada na extremidade da membrana, e em contacto com ela, permite a eliminação do excesso de reagentes e melhora as condições de fluxo (Figura 1).

EXEMPLOS

Exemplo 1. Método de ensaio. 0 tecido de transglutaminase obtido a partir de fonte natural ou por tecnologia de ADN recombinante é conjugado com partículas de ouro coloidal (20 a 40 pm de diâmetro), de acordo com Oliver C. (Oliver C, 1994. Conjugation of colloidal gold to proteins, Chapter 38 In: Javois LC, Human Press Inc., ed. Method Mol Biol, 34:303-307). 10

Quando uma amostra de soro, plasma ou sangue é adicionada ao suporte inerte onde o conjugado é depositado, os anticorpos anti-TG específicos reagem com o antígeno conjugado desenvolvendo um complexo imunológico (IC) que migra através da membrana de nitrocelulose (NC) (4 mm de largura, tamanho de poro5-10 ym) . Em poucos minutos a IC reage com o antígeno imobilizado (tTG) na "zona reactiva" da NC formando um sinal corado neste local. Em amostras negativas sem anticorpos anti-TG específicos, não será o IC desenvolvido e portanto nenhum sinal corado será visto na "zona reactiva" da NC.

Exemplo 2. Controlo da eficiência do ensaio

Para a avaliação da eficiência do ensaio, um anticorpo monoclonal anti-TG é adsorvido na mesma membrana NC numa "zona de controlo" subsequente, superior à "zona reactiva" tendo em conta o local de aplicação da amostra. Quando o excesso de antígeno conjugado atinge esta zona reage com o anticorpo monoclonal dando origem a um sinal corado.

De acordo com os dois exemplos atrás, os resultados do teste podem ser interpretados por examinação visual das zonas reactiva e de controlo após 15 minutos da aplicação da amostra. Os resultados possíveis são os seguintes (Figura 3):

Presença de dois sinais corados: Amostra positiva

Presença de apenas um sinal corado na "zona de controlo": Amostra negativa

Nenhum sinal corado: Resultado Não válido. Repetir o teste. 11

Vantagem do método 1. É um teste de passo único. 2. 0 ensaio não requer qualquer equipamento instrumental. 3. Fácil para interpretar os resultados. 4. Resultados em menos de 15 minutos. 5. Detecção de anticorpos anti-TG IgG e IgA no mesmo teste. 6. Método efectivo para diagnóstico de doença celíaca em pacientes com défice de IgA. 7. 0 ensaio pode ser realizado com soro, plasma ou amostras de sangue.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Esquema geral do ensaio. 0 antígeno conjugado (tecido de transglutaminase conjugado com um traçador corado) é seco num suporte fibroso inerte. 0 mesmo antígeno (tecido de transglutaminase) é adsorvido numa "zona reactiva" de uma membrana de nitrocelulose ou nylon. Um anticorpo anti-transglutaminase monoclonal é adsorvido na mesma membrana numa "zona de controlo" subsequente. Na extremidade do lado direito a compressa absorvente que permite a eliminação do excesso de reagentes após migração. A seta larga indica a direcção do fluxo lateral. É também mostrada a zona para a aplicação da amostra.

Figura 2. Princípio do ensaio. Quando o suporte conjugado é mergulhado numa amostra líquida os anticorpos anti tecido de tranglutaminase reagem com o antígeno conjugado, desenvolvendo e o complexo imunológico que migra através da faixa de membrana. 0 tecido de transglutaminase 12 imobilizado na nitrocelulose reage com os complexos imunológicos, devido à bivalência de moléculas de anticorpos, formando um sinal corado na "zona reactiva". 0 excesso de antigeno conjugado e complexos imunológicos continuam a migração e finalmente reagem com o anticorpo monoclonal anti-tTG formando um segundo sinal corado na faixa. Um resultado positivo , indicando a presença de anticorpos anti-tTG na amostra, será visto como dois sinais detectáveis visualmente subsequentes na faixa. Um ensaio negativo exibe apenas um sinal corado na "zona de controlo" porque os complexos imunológicos não se desenvolveram.

Figura 3. Interpretação dos resultados. Quinze minutos após a adição da amostra: Apenas um sinal corado na zona de controlo: indica um resultado negativo. Dois sinais corados: indica um resultado positivo. Nenhum sinal corado: indica um resultado não válido, de modo que o ensaio deverá ser repetido.

Lisboa, 30 de Outubro de 2006

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Ensaio para detectar anticorpos anti-transglutaminase IgA ou IgG numa amostra liquida, o método compreendendo: a) providenciar um sistema compreendendo: (i) um suporte poroso inerte em que o antigeno de tecido de transglutaminase conjugado com uma substância corada é depositado e seco, e em que o suporte permite libertação e fluxo lateral do antigeno conjugado quando contactado com uma amostra liquida; e (ii) uma membrana compreendendo uma zona reactiva que compreende antigeno de tecido de transglutaminase imobilizado; b) providedenciar uma amostra liquida a partir de um humano; c) adicionar a amostra liquida ao suporte poroso inerte contendo antigeno de tecido de transglutaminase conjugado com uma substância corada, em que o antigeno conjugado e/ou complexos imunológicos formados entre anticorpos na amostra e o antigeno conjugado migram para a zona reactiva por fluxo lateral; e d) detectar a ligação dos complexos imunológicos descrita no passo c) com o antigeno imobilizado; em que a ligação dos complexos imunológicos com o antigeno imobilizado indica anticorpos anti-transglutaminase IgA ou IgG na amostra. 2

2. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, em que a membrana compreende adicionalmente uma zona de controlo, em que a zona de controlo compreende um reagente de controlo que se liga com o antígeno conjugado.

3. Ensaio de acordo com a reivindicação 2, em que o método compreende adicionalmente detectar a ligação do antígeno conjugado com o reagente de controlo, em que a ligação do antígeno conjugado com o reagente de controlo indica a eficiência do método.

4. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é sangue.

5. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é plasma.

6. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é soro. Lisboa, 30 de Outubro de 2006