MXPA97001877A - Inmunoensayo para h. pylori en especimenes fecales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de H. pylori en un espécimen fecal, que comprende:a) dispersar un espécimen fecal, que se sospecha que porta H. pylori, en un diluyente de muestra:b) poner en contacto el espécimen fecal en el diluyente con un primer anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori para formar un complejo del anticuerpo y del antígeno;c) separar dicho espícimen y dicho complejo;d) exponer el complejo a un segundo anticuerpo policlonal para dicho antígeno, y una porción del anticuerpo que reacciona con dicho complejo, uno de los primero y segundo anticuerpos estando unido a un vehículo sólido y el otro siendo marcado con un agente de detección;y e) determinar la cantidad del anticuerpo marcado y, a la vez, determinar la presencia del antígeno H. pylori, en dicho espécimen fecal.

Description

INMUNOENSAYO PARA H. PYLORI EN ESPECÍMENES FECALES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un método para detectar Helicobacter pylori en especímenes fecales. H. pylori es un bacteria que se encuentra en el tracto gastrointestinal superior de seres humanos, la cual ha sido implicada en enfermedades gastroduodenales tales como úlceras pépticas, gastritis y otros malestares. La bacteria originalmente fue clasificada como Campylobacter, y después reclasificada como Helicobacter, con base en más información detallada con respecto a su ultraestructura y composición de ácido graso. Se han utilizado un número de diferentes técnicas, tanto invasivas como no invasivas para detectar H. pylori. Las técnicas invasivas implican biopsias y cultivos gástricos. Las técnicas no invasivas incluyen una prueba de respiro de urea, en donde al paciente se le da urea marcada de C-13 o C-14 con una bebida, y la detección del anticuerpo H. pylori en sueros utilizando antígenos en ensayos inmunusorbentes enlazados a la enzima (ELISA). Ejemplos para estas últimas técnicas se encuentran en la patente de E.U.A. 5,262,156 de Aleonohammad y solicitud de patente europea 0, 329 570 cedida a Blaser. Se han identificado y utilizado varios antígenos principales en los inmunoensayos para detectar anticuerpos H. pylori. Sin embargo, estos ensayos no han exhibido el carácter específico y la sensibilidad que son deseados en la serodiagnosis. Newell , D. G . , y otros, Serodian. Immunother. Infec. Dis. , 3: 1 - 16 (1989) . U n problema con estos inmunoensayos en la reactividad cruzada. Estudios de los antígenos dominantes en H. pylori, en particular, la proteína flagelar putativa, la cual tiene un peso molecular de 60 Da, han mostrado que algunos de estos antígenos no son específicos para H. pylori y también se ha encontrado en otras bacterias tales como C. jeuni y C. coli. U n segundo problema que se ha encontrado en el diseño de __ inmunoensayos para H. pylori es la variación de cepa. Se han observado diferencias substanciales en los antígenos, en diferentes cepas de H. pylori. Estos problemas imposi bilitan el d iseño de u ensayo alrededor del uso de u n sólo antígeno . También excluyen el uso de anticuerpos monoclonales . U n aspecto que se ha tomado para mejorar el carácter específico y la selectividad de los inmunoensayos de anticuerpo para H. pylori, ha sido util izar una mezcla de antígenos de diferentes cepas de H. pylori, dicha mezcla está enriquecida con ciertos fragmentos de antígeno. Una de ELISA , la cual detecta anticuerpos de H. pylori, en suero de la sangre, está comercialmente disponible de Meridian Diagnostics. Este ensayo utiliza lisato de célula completa bacteriano , como el antígeno . Existen ciertas desventajas al utilizar ELISA , que emplea antígenos para detectar la presencia de anticuerpos de H. pylori. En particular, la titulación del anticuerpo en suero humano permanece alta durante un tiempo prolongado (en algunos casos , tanto como seis meses) después de que se ha tratado la infección. Consecuentemente, una prueba positiva, utilizando ELISA, no necesariamente significa que el paciente está realmente infectado y requiere de un tratamiento para la infección por H. pylori. Cuando se confronta con un ELISA positivo, los médicos por lo regular solicitan una biopsia gástrica para confirmar la presencia de la bacteria antes de iniciar una terapia antibiótica. Por esto, el ELISA a base de antígeno no elimina la necesidad del procedimiento invasivo. En contraste, si se pudiera diseñar un inmunoensayo para detectar el antígeno H. pylori, en lugar del anticuerpo, la necesidad de hacer biopsias gástricas para confirmar la infección podría ser reducida significativamente, ya que el antígeno generalmente no puede ser detectado en un paciente en los días de este tratamiento. De esta manera, existe la necesidad de un ELISA, que detecte el antígeno H. pylori y, más particularmente, existe la necesidad de un ELISA para detectar H. pylori directamente de especímenes fecales. Ya que son conocidos los ensayos de ELISA para detectar microorganismos tales como C. Difficile en adenovirus en especímenes fecales, en estudios de pacientes con biopsias gástricas, las cuales son positivas para H. pylori, la bacteria ordinariamente no puede ser cultivada y aislada de los especímenes fecales. Este y los problemas de reactividad cruzada y la variación de cepa dan surgimiento a serias dudas de que un ELISA pueda ser diseñado para que sea específico para H. pylori y lo suficientemente sensible para detectar confiablemente el antígeno H. pylori directamente de un espécimen fecal .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente i nvención provee un método para detectar H. pylori en especímenes fecales, el cual comprende: a) dispersar un espécimen fecal, que se sospecha que porta H. pylori, en un diluyente de muestra; b) poner en contacto el espécimen fecal en el diluyente con un primer anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori para formar un complejo del anticuerpo y del antígeno; c) separar dicho espécimen de dicho complejo; d) exponer el complejo a un segundo anticuerpo policlona l para dicho antígeno, y una porción del anticuerpo que reacciona con dicho complejo, uno de los primero y segundo anticuerpos estando unido a un vehículo sólido y el otro siendo marca'do con un agente de detección ; y e) determinar la cantidad del anticuerpo marcado y, a la vez, determinar la presencia del antígeno H. pylori, en dicho espécimen fecal. En la modalidad preferida de la invención , el primer anticuerpo está unido a un vehículo , y el segundo está marcado con una enzima. También se proveen ensayos triples em paredados. Este inmunoensayo será suministrado en la forma de un equipo , que incluye una placa de cavidades revestidas para el anticuerpo , un diluyente de muestra, el anticuerpo marcado, por ejemplo, un conjugado de enzima-anticuerpo, regulador de pH de lavado y, en el caso de ELISA, una solución de substrato.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El inmunoensayo de la presente invención emplea anticuerpos policlonales para H. pylori . Estos anticuerpos pueden ser obtenidos de sueros de un animal sensibilizado. La sensibilización puede lograrse inyectando el antígeno a una especie productora de anticuerpo, típicamente un mamífero, y preferiblemente un conejo, cabra o vaca. Usüalmente se da una inyección inicial seguido por inyecciones reforzadoras subsecuentes para incrementar al máximo la respuesta. Óptimamente, el régimen de inyección es en dosis múltiples dadas a conejos White New Zealand. La cantidad de antígeno inyectado debe ser adecuada para producir que una cantidad suficiente del anticuerpo sea detectable. Se verifica la producción del anticuerpo utilizando un sangrado de análisis y Ensayo Fluorescente Indirecto. Las células H. pylori, de ATCC cepa 43504, se ha encontrado que son particularmente útiles para producir en anticuerpo policlonal. Como se mencionó anteriormente, en H. pylori se ha observado la variación substancial de cepa. Se han observado diferencias en el organismo en diferentes regiones gráficas, así como en grupos dietéticos. Sin embargo, se ha encontrado que los anticuerpos obtenidos a través de la sensibilización, utilizando células de la cepa 43504, son útiles para detectar el organismo a través de regiones geográficas y grupos dietéticos. Si es necesario, por ejemplo, si se encuentra que ELISA no es efectivo para detectar el organismo en ciertas poblaciones, se pueden utilizar células de más de una cepa de H. pylori para producir el anticuerpo. Las mismas marcas utilizadas en ensayos inmunométricos conocidos, pueden ser utilizadas para marcar el anticuerpo policlonal utilizado en la presente invención. Entre estas, se pueden mencionar marcas fluorogénicas para la detección mediante fluorimetría, como se describe en la patente de E.U.A., No. 3,940,475, marcadores enzimáticos, como se describe en la patente' de E.U.A. No. 3,654,090, y radioisótopos tales como Yodo-125. Uno de los marcadores enzimáticos más comunes es la enzima de peroxidasa de rábano (HRP) y de fosfatasa alcalina. El Ejemplo 3, que se presenta más adelante, ilustra la marcación de anticuerpos policlonales con HRP. El anticuerpo policlonal no marcado, utilizando en el procedimiento de la presente invención para extraer la substancia antigénica del espécimen fecal que se está probando, puede ser inmovilizado sobre cualquiera dé los soportes comúnmente utilizados en ensayos inmunométricos. Entre éstos, los que se pueden utilizar son papel filtro, perlas de plástico, polietileno, poliestireno, polipropileno, u otro tubo de ensayo adecuado. Las técnicas para unir los anticuerpos a dichos materiales son bien conocidas por aquellos expertos en el campo. Para preparar el espécimen fecal para utilizarse en el ensayo, el espécimen se dispersa en un diluyente de muestra a base de proteína. El diluyente es formulado y regulado en el pH ara reducir al mínimo la reactividad cruzada. Como ejemplos de diluyente de muestra, se pueden mencionar suero de bovino fetal, suero de cabra normal, suero de cobayo, suero de caballo, caseína, albúmina, gelatina y albúmina de suero de bovino (BSA). Se ha encontrado que es útil una dilución de una parte de espécimen fecal y cuatro partes de diluyente. Además de utilizar los aditivos a base de proteína, la reactividad cruzada puede ser reducida mediante la adición de detergentes, e incrementando o reduciendo ' el pH o la resistencia iónica del regulador de pH diluyente. Por ejemplo, muchos diluyentes de muestra contienen Tritón X-100 y/o Tween 20, a concentraciones que varían de entre 0.05% y 2%. Se puede añadir NaCI en las escalas de entre 0-2.9% para alterar la resistencia iónica del sistema regulador de pH. Estos cambios conducen a un carácter específico mayor reduciendo la probabilidad de que se formen interacciones débiles o no específicas. La reactividad cruzada también puede ser dirigida en la formulación de las soluciones de anticuerpo y los lavados que son utilizados en el análisis. El anticuerpo puede ser provisto en una solución regulada en su pH, junto con uno de los sueros de proteína previamente mencionados. Los lavados utilizados en el ensayo pueden ser formulados y regulados en su pH mediante la adición de sales y agentes tensoactivos para controlar la reactividad cruzada. Un lavado preferido para reducir la reactividad cruzada es una solución salina regulada en su pH con fosfato. La preparación del antígeno, producción de los anticuerpos policlonales y un ELISA se ilustran con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Preparación del Antígeno Helicobacter pylori (H. pylori) El H. pylori (ATCC cepa 43504) fue estriado para aislamiento en Agar de Soya Tríptica (TSA) suplementado con 5% de sangre de oveja desfibrinada. La placa se incubó a 37°C en un ambiente microaerofílico durante 6-7 días. El crecimiento bacteriano resultante se evaluó mediante el uso de morfología de colonia, reacciones de ureasa, catalasa y oxidasa, y cepa gram. Se subcultivó el crecimiento aceptable para cuatro TSA con placas de agar de sangre de oveja y creció a 37°C en un ambiente microaerofílico durante 3-4 días. Cada placa se inundó con 5 mi de 0.85% NaCI y el crecimiento bacteriano se cosechó mediante un propagador de placa. Las bacterias se centrifugaron a 10,000xg durante 15 minutos a 2-8°C. Cada pella se resuspendió en 3 mi de 0.85% NaCI y se combinó con un recipiente de centrífuga. La suspención bacteriana se centrifugó a 10,000xg durante 15 minutos a 2-8°C. La pella se resuspendió y se centrifugó, como se hizo anteriormente. La pella final se resuspendió a 3% del volumen original total en 20 mM de regulador de pH de fosfato. Las células bacterianas fueron transferidas a un recipiente frío y se les aplicó sonido 5 veces durante 3 minutos a la fijación máxima que no ocasiona la formación de espuma, con un descanso de 30 segundos entre los ciclos. Las células bacterianas tratadas con sonido se centrifugaron a 57,000xg durante 15 minutos a 2-8°C. El sobrenadante bacteriano se recogió y la pella se desechó.

EJEMPLO 2 Producción de Policlonal de Conejo Se diluyó el sobrenadante bacteriano obtenido en el Ejemplo 1, en partes iguales con auxiliar completo de Freunds (inmunógeno total de 1.0 mi) para proveer 1 x 108 células por mi. Esta solución se mezcló concienzudamente y se inyectaron intramuscularmente 0.2-0.5 mi de la solución a la pata trasera derecha, y se inyectaron subcutáneamente 0.1-0-25 mi de la solución a cada uno de los 8 a 10 sitios sobre el lomo. Se aplicaron inyecciones subsecuentes con un mes de diferencia utilizando auxiliar incompleto de Freunds y los sitios de inyección fueron limitados al lomo, subcutáneamente. Cada tres meses se tomó sangre de muestra. La sangre se tomó de la vena central de la oreja una semana después de la tercera inyección. Esta sangre se incubó durante la noche a 2-8°C. Al siguiente día, la sangre se centrifugó a 5,000xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se recogió y la pella se desechó. El sobrenadante se probó mediante Un Ensayo Fluorescente Indirecto (IFA). El IFA se realizó colocando 10ul de la suspensión de H. pylori sobre portaobjetos de vidrio y se fijó con calor. Los portaobjetos fueron bloqueados con 3% de albúmina de suero de bovino (BSA) durante 5 minutos, después se lavaron con un lavado de salina regulada en su pH de fosfato (PBS) y 0.5% de Tween 20 (lavado de PBS/Tween). Se añadieron y se incubaron, en u ambiente húmedo durante 30 minutos, 50ul de las sangres de muestra y del suero normal de conejo, como un control, diluido a 1:10 en salina regulada en su pH de fosfato con azida de sodio (PBSA). Después del lavado con PBS/Tween, se diluyó anticonejo de cabra conjugado para FITC (isotiocianato de fluoroesceína) a 1:10 en PBSA, y se añadieron a cada cavidad 50ul. Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos en un ambiente húmedo obscuro. Los portaobjetos se lavaron de nuevo. Se añadieron medios de montaje de ensayo de fluorescencia y una cubierta deslizante y se vieron en un microscopio fluorescente. Los conejos, cuyos sueros demostraron una lectura de intensidad de fluorescencia de 4 + , después fueron sangrados en volumen. La sangre en volumen se obtuvo similarmente a la sangre de prueba, excepto que se removieron 50 mi de cada conejo. La sangre se incubó y se centrifugó hasta tomar la sangre de muestra. El volumen total de sueros se determinó y se añadió un volumen igual de salina reguladora de pH de fosfato (PBS). Se realizó una precipitación de sulfato de amonio al 40% para remover la proteína innecesaria y se incubó a 2-8°C durante 24 horas. La mezcla se transfirió a un tubo de centrífuga, y se centrifugó a 10,000xg durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se resuspendió la pella en PBS a aproximadamente un tercio del volumen original. La suspensión de dializó contra 200 veces el volumen total de suspensión de 0.0175 M de fosfato de potasio, pH 6.5 a 2-8°C. Después de la diálisis, la suspensión se centrifugó a 10,000xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se recogió y la pella se desechó. Se equilibro una columna de DEAE (dimetilaminoetil celulosa) con 0.0175 M de fosfato de potasio, pH 6.5, a temperatura ambiente. El sobrenadante se colocó sobre la columna y las fracciones efluentes se recogieron. Se determinó una concentración de proteína (OD28o), y todas las fracciones mayores que 0.200 fueron agrupadas. El anticuerpo agrupado fue probado en ELISA.

EJEMPLO 3 Conjugación de Peroxidasa de Rábano La conjugación utilizó 10 mg de anticuerpo anti- H. pylori de conejo purificado con DEAE. El anticuerpo se llevó a un volumen final de 2.5 mi por concentración o por la adición de 10 mM de bicarbonato de sodio, pH 9.6. Se equilibró una columna PD-10 (Pharmacia) con 10 mM de bicarbonato de sodio, pH 9.6. El anticuerpo se añadió a la columna y se tomaron 9 fracciones de 1.0 mi. Se tomó una concentración de proteína (OD28oE O. = 1.4), y aquellas, con lectura por arriba de 0.200 fueron agrupadas. Se equilibró una columna PD-10 por separado con 1 mM de trihidrato-acetato de sodio, pH 4.3. La cantidad mínima de Peroxidasa de Rábano (HRP) utilizada, fue de 1.172 mg de HRP para cada 1 mg de anticuerpo. De 1-1/2 veces el HRP mínimo calculado se pesaron y se añadieron a 1.0 mi de agua desionizada. Se realizó una concentración de proteína (OD403E.O. = 2.274) y se diluyó HRP a 10 mg/ml con agua desionizada. Se añadió 0.1 M de m-periodato de sodio a una concentración de 0.2 mi por cada 4 mg de HRP. Esta reacción se dejó proseguir durante 20 minutos a temperatura ambiente con balanceo moderado. La reacción se detuvo mediante la adición de 50ul de 2 M de glicol etilénico por cada mi de HRP a 4 mg. El HRP se eluyó a través de PD-10 con 1 mM de trihidrato-acetato de sodio, pH 4.3. La relación de conjugación fue de 1 mg de anticuerpo a 1.172 mg de HRP. El anticuerpo se ajustó con 10 mM de bicarbonato de sodio, pH 9.6, y la HRP con 1 mM de trihidrato-acetato de sodio, pH 4.3. Los dos fueron combinados en un matraz dedicado y el pH se ajustó con 0.2 M de bicarbonato de sodio, pH 9.6 a 9.6. Protegida de la luz, la mezcla se incubó durante 2 horas sobre un rotador a 85-95 rpm a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se añadieron de 0.1 mi a 4 mg/ml de borohidruro de sodio por cada 8 mg de anticuerpo. La nueva mezcla se incubó a 4°C durante 2 horas sobre un rotador. El conjugado se hizo pasar a través de PD-10, se equilibro con PBS, y se recogieron las fracciones conteniendo el conjugado. Las fracciones se agruparon y se concentraron a aproximadamente 1.0 mi. El concentrado se colocó sobre una columna Sephracryl S-200 equilibrada con PBS a una velocidad de flujo de 10 ml/hr. Se recogieron 2.0 mi de fracciones y se realizó una concentración tanto de anticuerpo como de la HRP. Las fracciones con un pico simultáneo tanto en OD28o como en OD 03 se agruparon y se concentraron a aproximadamente 1.0 mg/ml. El Ejemplo 4 a continuación ilustra un así llamado ensayo "anterior", en el cual el anticuerpo unido al soporte primero se pone en contacto con el espécimen que está siendo tratado, para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo de anticuerpo/antígeno, y poniendo en contacto el complejo con una cantidad conocida de anticuerpos marcados. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica apreciarán que el ensayo inmunométrico también puede ser conducido como un así llamado ensayo "simultáneo" o "inverso". Un ensayo simultáneo involucra un sólo paso de incubación a media que el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado son añadidos a la muestra que está siendo probada, al mismo tiempo. Después de que se completa la incubación, el soporte sólido se lava para remover la muestra residual y el anticuerpo marcado, sin complejo. Después, se determinó la presencia del anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido. Un ensayo inverso implica primero la adición escalonada de una solución de anticuerpo marcado al espécimen fecal seguido por la adición del anticuerpo no marcado unido al soporte. Después de un segundo de incubación, el soporte se lava en una forma convencional para liberarlo del espécimen residual y del anticuerpo marcado sin reaccionar.

EJEMPLO 4 Prueba de ELISA El anticuerpo se diluyó en PBS serialmente entre 20ug/ml y 2.5ug/ml. Se añadió una alícuota de 0.100 mi, de cada dilución, a una tira Immunlon-ll (Dynatéch), se cubrió y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La placa se lavó una vez con el lavado de PBS/Tween. Se bloqueó con 1% BSA/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó una vez más con el lavado de PBS/Tween. Se diluyeron varias muestras positivas y negativas de 1:5 en 0.1% BSA/PBS. Cada muestra (0.100 mi) se añadió a una cavidad de las tiras, se cubrió y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavó 5 veces con un lavado de Merifluor C/G. Un anti- H. pylori de conejo, previamente aceptado, conjugado a peroxidasa de rábano, se diluyó a 10ug/ml, y se añadieron 0.100 mi a cada cavidad La placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. De nuevo, se lavó 5 veces con el lavado de PBS/Tween, después se desarrolló durante 10 minutos a temperatura ambiente con 0.100 mi de una solución de trimetilbensidina (TMB). Se detuvo con 0.50 mi de 2NH2SO y se leyó después de 2 minutos. La dilución que produce la señal máxima y el antecedente más bajo se eligió como la dilución óptima. Se pueden hacer determinaciones cuantitativas comparando la medida del anticuerpo marcado con aquella obtenida para las muestras calibradoras que contienen cantidades conocidas de antígeno. El Cuadro 1, a continuación, muestra la densidad óptica obtenida cuando cuatro muestras, cada una conteniendo un número predeterminado de organismos, se operaron a través del ensayo.

CUADRO 1 No. de Organismos 3 x 107 2.547 1.9 x 107 0.662 4.6 x 106 0.182 1.1 x 10d 0.028 En el Cuadro 2 se muestran los resultados de la operación de los seis especímenes clínicos a través del ensayo.

Muestra O D4S0/630 Resultado 1 0.301 Positivo 2 0.713 Positivo 3 0.284 Positivo 4 0.005 Negativo 5 0.033 Negativo 6 0.008 Negativo También se útil izaron los así llamados ensayos triples emparedados para detectar H. pylori en especímenes fecales de acuerdo con la invención . En la técnica son conocidos los ensayos triples y se puede aplicar la metodolog ía básica para detectar H. pylori en especímenes fecales . Un ensayo triple es típicamente conducido d ispersando un espécimen fecal sospechoso de portar H. pylori, en un diluyente de muestra que reduce al m ínimo la reacción cruzada y añadiendo la muestra diluida a un anticuerpo inmovilizado para H. pylori, que ha sido obtenido de una primera especie de un animal productor del anticuerpo. La muestra se incubó para formar el complejo de anticuerpo-antígeno . Después de lavar excesivamente el espécimen del soporte inmovilizado, se añadió un anticuerpo H. pylori, conocido como un anticuerpo primario y obtenido de una segunda especie de un animal productor de anticuerpo , al complejo de anticuerpo-antígeno y se incubó para formar u n complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Después de formar este com plejo y de remover el anticuerpo sin reaccionar, el complejo se hizo reaccionar con un anticuerpo conocido como un anticuerpo secundario, el cual es un anticuerpo para la especie productora de segundo anticuerpo, tal como inmonoglobulina anti-(conejo,vaca o cabra) , el anticuerpo secundario se marcó en una manera convencional , típicamente con una enzima , y se incubó con el completo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo para formar un complejo o emparedado de anticuerpo triple . Después de remover el anticuerpo secundario sin reaccionar, el antígeno es analizado en una manera convencional. Al utilizar una marca de enzima, se añade un substrato al complejo del antígeno , y se i nspeccionaron los tres anticuerpos y la reacción del substrato con la enzima enlazada, para determinar la cantidad del antígeno presente el espécimen. En el ensayo emparedado triple, como en el ensayo emparedado básico , los lavados y las soluciones de anticuerpo se formulan o se regulan en su pH , según sea necesario , para controlar la reactividad cruzada. Habiendo descrito con detalle la invención y haciendo referencia a las modalidades preferidas , será evidente para aquellos expertos en la técnica que son posibles modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención, según se define en las siguientes reivindicaciones .

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para la determinación de H. pylori en un espécimen fecal, que comprende: a) dispersar un espécimen fecal, que se sospecha que porta H. pylori, en un diluyente de muestra; b) poner en contacto el espécimen fecal en el diluyente con un primer anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori para formar un complejo del anticuerpo y del antígeno; c) separar dicho espécimen y dicho complejo; d) exponer el complejo a un segundo anticuerpo policlonal para dicho antígeno, y una porción del anticuerpo que reacciona con dicho complejo, uno de los primero y segundo anticuerpos estando unido a un vehículo sólido y el otro siendo marcado con un agente de detección; y e) determinar la cantidad del anticuerpo marcado y, a la vez, determinar la presencia del antígeno H. pylori, en dicho espécimen fecal.

2.- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el primer anticuerpo está unido a un vehículo sólido y el segundo anticuerpo está marcado con un agente de detección. 3 - El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el primer anticuerpo está marcado con un agente de detección y el segundo está unido a un vehículo sólido. 4.- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el diluyente de muestra es un diluyente a base de proteína. 5.- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo policlonal se obtiene sensibilizando un mamífero productor de anticuerpo con células H. pylori. 6.- El procedimiento de la reivindicación 4, en donde el diluyente de muestra contiene una proteína seleccionada del grupo que consiste de suero de bovino fetal, suero de cabra normal, suero de cobayo, suero de caballo, caseína, albúmina, gelatina, y albúmina de suero de bovino. 7.- El procedimiento de la reivindicación 1, en donde después de exponer el complejo al segundo anticuerpo, el complejo se lava con un regulador de pH que reduce la reactividad cruzada, o de otra manera mejora el carácter específico del análisis. 8.- El procedimiento de la reivindicación 5, en donde las células son células de una pluralidad de cepas de H. pylori. 9 - El procedimiento de la reivindicación 3, en donde dicho agente de detección se selecciona del grupo que consiste de fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano beta-galactosidasa. 10.- El procedimiento de la reivindicación 7, en donde dicho lavado es salina regulada en su pH de fosfato. 11.- El procedimiento de la reivindicación 5, en donde dichas célula son células de ATCC cepa 43504 12.- Un procedimiento para la determinación de H. pylori en un espécimen fecal, que comprende: a) dispersar un espécimen fecal, que se sospecha que porta H. pylori, en un diluyente de muestra; b) poner en contacto el espécimen fecal en el diluyente con un primer anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori unido a un vehículo sólido y un segundo anticuerpo policlonal marcado para H. pylori para formar un complejo de los anticuerpos y del antígeno; c) separar dicho espécimen y dicho complejo; d) determinar la cantidad del anticuerpo marcado y, a la vez, determinar la presencia del antígeno H. pylori, en dicho espécimen fecal. 1

3.- Un procedimiento para la determinación de H. pylori en un espécimen fecal, que comprende: a) dispersar un espécimen fecal, que se sospecha que porta H. pylori, en un diluyente de muestra; b) poner en contacto el espécimen fecal en el diluyente con un primer anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori producido por una primera especie productora de anticuerpo y unido a un vehículo sólido para formar un complejo del anticuerpo y del antígeno; c) separar dicho espécimen y dicho complejo; d) poner en contacto el complejo anticuerpo-antígeno formado en el paso b) con un anticuerpo policlonal primario para el antígeno H. pylori obtenido de una segunda especie productora de anticuerpo para producir un complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo; e) remover el anticuerpo primario no presente en el complejo del paso d); f) poner en contacto el complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo formado en el paso d) con un anticuerpo secundario, dicho anticuerpo secundario siendo un anticuerpo para la segunda especie productora de anticuerpo, por lo que dicho anticuerpo secundario forma un complejo con dicho complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo; y g) determinar la presencia del antígeno H. pylori en dicho espécimen fecal . 1

4. - U n equipo para la determinación de H. pylori en un espécimen fecal , que incluye u na placa de cavidades que tiene unida a la misma el anticuerpo policlonal para el antígeno H. pylori, un diluyente de muestra a base de proteína, un conjugado de u n anticuerpo policlonal de enzima para en antígeno H. pylori, u n regulador de pH de lavado y una solución de substrato.