ES2264515T3 - Sales del acido boronico utiles en formulaciones parenterales para la inhibicion selectiva de la trombina. - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica parenteral que comprende una sal de adición de base farmacéuticamente aceptable de ácido borónico de la fórmula (I): (Ver fórmula) donde Y comprende una fracción hidrófoba la cual, junto con el residuo de aminoácido borónico -NHCH(R9)-B(OH)2, tiene afinidad por el lugar de enlace del substrato de trombina; y R9 es un grupo alquilo de cadena recta interrumpido por uno o más enlaces de éter y en el cual el número total de átomos de oxígeno y carbono es 3, 4, 5 ó 6 o R9 es -(CH2)m-W donde m es 2, 3, 4 ó 5 y W es -OH o halógeno (F, Cl, Br o I), y, donde el YCO- es un residuo dipeptídico opcionalmente protegido N-terminalmente, los enlaces peptídicos en el ácido están opcionalmente e independientemente N-sustituidos por un grupo hidrocarbilo C1-C13 que contiene opcionalmente nitrógeno, oxígeno o sulfuro en cadena o en anillo y sustituido opcionalmente por un sustituto seleccionado de halo, hidroxi y trifluorometilo.

Description

Sales del ácido borónico útiles en formulaciones parenterales para la inhibición selectiva de la trombina.

Antecedentes

La presente revelación hace referencia a productos útiles desde el punto de vista farmacéutico que se pueden obtener a partir de ácidos organoborónicos. La revelación también hace referencia al uso de miembros de la clase de productos anteriormente mencionada, a su formulación, su preparación, sus intermedios sintéticos y otras materias.

La revelación hace referencia además a formulaciones farmacéuticas parenterales que contienen los productos descritos.

Compuestos del Ácido Borónico

Desde hace varios años se sabe que los compuestos del ácido borónico y sus derivados, p.e., ésteres, tienen actividades biológicas, especialmente como inhibidores o sustratos de proteasas. Por ejemplo, Koehler y col.. Biochemistry 10:2477, 1971 informa de que el ácido borónico 2-feniletano inhibe la serin-proteasa quimotripsina a niveles milimolares. La inhibición de la quimotripsina y subtilisina por ácidos arilborónicos (ácido fenilborónico, ácido m-nitro-fenilborónico, ácido m-aminofenilborónico, ácido m-bromofenilborónico) se ha dado a conocer en Phillip y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68:478-480, 1971. Biorg. Med. Chem. 2(1):35-48, 1994 presenta Se describe un estudio de la inhibición de la subtilisina Carlsberg por una variedad de ácidos borónicos, especialmente ácidos fenilborónicos sustituidos por Cl, Br, CH_{3}, H_{2}N, MeO y otros por Seufer-Wasserthal y col., Biorg. Med. Chem. 2(1):35-48,
1994.

En la descripción de inhibidores o sustratos de proteasas, P1, P2, P3, etc. designan los residuos de sustratos o inhibidores que son aminoterminales para el enlace peptídico escindible y S1, S2, S3, etc. designan los correspondientes subconjuntos de la proteasa relacionada de acuerdo con: Schechter, I. and Berger, A. On the Size of the Active Site in Proteases, Biochem. Biophys. Res. Comm., 27:157-162, 1967. En trombina, el sitio de enlace o "bolsillo de especificidad" es una rendija bien definida en la enzima, mientras que los subconjuntos de enlace S2 y S3 (también denominados respectivamente los bolsillos hidrófobos proximal y distal) son hidrófobos e interactúan enormemente con, respectivamente, Pro y (R)-Phe, entre otros.

La investigación farmacéutica sobre inhibidores de serin-proteasa se ha trasladado de los ácidos arilborónicos sencillos a los boropéptidos, p.e., péptidos que contienen un ácido borónico análogo a un ácido \alpha-amino-carboxílico. Se puede derivar el ácido borónico, frecuentemente para formar un éster. Shenvi (EP-A-145441 y US 4499082) reveló que los péptidos que contienen un ácido \alpha-aminoborónico con una cadena lateral neutra fueron inhibidores eficaces de elastasa y ha estado seguido por numerosas publicaciones de patentes relacionadas con inhibidores boropeptídicos de serin-proteasas. Se ha informado sobre inhibidores específicos de ácido borónico con enlace fuerte para elastasa (K_{i}, 0,25 nM), quimotripsina (K_{i}, 0,25 nM), catepsia (K_{i}, 21 nM), proteasa \alpha-lítica (K_{i}, 0,25 nM), dipeptidilaminopeptidasa de tipo IV (K_{i}, 16 pM) y, más recientemente, trombina (Ac-D-Phe-Pro-boroArg-OH (DuP 714 inicial K_{i} 1,2 nM).

Claeson y col. (US 5574014 y otras) y Kakkar y col. (WO 92/07869 y miembros de la familia, incluida la US 5648338) revelan inhibidores de trombina que tienen una cadena lateral C-terminal neutra, por ejemplo, una cadena lateral de alquilo o alcoxialquilo.

Las modificaciones de los compuestos descritos por Kakkar y col. se incluyen en la WO 96/25427, dirigidas a inhibidores de peptidilserin-proteasa en los que el enlace de péptidos naturales P2-P1 es reemplazado por otro enlace. Como ejemplos de enlaces de péptidos no naturales podemos mencionar -CO_{2}-, -CH_{2}O-, -NHCO-, -CHYCH_{2}-,
-CH=CH-, -CO(CH_{2})_{p}CO- donde p es 1, 2 ó 3, -COCHY-, -CO_{2}-CH_{2}NH-, -CHY-NX-, -N(X)CH_{2}-N(X)CO-, -CH=C(CN)CO-, -CH(OH)-NH-, -CH(CN)-NH-, -CH(OH)-CH_{2}- o -NH-CHOH-, donde X es H o un grupo amino-protector e Y es H o un halógeno, especialmente F. Enlaces de péptidos no naturales concretos son -CO_{2}- o -CH_{2}O-.

Metternich (EP 471651 y US 5288707, habiendo sido esta última transferida a Trigen Limited) revela variantes de boropéptidos de Phe-Pro-BoroArg en los que el P3 Phe se reemplaza por un aminoácido hidrófobo innatural tal como la trimetilsililalanina, p-terc-butil-difenil-sililoximetil-fenilalanina o p-hidroximetilfenilalanina y la cadena de lado P1 puede ser neutra (alcoxialquilo, alquiltioalquilo o trimetilsililalquilo).

El reemplazo del residuo P2 Pro de inhibidores de trombina borotripéptídica por una glicina N-sustituida se describe en Fevig J M y col. Bioorg. Med. Chem. 8:301-306 y Rupin A y col. Thromb. Haemost. 78(4):1221-1227, 1997. Véase también la US 5,585,360 (de Nanteui y col.).

Amparo (WO 96/20698 y miembro de la familia incluyendo la US 5698538) revela peptidomiméticos de la estructura Aril-engarce-Boro(Aa), donde Boro(Aa) puede ser un residuo aminoborato con una cadena de lado no básica, por ejemplo BoroMpg. El engarce es de la fórmula -(CH_{2})_{m}CONR- (donde m es 0 a 8 y R es H o determinados grupos orgánicos) o análogos de la misma en la que el enlace de péptidos -CONR- se reemplaza por -CSNR-, -SO_{2}NR-, -CO_{2}-, -C(S)O- o -SO_{2}O-. Aril es fenilo, naftilo o bifenilo sustituido por una, dos o tres fracciones seleccionadas a partir de un grupo especificado. Lo más típicamente, estos compuestos son de la estructura Aril-(CH_{2})_{n}-CONH-CHR^{2}-BY^{1}Y^{2}, donde R^{2} es, por ejemplo, una cadena de lado neutro, tal y como se describe anteriormente y n es 0 ó 1.

Se describen otros inhibidores de aminoborato o peptidoborato o sustratos de serin-proteasas en los documentos:

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US 4935493

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EP 341661

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WO 94/25049

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WO 95/09859

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WO 96/12499

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WO 96/20689

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Lee S-L y col., Biochemistry 36:13180-13186, 1997

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Dominguez C y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:79-84, 1997

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EP 471651

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WO 94/20526

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WO 95/20603

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WO 97/05161

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US 4450105

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US 5106948

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US 5169841.

Desafortunadamente, los ácidos organoborónicos pueden resultar relativamente difíciles de obtener en forma pura analíticamente. Así, los ácidos alquiloborónicos y sus boroxinas a menudo son sensibles al aire. Korcek y col., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2:242, 1972, muestra que el ácido butilborónico se oxida rápidamente por el aire para generar
1-butanol y ácido borónico.

Se sabe que la derivatización de los ácidos borónicos como ésteres cíclicos proporciona una resistencia a la oxidación. Por ejemplo, Martichonok V y col. J. Am. Chem. Soc. 118:950-958, 1996 establece que la derivatización de la dietanolamina proporciona protección contra la posible oxidación del ácido borónico. La patente estadounidense Nº 5.681.978 (Matteson DS y col.) muestra que los 1,2-dioles y 1,3-dioles, por ejemplo, el pinacol, forman ésteres borónicos cíclicos estables que no se oxidan fácilmente.

Wu y col., J. Pharm. Sci., 89:758-765, 2000, discute la estabilidad del compuesto N-(2-pirazina) ácido borónico carbonil-fenilalanin-leunina (LDP-341, también conocido como bortezomib), un agente anticancerígeno. Se describe cómo "durante un esfuerzo para formular el [LDP-341] para administración parenteral, el compuesto mostró un comportamiento de estabilidad errática". Se investigaron los caminos de degradación y se concluyó que la degradación era oxidativa, la oxidación inicial a peróxidos u oxígeno molecular y sus radicales.

El documento WO 02/059131 revela productos de ácido borónico los cuales se describen como estables. En concreto, estos productos son ciertos boropéptidos y/o boropeptidomiméticos en los cuales el grupo de ácido borónico se ha derivatizado con un azúcar. Algunos de los compuestos revelados son derivados azúcares de LDP-341.

Muchos fármacos comprenden un resto activo el cual es un ácido carboxílico. Hay un número de diferencias entre los ácidos carboxílicos y los ácidos borónicos, cuyos efectos sobre la administración, estabilidad y transporte de fármacos (entre otros) no se han investigado. Una característica de los compuestos de boro trivalente es que el átomo de boro está sp^{2} hibridado, lo que deja una órbita 2p_{z} vacía en el átomo de boro. Una molécula del tipo BX_{3} puede, por tanto, actuar como un aceptor del par de electrones, o ácido de Lewis. Puede utilizar el orbital 2p_{z} vacío para recoger un par de electrones no enlazados a partir de una base de Lewis para formar un enlace covalente. El BF_{3}, por tanto, reacciona con bases de Lewis tales como NH_{3} para formar complejos ácido-base en los cuales todos los átomos tienen un armazón cargado de electrones de valencia.

\newpage

El ácido borónico, de acuerdo con ello, puede actuar como un ácido de Lewis aceptando OH^{-}:

B(OH)_{3} + H_{2}O \rightarrow B(OH)_{4^{-}} + H^{+}

Adicionalmente, los ácidos borónicos del tipo RB(OH)_{2} son bibásicos y cuentan con dos pKas. Otro punto de distinción acerca de los compuestos de boro es la inusualmente corta longitud de los enlaces hacia el boro, de lo cual pueden ser responsables tres factores:

1. Formación de enlaces p\pi-p\pi;

2. Resonancia iónica-covalente;

3. Repulsiones reducidas entre electrones no enlazados.

Se muestran a continuación los supuestos equilibrios de ácidos borónicos y carboxílicos en KOH acuoso (excluyendo la formación de RBO_{2}^{2-}):

1

Síntesis de aminoborato

Se conoce como sintetizar ésteres de TRI 50c en la técnica anterior (véase más adelante) a través de los siguientes procedimientos:

2

El producto del paso anterior se convierte entonces mediante procedimientos conocidos en, por ejemplo, TRI 50b (véase más adelante). Véase por ejemplo Deadman J y col., J. Medicinal Chemistry 1995, 38, 1511-1522.

Trombosis

La hemostasis es la condición fisiológica normal de la sangre en la que sus componentes existen en un equilibrio dinámico. Cuando se altera el equilibrio, por ejemplo tras una lesión de un vaso sanguíneo, se desencadenan determinadas vías bioquímicas lo que lleva, en este ejemplo, a una parada del sangrado a través de la formación de coágulos (coagulación). La coagulación es un procedimiento dinámico y complejo en el que las enzimas proteolíticas tales como la trombina juegan un papel clave. La coagulación sanguínea puede producirse a través de cualquiera de las dos cascadas de activaciones zimógenas, las vías extrínseca e intrínseca de la cascada de coagulación. La última proteasa en cada vía es la trombina, la cual actúa para hidrolizar cuatro pequeños péptidos (dos FpA y dos FpB) de cada molécula de fibrinógeno, desprotegiendo así sus sitios de polimerización. Una vez formados, los polímetros de fibrina lineales pueden ser de enlace cruzado por el factor XIIIa, el cual se autoactiva mediante la trombina. Además, la trombina es un potente activador de plaquetas, sobre las cuales actúa en receptores específicos. La activación por trombina de las plaquetas lleva a la agregación de células y secreción de factores adicionales que posteriormente aceleran la creación de un tapón hemostático. La trombina también potencia su propia producción mediante la activación de los factores V y VIII.

Como se ha mencionado anteriormente, las plaquetas desempeñan dos papeles importantes en la hemostasis normal. En primer lugar, mediante agregación, constituyen el tapón hemostático inicial el cual inmediatamente detiene el sangrado de vasos sanguíneos rotos. En segundo lugar, la superficie de las plaquetas puede activarse y potenciar el factor antihemofílico, una propiedad a la que se denomina actividad procoagulante de las plaquetas. Esto puede considerarse como un incremento de la velocidad de activación de la protrombina mediante el factor Xa en presencia del factor Va y Ca^{2+}, referido como la reacción protrombinasa. Normalmente, existen pocos factores antihemofílicos (si existen) en la superficie de las plaquetas sin estimular, pero, cuando se activan las plaquetas, los fosfolípidos con carga negativa (fosfatidilserina y fosfatidilinositol) que normalmente están en el lado citoplásmico de la membrana se encuentran disponibles y proporcionan una superficie en la cual se producen dos pasos de la secuencia de coagulación. El fosfolípido en la superficie de plaquetas activadas acelera profundamente las reacciones acarreando la formación de trombina, de manera que la trombina pueda generarse a una velocidad más rápida que su neutralización por antitrombina III.

Un trombo se puede considerar como un producto anormal de un mecanismo normal y puede definirse como una masa o depósito formado por constituyentes de la sangre en una superficie del sistema cardiovascular, por ejemplo, del corazón o de un vaso sanguíneo. La trombosis puede considerarse como la condición patológica donde la actividad inadecuada del mecanismo hemostático tiene como resultado la formación de un trombo intravascular. Se reconocen tres tipos básicos de trombos:

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el trombo blanco, el cual se produce normalmente en arterias y consta principalmente de plaquetas;

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el trombo rojo, el cual se encuentra en venas y consta mayormente de fibrina y células rojas;

\bullet

el trombo mixto, el cual consta de componentes de los trombos blanco y rojo.

La composición de los trombos está influida por la velocidad del flujo sanguíneo en sus emplazamientos de formación. En general, los trombos blancos ricos en plaquetas se forman en sistemas de flujo alto, mientras que los trombos de coagulación rojos se forman en regiones de estasis. La alta velocidad de cizallamiento en las arterias evita la acumulación de intermedios de coagulación en la parte arterial de la circulación: sólo las plaquetas tienen la capacidad de formar trombos que se enlazan con el área de daño a través del factor von Willebrand. Tales trombos compuestos únicamente por plaquetas no son estables y se dispersan. Si el estímulo es fuerte, los trombos se formarán de nuevo y después se dispersarán continuamente hasta que se disminuya el estímulo. Para que se estabilice el trombo, se debe formar fibrina. A este respecto, se pueden acumular pequeñas cantidades de trombina en el trombo de plaquetas y activan el factor Va y estimulan la actividad procoagulante de las plaquetas. Estos dos acontecimientos llevan a un aumento total de la velocidad de activación de la protrombina mediante el factor Xa de 300.000 pliegues. La deposición de fibrina estabiliza el trombo de plaquetas. Los inhibidores de trombina indirectos, por ejemplo heparina, no son clínicamente eficaces en la estimulación de la inhibición de la actividad procoagulante de las plaquetas. De acuerdo con esto, sería útil un agente terapéutico que inhiba la actividad procoagulante de las plaquetas para tratar o prevenir afecciones trombóticas arteriales.

En la parte venosa de la circulación, el trombo consta de fibrina: la trombina puede acumularse dado el flujo más lento en la parte venosa y las plaquetas desempeñan únicamente un papel secundario.

La trombosis de este modo no se considera por tanto como un indicio simple sino, más bien, es una clase de indicios que abarcan distintas sub-clases para las cuales pueden ser adecuados diferentes agentes terapéuticos y/o protocolos. Así, las autoridades reguladoras tratan trastornos tales como, por ejemplo, la trombosis venosa profunda, la trombosis arterial cerebrovascular y el embolismo pulmonar como indicios diferentes a efectos de conceder licencias de medicamentos. Dos principales sub-clases de trombosis son la trombosis arterial y la trombosis venosa. La trombosis arterial incluye trastornos específicos tales como síndromes coronarios agudos [por ejemplo, infarto de miocardio (ataque al corazón, causado por trombosis en una arteria coronaria)], trombosis arterial cerebrovascular (ataque súbito causado por trombosis en el sistema arterial cerebrovascular) y trombosis arterial periférica. Ejemplos de las afecciones causadas por la trombosis venosa son la trombosis venosa profunda y el embolismo pulmonar.

La gestión de la trombosis implica comúnmente el uso de fármacos antiplaquetas (inhibidores de agregación de plaquetas) para controlar futuras trombogénesis y agentes trombolíticos para lisar el coágulo de reciente formación, tales agentes por separado o conjuntamente se utilizan en conjunción o combinación con anticoagulantes. Los anticoagulantes se utilizan también de forma preventiva (profilácticamente) en el tratamiento de pacientes susceptibles de padecer una trombosis.

En la actualidad, dos de las clases de fármacos más eficaces en uso clínico como anticoagulantes son las heparinas y los antagonistas de la vitamina K. Las heparinas son mezclas mal definidas de polisacáridos sulfatados que se enlazan a, y así potencian, la acción de la antitrombina III. La antitrombina III es un inhibidor de aparición natural de los factores de coagulación activados IXa, Xa, XIa, trombina y probablemente XIIa (véase Jaques, Pharmacol. Rev. 31:99-166, 1980). Los antagonistas de la vitamina K, de los cuales warfarina es el ejemplo más conocido, actúan indirectamente inhibiendo las carboxilaciones post-ribosómicos de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K II, VII, IX y X (véase Hirsch, Semin. Thromb. Hemostasis 12:1-11, 1986). Además, las terapias eficaces para el tratamiento de la trombosis, las heparinas y los antagonistas de la vitamina K tienen efectos secundarios desafortunados tales como hemorragias, trombocitopenia inducida con heparina (en el caso de la heparina) y variabilidad marcada entre pacientes, dando como resultado un margen de seguridad terapéutica pequeño e impredecible.

El uso de inhibidores de actuación directa de la trombina y otras enzimas serin-proteasas del sistema de coagulación se espera para aliviar estos problemas. A tal fin, se ha probado una gran variedad de inhibidores de la serin-proteasa, incluyendo boropéptidos, es decir, péptidos que contienen un ácido borónico análogo al \alpha-aminoácido. Si bien se han debatido anteriormente en esta memoria descriptiva los inhibidores de trombina de ácido borónico de acción directa, se describen posteriormente en la siguiente sección.

Inhibidores de trombina boropeptídica de residuo P1 neutro

Claeson y col. (US 5574014 y otras) y Kakkar y col. (WO 92/07869 y miembros de la familia, incluida la US 5648338) revelan inhibidores de trombina lipofílica que tienen una cadena lateral (P1) C-terminal neutra (sin carga), por ejemplo, una cadena lateral de alcoxialquilo.

Las familias de patentes de Claeson y col. y Kakkar y col. revelan ésteres borato que contienen la secuencia de aminoácido D-Fe-Pro-BoroMpg [(R)-Phe-Pro-BoroMpg], los cuales son inhibidores altamente específicos de trombina. De entre estos compuestos se puede mencionar en concreto el Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-OPinacol (también conocido como TRI 50b). El ácido borónico libre correspondiente se denomina TRI 50c. Para más información relativa al TRI 50b y compuestos relacionados, se remite al lector a los siguientes documentos:

\bullet Elgendy S y col.., in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G y col. Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:173-178, 1993

\bullet Claeson G y col., Biochem J. 290:309-312, 1993

\bullet Tapparelli C y col., J Biol Chem, 268:4734-4741, 1993

\bullet Claeson G, in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G y col. Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:83-91, 1993

\bullet Phillip y col., in The Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Claeson G y col. Eds, Advances in Experimental Medicine, 340:67-77, 1993

\bullet Tapparelli C y col., Trends Pharmacol. Sci. 14:366-376, 1993

\bullet Claeson G, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5:411-436, 1994

\bullet Elgendy y col., Tetrahedron 50:3803-3812, 1994

\bullet Deadman J y col., J. Enzyme Inhibition 9:29-41, 1995

\bullet Deadman J y col., J. Medicinal Chemistry 38:1511-1522, 1995.

La secuencia tripeptídica del TRI 50b tiene tres centros quirales. El residuo Phe se considera como de configuración (R)- y el residuo Pro de configuración (S)- natural, al menos en compuestos con actividad inhibidora comercialmente útil; el residuo Mpg se considera como de configuración (R)- en isómeros con actividad inhibidora comercialmente útil. Por tanto, el estereoisómero TRI 50b, activo o más activo, se considera de configuración R,S,R y puede representarse como:

3

\hskip3,5cm (RSR)-TRI 50b: Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg Pinacol

Aunque se ha descubierto que los inhibidores de trombina de actuación indirecta son útiles parenteralmente para el tratamiento de pacientes susceptibles de padecer o que padecen de trombosis venosa, lo mismo no es cierto para la trombosis arterial, porque sería necesario aumentar muchas veces la dosis utilizada en el tratamiento de la trombosis venosa para tratar (prevenir) la trombosis arterial. Tales dosificaciones aumentadas causan típicamente hemorragia, lo cual hace inadecuados o menos preferibles para el tratamiento de la trombosis arterial a los inhibidores de trombina de actuación indirecta. La heparina y sus derivados de bajo peso molecular son inhibidores de trombina indirectos, por lo que resultan inadecuados para tratar la trombosis arterial. Los inhibidores de trombina directos orales se encuentran en desarrollo para indicaciones arteriales pero pueden tener índices terapéuticos inferiores a los deseables, es decir, pueden tener niveles superiores a los deseados de hemorragia a dosis terapéutica.

Se pueden clasificar muchos compuestos de ácido organoborónico como lipófilos o hidrófóbos. Típicamente, tales compuestos incluyen, entre otros:

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boropéptidos de los cuales todos o la mayoría de los aminoácidos son

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hidrófóbos

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boropéptidos de los cuales al menos la mitad de los aminoácidos son hidrófóbos y los cuales tienen un sustituyente de terminal N hidrófóbo (grupo de aminoprotectores)

\bullet

no péptidos basados en restos hidrófóbas.

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Guía para la memoria descriptiva

Esta memoria descriptiva, tal y como se describe más detalladamente más adelante, se refiere en concreto a formulaciones farmacéuticas que contienen compuestos novedosos. Por conveniencia, el término "Productos Novedosos" en ocasiones (pero no siempre) se utiliza en la descripción para referirse a productos que contienen estos compuestos y composiciones novedosos; por ejemplo, el término se utiliza en los epígrafes.

Se describen procedimientos sintéticos concebidos en una parte anterior de la investigación y el programa de desarrollo correspondiente a los Productos Novedosos, cuyos procedimientos generaron una o más impurezas y no pudieron utilizarse aparte de eso como tales a escala industrial. El término "Procedimientos Sintéticos I" se utiliza en ocasiones (pero no siempre) en la descripción para referirse a tales procedimientos anteriores; por ejemplo, se utiliza el término en los epígrafes. Las materias sujeto que se refieren los Productos Novedosos también incluyen diversos aspectos de técnicas sintéticas subsiguientemente concebidas para crear los compuestos novedosos (o intermedios de estos) y productos de pureza relativamente alta obtenibles utilizando estas técnicas; el término "Procedimientos Sintéticos II" se utiliza en ocasiones (pero no siempre) en la descripción para referirse a dichos procedimientos subsiguientes; por ejemplo, se utiliza el término en los epígrafes. Al menos en determinados aspectos, los Procedimientos Sintéticos II representan un subconjunto de los Procedimientos Sintéticos I. Los productos específicos de los Procedimientos Sintéticos II se denominan para mayor comodidad en ocasiones como "Productos de Alta Pureza". Los Productos de Alta Pureza son un subconjunto de los Productos Novedosos.

Las frases Productos Novedosos, Procedimientos Sintéticos I, Procedimientos Sintéticos II y Productos de Alta Pureza se utilizan únicamente por comodidad y no deben entenderse como limitadores de la envergadura de la invención, la cual incluye toda la materia sujeto de la revelación, incluidos todos los materiales, especies, procedimientos y usos de éstos.

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Breve resumen de la revelación

Se ha descubierto que el TRI 50b tiende a hidrolizarse. Así en condiciones ácidas, por ejemplo en un ensayo de HPLC, el TRI 50b se convierte a la forma ácida con una media vida breve, lo cual implica una hidrólisis potencial en preparaciones parenterales que contienen agua a especies, que comprenden el ácido libre y sus aniones borato correspondientes en equilibrio con éste, que la literatura muestra como inestables a la degradación a través de la desboronación (partición del enlace carbono-boro) mediante una vía oxidativa (véase, p.e., Wu y col., discutido anteriormente).

La inestabilidad a hidrólisis de TRI 50b también presenta potenciales desventajas en cuanto a la preparación del compuesto y su formulación, así como en cuanto al almacenamiento de formulaciones farmacéuticas que lo contienen.

El TRI 50c, además, sufre inestabilidad por el hecho de que existe una tendencia problemática para la fracción boropéptida en sí misma a degradarse a través de la desboronación (escisión del enlace carbono-boro), mostrándose tal desboronación por la literatura como oxidativa, tal y como se muestra en la literatura (p.e. Wu y col., discutida anteriormente). El nivel de degradación puede ser notablemente alto.

Las propiedades discutidas anteriormente del TRI 50b y del TRI 50c no se restringirán a tales compuestos sino que serán compartidas por otros ésteres y ácidos de boropéptidos, incluso si las propiedades de tales otros boropéptidos difieren cuantitativamente.

La presente revelación proporciona una solución al problema del éster de diol de borato y, especialmente, a la inestabilidad del TRI50b la cual también proporciona el ácido borónico correspondiente con resistencia a la desboronación.

La presente revelación se basa en, entre otras cosas, el hallazgo de que determinados productos de ácido organoborónico están indicados para ser de estabilidad mejorada.

\newpage

Los beneficios de la presente revelación incluyen una solución para el problema del éster de diol borato y, especialmente, de la inestabilidad del TRI 50b, lo que quiere decir que los productos ahora revelados proporcionan, entre otros compuestos farmacológicamente activos los cuales son más estables que el TRI 50b y otros ésteres comparables en el sentido de estabilidad a hidrólisis. La revelación incluye adicionalmente una solución para el problema de la inestabilidad del ácido organoborónico, lo que significa que los productos revelados en el presente documento proporcionan, entre otros, compuestos farmacológicamente activos los cuales son más estables de cara a la desboronación que el TRI 50c. La estabilidad proporcionada en el marco de la revelación no es absoluta pero está mejorada en cuanto a los componentes comparadores. Los beneficios ofrecidos por la revelación incluyen adicionalmente el suministro de productos los cuales tienen una utilidad inesperada en formulaciones parenterales.

Se ha revelado un derivado de un aminoácido borónico el cual evita las desventajas de los ésteres de pinacol. La revelación también incluye un derivado del ácido péptidoborónico que tiene una indicación de estabilidad mejorada. En concreto, la revelación incluye entre otros derivados de ácido borónico de la materia sujeto que son relativamente estables a hidrólisis y desboronación y que son útiles en formulaciones parenterales para inhibir la trombina.

La revelación implica una sal de adición de base aceptable desde el punto de vista farmacéutico de determinados fármacos de ácido organoborónico, a saber boropéptidos hidrófobos (p.e. di o tripéptidos) los cuales son inhibidores de trombina que tienen un grupo P1 no básico. Como clase, dichas sales no son únicamente contrarias a la dirección del estado de la técnica, sino que adicionalmente tienen un nivel mejorado de estabilidad que no puede explicarse o predecirse sobre la base de la química conocida.

La revelación se refiere a sales de adición de bases de ácidos borónicos que tienen un residuo de ácido aminoborónico capaz de enlazar con el subsitio S1 de trombina enlazado a través de un enlace peptídico a una fracción hidrófoba capaz de enlazarse con los subconjuntos de trombina S2 y S3. En un primer aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica parenteral que incluye una sal de adición de base farmacéuticamente aceptable de un ácido borónico de fórmula (I):

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4

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donde

Y incluye un resto hidrófobo que, junto con el residuo de aminoácido borónico

-NHCH(R^{9})-B(OH)_{2}, tiene afinidad por el lugar de enlace del substrato de trombina; y

R^{9} es un grupo alquilo de cadena recta interrumpido por uno o más enlaces de éter (p.e. 1 ó 2) y en el cual el número total de átomos de oxígeno y carbono es 3, 4, 5 ó 6 (p.e. 5) o R^{9} es -(CH_{2})_{m}-W donde m es 2, 3, 4 ó 5 (p.e. 4) y W es -OH o halógeno (F, Cl, Br o I). R^{9} es un grupo alcoxialquilo en un subconjunto de compuestos, p.e., alcoxialquilo que contiene 4 átomos de carbono.

Los ácidos borónicos (I) son inhibidores de ácido borónico hidrófobos de trombina. Tales inhibidores pueden contener aminoácidos hidrófobos en Y, y esta clase de aminoácidos incluye aquellos cuya cadena lateral es hidrocarbilo, hidrocarbilo que contiene un oxígeno en cadena y/o enlazado al resto de la molécula por un oxígeno en cadena o heteroarilo o cualquiera de los grupos mencionados anteriormente cuando se sustituyen por hidroxi, halógeno o trifluorometilo. Algunas cadenas laterales hidrófobas representativas incluyen alquilo, alcoxialquilo, cualquiera de los anteriores cuando se sustituyen por al menos un arilo o heteroarilo, heteroarilo, arilo sustituido por al menos un alquilo y heteroarilo sustituido por al menos un alquilo. La prolina y otros iminoácidos que han sido sustituidos de anillo por nada o por uno de los restos listados en la oración anterior son también hidrófobos.

Algunas cadenas laterales hidrófobas contienen desde 1 a 20 átomos de carbono, p.e., fracciones no cíclicas con 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Las cadenas laterales que comprenden un grupo cíclico típicamente pero no necesariamente contienen de 5 a 13 miembros de anillo y en muchos casos, son sustituidos de fenilo o alquilo por uno o dos fenilos.

Se incluyen inhibidores los cuales contienen fracciones hidrófobas no peptídicas que se basan normalmente en fracciones que pueden formar una cadena lateral de un aminoácido hidrófobo, tal y como se describe anteriormente.

Los compuestos hidrófobos pueden contener, por ejemplo, un grupo amino y/o un grupo ácido (p.e., -COOH, -B(OH)_{2}). Generalmente, no contienen grupos polares múltiples de uno cualquiera de los tipos.

\newpage

La revelación contiene formulaciones que constan de sales de adición de base de inhibidores de ácido borónico de trombina y, por tanto, incluye las sales de ácidos borónicos peptídicos que tienen un coeficiente de partición entre 1-n-octanol y agua expresado como log P de más de 1,0 a pH fisiológico y 25ºC. Algunos ácidos borónicos peptídicos útiles en la invención tienen un coeficiente de partición de al menos 1,5. Una clase de ácidos borónicos peptídicos hidrófobos útiles en la invención tiene un coeficiente de partición de no más de 5.

Algunas subclases de ácidos organoborónicos hidrófobos son aquellas descritas por la Fórmula (III) bajo el siguiente epígrafe "Descripción detallada de varios ejemplos".

Se incluyen en la revelación formulaciones parenterales que contienen una sal de adición de base farmacéuticamente aceptable de un ácido borónico peptídico de la fórmula (II):

5

donde:

X es un resto enlazado al grupo amino N-terminal y puede ser H para formar NH_{2}. La identidad de X no es crítica, pero puede ser un resto X concreto descrito anteriormente. En un ejemplo puede mencionarse el benciloxicarbonilo.

aa^{1} es un aminoácido con una cadena lateral de hidrocarbilo que contiene no más de 20 átomos de carbono (p.e., hasta 15 y, opcionalmente, hasta 13 átomos de C) y que comprende al menos un grupo cíclico que tiene hasta 13 átomos de carbono. En determinados ejemplos, el/los grupo(s) cíclicos de aa^{1} contiene(n) 5 ó 6 miembros de anillo. Por ejemplo, el/los grupo(s) cíclicos de aa^{1} pueden ser grupos arilos, especialmente fenilo. Típicamente, hay uno o dos grupos cíclicos en la cadena lateral aa^{1}. Determinadas cadenas laterales comprenden, o constan de, metilo sustituido por uno o dos anillos de 5- o 6- miembros.

Más concretamente, el aa^{1} es Phe, Dpa o un análogo de los mismos total o parcialmente hidrogenado. Los análogos totalmente hidrogenados son Cha y Dcha.

aa^{2} es un iminoácido que tiene desde 4 hasta 6 miembros de anillo. Alternativamente, aa^{2} es Gly N-sustituido por un grupo hidrocarbilo C_{3}-C_{13}, p.e. un grupo hidrocarbilo C_{3}-C_{8} que comprende un anillo hidrocarbilo C_{3}-C_{6}; el grupo hidrocarbilo puede ser saturado, por ejemplo sustituyentes ejemplares son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Como un grupo hidrocarbilo que contiene uno o más enlaces insaturados se puede mencionar el fenilo y el metilo o etilo sustituido por fenilo, p.e., 2-feniletilo, así como \beta,\beta-dialquilfeniletilo.

Existe un debate en la literatura acerca de si los boratos en disolución acuosa forma las especies de boro "trigonal" B(OH)_{2} o "tetraédrica" B(OH)_{3^{-}}, pero la evidencia de RMN parece indicar que a un pH por debajo del primer pKa del ácido borónico la principal especie de boro es la neutra B(OH)_{2}. En el duodeno, el pH es probable que esté entre 6 y 7, de manera que la especie trigonal es probable que predomine aquí. En cualquier caso, el símbolo -B(OH)_{2} incluye las especies de boro tetraédricas y trigonales y a lo largo de la presente especificación los símbolos que indican una especie de boro trigonal abarcan también la especie tetraédrica. El símbolo puede incluir también grupos borónicos en forma de anhídrido.

Las sales pueden estar en forma de solvatos, especialmente hidratos.

Las sales pueden incluir, o constar esencialmente de, sales ácidas en las que el ácido borónico se desprotona individualmente. La revelación por lo tanto incluye productos que tienen una estequiometría de metal/borato consistente con los grupos boratos en el producto que predominantemente (más de 50% mol) llevan una carga simple negativa.

En particular, las formulaciones parenterales pueden contener las sales en fase sólida, por ejemplo, sales particuladas para la reconstitución como disoluciones acuosas antes de la administración mediante inyección o infusión. Tales sales reconstituidas también se incluyen en la revelación.

Como se describe posteriormente en el presente documento, también se suministran disoluciones de hemodiálisis que contienen una sal de la revelación.

Las sales del TRI 50c se obtienen a través de ésteres del TRI 50c. No obstante, las vías sintéticas publicadas hacia los ésteres de TRI 50c y por tanto hacia el TRI 50c dan lugar a una o más impurezas. Los Procedimientos Sintéticos I (sin publicar en el momento de presentación de la presente solicitud) para crear las sales dan lugar a una o más impurezas y no se obtuvieron sales de pureza muy alta. Adicionalmente, las sales han demostrado ser las más complicadas para obtener con pureza alta. Por tanto, las técnicas de purificación las cuales se aplicaron fallaron en producir sales de pureza muy alta. El HPLC no sería de utilidad en una escala industrial para purificar sales creadas a través de las síntesis del éster de TRI 50c publicado y las técnicas de preparación de sales de los Procedimientos Sintéticos I. En otras palabras, para que se proporcionen beneficios terapéuticos de las sales TRI 50c a aquellos en necesidad de los mismos, las sales deben ser obtenibles de forma industrial en forma adecuadamente pura y la forma pura debe ser alcanzable sin el uso de técnicas de purificación excesivamente caras.

La revelación proporciona técnicas para purificar de compuestos organoborónicos y técnicas para ayudar a mantener la pureza de los compuestos organoborónicos, y los productos de tales técnicas. La presente revelación proporciona adicionalmente técnicas para utilizar en fabricar tales sales de alta pureza y para usar las sales de alta pureza en sí mismas.

Las realizaciones de las formulaciones de la invención incluyen sales de ácido borónico de pureza especificada.

Las sales descritas en el presente documento incluyen productos obtenibles mediante (que tienen las características de un producto obtenido mediante) reacción del ácido borónico con una base fuerte y el término "sal" en el presente documento debe entenderse de conformidad con esto. El término "sal" en relación con los productos revelados, por tanto, no implica necesariamente que los productos contengan cationes y aniones discretos y debe entenderse como que engloba productos los cuales son obtenibles utilizando una reacción de un ácido borónico y una base. La revelación engloba productos los cuales, en una extensión mayor o menor, están en la forma de un compuesto de coordinación. La revelación por tanto proporciona también productos obtenibles mediante (que tienen las características de un producto obtenido a través de) la reacción del ácido borónico (I) con una base fuerte, así como el uso terapéutico, incluyendo el profiláctico, de dichos productos.

La presente revelación no se limita al procedimiento de preparación de las sales, siempre que estas contengan especies de borato derivadas del ácido borónico (I) y un contraión. Tales especies de borato puede ser aniones de borato en cualquier forma de equilibrio de los mismos. El término "forma de equilibrio" se refiere a diferentes formas de los mismos compuestos las cuales pueden representarse en una ecuación de equilibrio (p.e., ácido borónico en equilibrio con un anhídrido borónico y en equilibrio con diferentes iones de borato). Los boratos en la fase sólida pueden formar anhídridos y las sales de borato reveladas cuando están en la fase sólida pueden comprender anhídridos de borato, como una especie de equilibrio borónico. No se precisa que las sales se preparen mediante la reacción de una base que contiene el contraión y el ácido borónico (I). Adicionalmente, la revelación incluye productos de sales que pueden considerarse como preparados de forma indirecta por tal reacción de ácido/base, así como sales obtenibles a través de (teniendo las características de productos obtenidos a través de) dicha preparación indirecta. Como ejemplos de preparación posiblemente indirecta se pueden mencionar procedimientos, en los cuales, después de una recuperación inicial de la sal, se purifica y/o trata para modificar sus propiedades fisicoquímicas, por ejemplo, para modificar la forma sólida o la forma de hidrato, o ambas.

En algunas realizaciones, los cationes de las sales son monovalentes.

En algunas realizaciones, las sales comprenden especies de anhídridos; en otras, se encuentran esencialmente libres de especies de anhídridos.

Aspectos y realizaciones adicionales de la revelación se exponen en la siguiente descripción y reivindicaciones.

A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones de esta especificación, las palabras "comprender" y "contener" y sus variantes, por ejemplo, "comprendiendo" y "comprende" significan que "incluyendo pero no limitados a", y no se desean para excluir (y no lo hacen) otras fracciones, aditivos, componentes, números enteros o etapas.

Esta patente contiene datos que indican que la estabilidad (resistencia a la desboronación) de ácidos organoborónicos se puede incrementar si se suministran en forma de sales, por ejemplo, sales metálicas. En experimentos aislados, la sal de amonio del TRI 50c parecía descomponerse al secarse para producir amoniaco, mientras que la sal de colina mostró una descomposición rápida a una impureza desboronada. A pesar de que los experimentos no se han realizado para reproducir estas observaciones no repetidas, se proporciona una sub-clase en la cual las sales de amonio y colina quedan excluidas. La sal puede ser una sal ácida. En cualquier caso, esta técnica de estabilización forma parte de la revelación y es de aplicación, entre otros, a los ácidos organoborónicos descritos bajo el epígrafe "ANTECEDENTES" y a los ácidos organoborónicos descritos en las publicaciones mencionadas bajo dicho epígrafe.

Breve descripción de las ilustraciones

La Figura 1 es un cuadro al que se refiere el Ejemplo 35 y que muestra los resultados de un ensayo amidolítico de trombina del TRI 1405 (sal de magnesio del TRI 50c) y del TRI 50b, donde Vmáx es la velocidad máxima de reacción medida mediante el ensayo amidolítico.

La Figura 2 es una trama a la que se refiere el Ejemplo 39 que muestra holgura en la fase intravenosa y cinética tras una única dosis de TRI 50b o TRI 50c.

Descripción detallada de varios ejemplos Glosario

Los siguientes términos y abreviaturas se utilizan en la presente especificación:

La expresión "sal ácida" como se aplica a una sal de un ácido borónico se refiere a sales de las cuales un grupo simple -OH del grupo de ácidos representados trigonalmente -B(OH)_{2} se desprotona. Así sales en las que el grupo borato lleva una carga individual negativa y puede representarse como -B(OH)(O^{-}) o como [-B(OH)_{3}]^{-} son sales ácidas. La expresión abarca sales de un catión que tienen una valencia n donde la fracción molar de ácido borónico hacia el catión es de aproximadamente n a 1. En términos prácticos, la estequiometría observada no suele ser de exactamente n:1, pero será consistente con una estequiometría n:1 nocional. Por ejemplo, la masa observada del catión podría variar de la masa calculada para una estequiometría n:1 en no más de alrededor del 10%, p.e., no más de alrededor del 7,5%; en algunos casos, una masa observada de un catión puede variar de la masa calculada en no más de aproximadamente el 1%. Las masas calculadas se basan adecuadamente en la forma trigonal del borato. (A un nivel atómico, una sal estequiométricamente consistente con ser una sal ácida pudo contener boratos en una mezcla de estados de protonación, cuya media se aproxima a una desprotonación simple y tales sales "mezcladas" se incluyen en el término "sal ácida"). Algunos ejemplos de sales ácidas son las sales de monosodio y las sales de
hemicalcio.

El ácido \alpha-aminoborónico o el Boro(aa) se refieren a un aminoácido en el que el grupo CO_{2} ha sido reemplazado por el BO_{2}.

El término "resto protector de aminogrupo" se refiere a cualquier grupo utilizado para derivatizar un aminogrupo, especialmente un aminogrupo N-terminal de un ácido peptídico o aminoácido. Dichos grupos incluyen, sin limitación, las fracciones de alquilo, acilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo y sulfonilo. No obstante, el término "fracción protectora de aminogrupo" no pretende limitarse a tales grupos protectores completos que se emplean comúnmente en la síntesis orgánica, ni pretende limitarse a grupos que son fácilmente escindibles.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en el presente documento para referirse a aquellos componentes, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance de una opinión médica sólida, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos o animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica o cualquier otro problema o complicación excesivos, en proporción a una relación de beneficio/riesgo razona-
ble.

La expresión "inhibidor de trombina" se refiere a un producto el cual, dentro del alcance de una opinión farmacológica sólida, es potencialmente o realmente útil desde el punto de vista farmacéutico como un inhibidor de trombina, e incluye referencia a una sustancia la cual contiene una especie farmacéuticamente activa y se describe, promociona o autoriza como un inhibidor de trombina. Tales inhibidores de trombina pueden ser selectivos, esta es la forma de la que se consideran, dentro del alcance de una opinión farmacológica sólida, hacia la trombina como contraposición a otras proteasas; el término "inhibidor de trombina selectivo" incluye la referencia a una sustancia que comprende una especie farmacéuticamente y se describe, promociona o autoriza como un inhibidor de trombina selectivo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema anular que tiene al menos un (p.e., 1, 2 ó 3) heteroátomo de anillo y que tiene un sistema de enlace doble de anillo conjugado. El término "heteroátomo" incluye el oxígeno, el sulfuro y el nitrógeno, de los cuales el sulfuro es en ocasiones menos preferido.

"Aminoácido natural" se refiere a un aminoácido L (o residuo de este) seleccionado del siguiente grupo de aminoácidos neutros (hidrófoba o polar), cargados positivamente y cargados negativamente:

Aminoácidos hidrófobos

\quad

A = Ala = alanina

\quad

V = Val = valina

\quad

I = Ile = isoleucina

\quad

L = Leu = leucina

\quad

M = Met = metionina

\quad

F = Phe = fenilalanina

\quad

P = Pro = prolina

\quad

W = Trp = triptófano

\newpage

Aminoácidos polares (neutros o sin carga)

\quad

N = Asn = asparragina

\quad

C = Cys = cisteína

\quad

Q = Gln = glutamina

\quad

G = Gly = glicina

\quad

S = Ser = serina

\quad

T = Thr = treonina

\quad

Y = Tyr = tirosina

\vskip1.000000\baselineskip

Aminoácidos con carga positiva (básicos)

\quad

R = Arg = arginina

\quad

H = His = histidina

\quad

K = Lys = lisina

\vskip1.000000\baselineskip

Aminoácidos con carga negativa

\quad

D = Asp = ácido aspártico

\quad

E = Glu = ácido glutámico.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ACN = acetonitrilo

Aminoácido = \alpha-aminoácido

Sal de adición de base = una sal la cual se prepara a partir de la adición de una base inorgánica o una base orgánica a un ácido libre (en este caso, el ácido borónico).

Cbz = benciloxicarbonilo

Cha = ciclohexilalanina (un aminoácido no natural hidrófobo)

Con carga (aplicado a fármacos o fragmentos de moléculas de fármacos, p.e., residuos de aminoácido) = llevan una carga a pH fisiológico, como en el caso de un grupo amino, amidino o carboxi.

Dcha = diciclohexilalanina (un aminoácido no natural hidrófobo)

Dpa = difenilalanina (un aminoácido no natural hidrófobo)

Fármaco = una sustancia farmacéuticamente útil, tanto si es un principio activo in vivo o un profármaco

i.v. = intravenoso

Mpg = 3-metoxipropilglicina (un aminoácido no natural hidrófobo)

Multivalente = valencia de al menos dos, por ejemplo, dos o tres

Neutro (aplicado a fármacos o fragmentos de moléculas de fármacos, p.e., residuos de aminoácidos) = sin carga = que no lleva carga a pH fisiológico

Pinac = Pinacol = 2,3-dimetil-2,3-butanediol

Pinanodiol = 2,3-pinanodiol = 2,6,6-trimetilbiciclo [3.1.1] heptano-2,3-diol

Pip = ácido pipecolínico

Temperatura ambiente = 25°C \pm 2°C

s.c. = subcutáneo

Base fuerte = una base que tiene un pKb lo suficientemente alto como para reaccionar con un ácido borónico. Idealmente tales bases tiene un pKb de 7 o más, p.e., 7,5 o más, por ejemplo, alrededor de 8 o más

THF = tetrahidrofurán

Thr = trombina

Productos novedosos - Los compuestos

La invención proporciona los productos y los usos expuestos en las reivindicaciones. Esta sección de la patente describe los compuestos utilizados en los productos reivindicados y sus usos.

Los productos de la revelación comprenden las sales de adición de base de ácidos borónicos los cuales son miembros de una clase que tienen un residuo de ácido aminoborónico capaz de enlazar con el subsitio S1 de trombina enlazado a través de un enlace peptídico a una fracción hidrófoba capaz de enlazarse con los subsitios de trombina S2 y S3, o son miembros de una subclase de los mismos. Un aspecto de la invención reside en medicamentos parenterales que contienen sales de adición de base de inhibidores de trombina selectivos que son ácidos de este tipo, las sales tienen un catión de valencia n y una estequiometría observada consistente con una estequiometría nocional ácido:catión de n:1.

La revelación incluye formulaciones parenterales, productos, usos y procedimientos como se exponen en las reivindicaciones que implican sales de adición de base de ácidos de la fórmula (I):

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

en los que

Y incluye un resto hidrófobo el cual, junto con el residuo de aminoácido borónico -NHCH(R^{9})-B(OH)_{2}, tiene afinidad por el lugar de enlace del substrato de trombina; y

R^{9} es un grupo alquilo de cadena recta interrumpido por uno o más enlaces de éter y en la cual el número total de átomos de oxígeno y carbono es 3, 4, 5 ó 6 (p.e. 5) o R^{9} es -(CH_{2})_{m}-W donde m es 2, 3, 4 ó 5 (p.e. 4) y W es -OH o halógeno (F, Cl, Br o I). Algunos ejemplos de alquilo de cadena recta interrumpido por uno o más enlaces de éter (-O-) pueden ser el alcoxialquilo (una interrupción) y el alcoxialcoxialquilo (dos interrupciones). R^{9} es un grupo alcoxialquilo en un subconjunto de compuestos, p.e., alcoxialquilo que contiene 4 átomos de carbono.

Típicamente, el YCO- consta de un residuo de aminoácido (tanto natural como no natural) el cual se enlaza al subconjunto S2 de trombina, estando el residuo de aminoácido enlazado en el terminal N a un resto que enlaza el subconjunto S3 de trombina.

En una clase de ácidos de la Fórmula (I), el YCO- es un residuo dipeptídico opcionalmente N-terminalmente protegido el cual se enlaza con los sitios de enlace S3 y S2 de trombina y los enlaces peptídicos en el ácido están opcionalmente e independientemente sustituidos en N por un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{13} que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno o sulfuro en cadena y/o en anillo y que está opcionalmente sustituido por un sustituyente seleccionado de entre halo, hidroxi y trifluorometilo. El grupo de protección N-terminal, cuando se encuentra presente, puede ser un grupo X tal y como se ha definido anteriormente (distinto del hidrógeno). Normalmente, el ácido no contiene ningún enlaces peptídico N-sustituido; donde hay un enlace peptídico N-sustituido, el sustituyente es normalmente hidrocarbilo de 1C a 6C, p.e., hidrocarbilo saturado; el sustituto N comprende un anillo en algunas realizaciones, p.e., cicloalquilo, y puede ser ciclopentilo, por ejemplo. Una clase de ácidos tiene un grupo protector N-terminal (p.e., un grupo X) y enlaces peptídicos no sustituidos.

Cuando el YCO- sea un residuo bipeptídico (tanto si está protegido por terminal N como si no), el residuo de aminoácido de enlace S3 puede ser de configuración R y/o el residuo de enlace S2 puede ser de configuración S. El fragmento -NHCH(R^{9})-B(OH) puede ser de configuración R. La revelación no se restringe a centros quirales de estas conformaciones, no obstante.

\newpage

En una clase de compuestos, la cadena lateral del aminoácido P3 (enlace S3) y/o del aminoácido P2 (enlace S2) es una fracción distinta al hidrógeno seleccionado de un grupo de fórmula A o B:

(A)-(CO)_{a}-(CH_{2})_{b}-D_{c}-(CH_{2})_{d}-E

(B)-(CO)_{a}-(CH_{2})_{b}-D_{c}-C_{e}(E^{1})(E^{2})(E^{3})

en los que

a es 0 ó 1;

e es 1;

b y d son independientemente 0 o un número entero de manera que (b+d) sea de 0 a 4, en función del caso,

(b+e) sea de 1 a 4;

c es 0 ó 1;

D es O o S;

E es H, alquilo C_{1}-C_{6} alkilo, o un grupo cíclico saturado o no saturado que normalmente contenga hasta 14 miembros y en particular sea un anillo de 5-6 miembros (p.e. fenilo) o un sistema de anillo condensado de 8-14 miembros (p.e., naftilo), cuyo alquilo o grupo cíclico esté sustituido opcionalmente por hasta 3 grupos (p.e., grupo 1) independientemente seleccionados de entre trialquilsililo C_{1}-C_{6} trialkilsililo, -CN, -R^{13}, -R^{12}OR^{13}, -R^{12}COR^{13}, -R^{12}CO_{2}R^{13} y -R^{12}O_{2}CR^{13}, donde -R^{12} es -(CH_{2})_{f}- y R^{13} es -(CH_{2})_{g}H, o por un resto cuyos átomos no hidrógenos consten de átomos de carbono y heteroátomos en anillo y número de 5 a 14 y que contengan un sistema de anillo (p.e., grupo arilo) y opcionalmente un alquilo y/o un grupo alquileno, en los que f y g sean independientemente de 0 a 10, siendo particularmente g al menos 1 (si bien -OH puede también mencionarse como un sustituto), siempre que (f+g) no supere 10, más concretamente, no supere 6 y lo más particularmente sea 1, 2, 3 o 4, y siempre que haya únicamente un sustituto individual si éste es una fracción mencionada que contenga un sistema de anillo o E sea trialquilsililo C_{1}-C_{6} trialkilsililo; y E^{1}, E^{2} y E^{3} se seleccionen cada uno independientemente entre -R^{15} y -J-R^{15}, donde J es un anillo de 5-6 miembros y -R^{15} se selecciona de entre trialquilsililo C_{1}-C_{6} trialkilsililo, -CN, -R^{13}, -R^{12}OR^{13}, -R^{12}COR^{13}, -R^{12}CO_{2}R^{13}, -R^{12}O_{2}CR^{13}, y uno o dos halógenos (p.e., en el último caso para formar una fracción -J-R^{15} que sea diclorofenilo), donde R^{12} y R^{13} son, respectivamente, una fracción R^{12} y una fracción R^{13} tal y como se define anteriormente (en algunos ácidos donde E^{1}, E^{2} y E^{3} contienen un grupo R^{13}, g es 0 ó 1);

en cuya fracción de la Fórmula (A) o (B) cualquier anillo es carbocíclico o aromático, o ambos, y uno o más de los átomos cualesquiera de hidrógeno enlazados a un átomo de carbón se reemplaza opcionalmente por un halógeno, especialmente F.

En determinados ejemplos, a es 0. Si a es 1, c puede ser 0. En ejemplos particulares, (a+b+c+d) y (a+b+c+e) no son más de 4 y son más especialmente 1, 2 ó 3. (a+b+c+d) puede ser 0.

Los grupos de ejemplo para E, E^{1}, E^{2} y E^{3} incluyen anillos aromáticos tales como fenilo, naftilo, piridilo, quinolinilo y furanilo, por ejemplo; anillos no saturados no aromáticos, por ejemplo, ciclohexenilo; anillos saturados tales como ciclohexilo, por ejemplo. E puede ser un sistema de anillo fundido que contenga tanto anillos aromáticos como no aromáticos, por ejemplo, fluorenilo. Una clase de grupos E, E^{1}, E^{2} y E^{3} son anillos aromáticos (incluidos los heteroaromáticos), especialmente anillos aromáticos de 6 miembros. En algunos compuestos, E^{1} es H mientras que E^{2} y E^{3} no son H; en aquellos compuestos, algunos ejemplos de grupos E^{2} y E^{3} son fenilo (sustituido o no sustituido) y alquilo C_{1}-C_{4}, p.e., metilo.

En una clase de realizaciones, E contiene un sustituyente que es alquilo C_{1}-C_{6} alquilo C_{1}-C_{5} alquilo) )carbonilo, carboxialquilo C_{1}-C_{5} alquilo, aril, arilo (incluido heteroarilo), especialmente arilo de 5 miembros o preferentemente de 6 miembros (p.e., fenilo o piridilo), o arilalquilo (p.e., arilmetilo o ariletilo donde el arilo puede ser heterocíclico y es preferentemente de 6 miembros).

En otra clase de realizaciones, E contiene un sustituto que es OR^{13}, donde R^{13} puede ser un anillo de 6 miembros, el cual puede ser aromático (p.e. fenilo) o alquilo (p.e. metilo o etilo) sustituido por un anillo tal de 6 miembros.

Una clase de fracciones de la fórmula A o B son aquellas en las que E es un anillo aromático de 6 miembros opcionalmente sustituido, particularmente en la posición 2 o la posición 4, por -R^{13} u -OR^{13}.

La revelación incluye sales en las que la cadena lateral P3 y/o P2 comprende un grupo cíclico en el cual los hidrógenos 1 ó 2 han sido reemplazados por un halógeno, p.e., F o Cl.

\newpage

La revelación incluye una clase de sales en las que las cadenas laterales de la fórmula (A) o (B) son de las siguientes fórmulas (C), (D) o (E):

7

en las que q es de 0 a 5, p.e., es 0, 1 ó 2 y cada T es independientemente hidrógeno, uno o dos halógenos (p.e. F o Cl), -SiMe_{3}, -CN, -R^{13}, -OR^{13}, -COR^{13}, -CO_{2}R^{13} u -O_{2}CR^{13}. En algunas realizaciones de estructuras (D) y (E), T se encuentra en la posición 4 del(os) grupo(s) fenilo y es -R^{13}, -OR^{13}, -COR^{13}, -CO_{2}R^{13} o -O_{2}CR^{13}, y R^{13} es alquilo C_{1}-C_{10} y, más concretamente alquilo C_{1}-C_{6}. En una sub-clase, T es -R^{13} o -OR^{13}, por ejemplo, en la que f y g son cada una independientemente 0, 1, 2 ó 3; en algunos grupos de cadenas laterales de esta subclase, T es -R^{12}OR^{13} y R^{13} es H.

En una clase de los restos, la cadena lateral es de la fórmula (C) y cada T es independientemente R^{13} o OR^{13} y R^{13} es alquilo C_{1}-C_{4}. En algunos de estos compuestos, R^{13} es alquilo ramificado y en otros es una cadena recta. En algunos restos, el número de átomos de carbono oscila es de 1 a 4.

En muchos fragmentos dipeptídicos YCO- (cuyos dipéptidos pueden estar protegidos N-terminalmente o no), el aminoácido P3 tiene una cadena lateral de fórmula (A) o (B), tal y como se describe anteriormente, y el residuo P2 es de un iminoácido.

La revelación, incluye por tanto incluye medicamentos que contienen sales, p.e., sales metálicas, de ácidos organoborónicos los cuales son inhibidores de trombina, particularmente inhibidores de trombina seleccionados, que tienen un resto P1 neutro (enlazado con S1). Para más información acerca de los restos los cuales se enlazan con los sitios de trombina S3, S2 y S1, véase por ejemplo Tapparelli C y col., Trends Pharmacol. Sci. 14:366-376, 1993; Sanderson P y col., Current Medicinal Chemistry, 5:289-304, 1998; Rewinkel J y col., Current Pharmaceutical Design, 5:1043-1075, 1999; y Coburn C Exp. Opin. Ther. Patents 11(5):721-738, 2001. Las sales inhibidoras de trombina de la revelación no se limitan a aquellas que tienen los grupos de afinidad S3, S2 y S1 descritos en las publicaciones listadas en la oración anterior.

Los ácidos borónicos pueden tener una Ki para trombina de alrededor de 100 nM o menos, por ejemplo, alrededor de 20 nM o menos.

Un subconjunto de ácidos de la Fórmula (I) contiene los ácidos de la Fórmula (III):

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X es una fracción enlazada al grupo amino N-terminal y puede ser H para formar NH_{2}. La identidad de X no es crítica pero puede ser un resto X concreto descrito anteriormente. Como ejemplo puede mencionarse el benciloxicarbonilo.

En ciertos ejemplos X es R^{6}-(CH_{2})_{p}-C(O)-, R^{6}-(CH_{2})_{p}-S(O)_{2}-, R^{6}-(CH_{2})_{p}-NH-C(O)- o R^{6}-(CH_{2})_{p}-O-C(O)- en los que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 (de los cuales se prefieren 0 y 1) y R^{6} es H o un grupo cíclico de 5 a 13 miembros opcionalmente sustituido por 1, 2 ó 3 sustituyentes seleccionados de entre halógeno, amino, nitro, hidroxi, un grupo cíclico C_{5}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{4} alquilo que contiene, y/o enlaza con el grupo cíclico de 5 a 13 miembros a través de una cadena O, los grupos alquilo anteriormente mencionados están sustituidos por un sustituto seleccionado de entre halógeno, amino, nitro, hidroxi y grupo cíclico C_{5}-C_{6}. Más particularmente, X es R^{6}-(CH_{2})_{p}-C(O)- o R^{6}-(CH_{2})_{p}-O-C(O)- y p es 0 ó 1. El mencionado grupo cíclico de entre 5 y 13 miembros es a menudo aromático o heteroaromático, por ejemplo, es un grupo aromático o heteroaromático de 6 miembros. En muchos casos, el grupo no está sustituido.

Algunos ejemplos de grupos X son (2-pirazina) carbonilo, (2-pirazina) sulfonilo y, concretamente, benciloxicarbonilo.

aa^{1} es un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral de hidrocarbilo que contiene no más de 20 átomos de carbono (p.e., hasta 15 y, opcionalmente, hasta 13 átomos de C) y que contiene al menos un grupo cíclico que tiene hasta 13 átomos de carbono. En ciertos ejemplos, el/los grupo(s) cíclicos de aa^{1} contiene(n) 5 ó 6 miembros de anillo. Por ejemplo, el/los grupo(s) cíclicos de aa^{1} pueden ser grupos arilo, particularmente fenilo. Típicamente, existen uno o dos grupos cíclicos en la cadena lateral aa^{1}. Determinadas cadenas laterales comprenden o constan de metilo sustituido por uno o dos anillos de 5- o 6- miembros.

Más particularmente, aa^{1} es Phe, Dpa o un análogo de los mismos total o parcialmente hidrogenado. Los análogos totalmente hidrogenados son Cha y Dcha.

aa^{2} es un residuo de iminoácido que tiene desde 4 hasta 6 miembros de anillo. Alternativamente, aa^{2} está N-sustituido en Gly por un grupo hidrocarbilo C_{3}-C_{13}, p.e. un grupo hidrocarbilo C_{3}-C_{8} que contiene un anillo hidrocarbilo C_{3}-C_{6}; el grupo hidrocarbilo puede estar saturado, por ejemplo N-sustituyentes ejemplares son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Como un grupo hidrocarbilo que contiene uno o más enlaces insaturados, podemos mencionar el fenilo y el metilo o etilo sustituido por fenilo, p.e., 2-feniletilo, así como \beta,\beta-dialquilfeniletilo.

Una clase ejemplar de productos consta de aquellos en los que aa^{2} es un residuo de un iminoácido de fórmula (IV)

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donde R^{11} es -CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -S-CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, cuyo grupo cuando el anillo es de 5 ó 6 miembros se sustituye opcionalmente por uno o más grupos -CH_{2}- por entre 1 y tres grupos alquilo C_{1}-C_{3}, por ejemplo para formar el grupo R^{11} -S-C(CH_{3})_{2}-. De estos iminoácidos, el ácido azetidino-2-carboxílico, especialmente el ácido (s)-azetidino-2-carboxílico y, más concretamente, la prolina son ilustrativos.

Se puede apreciar de lo anterior que una clase muy preferida de productos consiste en aquellos en los que
aa^{1}-aa^{2} es Phe-Pro. En otra clase preferida, aa^{1}-aa^{2} es Dpa-Pro. En otros productos, aa^{1}-aa^{2} es Cha-Pro o Dcha-Pro. Por supuesto, también se incluyen las clases de producto correspondientes en las cuales Pro se reemplaza con ácido (s)-azetidino-2-carboxílico.

R^{9} es tal y como se ha definido anteriormente y puede ser una fracción R^{1} de la fórmula -(CH_{2})_{s}-Z. El número entero s es 2, 3 ó 4 y W es -OH, -OMe, -OEt o halógeno (F, Cl, I o, preferiblemente, Br). Grupos Z particularmente ilustrativos son -OMe y -OEt, especialmente -OMe. En determinados ejemplos, s es 3 para todos los grupos Z y, además, para todos los compuestos de la revelación. Grupos R^{1} concretos son 2-bromoetilo, 2-cloroetilo, 2-metoxietilo, 4-bromobutilo, 4-clorobutilo, 4-metoxibutilo y, especialmente, 3-bromopropilo, 3-cloropropilo y 3-metoxipropilo. Más preferentemente, R^{1} es 3-metoxipropilo. 2-etoxietilo es otro grupo preferido R^{1}.

De acuerdo con esto, una clase específica de sales consta de aquellas de ácidos de la fórmula X-Fe-Pro-Mpg-B(OH)_{2}, especialmente Cbz-Phe-Pro-Mpg-B(OH)_{2}; también se incluyen análogos de estos compuestos en los que Mpg se reemplaza por un residuo por otro de los grupos R^{1} y/o Phe se reemplaza por Dpa u otro residuo aa^{1}.

El resto aa^{1} de la sal es preferiblemente de configuración R. El resto aa^{2} es preferiblemente de configuración (S). Las sales especialmente preferibles tiene aa^{1} de configuración (R) y aa^{2} de configuración (S). El centro quiral -NH-CH(R^{1})-B- es preferiblemente de configuración (R). Se considera que las formulaciones comerciales tendrán centros quirales en disposición (R,S,R), como por ejemplo en el caso de sales de Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH:

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Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH

La revelación incluye sales de Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH (y de otros compuestos de la fórmula X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH) las cuales son al menos puras al 90%, p.e., al menos puras al 95%.

En términos generales, las sales descritas en el presente documento pueden considerarse como correspondientes a productos de reacción de un ácido organobórico, tal y como se describe anteriormente, con una base fuerte, p.e., un compuesto metálico básico; las sales no obstante no se limitan a productos resultantes de una reacción tal y pueden obtenerse mediante vías alternativas.

Por tanto las sales pueden obtenerse mediante el contacto de un ácido de la fórmula (I) con una base fuerte. La revelación contempla así productos (composiciones de materia) que tienen las características de un producto de reacción de un ácido de la fórmula (I) y una base fuerte. La base es farmacéuticamente aceptable.

Podemos mencionar como las sales adecuadas aquellas de metales, p.e., de metales monovalentes o bivalentes, y bases orgánicas más fuertes, por ejemplo:

1. Sales de metales alcalinos;

2. Sales bivalentes, p.e., de metales alcalinotérreos;

3. Metales del grupo III;

4. Sales de compuestos que contienen nitrógeno orgánico fuertemente básico, incluyendo:

4A.

Sales de guanidinas y sus análogos;

4B.

Sales de amina fuertemente básica, ejemplos de las cuales incluyen (1) aminoazúcares y (ii) otras aminas.

De las sales anteriores, son particularmente ilustrativas las de metales alcalinos, especialmente el Na y el Li. También son ilustrativas las de aminoazúcares.

Las sales específicas son del borato ácido aunque en la práctica las sales ácidas pueden contener una muy pequeña proporción del borato doblemente desprotonado. El término "borato ácido" se refiere a los grupos -B(OH)_{2} trigonales, en los cuales uno de los grupos B-OH está desprotonado así como a los grupos tetraédricos correspondientes en equilibrio con aquellos. Los boratos ácidos tienen una estequiometría consistente con la desprotonación individual.

Por tanto la revelación incluye productos (composiciones de materia) los cuales comprenden sales las cuales pueden representarse mediante la fórmula (V):

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donde Y^{n+} es un catión farmacéuticamente aceptable que se puede obtener a partir de una base fuerte y aa^{1}, aa^{2}, X y R^{1} son como se han definido anteriormente. También se incluyen productos en los que R^{1} se reemplaza por otro

\hbox{grupo
R ^{9} .}

Una clase de sales tiene una solubilidad de alrededor de 10 mM o más, p.e. de al menos alrededor de 20 mM, cuando su solubilidad viene determinada como se describe en los ejemplos a una disolución de 25 mg/ml. Todavía más particularmente tienen aún una solubilidad de al menos 50 mM cuando su solubilidad viene determinada tal y como se describe en los ejemplos a una disolución de 50 mg/ml.

La revelación incluye sales de ácidos borónicos (I) que tienen una estequiometría observada consistente con la sal que es de la (que está representada por la) fórmula "(borato^{-})_{n} catión^{n+}". Una clase de tales sales se representa mediante la fórmula:

[Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)(O^{-})]M^{+}

donde M^{+} representa un catión monovalente, especialmente un catión metálico alcalino. Se entiende que la representación anterior es una representación nocional de un producto cuya estequiometría observada no suele ser literal y exactamente 1:1. En cualquier caso, una sal concreta es la sal monosódica Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2} (TGN 255). En la fórmula anterior, el borato representado trigonalmente representa, como siempre, boratos que son trigonales, tetraédricos o mixtos trigonales/tetraédricos.

Algunos ejemplos ilustrativos son productos los cuales contienen:

(i) especie seleccionada de entre (a) ácidos de la fórmula (VIII): X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2} donde X es H o un grupo aminoprotector, especialmente Cbz, y (b) aniones de borato de estos y (c) cualquier forma de equilibrio de lo anterior (p.e., un anhídrido); y

(ii) iones con una valencia n en combinación con la especie mencionada, teniendo dicha especie y los iones mencionados una estequiometría observada consistente con una estequiometría nocional especie:ión de n:1. En una clase de sales, n es 1.

Considerando los contraiones sucesivamente:

1. Metal monovalente, especialmente, sales de metales alcalinos

Entre los metales alcalinos adecuados se encuentran el litio, el sodio y el potasio. Todos estos son notablemente solubles. El litio y el sodio son ilustrativos debido a su alta solubilidad. Las sales de litio y particularmente las de sodio son de una solubilidad sorprendentemente alta en relación con el potasio entre otros. El sodio es el más usado en muchos ejemplos. Las sales que contienen mezclas de metales alcalinos se contemplan por en la revelación.

La revelación incluye productos que contienen sales de la fórmula (VI)

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donde M^{+} es un ión de metal alcalino y aa^{1}, aa^{2}, X y R^{1} son como se definen anteriormente, así como sales en las que tanto los grupos hidroxi del grupo borato están en forma de sal (preferiblemente con otro grupo M^{+} idéntico) y las mezclas de tales sales. También se incluyen productos en los que R^{1} se reemplace por otro grupo R^{9}.

2. Sales divalentes, p.e., de metales alcalinotérreos (metal del Grupo II)

Un ejemplo de metal divalente es calcio. Otro metal divalente adecuado es magnesio. También se considera el cinc. Los metales divalentes se utilizan habitualmente en una relación de ácido borónico:metal de sustancialmente 2:1, para alcanzar la fracción de borato monovalente preferida. También se consideran sales que contienen mezclas de metales divalentes, p.e., mezclas de metales terrestres alcalinos.

También se revelan productos (composiciones de materia) los cuales comprenden sales que pueden representarse mediante la fórmula (VII):

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donde M^{2+} es un catión de metal divalente, p.e. un catión de alcalinotérreo o cinc, y aa^{1}, aa^{2'}, X y R^{9} son como se define anteriormente, así como las sales en las cuales están desprotonados tanto los dos grupos hidroxi del grupo borato como las mezclas de tales sales. Como se ha indicado anteriormente, el borato puede comprender una especie tetraédrica.

3. Metales del grupo III

Entre los metales del Grupo III adecuados se incluyen el aluminio y el galio. También se contemplan sales que contienen mezclas de metales del Grupo III.

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La revelación incluye productos que contienen sales de la fórmula (VIII):

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donde M^{3} es un ión de metal del grupo III y aa^{1}, aa^{2}, X y R^{9} son como se definen anteriormente, así como sales en las que están en forma de sal tanto los grupos hidroxi del grupo borato como las mezclas de tales sales. Como se ha indicado anteriormente, el borato puede incluir una especie tetraédrica.

4. Compuestos con contenido de nitrógeno orgánico básico fuerte

La revelación incluye productos obtenibles a través de (que tienen las características de un producto obtenido a través de) la reacción de un ácido borónico peptídico como se define anteriormente y una base orgánica fuerte. Se describen dos clases ilustrativas de base orgánica en las secciones 4A y 4B a continuación. Se prefieren especialmente las sales ácidas (en las que uno de los dos grupos borónicos -OH se encuentra desprotonado). Más comúnmente, las sales contienen un tipo sencillo de contraión orgánico (sin importar los contaminantes traza), pero la revelación contempla las sales que contienen mezclas de contraiones orgánicos; en una subclase, los diferentes contraiones se encuentran dentro de la familia de la sección 4A descrita más adelante o, como puede ser el caso, en la familia de la sección 2B más adelante; en otra subclase, las sales contienen una mezcla de contraiones orgánicos que no son todos de la misma familia (4A o 4B).

Las bases orgánicas adecuadas incluyen aquellas con un pKb de 7 o más, p.e., 7,5 o más, por ejemplo en la región de 8 o más. Se favorecen las bases que son menos lipofílicas [p.e., que tienen al menos un grupo funcional polar (p.e., 1, 2 ó 3 tales grupos) por ejemplo, hidroxi]; así los aminoazúcares son una clase de base favorecida.

4A. Guanidinas y sus análogos

El componente guanidino (guanidina) puede en principio ser cualquier compuesto soluble y farmacéuticamente aceptable que tiene un grupo guanidino o un grupo guanidino sustituido, o un análogo de guanidina sustituido o sin sustituir. Los sustitutos adecuados incluyen arilo (p.e., fenilo), alquilo o alquilo interrumpido por un éter o enlace de tioéter y, en cualquier caso, típicamente contienen de 1 a 6 y especialmente 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono, como es el caso del metilo o del etilo. El grupo guanidino puede tener 1, 2, 3 ó 4 grupos de sustitución pero más usualmente tiene 1 ó 2 grupos de sustitución, por ejemplo, en un nitrógeno terminal. Una clase de guanidinas es monoalquilada; otra clase es dialquilada. Se pueden mencionar como análogos de la guanidina tioguanidinas y l2-amino piridinas. Los compuestos que tienen grupos guanidinos no sustituidos, por ejemplo, guanidina y arginina, forman una clase particular.

Las sales que contienen mezclas de guanidinas están contempladas en la revelación.

Un compuesto guanidino concreto es la L-arginina o un análogo de la L-arginina, por ejemplo, la D-arginina o la D- o, preferiblemente, los L-isómeros de homoarginina o agmatina [(4-aminobutilo) guanidina]. Análogos de la arginina menos preferidos son el éster metílico de NG-nitro-L-arginina, por ejemplo, y análogos de guanidina limitados, especialmente 2-amino pirimidinas, por ejemplo, 2,6-quinazolinadiaminas tales como 5,6,7,8-tetrahidro-2,6-quinazolinediamina, por ejemplo. El compuesto guanidino también puede ser un péptido, por ejemplo, un dipéptido, que contenga arginina; uno de estos dipéptidos es L-tirosil-L-arginina.

Algunos compuestos guanidinos concretos son compuestos de la fórmula (VII):

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donde n es de 1 a 6 y, por ejemplo, al menos 2, p.e. 3 o más y, en muchas instancias, no más de 5. Más concretamente, n es 3, 4 ó 5. R^{2} es H o carboxilato o carboxilato derivatizado, por ejemplo para formar un éster (p.e. un éster de alquilo C_{1}-C_{4}) o amida. R^{3} es H, alquilo C_{1}-C_{4} o un residuo de aminoácido natural o no natural (p.e., tirosina). Los compuestos de la fórmula (IV) son habitualmente de configuración L. Los compuestos de la fórmula (IV) son arginina (n=3; R^{2}=carboxi; R^{3}=H) y derivados o análogos de arginina.

La revelación incluye productos que contienen sales de la fórmula (IX)

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donde aa^{1}, aa^{2}, X y R^{1} son como se han definido anteriormente y G^{+} es la forma protonada de un compuesto orgánico farmacéuticamente aceptable que contiene un grupo guanidino o un análogo del mismo, así como sales en las que tanto los grupos hidroxi del grupo borato están en forma de sal (preferiblemente con otro grupo G^{+} idéntico) y mezclas de tales sales. También se incluyen productos en los que R^{1} se reemplaza por otro grupo R^{9}.

4B. Aminas fuertemente básicas

La revelación incluye productos obtenibles a través de (que tienen las características de un producto obtenido a través de) la reacción de un ácido borónico peptídico como se define anteriormente y una base orgánica fuerte que es una amina. La amina puede, en principio, ser cualquier amina soluble y farmacéuticamente aceptable.

Se prevé que una clase deseable de amina incluya aquellas que tienen grupos funcionales polares además de un grupo amino individual, pues tales compuestos serán más hidrofílicos y de este modo más solubles que otros. En ciertas sales, el grupo funcional o cada grupo funcional adicional es hidroxi. Algunas aminas tienen 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 grupos funcionales adicionales, especialmente grupos hidroxi. En una clase ilustrativa de aminas la relación de (grupos amino más hidroxi):átomos de carbono es de 1:2 a 1:1, siendo esta última especialmente preferida. Estas aminas con uno o más grupos funcionales polares adicionales pueden ser un hidrocarburo, especialmente un alcano, sustituido por el grupo amino y el/los grupo(s) polar(es) adicional(es). El grupo amino puede ser sustituido o no sustituido y, salvo los sustitutos aminos, la base polar puede contener, por ejemplo, hasta 10 átomos de carbono; usualmente no hay menos de tres de dichos átomos de carbono, p.e., 4, 5 ó 6. Los aminoazúcares se incluyen en esta categoría de bases polares.

La revelación incluye productos que contienen sales de la fórmula (X)

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donde aa^{1}, aa^{2}, X y R^{1} son como se han definido anteriormente y A^{+} es la forma protonada de una amina farmacéuticamente aceptable, así como sales en las que tanto los grupos hidroxi del grupo borato están en forma de sal (preferiblemente con otro grupo A^{+} idéntico) y mezclas de tales sales. En una clase de tales productos, A^{+} es la forma protonada de una amina descrita en la sección 2B(i) a continuación; en otra clase A^{+} es la forma protonada de una amina descrita en la sección 2B(ii) a continuación. También se incluyen productos en los que R^{1} se reemplace por otro grupo R^{9}.

Se describen dos clases ilustrativas de base amina en las secciones 4B(i) y 4B(ii) a continuación. Se prefieren especialmente las sales ácidas (en las que uno de los dos grupos borónicos -OH se encuentra desprotonado). Más comúnmente, las sales contienen un tipo único de contraiones amina (sin importar los contaminantes de trazado), pero la revelación contempla las sales que contienen mezclas de contraiones amina; en una subclase, los diferentes contraiones se encuentran dentro de la familia de la sub-sección 4B(i) descrita más adelante o, como puede ser el caso, en la familia de la sub-sección 4B(ii) de más adelante; en otra subclase, las sales contienen una mezcla de contraiones orgánicos que no son todos de la misma familia (4B(i) o 4B(ii)).

4B(i) Aminoazúcares

La identidad del aminoazúcar no es fundamental. Entre los aminoazúcares preferidos se incluyen los azúcares de anillo abierto, especialmente las glucaminas. Los aminoazúcares cíclicos también se prevén útiles. Una clase de aminoazúcares no está N-sustituida y otra clase, preferida, está N sustituida por uno o dos sustitutos N (p.e., uno). Sustituyentes adecuados son grupos hidrocarbilos, conteniendo por ejemplo por ejemplo y sin limitación de 1 a 12 átomos de carbono; los sustituyentes pueden incluir fracciones de alquilo o arilo o ambas. Sustituyentes ejemplares son los grupos alquilos C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7} y C_{8}, en concreto, el metilo y el etilo, de los cuales el metilo es ilustrativo. Los datos indican que los aminoazúcares, especialmente la N-metil-D-glucamina, son de solubilidad sorprendentemente alta.

Un azúcar más preferido es N-metil-D-glucamina:

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4B(ii) Otras aminas

Otras aminas adecuadas también incluyen aminoácidos (que se dan en la naturaleza o que no) cuya cadena lateral está sustituida por un grupo amino, especialmente lisina.

Algunas aminas son compuestos de la fórmula (XI):

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donde n, R^{2} y R^{3} son como se define en relación con la fórmula (IV). Los compuestos de la fórmula (VI) son habitualmente de configuración L. Los compuestos de la fórmula (VI) son lisina (n=4; R^{2}=carboxilo; R^{3}=H) y derivados o análogos de lisina. Una amina más preferida es la L-lisina.

Otras aminas adecuadas son heterociclos que contienen nitrógeno. Al menos usualmente, tales compuestos heterocíclicos son alicíclicos; una clase de compuestos heterocíclicos está N-sustituida y otra clase, preferida, no está N-sustituido. Los heterociclos pueden contener 6 átomos que forman anillo, como en los casos de piperidina, piperazina y morfolina. Una clase de aminas incluye heterociclos que contienen N sustituidos por sustitutos polares, especialmente hidroxi, p.e., 1, 2 ó 3 veces.

La revelación, por tanto, incluye aminas distintas a aminoazúcares las cuales tienen uno o más sustitutos polares (p.e., 1, 2, 3, 4, 5 ó 6), especialmente hidroxi, además de un grupo amino. Tales compuestos pueden tener una razón de (grupos amino más hidroxi):átomos de carbono de 1:2 a 1:1, siendo esta última razón especialmente preferida.

La revelación incluye sales mixtas, es decir sales que contienen una mezcla de restos boropeptídicos y/o contraiones pero se prefieren las sales simples.

Las sales en forma sólida pueden contener un disolvente, p.e., agua. Se incluye una clase de productos en los que las sales son esencialmente anhidras. También se incluye una clase en la cual las sales son hidratos.

Procedimientos Sintéticos I

1. Síntesis peptídica/peptidomimética

La síntesis de los boropéptidos, incluyendo, por ejemplo, Cbz-D-Phe-Pro-BoroMpg-OPinacol, es familiar para aquellos expertos en la técnica y se describe en la técnica previa mencionada anteriormente, incluida Claeson y col. (US 5574014 y otras) y Kakkar y col. (WO 92/07869 y miembros de su familia incluyendo la US 5648338). Se describe también por Elgendy y col. Adv. Exp. Med. Biol. (USA) 340:173-178, 1993; Claeson,G. y col. Biochem. J. 290:309-312, 1993; Deadman y col. J. Enzyme Inhibition 9:29-41, 1995, y Deadman y col. J. Med. Chem. 38:1511-1522, 1995.

La síntesis estereoselectiva con configuración S o R al carbono B-terminal quiral puede llevarse a cabo utilizando metodología establecida (Elgendy y col. Tetrahedron. Lett. 33:4209-4212, 1992; WO 92/07869 y miembros de sus familia incluyendo la US 5648338) utilizando (+) o (-)- pinanodiol como director quiral (Matteson y col. J. Am. Chem. Soc. 108:810-819, 1986; Matteson y col. Organometallics. 3:1284-1288, 1984). Otro enfoque consiste en resolver el intermedio aminoborato requerido (p.e., Mpg-BOPinacol) para obtener de forma selectiva el isómero (R) deseado y acoplarlo a la fracción dipeptídica (p.e., Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro, la cual es la misma que Cbz-D-Phe-L-Pro), la cual formará el resto de la molécula.

Los boropéptidos pueden sintetizarse inicialmente en la forma de ésteres de ácido borónico, particularmente ésteres con dioles. Dichos ésteres de diol pueden convertirse en ácido borónico peptídico, tal y como se describe a continuación.

2. Éster para conversión en ácido

Un éster de borato peptídico tal como Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-OPinacol puede hidrolizarse para formar el ácido correspondiente.

Una técnica novedosa para convertir un éster de diol de un ácido borónico peptídico de la fórmula (I) en el ácido comprende disolver el éster de diol en un éter y particularmente un éter de dialquilo, haciendo reaccionar el diol así disuelto con una diolamina, por ejemplo, una dialcanolamina, para formar un precipitado de producto, recuperar el precipitado, disolverlo en un disolvente orgánico polar y hacer reaccionar el producto así disuelto con un medio acuoso, p.e., un ácido acuoso, para formar un ácido borónico peptídico. El ácido borónico puede recuperarse desde la capa orgánica de la mezcla resultante de la reacción, por ejemplo, eliminando el disolvente, por ejemplo mediante evaporación al vacío o destilación. La reacción entre el éster de diol y la diolamina puede llevarse a cabo bajo reflujo, por ejemplo.

La identidad del diol no es fundamental. Como dioles adecuados podemos mencionar los compuestos alifáticos y aromáticos que tienen grupos hidroxi que se sustituyen en átomos de carbono adyacentes o en átomos de carbono sustituidos por otro carbono. Es decir, los dioles adecuados incluyen compuestos que tienen al menos dos grupos hidroxi separados por al menos dos átomos de carbono que se conectan en una cadena o anillo. Una clase de dioles contiene hidrocarbonos sustituidos por exactamente dos grupos hidroxi. Uno de dichos dioles es el pinacol y otro el pinanodiol; también se puede mencionar el neopentilglicol, el 1,2-etanodiol, el 1,2-propanodiol, el 1,3-propanodiol, el 2,3-butanediol, el 1,2-diisopropiletanodiol, el 5,6-decanodiol y el 1,2-diciclohexiletanodiol.

Los grupos alquilo del éter de dialquilo preferentemente tienen 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono y los grupos alquilos pueden ser los mismos o diferentes. Un éter ejemplar es el éter dietílico.

Los grupos alquilo de la dialcanolamina preferentemente tienen 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono y los grupos alquilo pueden ser los mismos o diferentes. Una dialcanolamina ejemplar es la dietanolamina. El producto de reacción de la dietanolamina y el ácido borónico se hidroliza en agua a temperatura ambiente y la velocidad de hidrólisis puede acelerarse añadiendo ácido o base.

El disolvente orgánico polar es preferiblemente CHCl_{3}. Otros ejemplos son alcanoles polihalogenados en general y acetato de etilo. En principio, cualquier disolvente orgánico polar se acepta con excepción de los alcoholes.

El ácido acuoso es adecuadamente un ácido inorgánico fuerte a un pH en la región de 1 tal como el ácido clorhídrico, por ejemplo.

Después de la reacción con el ácido, la mezcla de reacción es debidamente enjuagada con, por ejemplo, NH_{4}Cl u otra base suave.

Un ejemplo de un procedimiento específico sería el que sigue

1. El éster de pinacol o pinanodiol del ácido borónico peptídico seleccionado se disuelve en éter dietílico.

2. Se añade dietanolamina y la mezcla se somete a reflujo a 40ºC.

3. Se elimina (filtra) el producto precipitado, se lava (normalmente varias veces) con éter de dietilo u otro disolvente orgánico polar distinto de un alcohol, y se seca (p.e., mediante evaporación al vacío).

4. El producto seco se disuelve en un disolvente orgánico polar distinto de un alcohol, p.e., CHCl_{3}. Se añade el ácido acuoso o la base, p.e., ácido clorhídrico (pH 1), y se remueve la mezcla durante p.e. aproximadamente a temperatura ambiente.

5. La capa orgánica se elimina y se lava con disolución de NH_{4}Cl.

6. El disolvente orgánico se destila y se seca el producto sólido residual.

El ácido resultante del procedimiento anterior puede convertirse en una sal del ácido con una base farmacéuticamente aceptable cuya sal puede por el contrario formularse en una composición farmacéutica en forma de dosificación parenteral.

3. Síntesis de las sales

En general, las sales pueden prepararse poniendo el contacto el ácido borónico peptídico correspondiente con una base fuerte adecuada para formar la sal deseada. En el caso de las sales metálicas, los hidróxidos metálicos son bases adecuadas (alternativamente, pueden utilizarse los carbonatos metálicos, por ejemplo), mientras que en ocasiones resulta más conveniente que el ácido entre en contacto con un alcóxido metálico relevante (p.e., metóxido), para cual el alcanol correspondiente es un disolvente adecuado. Las sales con bases orgánicas pueden prepararse poniendo en contacto del ácido borónico peptídico con la base orgánica en sí misma. Las sales ilustrativas son las sales ácidas (un protón -BOH reemplazado) y, para crear sales ácidas con un catión monovalente, el ácido y la base reaccionan adecuadamente en cantidades sustancialmente equimolares. Se establece, por tanto, de forma general que la relación molar habitual ácido:base es sustancialmente n:1, donde n es la valencia del catión de la base.

En un procedimiento, una disolución del ácido borónico peptídico en un disolvente orgánico miscible en agua, por ejemplo acetonitrilo o un alcohol (p.e., etanol, metanol, un propanol, por ejemplo, isopropanol, u otro alcanol), se combina con una disolución acuosa de la base. Se permite reaccionar al ácido y a la base y se recupera la sal. La reacción se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente (p.e., a una temperatura de entre 15 y 30°C, p.e., de 15 a 25°C), pero se puede utilizar una temperatura elevada, por ejemplo, hasta el punto de ebullición de la mezcla de reacción, pero normalmente inferior, p.e., una temperatura de hasta 40°C o 50°C. La mezcla de reacción se puede dejar reposar o agitarse (normalmente se remueve).

El tiempo durante el cual se permite reaccionar al ácido y a la base no es fundamental pero resulta deseable mantener la mezcla de reacción durante al menos una hora. Usualmente es adecuado un periodo de una a dos horas pero también pueden emplearse tiempos de reacción más prolongados.

La sal puede recuperarse a partir de la mezcla de reacción mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, evaporación o precipitación. La precipitación puede llevarse a cabo añadiendo un exceso de disolvente miscible en el que la sal tenga una solubilidad limitada. En una técnica preferida, la sal se recupera mediante evacuación de la mezcla de reacción hasta el secado. La sal preferiblemente se purifica después de esto, por ejemplo redisolvendo la sal antes de filtrar la disolución resultante y secándola, por ejemplo, evacuándola hasta sequedad. La redisolución puede llevarse a cabo utilizando agua, p.e., agua destilada. La sal puede purificarse después, por ejemplo para eliminar el agua residual mediante una redisolución adicional en un disolvente adecuado, el cual es ventajosamente acetato de etilo o THF seguido de evaporación hasta sequedad. El procedimiento de purificación puede llevarse a cabo a temperatura ambiente (es decir, de 15 a 30°C, p.e., de 15 a 25°C), o a una temperatura modestamente elevada, tal como, p.e. una temperatura que no supere los 40°C o 50°C; por ejemplo, la sal puede disolverse en agua y/o disolvente agitándola con o sin calentarla a, por ejemplo, 37°C.

Generalmente, los disolventes preferidos para su uso en la purificación de sales son el acetato de etilo o THF, o tal vez otro disolvente orgánico.

Un procedimiento general para sintetizar sales de Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH es el siguiente:

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se le añade la base requerida en la disolución en agua destilada (190 ml); se añade la base como una disolución de 0,2 M para un catión monovalente. Se deja que la disolución transparente resultante reaccione, por ejemplo, dejándola reposar o agitándola, durante un periodo usual, en cualquier caso, de entre una y dos horas. La reacción típicamente se lleva a cabo a temperatura ambiente (p.e., de 15 a 30ºC, p.e., de 15 a 25°C), pero alternativamente la temperatura puede elevarse de forma alternativa (p.e., hasta 30ºC, 40ºC o 50ºC). Después se evacua la mezcla de reacción hasta el secado al vacío con su temperatura no excediendo de 37°C, para proporcionar típicamente un sólido blanco frágil o un líquido oleoso/pegajoso. El líquido oleoso/pegajoso se redisuelve en la cantidad mínima de agua destilada necesaria (de 200 ml a 4 l), típicamente con calentamiento (p.e., de 30 a 40ºC), usualmente hasta 2 horas. Se filtra la disolución, habitualmente a través de papel de filtro, y se evacua hasta el secado, una vez más con la temperatura de la disolución no excediendo de 37°C, o se se ca por congelación. El producto resultante se seca al vacío durante toda una noche para producir normalmente un sólido frágil blanco. Si el producto se encuentra presente como un sólido oleoso o pegajoso se disuelve después en acetato de etilo y se evacua hasta el secado para producir un producto sólido blanco. El sólido blanco es normalmente un polvo grueso, amorfo.

En variaciones del procedimiento general anterior, el acetonitrilo se reemplaza por otro disolvente orgánico miscible en agua, notablemente un alcohol, tal y como se ha discutido anteriormente, especialmente etanol, metanol, isopropanol u otro propanol.

Cuando una sal de ácido borónico es menos soluble en un medio de reacción seleccionado para la formación de sales de manera que su preparación directa a partir del ácido y la base correspondientes sea inconveniente, la sal menos soluble puede prepararse a partir de una sal más soluble en el medio de reacción.

4. Separación de estereoisómeros

Los estereoisómeros de un éster borónico peptídico o de un aminoborato intermedio sintético se pueden redisolver, por ejemplo, de cualquier forma conocida. En particular, los esteroisómeros de ésteres borónicos pueden resolverse mediante HPLC.

Procedimientos Sintéticos II

Estabilidad y Pureza de los Compuestos

Las publicaciones existentes muestran que los ácidos organoborónicos se degradan mediante oxidación del enlace C-B. Véase por ejemplo Wu y col. (véase más arriba). Trabajos anteriores sobre las sales del TRI 50c confirmaron que estas sales y/o intermedios en su preparación son ligeramente inestables, hasta tal punto que las sales demostraron contener una impureza libre de boro, denominada impureza I, que evidentemente fue generada por la escisión del enlace C-B. Las sales como clase son significativamente más estables a tal degradación que el ácido libre.

Estas sales anteriores del TRI 50c se realizaron mediante los procedimientos generales descritos en los Ejemplos 5 y 9 de esta especificación. La impureza I tiene la siguiente estructura:

20

Por ejemplo, un cromatograma HPLC, redactado utilizando un procedimiento de fase reversa que se describe de forma más concreta en el Ejemplo 34, produjo los siguientes datos para la sal monosódica del TRI 50c, conseguidos siguiendo los procedimientos de los Ejemplos 5 y 9 del presente documento:

	Nombre	RT (min)	Área	Altura	Cantidad	Unidades	% de Área
1	Benzaldehído	6,145	2487	224			0,39
2	Impureza I	11,022	6379	539			1,00
3	TRI50c	11,679	628872	51108	946,063	ug/mL	98,61

Los intentos para purificar sales contaminadas con la Impureza I no fueron exitosos, y pareció que, por ejemplo, la Impureza I se generó a partir de las sales en columnas de HPLC.

La pureza quiral relativa de las sales obtenidas tras el procedimiento general de los Ejemplos 5 y 9 se alcanzó volviendo a disolver el éster de pinacol del TRI 50c mediante HPLC, denominado TRI 50b, y convirtiendo el TRI 50b nuevamente disuelto en las sales. Tal procedimiento de HPLC no es aceptable para la producción de fármacos comerciales normales.

Se ha descubierto adicionalmente que la síntesis de técnica anterior resumida previamente bajo el epígrafe "Procedimiento de Aminoborato" resulta, cuando se aplica a la síntesis del TRI 50c o un éster del mismo, en la formación de una impureza denominada Impureza IV:

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Los intentos para separar la Impureza IV del TRI 50c no han tenido éxito. Lo mismo se aplica a las sales y ésteres del TRI 50c y a las sales y ésteres correspondientes de la Impureza IV. Ninguna técnica de purificación de las probadas puede evitar la presencia de la Impureza IV si se utiliza la técnica de síntesis previa mencionada.

\newpage

Procedimiento Sintético II

Los procedimientos

Entre otras cosas, la presente revelación se refiere a los problemas para controlar la partición del enlace C-B en compuestos organoborónicos, así como para proporcionar sales purificadas quiralmente del TRI 50c y otros ácidos organoborónicos a escala comercial. A este respecto, se ha descubierto que los enlaces C-B parecen partirse por medio de un mecanismo no oxidativo el cual se produce en presencia de muchos disolventes, incluyendo el agua y p.e. ácidos y bases acuosos, entre otros.

También se ha descubierto que la precipitación selectiva quiralmente puede utilizarse para recuperar ácidos organoborónicos en alta pureza.

Así la escisión del enlace C-B (y de este modo en particular la generación de la Impureza I) puede controlarse mediante:

\bullet

La selección de acetonitrilo como disolvente, cuando se precisa un disolvente para el procesamiento y el acetonitrilo tiene el poder de disolución necesario; se selecciona en particular el acetonitrilo en proceso cuando se desea o necesita un disolvente polar.

\bullet

La evitación de un contacto excesivo con agua.

En términos de producción de la sal del TRI 50c, por tanto, la revelación incluye procedimientos que contienen una, dos o tres de las siguientes características:

(i)

redisolución de los epimeros (R,S,S) y (R,S,R) del TRI 50c mediante precipitación selectiva de forma quiral utilizando dietanolamina y convenientemente, pero no necesariamente, utilizando como material de partida el TRI 50c en forma de éster, por ejemplo, el éster de pinacol;

(ii)

control de la duración y/o condiciones de hidrólisis del éster de dietanolamina del TRI 50c, por ejemplo como se obtiene mediante tal precipitación para controlar la ruptura del enlace C-B;

(iii)

uso de acetonitrilo como disolvente para el TRI 50c, por ejemplo como se obtiene mediante tal hidrólisis con el objeto de hacer reaccionar el TRI 50c con una base para formar la sal. Otro disolvente favorable puede ser el tetrahidrofurán.

Como una característica opcional, o incluso aislada, cuarta característica optativa, o incluso aislada, se pueden secar las sales del TRI 50c mediante azeosecado utilizando acetonitrilo.

Se considera que la escisión del enlace C-B puede producirse mediante un mecanismo nucleofílico y la revelación incluye por lo tanto procedimientos en los cuales las oportunidades de un ataque nucleofílico se minimizan.

Las cuatro características anteriores, o una, dos o tres cualesquiera de ellas, pueden aplicarse a la fabricación y procesamiento de otros compuestos borónicos, especialmente ácidos de la fórmula (I) y sus derivados (p.e., ésteres y sales).

Se puede utilizar la dietanolamina por tanto para redisolver mediante precipitación selectiva los diastereómeros de ácidos borónicos de la fórmula (Ia)

22

El material de partida puede ser un ácido (Ia) o un derivado del mismo capaz de formar un éster de dietanolamina del ácido borónico. La precipitación selecciona ácidos que tienen un centro quiral C* de configuración (R) como precipitado. El precipitado se recupera y se convierte al ácido borónico correspondiente o a la sal del mismo. La sal se realiza en una formulación farmacéutica parenteral.

Para una pureza quiral y un rendimiento óptimos, se puede utilizar la dietanolamina en una cantidad de aproximadamente 1,25 \pm 0,1 equivalentes sobre la base de equivalentes iniciales de ácido borónico con un centro quiral C* de configuración (R).

El ácido borónico inicial o derivado de ácido puede por ejemplo contener de un 50% a un 60% de moléculas con centro quiral C* de configuración (R) y de un 40% a un 50% de moléculas que tienen centro quiral C* de configuración (S).

El procedimiento abre la vía para la comercialización de los ácidos borónicos (I) y sus derivados, especialmente sales, como fármacos. Se proporcionan por lo tanto productos y actividades a escala comercial que utilizan los ácidos borónicos (I) y sus derivados en la presente.

Por tanto, resulta útil para la fabricación de productos de la invención un procedimiento para separar diastereómeros de un ácido borónico de la fórmula (I) que comprenda:

combinar en disolución de éter dietílico (A) una especie de boro seleccionada del ácido borónico (I) y sus ésteres, incluyendo la especie de boro moléculas que tienen un centro quiral C* de configuración (R) y moléculas que tienen centro quiral C* de configuración (S) y (B) dietanolamina, estando la dietanolamina de una cantidad de alrededor de equivalentes de 1,25 \pm 0,1 basados en la especie de boro en la que el centro quiral C* es de configuración (R), y mezclando para formar una mezcla;

ocasionar o permitir que la especie bórica y la dietanolamina reaccionen hasta que se forme un precipitado; y

recuperar el precipitado.

Cuando el material de partida es un éster, puede ser un éster del ácido borónico con un alcohol seleccionado del grupo que consta de alcoholes cuyos heteroátomos donantes de electrón de potencial único son oxígenos que, en el éster borónico, se correspondan con los oxígenos del grupo funcional éster.

En algunos procedimientos, la dietanolamina está en una cantidad que oscila de 1,2 a 1,3 equivalentes en base a la especie de boro en la cual el centro quiral C* sea de configuración (R).

Se incluyen procedimientos en los cuales la especie de borato es un éster del ácido borónico y un diol, en concreto un diol que no se encuentre entorpecido estéricamente. Como ejemplos de dioles se pueden mencionar el pinacol, el neopentilglicol, el 1,2-etanodiol, el 1,2-propanodiol, el 1,3-propanodiol, el 2,3-butanodiol, el 1,2-diisopropiletanodiol o el 5,6-decanodiol. Un diol en particular es el pinacol.

Las especies de boro y la dietanolamina pueden hacerse reaccionar mediante el calentamiento de la mezcla a una temperatura elevada, por ejemplo la mezcla se puede someter a reflujo, p.e. durante al menos 10 horas.

El precipitado puede recuperarse mediante filtración. El precipitado recuperado puede lavarse con éter dietílico. El precipitado recuperado, después del lavado si tal tiene lugar, puede disolverse en un disolvente seleccionado de entre CH_{2}Cl_{2} y CHCl_{3} y volverse a precipitar combinando la disolución resultante con éter dietílico. Un disolvente concreto es CH_{2}Cl_{2}.

El precipitado recuperado puede convertirse en el ácido de la fórmula (I), adecuadamente mediante hidrólisis, por ejemplo disolviendo el precipitado en un disolvente orgánico seleccionado de p.e., halohidrocarburos y combinaciones de los mismos, agitando la disolución resultante con un líquido acuoso, p.e., un ácido acuoso que tiene un pH por debajo de 3, por lo cual el precipitado disuelto se convierte en el ácido de la fórmula (I) y recuperando el ácido de la fórmula (I) mediante evaporación. El disolvente orgánico puede ser CH_{2}Cl_{2} o CHCl_{3}. Un disolvente particular es CH_{2}Cl_{2}. En algunos procedimientos, se evapora adicionalmente el disolvente orgánico a partir del ácido recuperado a partir de la fórmula (I).

También son útiles para la elaboración de productos de la invención procedimientos en los cuales se hidroliza un éster de un ácido borónico (I), particularmente un éster de dietanolamina en una manera la cual controla la escisión del enlace C-B. En particular, esto implica limitar el periodo de hidrólisis a la temperatura seleccionada. En el caso de hidrólisis del éster de dietanolamina, la hidrólisis adecuadamente se lleva a cabo a temperatura ambiente, o más baja, durante un periodo que no excede de aproximadamente 30 minutos, p.e., que no excede de aproximadamente 20 minutos y óptimamente de aproximadamente de 20 minutos.

Así el precipitado recuperado referido en el el último párrafo puede hidrolizarse utilizando un ácido acuoso, especialmente el ácido clorhídrico al 2% u otro ácido mineral de pH similar, durante no más de alrededor de 30 minutos y a temperatura ambiente, o inferior. Adecuadamente, el precipitado se disuelve en un disolvente orgánico no nucleofílico (p.e., un halohidrocarburo una mezcla de halohidrocarburo, por ejemplo, CH_{2}Cl_{2}) y la disolución resultante entra en contacto con el ácido acuoso durante un periodo como el descrito anteriormente. El precipitado se hidroliza este modo para formar el ácido libre de la fórmula (I), el cual permanece en el disolvente orgánico. El disolvente orgánico puede separarse del medio acuoso y posteriormente evaporarse para obtener un ácido sólido de la fórmula I.

En algunos procedimientos se seca un ácido de la fórmula (I), por ejemplo, uno obtenido de acuerdo con la descripción del párrafo precedente. En una clase de procedimientos, se seca el ácido de la fórmula (I) cuando se encuentra en el disolvente orgánico haciendo entrar en contacto al disolvente con un sólido higroscópico.

Se incluyen procedimientos en los cuales el ácido de la fórmula (I), cuando se encuentra en el disolvente orgánico, se lava con una sal de amonio acuosa.

\newpage

El ácido borónico purificado quiralmente puede convertirse en una sal de adición de base farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular disolviendo el ácido en acetonitrilo, combinando la disolución resultante con una disolución o suspensión de una base farmacéuticamente aceptable, y ocasionando o permitiendo reaccionar a la base y al ácido, posteriormente evaporando hasta sequedad para obtener un residuo de evaporación. La etapa de ocasionar o permitir reaccionar a la base y al ácido puede comprender agitar la combinación de la disolución de acetonitrilo del ácido y la disolución acuosa o suspensión de la base a una temperatura de no más de 35ºC y a menudo de no más de 30ºC, p.e., no más de 25ºC; una temperatura óptima es la temperatura ambiente, en cuyo caso resultaría apropiado un tiempo de reacción de alrededor de 2 horas. El procedimiento puede implicar también:

(i)

volver a disolver el residuo de evaporación en acetonitrilo y evaporar la disolución resultante hasta sequedad; y

(ii)

repetir la etapa (i) todas las veces que sea necesario para obtener un residuo de evaporación seco.

En algunos procesos, el residuo de evaporación seco se disuelve en acetonitrilo o tetrahidrofurano para formar una disolución, y esta se combina con (p.e., se añade lentamente a una velocidad lo suficientemente lenta como para evitar la formación de aglutinados) una mezcla v/v de 3:1 a 1:3 de éter dietílico y un disolvente alifático o cicloalifático para formar un precipitado, añadiéndose dicha disolución a la mezcla disolvente de éter dietílico/(ciclo) alifático en una razón (disolución:mezcla) de desde 1:5 hasta 1:15 v/v. El precipitado se recupera y algo o sustancialmente todo el disolvente restante se elimina del precipitado recuperado manteniéndose mientras la temperatura a no más de 35ºC, p.e., se elimina bajo presión reducida. Se incluyen procedimientos en los cuales la temperatura al comienzo del procedimiento de secado es de aproximadamente 10ºC y se incrementa durante el procedimiento a 35ºC. El disolvente alifático o cicloalifático puede tener 6, 7 u 8 átomos de carbono; el disolvente puede ser un alcano, por ejemplo, un n-alcano, p.e., n-heptano. Algunas reacciones pueden llevarse a cabo a temperatura ambiente, la cual puede ser por ejemplo
de entre 15 y 30ºC, p.e., de 20 a 30ºC; algunas veces la temperatura ambiente puede ser la temperatura de la sala.

Las sales producidas por la invención pueden contener una cantidad traza del disolvente alifático o cicloalifático, p.e. una cantidad de menos del 0,1%, particularmente menos del 0,01%, por ejemplo, una cantidad de alrededor del 0,005%.

En el procedimiento para crear la sal, la base puede contener un catión de valencia n y puede utilizarse en una estequiometría (ácido borónico:base) de aproximadamente n:1. En procedimientos concretos, la base es un metal alcalino o una base de metal alcalinotérreo, por ejemplo un hidróxido de metal alcalino o un hidróxido de metal terrestre alcalino. Como una base se puede mencionar el hidróxido de sodio. Como otra base se puede mencionar el hidróxido de calcio. La revelación incluye procedimientos en los que la base es hidróxido de sodio y el residuo seco de evaporación se disuelve en acetonitrilo. La revelación incluye procedimientos en los cuales la base es hidróxido de calcio y el residuo seco de evaporación se disuelve en tetrahidrofurano.

La revelación no se limita según el procedimiento mediante el cual se obtienen los ácidos borónicos de la Fórmula (I) (por ejemplo, como un éster de los mismos). No obstante, en una clase del asunto, el ácido de la Fórmula (I) tiene un grupo R^{1} de la fórmula -(CH_{2})_{s}-O-R^{3} en la que R^{3} es metilo o etilo y s es independientemente 2, 3 ó 4 y el ácido de la Fórmula (I) se prepara a través de un intermedio de la Fórmula (XXV):

(XXV),(HO)_{2}B-(CH_{2})_{s}-O-R^{3}

cuyo intermedio se crea mediante la reacción entre un éster de borato y un 1-metaloalcoxialcano adecuado.

Los intermedios de la Fórmula (XXV) pueden crearse haciendo reaccionar un 1-metaloalcoxialcano, donde el alcoxialcano es de la fórmula -(CH_{2})_{s}-O-R^{3}, con un éster de borato para formar un compuesto de la Fórmula (XXV).

Se apreciará que el procedimiento anterior proporciona un procedimiento general para crear ácidos alcoxialquilborónicos, los cuales pueden presentarse mediante la fórmula R^{Z}-O-R^{Y}-B(OH)_{2}. Tales ácidos alcoxialquilborónicos pueden convertirse en aminoboratos y los aminoboratos pueden derivatizarse en su grupo amino para formar un enlace de amida vinculado a otro resto. En otras palabras, los aminoboratos pueden convertirse en boropéptidos. El procedimiento se describirá ahora adicionalmente con referencia sin limitación a compuestos de la Fórmula (XXV).

Los materiales de partida para la reacción pueden ser un metaloalcoxialcano, p.e., un reactivo de Grignard, obtenible a partir de 1-haloalcoxialcano de la fórmula Hal-(CH_{2})_{s}-O-R^{3} (donde Hal es un halógeno) y un éster de borato. El metal es en particular magnesio. Otro metal es litio, en cuyo caso el reactivo metálico puede prepararse mediante la reacción del 1-haloalcoxialcano con butillitio. Cuando el procedimiento incluye la preparación del reactivo metálico a partir del haloalcoxialcano, el haloalcoxialcano puede ser un cloroalcoxialcano; también se pueden utilizar los compuestos de bromo correspondientes. Para crear un reactivo de Grignard, se puede hacer reaccionar el magnesio con el haloalcoxialcano.

Ésteres de borato adecuados son ésteres de alcoholes mono y bifuncionales (p.e., de EtOH, MeOH, BuOH, pinacol, glicol, pinanodiol, etc.). Por ejemplo, el éster puede ser de la fórmula B(OR^{a})(OR^{b})(OR^{c}) donde R^{a}, R^{b} y R^{c} son alquilo C_{1}-C_{4} y pueden ser el mismo que cada uno de los otros.

Un procedimiento de ejemplo para realizar una Fórmula (XXV) intermedia, ilustrada con referencia al metoxipropano como la especie de alcoxialcano, es:

\vskip1.000000\baselineskip

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\vskip1.000000\baselineskip

Las reacciones se llevan a cabo adecuadamente en un disolvente orgánico, p.e., THF.

El procedimiento descrito anteriormente para crear ácidos alcoxialquilborónicos evita la generación de la Impureza IV (véase más arriba) o sus análogos en aquellos casos en los que el producto final no es el TRI 50c o un derivado del mismo (sal, éster, etc.). El procedimiento por tanto proporciona una vía exclusiva para crear el TRI 50c, sus ésteres y sales, no contaminados por la Impureza IV, y para crear otros ácidos aminoborónicos los cuales se sustituyen en \alpha- para el boro mediante un grupo alcoxialquilo y están incontaminados por impurezas análogas a la Impureza IV.

Un ácido alcoxialquilborónico, es decir un compuesto el cual puede representarse mediante la fórmula R^{Z}-O-R^{Y}-B(OH)_{2}, puede convertirse en un compuesto aminoborónico, por ejemplo, un boropéptido, mediante cualquier procedimiento adecuado, p.e., uno conocido en la técnica. Se ilustra un esquema de reacción para fabricar ácidos alcoxialquilborónicos en aminoboratos y para convertir los aminoboratos en boratos peptídicos con referencia a la síntesis del TRI 50c al inicio de los ejemplos de la presente memoria descriptiva. El esquema de reacción puede modificarse según se desee, p.e.: se puede omitir la precipitación de dietanolamina y las etapas subsiguientes y/o se pueden realizar sustituciones de reactivo. Por ejemplo, se puede sustituir el pinacol por otro diol. La LDA es una base fuerte no nucleofílica y puede reemplazarse por otra base tal. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, diisopropilamida de litio, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina de litio, 4-metilpiperazida de 1-litio, piperazida de 1,4-dilitio, bis(trimetilsilil)amida de litio, bis(trimetilsilil)amida de sodio, bis(trimetilsilil)amida de potasio, cloruro de isopropilmagnesio, cloruro de fenilmagnesio, dietilamida de litio y terc-butóxido de potasio. Las reacciones pueden llevarse a cabo en cualquier disolvente adecuado: donde n-heptano se utiliza en los Ejemplos, se puede reemplazar por otro disolvente inerte no polar, p.e. otro disolvente alifático o cicloalifático, por ejemplo, un alcano, p.e., un n-alcano.

Por tanto, la revelación incluye un procedimiento para crear un aminoborato de la Fórmula (XXI)

(XXI)H_{2}N ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{R ^{Y} }{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R ^{Z} }}}}}}

(R^{X}) --- B(OH)_{2}

en el que

R^{X} es H;

R^{Y} es alquileno;

R^{Z} es alquilo; y

R^{Y}-O-R^{Z} es un grupo R^{9} de la fórmula (I), p.e., un grupo R^{1} de la fórmula (II),

el procedimiento que implica la reacción de un 1-metaloalcoxialcano con un éster de borato para formar un ácido borónico de la fórmula R^{Z}-O-R^{Y}-B(OH)_{2}, esterificando el ácido, poniendo en contacto el ácido esterificado con CH_{2}Cl_{2} y ZnCl_{2} en presencia de una base fuerte, poniendo en contacto el resultante producido con LiHMDS y poniendo en contacto a su vez el producto resultante con cloruro de hidrógeno.

El producto está libre de contaminante de la fórmula (XXII):

(XXII)H_{2}N-C(R^{X})(R^{Y})-B(OH)_{2}

\newpage

El aminoborato (XXI) se puede hacer reaccionar con un dipéptido protegido opcionalmente correspondiente al resto YCO- de la fórmula (I) para formar un borato peptídico de la fórmula (I). En términos generales, por tanto, la revelación incluye ácidos peptidoborónicos de la Fórmula (XXIII):

(XXIII)Q --- CO ---

\delm{N}{H}

---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{R ^{Y} }{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R ^{Z} }}}}}}

(R^{X}) --- B(OH)_{2}

en los que

Q-CO es Y-CO; y

R^{X}, R^{Y} y R^{Z} son como se define con referencia a la fórmula (XXI),

en la que el ácido organoborónico está libre de una impureza de Fórmula (XXIV):

(XXIV)Q --- CO ---

\delm{N}{H}

---

\delm{C}{\delm{\para}{R ^{Y} }}

(R^{X}) --- B(OH)_{2}

La revelación además incluye adicionalmente derivados de los ácidos de la Fórmula (XXIII) (p.e., sales de ácido o adición de base, ésteres) los cuales están libres de la impureza de la Fórmula (XXIV) y derivados de la misma.

La identidad exacta de R^{Y} y R^{Z} depende de la identidad del producto final, y no de parte del procedimiento o sus beneficios.

Se apreciará de lo anterior que los procedimientos descritos anteriormente pueden utilizarse en la elaboración de sales de ácidos organoborónicos como los descritos. No es necesario para pasos secuenciales llevarse a cabo como una operación o en el mismo emplazamiento: pueden realizarse de esta forma o se pueden distribuir procedimientos diferentes (diferentes partes de la síntesis global) en el tiempo y/o en el espacio. Sales de producto final concretas son sales de monosodio, monolitio, hemicalcio y hemimagnesio, por ejemplo del TRI 50c.

Generalmente, las reacciones pueden llevarse a cabo adecuadamente con un disolvente no nucleofílico. Donde se encuentra presente un disolvente nucleofílico, se prefiere un contacto mínimo, por ejemplo, en el caso de hidrólisis de ésteres de dietanolamina.

Los productos de alta pureza

Los "productos de alta pureza" útiles en los productos y usos de la invención incluyen sales obtenibles mediante (que tienen las características de un producto obtenido mediante) los procedimientos revelados.

Son particularmente útiles en los productos y usos de los productos de la invención las sales de adición de base de un ácido borónico de la fórmula (I) que tienen la pureza quiral de tal sal cuando se prepara mediante un procedimiento descrito en el presente documento. También son útiles las sales de adición de base de un ácido borónico de la fórmula (I) que tienen la pureza de tal sal cuando se prepara mediante un procedimiento descrito en el presente documento.

Las identidades de tales sales serán patentes a partir de la descripción precedente y los siguientes ejemplos. Además, los productos de la revelación se describen en las reivindicaciones. Hay que señalar especialmente los datos del Ejemplo 43, que indican que los procedimientos de la invención pueden alcanzar notablemente sales de producto final libres de impurezas detectables mediante HPLC. En otros ejemplos, las sales están sustancialmente libres de impurezas, p.e., al menos un 98% puras, más habitualmente un 99% puras, p.e., al menos un 99,5% puras en términos de área de pico de porcentaje de HPLC de fase reversa (RP). Las sales pueden ser al menos un 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% puras en términos de área de pico de porcentaje de HPLC de fase reversa (RP). Los procedimientos de HPLC de RP adecuados cumplen con la referencia 1 y/o la referencia 2 y/o la referencia 3 del Ejemplo 43. También se incluyen productos al menos sustancialmente libres de la Impureza I y sus análogos, productos libres de la Impureza IV y sus análogos y productos que contienen pequeñas trazas de disolvente no polar, p.e., n-heptano. La cantidad de traza de disolvente no polar puede ser menos de 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,01% o 0,005%, según determine la cromatografía de GC-cámara de aire.

También se incluyen las sales que contienen menos de 410 ppm de acetonitrilo.

Algunas sales contienen impurezas de menos de 10.000 ppm, 5.000 ppm, 1.000 ppm o 500 ppm.

Uso de los productos de la revelación

Las sales de la revelación son inhibidores de trombina. Por tanto, son útiles para la inhibición de la trombina. Hay por lo tanto compuestos suministrados los cuales tienen potencial para controlar la hemostasis y especialmente para inhibir coagulación, por ejemplo en el tratamiento o prevención de efectos secundarios tras infarto de miocardio. El uso médico de los compuestos puede ser profiláctico (incluyendo tratar trombosis así como prevenir la aparición de la misma), así como terapéutico (incluyendo la prevención de la reaparición de la trombosis o eventos trombóticos secundarios).

Las sales pueden utilizarse cuando se necesita un agente anti-trombogénico. Adicionalmente, se ha descubierto que las sales, incluyendo las de los ácidos borónicos de Fórmula (III), son beneficiosas por el hecho de que la clase es útil para tratar la trombosis arterial mediante terapia o profilaxis. Las sales reveladas están, por tanto, indicadas para el tratamiento o profilaxis de la trombosis y la hipercoagulabilidad de la sangre y los tejidos animales, incluido el ser humano. El término "trombosis" incluye, entre otras, trombosis atrófica, trombosis arterial, trombosis cardiaca, trombosis coronaria, trombosis progresiva, trombosis infecciosa, trombosis mesentérica, trombosis placentaria, trombosis propagada, trombosis traumática y trombosis venosa.

Se sabe que la hipercoagulabilidad puede llevar a enfermedades tromboembólicas.

Algunos ejemplos de tromboembolismo venoso los cuales pueden tratarse o prevenirse con compuestos de la revelación incluyen la obstrucción de una vena, la obstrucción de una arteria pulmonar (embolismo pulmonar), la trombosis venosa profunda, la trombosis asociada con cáncer y quimioterapia del cáncer, la trombosis heredada con enfermedades trombofílicas tales como deficiencia de la proteína C, deficiencia de la proteína S, deficiencia de la antitrombina III y Factor V de Leiden y trombosis resultante de desórdenes trombofílicos adquiridos tales como lupus sistémico eritematoso (enfermedad inflamatoria de tejidos conjuntivos). En lo que respecta también a la tromboembolia venosa, los compuestos de la revelación son útiles para mantener la patente de catéteres permanentes.

Ejemplos de tromboembolismo cardiogénico el cual puede tratarse o prevenirse con compuestos de la revelación incluyen ataque tromboembólico (trombo desprendido que causa aflicción neurológica relacionada con un suministro sanguíneo cerebral reducido), tromboembolismo cardiogénico asociado con fibrilación atrial (contracción rápida, irregular de fibrillas musculares de la cámara superior del corazón), tromboembolismo cardiogénico asociado con válvulas cardiacas protésicas tales como válvulas cardiacas mecánicas, y tromboembolia cardiogénica asociada con enfermedad cardiaca.

Ejemplos de afecciones que implican trombosis arterial incluyen angina inestable (dolor constrictivo agudo en el pecho de origen coronario), infarto de miocardio (muerte de la célula del músculo cardiaco como resultado de un suministro sanguíneo insuficiente), enfermedad cardiaca isquémica (isquemia local debido a la obstrucción (por ejemplo por estrechamiento arterial) del suministro sanguíneo), reoclusión durante o tras angioplastia coronaria transluminal percutánea, restenosis tras angioplastial coronaria transluminal percutánea, oclusión de injertos de derivación arterial coronario y enfermedad cerebrovascular oclusiva. También con respecto a la trombosis arterio-venosa (mixta), resultan útiles compuestos anti-trombóticos de la revelación para mantener la permeabilidad en anastomosis arterio-venosas.

Otras condiciones asociadas con la hipercoagulabilidad y las enfermedades tromboembólicas que pueden mencionarse son deficiencias heredadas o adquiridas en el cofactor II de heparina, anticuerpos antifosfolípidos circulantes (anticoagulante Lupus), homocisteinemia, trombocitopenia inducida por heparina y defectos en fibrinólisis.

Algunos usos particulares los cuales pueden mencionarse incluyen el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de trombosis venosa y embolismo pulmonar. Indicaciones preferidas previstas para los productos de la revelación (notablemente las sales del TRI 50c) incluyen:

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Prevención de efectos tromboembólicos venosos (p.e., trombosis venosa profunda y/o embolismo pulmonar). Algunos ejemplos incluyen pacientes sometidos a cirugía ortopédica tale como reemplazo total de cadera, reemplazo total de rodilla, cirugía mayor de cadera o rodilla; pacientes sometidos a cirugía general con alto riesgo de trombosis, tal como cirugía abdominal o pélvica para el cáncer; y en pacientes que deban permanecer en cama durante más de tres días y con fallo cardiaco agudo, fallo respiratorio agudo, infección.

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Prevención de trombosis en el circuito de hemodiálisis en pacientes, en pacientes con enfermedad renal en fase terminal.

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Prevención de eventos cardiovasculares (muerte, infarto de miocardio, etc.) en pacientes con enfermedad final en fase terminal, tanto si requieren sesiones de hemodiálisis como si no.

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Prevención de eventos venosos tromboembólicos en pacientes que reciben quimioterapia a través de un catéter permanente.

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Prevención de eventos tromboembólicos en pacientes sometidos a procedimientos de reconstrucción arterial de miembros inferiores (derivación, endarteriectomía, angioplastia transluminal, etc.).

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Tratamiento de eventos venosos tromboembólicos.

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Prevención de eventos cardiovasculares en síndromes coronarios agudos (p.e., angina inestable, isquemia miocardial de ola no Q/infarto), en combinación con otro agente cardiovascular, por ejemplo, aspirina (ácido acetilsalicílico; aspirina es una marca registrada en Alemania), trombolíticos (véanse ejemplos más adelante), agentes antiplaquetas (véanse ejemplos más adelante).

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Tratamiento de pacientes con infarto de miocardio agudo en combinación con ácido acetilsalicílico, trombolíticos (véanse ejemplos más adelante).

Los inhibidores de trombina de la revelación están así indicados tanto en el tratamiento terapéutico como en el profiláctico de todos los desórdenes anteriormente mencionados.

En un procedimiento, los productos de la revelación se utilizan para el tratamiento de pacientes mediante hemodiálisis, proporcionando el producto en la disolución de diálisis, tal como se describe en relación con otros inhibidores de trombina en el documento WO 00/41715. La revelación, por tanto, incluye disoluciones de diálisis y concentrados de diálisis los cuales comprenden un producto de la revelación, así como un procedimiento de tratamiento por diálisis de un paciente en necesidad de tal tratamiento, el cual contiene el uso de una disolución para diálisis que incluye un inhibidor de trombina de bajo peso molecular. También se incluye el uso de un producto antitrombótico de la revelación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento mediante diálisis de un paciente en el que el producto antitrombótico de la revelación se suministra en la disolución de diálisis.

En otro procedimiento, los productos de la revelación se utilizan para combatir la proliferación no deseada de células, como se describe en relación con otros inhibidores de trombina en la WO 01/41796. La proliferación indeseable de células es normalmente la proliferación no deseada de células hiperplásticas, por ejemplo, la proliferación de células musculares lisas, especialmente células musculares lisas vasculares. Los productos de la revelación encuentran aplicación particularmente en el tratamiento de la hiperplasia íntima, un componente de la cual es la proliferación de células musculares lisas. La restenosis puede considerarse como debida a la hiperplasia neoíntima; de acuerdo con ello la hiperplasia íntima en el contexto de la revelación incluye la restenosis.

Los productos de la revelación también se contemplan para el tratamiento de desórdenes isquémicos. Más particularmente, pueden utilizarse en el tratamiento (tanto terapéutico como profiláctico) de un desorden isquémico en un paciente que tenga, o en riesgo de, padecer fibrilación atrial no valvular (FANV), tal y como se describe en relación con otros inhibidores de trombina en el documento WO 02/36157. Los trastornos isquémicos son afecciones cuyos resultados incluyen una restricción del flujo sanguíneo a una parte del cuerpo. El término se entenderá para incluir trombosis e hipercoagulabilidad en sangre, tejidos y/o órganos. Usos particulares que pueden mencionarse incluyen la prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiacas isquémicas, infarto de miocardio, eventos embólicos sistémicos en, p.e., los riñones o el bazo y, más particularmente de isquemia cerebral, incluyendo la trombosis cerebral, el embolismo cerebral y/o la isquemia cerebral asociada con trombosis o embolismo no cerebral (en otras palabras, el tratamiento (tanto terapéutico como profiláctico) de apoplejía trombótica o isquémica y de ataque isquémico transitorio), particularmente en pacientes con, o en riesgo de, FANV.

Los productos de la revelación también se contemplan para el tratamiento de desórdenes reumáticos/artríticos, como se describe en relación con otros inhibidores de trombina en el documento WO 03/007984. Así, los productos de la revelación pueden utilizarse en el tratamiento de artritis crónica, artritis reumatoide, osteoartritis o espondilitis anquilosante.

Además, los productos de la revelación se espera que tengan utilidad en la profilaxis de reoclusión (es decir trombosis) tras trombolisis, angioplastia transluminal percutánea (PTA) y operaciones de derivación coronaria; la prevención de la retrombosis tras microcirugía y cirugía vascular en general. Indicaciones adicionales incluyen el tratamiento terapéutico y/o el tratamiento profiláctico de coagulación intravascular diseminada causada por bacterias, traumas múltiples, intoxicación o por cualquier otro mecanismo; tratamiento anticoagulante cuando la sangre se encuentra en contacto con superficies extrañas en el cuerpo tales como injertos vasculares, espirales vasculares, catéteres vasculares, válvulas protésicas mecánicas y biológicas u otro dispositivo médico; y tratamiento anticoagulante cuando la sangre está en contacto con dispositivos médicos fuera del cuerpo en situaciones tales como cirugía cardiovascular utilizando una máquina de corazón-pulmón o en la hemodiálisis.

Los productos de la revelación también están indicados para el tratamiento de condiciones en las que hay un exceso indeseable de trombina sin signos de hipercoagulabilidad, por ejemplo en enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer. Además de sus efectos sobre el procedimiento de coagulación, la trombina se conoce por activar un gran número de células (tales como neutrófilos, fibroblastos, células endoteliales y células musculares lisas). Por tanto, los compuestos de la revelación también pueden ser útiles para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de síndrome de insuficiencia respiratoria idiopática y del adulto, fibrosis pulmonar tras tratamiento con radiación o quimioterapia, choque séptico, septicemia, respuestas inflamatorias, las cuales incluyen, pero no se limitan a, edema, arteriosclerosis aguda o crónica, tal como enfermedad arterial coronaria, enfermedad arterial cerebral, enfermedad arterial periférica, daño por reperfusión y restenosis tras angioplastia transluminal percutánea (PTA).

Las sales también pueden ser útiles para el tratamiento de la pancreatitis.

Las sales descritas en el presente documento también se consideran útiles para inhibir la actividad procoagulante de las plaquetas. La revelación proporciona un procedimiento para inhibir la actividad procoagulante de las plaquetas administrando una sal de un ácido borónico descrito en el presente documento a un mamífero con riesgo de padecer o que padece trombosis arterial, especialmente un paciente humano. También se proporciona el uso de tales sales para la fabricación de medicamentos para la inhibición de la actividad procoagulante de las plaquetas.

El uso de productos de la revelación como inhibidores de la actividad procoagulante de las plaquetas se basa en la observación de los ácidos borónicos descritos en el presente documento que están indicados para ser eficaces en inhibición de trombosis arterial así como de trombosis venosa.

Entre las indicaciones que implican trombosis arterial se incluyen los síndromes coronarios agudos (especialmente el infarto de miocardio y la angina inestable), la trombosis cerebrovascular y la oclusión arterial periférica y la trombosis arterial que se produce como resultado de la fibrilación atrial, la enfermedad cardiaca valvular, anastomosis arterio-venosas, catéteres permanentes o prótesis intravasculares coronarias. De acuerdo con ello, en otro aspecto se proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada de este grupo de indicaciones, que comprende administrar a un mamífero, especialmente a un paciente humano, una sal de la revelación. La revelación incluye productos para usar en un ambiente arterial, p.e., una prótesis intravascular u otro implante arterial, que tenga un recubrimiento que incluya una sal correspondiente a la revelación.

Las sales de la revelación pueden utilizarse profilácticamente para tratar a un individuo que se crea que está en riesgo de sufrir de trombosis arterial o de una afección o enfermedad que implique trombosis arterial o terapéuticamente (incluido para prevenir la recurrencia de trombosis o efectos trombóticos secundarios).

Por tanto se incluye el uso de inhibidores de trombina seleccionados (sales ácidas organoborónicas) descritos en el presente documento para el tratamiento de los trastornos anteriores mediante profilaxis o terapia, así como su uso en formulaciones farmacéuticas y en la elaboración de formulaciones farmacéuticas.

Administración y formulaciones farmacéuticas

Las sales pueden administrarse a un huésped sano, por ejemplo, en el caso en que el fármaco tenga actividad antitrombogénica, para obtener un efecto antitrombogénico. En el caso de animales más grandes, tales como humanos, los compuestos pueden administrarse solos o en combinación con diluyentes farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" incluye la aceptabilidad tanto para propósitos humanos como veterinarios, cuya aceptabilidad para uso farmacéutico en humanos se prefiere.

Las sales de la revelación pueden combinarse y/o coadministrarse con cualquier agente de tratamiento cardiovascular. Existen grandes cifras de agentes de tratamiento cardiovascular disponibles en el uso comercial, en la evaluación clínica y en el desarrollo preclínico, los cuales podrían seleccionarse para su uso con un producto de la revelación para la prevención de trastornos cardiovasculares mediante terapia combinada de fármacos. Dicho agente puede ser uno o más agentes seleccionados de entre, pereo no limitados a, varias categorías principales, a saber, un fármaco de reducción de lípidos, incluyendo un inhibidor IBAT (cotransportador de ácido ileal Na^{+}/bílico), un fibrato, niacina, una estatina, un inhibidor CETP (proteína de transferencia de éster colesterilo) y un secuestrante de ácido bíliar, un antioxidante, incluida la vitamina E y el probucol, un antagonista IIb/IIIa (p.e., abciximab, eptifibatida, tirofibán), un inhibidor de aldosterona (p.e. espirolactona y epoximexrenona), un antagonista de receptor de adenosina A2 (p.e. losartán), un agonista de receptor de adenosina A3, un betabloqueante, ácido acetilsalicílico, un diurético de bucle y un inhibidor ACE (enzima convertidora de angiotensina).

Las sales de la revelación pueden combinarse y/o coadministrarse con cualquier agente antitrombótico con un mecanismo de acción diferente, tales como agentes antiplaquetas, ácido acetilsalicílico, ticlopidina, clopidogrel, receptor de tromboxano y/o inhibidores de sintetasa, prostaciclina-miméticos e inhibidores de fosfodiesterasa y antagonistas del receptor ADP (P_{2} T).

Los productos de la revelación pueden también combinarse y/o coadministrarse con trombolíticos tales como activador de plasminógeno de tejido (natural, recombinante o modificado), estreptokinasa, urokinasa, prurokinasa, complejo activador de estreptokinasa de plasminógeno anisoilado (APSAC), activadores de plasminógeno de las glándulas salivares animales, y similares, para el tratamiento de enfermedades trombóticas, en particular el infarto de miocardio.

Las sales de la revelación pueden combinarse y/o administrarse conjuntamente con un cardioprotector, por ejemplo, un agonista receptor de adenosina A1 o A3.

También se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad inflamatoria en un paciente que comprende tratar del paciente con un producto de la revelación y un NSAID, p.e., un inhibidor de COX-2. Tales enfermedades incluyen pero no se limitan a nefritis, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, glomerulonefritis, vasculitis y sarcoidosis. De acuerdo con ello, las sales antitrombóticas de la revelación pueden combinarse y/o coadministrarse con un NSAID.

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Típicamente, por tanto, las sales descritas en el presente documento pueden administrarse a un huésped para obtener un efecto de inhibidor de trombina, o en cualquier otro contexto de inhibición de trombina o antitrombótico mencionado en el presente documento.

Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente revelación pueden variarse tal como para obtener una cantidad del/de los compuesto(s) activo(s) que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular (referida en el presente documento como "cantidad terapéutica eficaz"). El nivel de dosificación seleccionado dependerá de la actividad del compuesto particular, la gravedad de la afección que se trata y la afección e historial médico previos del paciente que se trata. No obstante, está dentro del estado del arte comenzar las dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para alcanzar el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se alcance el efecto deseado.

De acuerdo con un aspecto adicional se proporciona una formulación parenteral que incluye una sal como se describe en el presente documento. La formulación puede constar de la sal sola o puede contener componentes adicionales, en particular la sal puede estar en combinación con un diluyente, excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un agente de tonicidad con el propósito de crear una formulación sustancialmente isotónica con el cuerpo del sujeto que va a recibir la formulación, p.e., con plasma humano. La formulación puede estar en forma lista para ser utilizada o en una forma que requiera la reconstitución antes de la administración.

En la actualidad se contempla que, en caso de administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, de las sales del TRI 50c, las sales deben por ejemplo administrarse en una cantidad desde 0,5 a 2,5 mg/kg p.e. durante un periodo máximo de 72 horas, calculadas como TRI 50c. Otras sales pueden administrarse en cantidades molares equivalentes. La revelación no se limita a la administración en tales cantidades o regímenes e incluye dosificaciones y regímenes fuera de aquellos descritos en la oración anterior.

Las preparaciones parenterales pueden administrarse mediante una o más vías, tales como vía intravenosa, subcutánea, intradermal e infusión; un ejemplo particular es la vía intravenosa. Una formulación revelada en el presente documento puede administrarse utilizando una jeringa, inyector, émbolo para formulaciones sólidas, bomba o cualquier otro dispositivo reconocido en la técnica para administración parenteral.

Las formas de dosificación líquida para administración parenteral pueden incluir disoluciones, suspensiones, formulaciones de liposomas o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener otros compuestos. Los agentes de tonicidad (para el propósito de crear formulaciones sustancialmente isotónicas con el cuerpo del sujeto, p.e., con plasma humano) tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, sulfato de sodio, dextrosa, manitol y/o glicerol pueden añadirse opcionalmente a la formulación parenteral. Se puede añadir un tampón farmacéuticamente aceptable para controlar pH. Pueden añadirse opcionalmente a la formulación parenteral los agentes de espesado o viscosidad, por ejemplo, los derivados de celulosa bien conocidos (p.e., metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa), gelatina y/o goma arábiga.

Las formas de dosificación sólida para administración parenteral pueden abarcar formas sólidas y semisólidas y pueden incluir pellas, polvos, gránulos, parches y geles. En tales formas de dosificación sólida, el compuesto activo se mezcla normalmente con al menos un excipiente o diluente inerte, farmacéuticamente aceptable. Las sales reveladas pueden presentarse como sólidos en forma sólida finamente dividida, por ejemplo pueden ser molidas o micronizadas.

Las formulaciones también pueden incluir antioxidantes y/o conservantes. Como antioxidantes se pueden mencionar los derivados de tiol (p.e., tioglicerol, cisteína, acetilcisteína, cistina, ditioeritreitol, ditiotreitol, glutatión), tocoferoles, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, sales de ácido de azufre (p.e., sulfato de sodio, bisulfito de sodio, bisulfito acetona de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, sulfoxilato de formaldehído de sodio, tiosulfato de sodio) y ácido nordihidroguaiaretico. Algunos conservantes adecuados pueden ser por ejemplo fenol, clorobutanol, alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de benzalkonio y cloruro de cetilpiridinio.

Las formulaciones parenterales pueden prepararse como parenterales de gran volumen (LVPs), p.e. mayores que 100 ml, más particularmente alrededor de 250 ml, de una formulación líquida del compuesto activo. Ejemplos de LVPs son bolsas de infusión. Las formulaciones parenterales pueden prepararse alternativamente como parenterales de pequeño volumen (SVPs), p.e., de alrededor de 100 ml o menos de una formulación líquida del compuesto activo. Algunos ejemplos de SVPs son viales con disolución, viales para reconstitución, jeringas prellenadas para inyección y dispositivos de jeringas de doble cámara.

Las formulaciones de la revelación incluyen aquellas en las cuales la sal es una sal de metal alcalino, por ejemplo una sal de litio, sodio o potasio, de entre las cuales se pueden mencionar como sales particulares las sales de sodio. Otra clase de formulaciones contiene sales de aminoazúcares de los ácidos borónicos revelados, por ejemplo, sales de N-metil-D-glucamina. Las sales mencionadas en este párrafo pueden administrarse como disoluciones en agua, que contienen normalmente uno o más aditivos, por ejemplo, agente(s) de isotonicidad y/o antioxidante(s). Una forma adecuada de almacenar las sales es en forma sólida, por ejemplo, como polvo seco, y prepararlas en disoluciones para su administración antes de la administración.

Una clase de formulaciones reveladas en el presente documento son las formulaciones intravenosas. Para formulaciones administradas intravenosamente, el compuesto o compuestos activos pueden estar presentes en concentraciones variables, con un vehículo aceptable para preparaciones parenterales que conforman el resto. Particularmente, el diluente es agua, particularmente, agua libre de pirógeno, o es de base acuosa. Particularmente, el diluente para tales preparaciones parenterales en una disolución acuosa que contiene un agente de tonicidad, por ejemplo, una disolución de cloruro de sodio.

Por "de base acuosa" se quiere decir que la formulación comprende un disolvente el cual consta de agua o de disolvente o disolventes orgánicos de agua o miscibles en agua; igual que contiene una sal de la revelación en forma disuelta, el disolvente puede tener disueltas en él una o más sustancias diferentes, por ejemplo, un antioxidante y/o un agente de isotonicidad. Como codisolventes orgánicos podemos mencionar aquellos disolventes miscibles en agua utilizados comúnmente en la técnica, por ejemplo propileneglicol, polietileneglicol 300, polietileneglicol 400 y etanol. Preferentemente, solo se utilizan los codisolventes orgánicos en casos donde el agente activo no es lo suficientemente soluble en agua para proporcionar una cantidad terapéuticamente aceptable en una forma de dosificación simple. Como se indica previamente, la revelación incluye formulaciones de sales de metal alcalino de los ácidos borónicos revelados, p.e. TRI 50c, que tienen un disolvente el cual consta de agua.

La solubilidad del compuesto activo en las presentes formulaciones puede ser tal que la turbidez de la formulación sea inferior a 50 NTU, p.e. inferior a 20 NTU tal como por ejemplo inferior a 10 NTU.

Es deseable que las formulaciones parenterales se administren a pH fisiológico o cercano. Se considera que la administración en una formulación a un pH alto (es decir, superior a 8) o a un pH bajo (p.e., menos de 5) no es deseable. En particular, se contempla que las formulaciones se administren a un pH de entre 6.0 y 7.0, como por ejemplo a un pH de 6,5.

La formulación parenteral puede purgarse de aire mientras se embala. La formulación parenteral puede embalarse en un contenedor estéril, p.e., vial, como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo. Tales formulaciones pueden almacenarse en forma de lista para ser utilizada o en una forma que requiera la reconstitución antes de la administración.

Las formulaciones parenterales de acuerdo con la revelación pueden embalarse en contenedores. Se pueden elegir contenedores los cuales están hechos de material el cual es no reactivo o sustancialmente no reactivo con la formulación parenteral. Se pueden utilizar contenedores de vidrio o plástico, p.e. bolsas de infusión de plástico. Una preocupación de los sistemas de contenedor es la protección que permiten para una disolución contra la degradación por UV. Si se desea, se puede utilizar vidrio ámbar que utiliza óxido de hierro o una cubierta opaca colocada sobre el contenedor para obtener la protección contra los UV adecuada.

Los contenedores de plástico tales como bolsas de infusión de plástico son ventajosas en que son de peso relativamente ligero y son irrompibles y por tanto más fáciles de almacenar. Este es concretamente el caso de parenterales de Gran Volumen.

Las preparaciones intravenosas pueden prepararse mediante la combinación del componente o componentes activos con el transportador. Después de que se mezcle la formulación, puede esterilizarse, por ejemplo, utilizando procedimientos conocidos. Una vez que la formulación ha sido esterilizada, está lista para ser administrada o embalada, especialmente en un embalaje oscuro (p.e., embalaje en botellas o plásticos), para su almacenamiento. Se prevé, no obstante, que las sales reveladas podrían no almacenarse en disolución, sino como sólidos secos, especialmente una forma dividida finamente tal como, por ejemplo, un liofilizado, para prolongar su vida útil; esto se aplicaría por supuesto a otras formulaciones parenterales, no sólo a las intravenosas.

Las preparaciones intravenosas pueden adoptar la forma de parenterales de gran volumen o de parenterales de pequeño volumen, como se describe anteriormente.

En una realización específica, la presente revelación se dirige a productos, particularlmente kits, para producir una unidad de administración de dosis única. Los productos (kits) pueden contener tanto un primer contenedor que tiene el compuesto activo (opcionalmente combinado con aditivos, por ejemplo antioxidantes, conservantes y, en algunos ejemplos, agente de tonicidad) como un segundo contenedor con el transportador/diluyente (por ejemplo agua, conteniendo opcionalmente uno o más aditivos, por ejemplo, agente de tonicidad). Como ejemplos de tales productos podemos mencionar jeringas prellenadas simples y de múltiples cámaras (p.e., de cámara dual); jeringas prellenadas ejemplares son obtenibles de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania. Tales jeringas de cámara dual o jeringas binarias tendrán en una cámara una preparación seca que incluya o consista en el compuesto activo y en la otra cámara un diluente o diluyente adecuado tal como se describen en el presente documento. Las dos cámaras se juntan de tal manera que la mezcla de sólido y líquido forma la disolución definitiva.

Una clase de formulaciones reveladas en el presente documento incluye formulaciones subcutáneas o intradérmicas (por ejemplo, formulaciones para inyección) en las cuales la sal activa (o la combinación de agente activo) se formula en una preparación parenteral que puede inyectarse subcutáneamente o intradérmicamente. La formulación para administración incluirá la sal activa y un transportador líquido.

El transportador utilizado en una preparación parenteral que se inyectará subcutáneamente o intradérmicamente puede ser un transportador acuoso (por ejemplo, agua, conteniendo normalmente un aditivo p.e. un antioxidante y/o un agente de isotonicidad) o un diluente no acuoso (de nuevo se pueden incluir uno o más aditivos). Como un transportador no acuoso para tales preparaciones parenterales podemos mencionar el aceite de oliva altamente purificado.

El compuesto activo y el transportador se combinan típicamente por ejemplo, en una mezcladora. Después de que se mezcla la formulación, preferiblemente se esteriliza, tal como con radiación U.V. Una vez que la formulación ha sido esterilizada, ésta está lista para ser inyectada o embalada para su almacenaje. Se prevé, no obstante, que las sales reveladas no se almacenarán en formulación líquida, sino en sólidos secos para prolongar su vida útil.

Para efectuar implantes subcutáneos, la sal activa se puede formular adecuadamente junto con uno o más polímeros que se erosionan o degradan gradualmente cuando se utilizan, p.e., polímeros de silicota, vinilacetato de etileno, polietileno o polipropileno.

Las formulaciones transdérmicas pueden prepararse en forma de matrices o membranas, o como fluidos o formulaciones viscosas en aceite o hidrogeles o como una pella de polvo comprimido. Para los parches transdérmicos, se puede incluir un adhesivo el cual es compatible con la piel, tal como poliacrilato, un adhesivo de silicona o poliisobutileno, así como una lámina hecha de, p.e., polietileno, polipropileno, vinilacetato de etileno, polivinilcloruro, cloruro de polivinilideno o poliéster y una lámina protectora hecha de, p.e., poliéster o papel recubierto con silicona o un fluoropolímero. Para la preparación de disoluciones transdérmicas o geles, se puede utilizar agua o disolventes orgánicos o mezclas de los mismos. Los geles transdérmicos pueden además contener uno o más agentes de gelificación o espesantes adecuados tales como silicona, tragacanto, almidón o derivados de almidón, celulosa o derivados de celulosa o ácidos poliacrílicos o derivados de los mismos. Las formulaciones transdérmicas pueden contener adecuadamente una o más sustancias que mejoren la absorción a través de la piel, tales como sales bíliares o derivados de las mismas y/o fosfolípidos. Las formulaciones transdérmicas pueden prepararse de acuerdo con un procedimiento revelado en, p.e., B W Barry, "Dermatological Formulations, Percutaneous Absorption", Marcel Dekker Inc., New York-Basel, 1983, o Y W Chien, "Transdermal Controlled Systemic Medications", Marcel Dekker Inc., New York-Basel, 1987.

Se entenderá de lo anterior que se han proporcionado productos farmacéuticos que incluyen una sal de metal alcalino, particularmente una sal de sodio, de un ácido borónico de la Fórmula (I) en forma de partículas secas finas, adecuada para la reconstitución en una formulación parenteral lista para ser utilizada acuosa. La sal de metal alcalino es adecuadamente una sal ácida. La sal de metal alcalino puede estar en una forma de dosificación de unidad parenteral de pequeño volumen. La sal de metal alcalino puede presentarse en una forma, p.e., en forma de polvo seco, adecuada para reconstituir como una parenteral de gran volumen. Un ejemplo es una sal de sodio de un ácido borónico de la Fórmula (I), especialmente el TRI 50c, en forma de polvo seco para reconstitución como una formulación intravenosa líquida (disolución) que contiene un agente de tonicidad, especialmente cloruro de sodio. La forma de polvo seco de una sal utilizada en una formulación parenteral podrá ser un liofilizado. La disolución reconstituida puede administrarse mediante inyección o infusión.

Ejemplos Guía para los ejemplos

Todos los Ejemplos hacen referencia a los Productos Novedosos de la presente revelación. Específicamente, los Ejemplos tienen que ver con las diferentes categorías mencionadas en la "Guía para la Especificación" tal y como sigue:

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Los ejemplos de 1 a 4 y de 42 a 44 tienen que ver con los Procedimientos Sintéticos II y, por tanto, con los Productos de Pureza Alta (una clase de Producto Novedoso)

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Los ejemplos de 5 a 35 y 40 tienen que ver con los Procedimientos Sintéticos I y con la caracterización y ensayo de los Productos Novedosos utilizando las técnicas de los Procedimientos Sintéticos I

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Los ejemplos de 36 a 39 y 41 contienen material sin publicar que sirve para verificar que el TRI 50c y de este modo los Productos Novedosos (incluyendo por lo tanto los Productos de Pureza Alta) son eficaces en contextos arteriales, así como venosos.

Ejemplos de 1 a 4

Observaciones introductorias Aparato

A través de los siguientes procedimientos de los Ejemplos 1 a 4, se utiliza material de vidrio de laboratorio estándar y, donde proceda, un aparato especializado para la manipulación y transferencia de reactivos sensibles al aire.

Todo el material de vidrio se calienta a 140-160ºC durante al menos 4 horas antes de su uso y después se enfría en un desecador o mediante el montaje en caliente y la purga con una corriente de nitrógeno seco.

Disolventes

Los disolventes orgánicos utilizados en los procedimientos de los Ejemplos de 1 a 4 son todos secos. Adecuadamente, se secan con sodio antes de su uso.

Secado

En los procedimientos de secado del Ejemplo de 1 a 4, se prueba la sequedad de los productos (incluida la sequedad en términos de disolvente orgánico) observando la pérdida de peso en el secado. Se siguió el siguiente procedimiento para determinar la pérdida en el secado: se colocó una muestra en el secador de vacío y se secó a 40ºC a 10000 pascales (100 mbar) durante 2 horas. Los productos se consideran secos cuando el descenso de peso durante el secado es inferior al 0,5% del peso total del material de partida.

Los ejemplos de 1 a 4 describen el rendimiento del siguiente esquema de reacción y la conversión del TRI 50c resultante en las sales de sodio y calcio del mismo:

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LDA = diisopropilamida de litio

LiHMDS = hexametildisilazana de litio, también conocida como bis(trimetilsilil)amida de litio

Diethanolamine: dietanolamina

Ejemplo 1 Síntesis del TRI 50d

Paso 1

Z-DIPIN B

Procedimiento A

17,8 g (732,5 mmol) de trasvases de magnesio, 0,1 g (0,4 mmol) de yodo y 127 ml de tetrahidrofurano seco se cargan y calientan a reflujo. Después se añaden y remueven bajo reflujo hasta que comienza la reacción vigorosa 15 ml de una disolución de 66 g (608 mmol) de 1-cloro-3-metoxipropano en 185 ml de tetrahidrofurano seco. Después de cesar la exoterma inicial, la disolución de 1-cloro-3-metoxipropano se añade lentamente para mantener reflujo suave hasta que todo el magnesio se consume. Después de que termina la reacción, se enfría la reacción a temperatura ambiente y se añade lentamente a una disolución de 64,4 g (620 mmol) de trimetilborato en 95 ml de tetrahidrofurano seco; la última disolución se enfría por debajo de los 0ºC y, si se calienta en el transcurso de la reacción, se debe añadir la mezcla de reacción a ésta con la suficiente lentitud como para mantener la temperatura de esta disolución por debajo de los 65ºC. Después de la adición completa, se deja que la mezcla de reacción se caliente a aproximadamente 0ºC y se remueve durante otros 60 minutos. Después se añade lentamente una disolución de 22,4 ml de ácido sulfúrico a 400 ml de agua de manera que se mantenga la temperatura por debajo de los 20ºC. Se deja que se asienten las capas y se separan las fases. La capa acuosa se vuelve a lavar tres veces con 200 ml de terc-butilmetiléter. Se deja que se asienten las capas orgánicas combinadas y se elimina el agua adicional separada de esta disolución. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora hasta el secado. Se filtra el residuo de la evaporación a partir del sólido precipitado y el filtrado se disuelve en 175 ml de tolueno. Se cargan en la disolución 34,8 g (292 mmol) de pinacol seguido por agitación a temperatura ambiente durante no menos de 10 horas. La disolución se evapora hasta el secado, se disuelve en 475 ml de n-heptano y se lava tres veces con 290 ml de disolución acuosa saturada de carbonato de hidrógeno sódico. La disolución de n-heptano se evapora hasta el secado y el residuo de evaporación se destila y la fracción con punto de ebullición a 40-50ºC a 10-50 pascales (0,1-0,5 mbar) se recupera.

Punto de ebullición: 40-50°C/10-50 pascales (0,1-0,5 mbar)

Rendimiento: 40,9 g (70%) Z-DIPIN B (aceite)

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Procedimiento B

17,8 g (732,5 mmol) de trasvases de magnesio, 0,1 g (0,4 mmol) de yodo y 127 ml de tetrahidrofurano seco se cargan y calientan a reflujo. Posteriormente, se añaden y remueven bajo reflujo hasta que comienza la reacción vigorosa 15 ml de una disolución de 66 g (608 mmol) de 1-cloro-3-metoxipropano en 185 ml de tetrahidrofurano seco. Después de cesar el exotermo inicial, la disolución de 1-cloro-3-metoxipropano se añade lentamente manteniendo un reflujo suave. Una vez terminada la reacción, se enfría la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se añade lentamente a una disolución de 64,4 g (620 mmol) de trimetilborato en 95 ml de tetrahidrofurano seco, manteniendo la temperatura de esta disolución por debajo de menos 65ºC. Una vez completada la adición, se deja que la mezcla de reacción se caliente a aproximadamente 0ºC y se remueve durante otros 60 minutos. Posteriormente, se añade lentamente una disolución de 22,4 ml de ácido sulfúrico en 400 ml de agua manteniendo así la temperatura por debajo de los 20ºC. El disolvente orgánico se elimina por destilación en vacío. Se cargan en la disolución acuosa del residuo de evaporación 300 ml de n-heptano seguidos por la adición de 34,8 g (292 mmol) de pinacol. Se remueve la mezcla de dos fases a temperatura ambiente durante no menos de dos horas. Después de dejar asentarse a las fases, se separa la fase acuosa. Se cargan 300 ml de n-heptano en la disolución acuosa y se remueve la mezcla de dos fases a temperatura ambiente durante no menos de 2 horas. Después de dejar asentarse a las fases, se separa la fase acuosa. Se combinan y lavan una vez las capas orgánicas con 200 ml de agua, seguido de 200 ml de disolución de carbonato de hidrógeno sódico saturado y dos lavados más con 200 ml de agua cada uno. La disolución de n-heptano se evapora hasta el secado y el residuo de evaporación se destila y la fracción con punto de ebullición 40-50ºC a 10-50 pascales (0,1-0,5 mbar) se recupera.

Punto de ebullición: 40-50°C/10-50 pascales (0,1-0,5 mbar)

Rendimiento: 40,9 g (70-85%) Z-DIPIN B (aceite)

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Paso 2

Z-DIPIN C

Se cargan 16,6 g (164 mmol) de diisopropilamina y 220 ml de tetrahidrofurano y se enfrían a entre -30 y -40ºC. Se añaden a esta disolución 41,8 g (163 mmol) de n-butillitio, 25% en n-heptano, seguido por agitación a entre 0 y -5ºC durante una hora. Esta disolución de reciente preparación de diisopropilamida de litio se enfría a -30ºC y después se añade a una disolución de 27,9 g (139 mmol) de Z-DIPIN B en 120 ml de tetrahidrofurano y 35,5 g (418 mmol) de diclorometano a una temperatura entre -60 y -75ºC. Se remueve la disolución a esa temperatura durante media hora seguipo por la adición de 480 ml (240 mmol) de cloruro de cinc (II) anhidro 0,5 N en tetrahidrofurán o 32,5 g (240 mmol) de cloruro de cinc (II) sólido anhidro. Después de remover a -65ºC durante una hora, se deja calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se remueve durante otras 16-18 horas. La mezcla de reacción se evapora hasta el secado (es decir, hasta que se elimina el disolvente) y se procede a añadir 385 ml de n-heptano. Se lava la mezcla de reacción con 150 ml de ácido sulfúrico al 5% con 190 ml de disolución de carbonato de hidrógeno sódico saturado, y 180 ml de disolución de cloruro sódico saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora hasta sequedad (p.e., hasta que se elimina el disolvente). El residuo oleoso se transfiere al siguiente paso sin mayor purificación.

Rendimiento: 19 g (55%) Z-DIPIN C

Paso 3

Z-DIPIN D

Se añaden a una disolución de 23,8 g (148 mmol) de hexametildisilazano en 400 ml de tetrahidrofurano a -15ºC 34,7 g (136 mmol) de n-butillitio, 25% en n-heptano y se remueve durante una hora. Se enfría la disolución a -55ºC y posteriormente se añaden 30,6 g (123 mmol) de Z-DIPIN C disuelto en 290 ml de tetrahidrofurano y 35 ml de tetrahidrofurano a esta disolución de reciente preparación de LiHMDS. Se deja calentar la disolución a temperatura ambiente y se remueve durante 12 horas. Se evapora la mezcla de reacción hasta sequedad, se disuelve el residuo de evaporación en 174 ml de n-heptano y se lava con 170 ml de agua y 75 ml de disolución de cloruro de sodio saturado. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora hasta sequedad completa (p.e., hasta que se elimina el disolvente). Se disuelve el residuo oleoso en 100 g de n-heptano. Esta disolución se transfiere a la siguiente etapa sin purificación adicional.

Rendimiento: 32,2 g (70%) Z-DIPIN D

Paso 4

Z-DIPIN (TRI50b, en bruto)

Se diluye una disolución de 26,6 g (71 mmol) de Z-DIPIN D en 82,6 g de n-heptano con 60 ml de n-heptano y se enfría a -60ºC seguido por introducción de 10,5 g (285 mmol) de cloruro de hidrógeno. Posteriormente se evacua y limpia con nitrógeno la mezcla de reacción, mientras que la temperatura se aumenta a intervalos de aproximadamente 20ºC hasta temperatura ambiente. Se elimina el disolvente del precipitado oleoso y se reemplaza varias veces con 60 ml de n-heptano fresco. El residuo oleoso se disuelve en 60 ml de tetrahidrofurano (Disolución A).

Se cargan y enfrían a -20ºC en un matraz diferente 130 ml de tetrahidrofurano, 24,5 g (61,5 mmol) de Z-D-Phe-Pro-OH y 6,22 g (61,5 mmol) de N-metilmorfolina. A esta disolución se le añade una disolución de 8,4 g (61,5 mmoles) de isobutilcloroformato en 20 ml de tetrahidrofurano y se remueve durante 30 minutos, seguido por adición de la Disolución A a -25ºC. Después de completar la adición, se añaden hasta 16 ml (115 mmol) de trietilamina ajustando el pH a 9-10, el cual se mide utilizando un bastón de pH. Se deja calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se remueve durante 3 horas, todavía bajo nitrógeno. Se evapora el disolvente hasta sequedad y se disuelve el residuo de evaporación en 340 ml de tert.-butilmetiléter (t-BME). Se lava dos veces la disolución de Z-DIPIN en t-BME con 175 ml de ácido clorhídrico al 1,5%. Se vuelven a lavar los lavados ácidos combinados con 175 ml de t-BME. Se lavan las capas orgánicas combinadas con 175 ml de agua, con 175 ml de disolución de carbonato de hidrógeno sódico saturado, con 175 ml de disolución de cloruro sódico al 25%, se secan con sulfato de magnesio y se filtran. Esta disolución se transfiere a la siguiente etapa sin purificaciónc adicional.

Rendimiento: 29,9 g (80%) Z-DIPIN

Ejemplo 2 Síntesis del TRI 50d (aducto de dietanolamina del TRI 50c)

El material de partida utilizado en este Ejemplo es la disolución de TRI 50b ("Z-DIPIN") obtenida en el Ejemplo 1. La disolución se encamina hacia la síntesis del TRI 50d sin mayor purificación. La disolución de Z-DIPIN en t-BME (que contiene 7,0 g (11,5 mmol) de (R,S,R) TRI50b, calculada sobre la base de los resultados HPLC de Z-DIPIN) se evapora hasta sequedad y el residuo de evaporación se disuelve en 80 ml de éter dietílico. Se añaden 1,15 g (14,4 mmol) de dietanolamina y se calienta la mezcla a reflujo durante al menos 10 horas, procedimiento durante el cual producto se precipita. La suspensión se enfría a 5-10ºC, se filtra y el residuo del filtro se lava con éter dietílico.

Para mejorar la pureza quiral y química la torta húmeda del filtro (7 g) se disuelve en 7 ml de diclorometano, se enfría a 0-5ºC y el producto se precipita mediante la adición de 42 ml de éter dietílico y se filtra. Se seca el producto húmedo aislado a 35ºC en vacío o al menos 4 horas, hasta el día.

Rendimiento: 5,5 g (80%) Tri50d

Punto de fusión: 140-145°C

Ejemplo 3 Preparación de sal de sodio del TRI50c

Se disuelven 1,5 kg (2,5 mol) del TRI50d del ejemplo 2 en 10,5 L de diclorometano. Se añaden 11 L de ácido clorhídrico al 2% y se remueve la mezcla durante 30 minutos como máximo (óptimamente, alrededor de 20 minutos) a temperatura ambiente. Se forma un precipitado en la fase orgánica. Después de remover, se deja que se asienten las capas y se separan. La capa acuosa se vuelve a lavar dos veces con 2,2 L de diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavan con una disolución de 625 g de cloruro amónico en 2,25 L de agua. (El cloruro amónico amortigua el pH de las extracciones acuosas para que se encuentre en un rango de aproximadamente pH 1-2 a aproximadamente pH 4-5, según condiciones ácidas fuertes pueden escindir los enlaces peptídicos). Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y el filtrado se evapora hasta el secado. Se lleva a cabo un ensayo del ácido borónico libre (mediante el procedimiento RP HPLC del Ejemplo 43 durante un máximo de 30 minutos (opcionalmente alrededor de 20 minutos) a temperatura ambiente) y se calculan las cantidades de los disolventes y la base para la conversión del ácido en la sal. Si se obtienen 2,5 mol del ácido libre, se disuelve el residuo de evaporación en 5 l de acetonitrilo seguidos con la adición de una disolución de 100 g (2,5 mol) de hidróxido sódico como una disolución al 5% en 2,2 L de agua. Se remueve la disolución durante dos horas a temperatura ambiente (p.e., a entre 15 y 30ºC, óptimamente a temperatura ambiente) y después se evapora al vacío (de aproximadamente 1333,22 pascales (10 mmHg)) a una temperatura que no supere los 35ºC. Se disuelve repetidamente el residuo de evaporación en 3,5 L de acetonitrilo recién preparado y se evapora hasta sequedad eliminando los restos de agua. Si el residuo de evaporación está seco, se disuelve en 3 L de acetonitrilo (o alternativamente en 6 L de THF) y se añade lentamente a una mezcla de 32 L de n-heptano y 32 L de éter dietílico. La adición se lleva a cabo con la suficiente lentitud evitando aglutinamiento o pegado del producto y se lleva a cabo durante un tiempo no inferior a 30 minutos. Se filtra el producto precipitado, se lava con n-heptano y se seca al vacío a una temperatura inicial de alrededor de 10ºC y después se incrementa hasta un límite de alrededor de 35ºC hasta que se seque.

Rendimiento: 1,0 kg (70%) de sal de sodio del Tri50c.

Ejemplo 4 Preparación de sal de calcio del TRI50c

Se disuelven 1,5 kg (2,5 mol) del TRI50d del ejemplo 2 en 10,5 L de diclorometano. Se añaden 11 L de ácido clorhídrico al 2% y se remueve la mezcla durante 30 minutos como máximo (óptimamente alrededor de 20 minutos) a temperatura ambiente. Después de remover se deja que las capas se asienten y separen. La capa acuosa se vuelve a lavar dos veces con 2,2 L de diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavan con una disolución de 625 g de cloruro amónico en 2,25 L de agua. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y el filtrado se evapora hasta sequedad. Se lleva a cabo un ensayo del ácido borónico libre y se calculan las cantidades de los disolventes y la base para la conversión del ácido en la sal. Si se obtienen 2,5 mol del ácido libre, se disuelve el residuo de evaporación en 5 L de acetonitrilo y se prosigue con la adición de una suspensión de 93 g (1,25 mol) de hidróxido cálcico en 1 L de agua. Se remueve la disolución durante dos horas a temperatura ambiente (p.e., a entre 15 y 30ºC, óptimamente a temperatura ambiente) y después se evapora al vacío (de aproximadamente 1333,22 pascales (10 mmHg)) a una temperatura inicialmente de alrededor de 10ºC y posteriormente aumentándola hasta alrededor de 35ºC. Se disuelve repetidamente el residuo de evaporación en 3,5 L de acetonitrilo fresco y se evapora hasta sequedad eliminando los restos de agua. Si el residuo de evaporación está seco, se disuelve en 6 L de tetrahidrofurano y se añade lentamente a una mezcla de 32 L de n-heptano y 32 L de éter dietílico. La adición se lleva a cabo con la suficiente lentitud evitando aglutinamiento o pegado del producto y se lleva a cabo durante un tiempo no inferior a 30 minutos. Se filtra el producto precipitado, lavado con n-heptano y secado en vacío (de aproximadamente 10 mmHg) a una temperatura por debajo de los 35°C hasta el secado.

Rendimiento: 0,98 kg (70%) de sal de calcio del Tri50c.

Los procedimientos de los Ejemplos de 1 a 4 pueden escalarse y, si se opera con cuidado, producirán sales con una pureza alta. En el paso de precipitación de la dietanolamina es importante utilizar 1,25 equivalentes de dietanolamina por equivalente de (R,S,R) TRI 50b. En la hidrólisis del éster de dietanolamina, es importante evitar un contacto excesivamente largo con el ácido acuoso. Al mismo tiempo, el TRI 50b debería sintetizarse a través de la reacción Grignard para obtener Z-DIPIN A.

Ejemplo 5 Conversión alternativa del TRI 50b en TRI50c

Los procedimientos sintéticos descritos en este y en los ejemplos sintéticos siguientes se llevaron a cabo de forma general bajo nitrógeno y utilizando disolventes secos suministrados por fuentes comerciales.

1. Se disolvieron aproximadamente 300 g de TRI 50b, obtenidos a través de la purificación HPLC de TRI 50b racémico, en aproximadamente 2,5 L de éter dietílico. Se estima que las diferentes partidas de TRI 50b tenían purezas isómeras que oscilaban entre el 85% de R,S,R hasta más del 95% de R,S,R.

2. Se añadieron aproximadamente 54 ml de dietanolamina (1:1 de estequiometría con contenido total de TRI 50b) y se sometió a reflujo a 40ºC.

3. Se eliminó el producto precipitado, se enjuagó varias veces con dietliéter y se secó.

4. El producto seco se disolvió en CHCl_{3}. Se añadió ácido clorhídrico (pH 1) y se removió la mezcla aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente.

5. La capa orgánica se eliminó y se enjuagó con disolución de NH_{4}Cl.

6. El disolvente orgánico se destiló y se secó el producto sólido residual.

Rendimiento habitual: Aproximadamente 230 g

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Ejemplo 6 Preparación de sal de litio del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade LiOH como una disolución de 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta el secado al vacío sin que su temperatura supere los 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se redisuelve en 500 ml de agua destilada necesaria con ligero calentamiento durante aproximadamente 20 minutos. Se filtra la disolución con papel de filtro y se evacua hasta el secado, de nuevo sin que la temperatura de la disolución supere los 37°C. El producto resultante se seca al vacío toda la noche produciendo normalmente un sólido blanco quebradizo.

Entonces se secó la sal al vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento 17,89 g.

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Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado	% de Metal Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
57,14	6,60	7,34	2,07	Li 1,26
(61,03)	(6,64)	(7,90)	(2,03)	(1,31)

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Ejemplo 7 Espectros UV/Visibles de sal de litio de TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal resultantes del procedimiento del Ejemplo 6 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. La sal proporcionó \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal seca con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

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A = \varepsiloncl

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donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 451

Ejemplo 8 Solubilidad acuosa de la sal de litio del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se realizó utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 6. El procedimiento modificado difiere del descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver. La sal de litio era comparativamente soluble y, por tanto, se volvió a disolver a 50 mg/ml en la misma forma descrita anteriormente.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 43 mM (23 mg/ml).

Solubilidad cuando se disolvió a 50 mg/ml: 81 mM (43 mg/ml).

Ejemplo 9 Preparación de sal de sodio del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade NaOH como una disolución de 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta el secado en vacío sin que su temperatura supere los 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se vuelve a disolver en 500 ml de agua destilada con un ligero calentamiento durante aproximadamente 15-20 minutos. Se filtra la disolución con papel de filtro y se evacua hasta el secado, una vez más sin que la temperatura de la disolución supere los 37°C. El producto resultante se seca en vacío toda la noche produciendo normalmente un sólido blanco duro. El producto puede encontrarse presente como un sólido oleoso o pegajoso debido al agua residual, en cuyo caso se disuelve en acetato de etilo y se evacua hasta el secado para producir un producto sólido blanco.

Entonces se secó la sal en vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento: Más del 50%.

Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado	% de Metal Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
59,93	6,47	7,31	1,91	Na 3,81
(59,24)	(6,44)	(7,67)	(1,98)	(4,20)

Ejemplo 10 Espectros UV/Visibles de sal de sodio de TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal de sodio resultantes del procedimiento del Ejemplo 9 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. La sal proporcionó \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal secada con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 415.

Ejemplo 11 Solubilidad acuosa de la sal de sodio del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se realizó utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 9. El procedimiento modificado difiere de aquel descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver. La sal de sodio era comparativamente soluble y, por tanto, se volvió a disolver a 50 mg/ml en la misma forma descrita anteriormente.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 44 mM (25 mg/ml).

Solubilidad cuando se disolvió a 50 mg/ml: 90 mM (50 mg/ml).

Ejemplo 12 Preparación de sal de potasio del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade KOH como una disolución de 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta el secado en vacío sin que su temperatura supere los 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se vuelve a disolver en 1 L de agua destilada con un calentamiento a 37ºC durante aproximadamente 2 horas. Se filtra la disolución con papel de filtro y se evacua hasta el secado, de nuevo con temperatura de la disolución no superando los 37°C. El producto resultante se seca al vacío durante toda una noche dando como resultado normalmente un sólido blanco frágil.

Rendimiento: 14,45 mg.

Entonces se secó la sal en vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

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Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado	% de Metal Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
54,84	6,25	7,02	2,01	K 4,29
(57,55)	(6,26)	(7.45)	(1,92)	(6,94)

Ejemplo 13 Espectros UV/Visibles de sal de potasio de TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal de potasio resultantes del procedimiento del Ejemplo 12 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. El TRI y la sal proporcionaron \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal seca con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 438.

Ejemplo 14 Solubilidad acuosa de la sal de potasio del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se fabricó usando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 12. El procedimiento modificado difiere del descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se llevó a cabo mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal secada, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 29 mM (16 mg/ml).

Ejemplo 15 Preparación de sal de cinc del TRI 50c

La solubilidad relativa del hidróxido de cinc es tal que, si el hidróxido se hubiera utilizado para preparar la sal del TRI 50c correspondiente utilizando el procedimiento del Ejemplo 6, no habría resultado en una formación de sal homogénea. Se desarrolló por tanto un nuevo procedimiento para preparar la sal de cinc, tal y como se describe en el presente y en los próximos ejemplos.

La sal de sodio del TRI 50c (2,24 g, 4,10 mM) se disolvió en agua destilada (100 ml) a temperatura ambiente y el cloruro de cinc en THF (4,27 ml, 0,5 mM) se añadió cuidadosamente con agitación. Se filtró un precipitado blanco que se formó de inmediato y se enjuagó con agua destilada. Este sólido se disolvió en acetato de etilo y se enjuagó con agua destilada (2 x 50 ml). La disolución orgánica se evacuó hasta sequedad y el sólido blanco producido se secó sobre sílice en un desecador durante 3 días antes del microanálisis. Rendimiento 1,20 g.

RMN ^{1}H 400 MHz, \delta_{H}(CD_{3}OD) 7,23-7,33 (20H, m, ArH), 5,14 (4H, m, PhCH_{2}O), 4,52 (4H, m, \alphaCH), 3,65 (2H, m), 3,31 (12H, m), 3,23 (6H, s, OCH_{3}), 2,96 (4H, d, J 7,8 Hz), 2,78 (2H, m), 2,58 (2H, m), 1,86 (6H, m), 1,40 (10H, m).

RMN ^{13}C 75 MHz \delta_{C}(CD_{3}OD) 178,50, 159,00, 138,05, 137,66, 130,54, 129,62, 129,50, 129,07, 128,79, 128,22, 73,90, 67,90, 58,64, 58,18, 56,02, 38,81, 30,06, 28,57, 28,36, 25,29.

FTIR (disco KBr) \nu_{máx.} (cm^{-1}) 3291,1, 3062,7, 3031,1, 2932,9, 2875,7, 2346,0, 1956,2, 1711,8, 1647,6, 1536,0, 1498,2, 1452,1, 1392,4, 1343,1, 1253,8, 1116,8, 1084,3, 1027,7, 916,0, 887,6, 748,6, 699,4, 595,5, 506,5.

Ejemplo 16 Preparación de sal de arginina del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade arginina como una disolución 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta sequedad al vacío sin que su temperatura supere los 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se vuelve a disolver en 2 L de agua destilada con un calentamiento a 37ºC durante 2 horas. Se filtra la disolución con papel de filtro y se evacua hasta el secado, una vez más sin que la temperatura de la disolución supere los 37°C.
El producto resultante se seca al vacío durante toda una noche produciendo normalmente un sólido blanco duro.

Entonces se secó la sal al vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento: 10,54 g.

Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
52,47	7,12	15,25	1,52
(56,65)	(7,20)	(14,01)	(1,54)

Ejemplo 17 Espectros UV/Visibles de sal de arginina de TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal resultantes del procedimiento del Ejemplo 15 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. El TRI y la sal proporcionaron \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal secada con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 406.

Ejemplo 18 Solubilidad acuosa de la sal de arginina del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se elaboró utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 16. El procedimiento modificado difiere de aquel descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 14 mM (10 mg/ml).

Ejemplo 19 Preparación de sal de lisina del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade L-lisina como una disolución de 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta sequedad al vacío con su temperatura no excediendo de 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se vuelve a disolver en 3 L de agua destilada con un calentamiento a 37ºC durante 2 horas. Se filtra la disolución con papel de filtro y se evacua hasta sequedad, de nuevo con la temperatura de la disolución no superando los 37°C. El producto resultante se seca en vacío durante toda una noche produciendo normalmente un sólido blanco frágil. El producto puede encontrarse presente como un sólido oleoso o pegajoso (debido al agua residual), en cuyo caso se disuelve entonces en acetato de etilo y se evacúa hasta sequedad produciendo un producto sólido blanco.

Después se secó la sal al vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento: 17,89.

Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
57,03	7,43	10,50	1,72
(59,11)	(7,36)	(10,44)	(1,61)

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20 Espectros UV/Visibles de sal de lisina de TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal resultantes del procedimiento del Ejemplo 19 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. El TRI50C y la sal proporcionaron \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal secada con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 437.

Ejemplo 21 Solubilidad acuosa de la sal de lisina del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se elaboró utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 19. El procedimiento modificado difiere de aquel descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 13 mM (8,6 mg/ml).

Ejemplo 22 Preparación de la sal de N-metil-D-glucamina del TRI50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 (20,00 g, 38,1 mM) se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade N-metil-D-glucamina como una disolución de 0,2 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacua hasta el secado en vacío sin que su temperatura supere los 37°C. El líquido oleoso/pegajoso resultante se vuelve a disolver en 500 ml de agua destilada con un ligero calentamiento durante aproximadamente 20 minutos. Se filtra la disolución a través de papel de filtro y se evacúa hasta sequedad, una vez más sin que la temperatura de la disolución supere los 37°C, o se congela en seco. El producto resultante se seca en vacío durante la noche para que finalmente dé como resultado un sólido frágil blanco duro.

Después se secó la sal en vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento: 21,31 g.

Microanálisis

% de C Encontrado	% de H Encontrado	% de N Encontrado	% de B Encontrado
(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)	(Calc.)
56,67	7,28	7,74	1,63
(56,67)	(7,41)	(7,77)	(1,50)

Ejemplo 23 Espectros UV/Visibles de la sal de N-metil-D-glucamina del TRI50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal resultantes del procedimiento del Ejemplo 22 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. El TRI50C y la sal proporcionaron \lambda_{máx.} a 210 y 258 nm. Se midió entonces el peso de la sal secada con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 433.

Ejemplo 24 Solubilidad acuosa de la sal de N-metil-D-glucamina del TRI50c

La sal utilizada en este Ejemplo se elaboró utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 22. El procedimiento modificado difiere de aquel descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. Se observó que la sal se disolvía completamente. La sal era comparativamente soluble y, por tanto, se volvió a disolver a 50 mg/ml en la misma forma descrita anteriormente.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 35 mM (25 mg/ml).

Solubilidad cuando se disolvió a 50 mg/ml: 70 mM (50 mg/ml).

Ejemplo 25 Preparación alternativa de sal de arginina del TRI50c

La sal de arginina se forma simplemente añadiendo un ligero exceso molar de L-arginina a una disolución de 0,2-0,3 mmol de TRI50c en 10 ml de acetato de etilo. El disolvente se evapora después de una hora, y el residuo se tritura dos veces con hexano eliminando el exceso de arginina.

Ejemplo 26 Primera preparación de sal de calcio del TRI 50c

El Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH (20,00 g, 38,1 mM) obtenido mediante el procedimiento del Ejemplo 5 se disuelve en acetonitrilo (200 ml) con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añade Ca(OH)_{2} como una disolución de 0,1 M en agua destilada (190 ml). La disolución transparente resultante se remueve durante 2 horas a temperatura ambiente y después se evacúa hasta el secado en vacío sin que la temperatura supere los 37ºC. El producto resultante es un sólido blanco quebradizo.

Después se secó la sal al vacío sobre sílice a un peso constante (72 horas).

Rendimiento: 17,69 g.

Ejemplo 27 Segunda preparación alternativa de sal de calcio del TRI 50c

Se disolvieron 50,0 g de TRI 50c (95,2 mmol) removiéndolos en 250 ml de acetonitrilo a temperatura ambiente y posteriormente se enfriaron en un baño de hielo. Se añadieron a esta disolución enfriada con hielo 100 ml de una suspensión acuosa de 3,5 g (47,6 mmol) de hidróxido de calcio gota a gota, se removió durante 2,5 horas a temperatura ambiente, se filtró y la mezcla resultante se evaporó hasta sequedad, no excediendo la temperatura de 35ºC. El residuo transparente oleoso de color amarillento se volvió a disolver en 200 ml de acetona y se evaporó hasta el secado. El procedimiento de nueva disolución en acetona se repitió una vez más para obtener una espuma incolora.

Se redisolvió esta espuma en 100 ml de acetona, se filtró y se añadió gota a gota a una disolución enfriada con hielo de 1.100 ml de éter de petróleo 40/60 y 1.100 ml de éter dietílico. Se filtró el precipitado incoloro resultante, se lavó dos veces con éter de petróleo 40/60 y se secó en condiciones de alto vacío, produciendo 49,48 g de sólido incoloro (92%), con una pureza del 99,4%, de acuerdo con la medición HPLC.

Ejemplo 28 Espectros UV/Visibles de sal de calcio de TRI 50c

Se registraron espectros UV/Visibles de la sal resultantes del procedimiento del Ejemplo 26 en agua destilada a 20ºC desde 190 nm a 400 nm. El TRI 50C y la sal proporcionaron \lambda_{max} a 210 y 258 nm. Se midió después el peso de la sal seca con el objeto de calcular el coeficiente de extinción. Se utilizó el \lambda_{máx.} a 258 nm. Se calculó el coeficiente de extinción utilizando la fórmula:

A = \varepsiloncl

donde

A es la absorbancia

C es la concentración

I la longitud del trayecto de la célula UV y

\varepsilon es el coeficiente de extinción.

Coeficiente de extinción: 955.

Ejemplo 29 Solubilidad acuosa de sal de calcio del TRI 50c

La sal utilizada en este Ejemplo se realizó utilizando una modificación del procedimiento descrito en el Ejemplo 27. El procedimiento modificado difiere del descrito en que se utilizaron 100 mg de TRI 50c como material de partida, el producto de la redisolución en agua se secó mediante secado por congelación y la filtración se realizó mediante un filtro de 0,2 \mum. Se cree que la sal contiene alrededor del 85% de isómero R,S,R.

Para determinar la solubilidad acuosa máxima, se batieron en agua a 37ºC 25 mg de la sal seca, se filtró la muestra y se midió el espectro UV. La sal dejó un residuo blanco de material sin disolver.

Solubilidad cuando se disolvió a 25 mg/ml: 5 mM (5 mg/ml).

Ejemplo 30 Actividad in vitro de la sal de calcio del TRI 50c

Se sometió la sal de calcio del TRI 50c a ensayo como un inhibidor de la \alpha-trombina humana mediante un ensayo amidolítico (J. Deadman y col., J. Med. Chem. 38:15111-1522, 1995, que informa de un valor Ki de 7nM para el TRI 50b).

La inhibición de la \alpha-trombina humana, por tanto, vino determinada por la inhibición de la hidrólisis catalizada por enzimas de tres concentraciones diferentes de sustrato cromogénico S-2238.

Se incubaron 200 \mul de muestra o tampón y 50 \mul de S-2238 a 37ºC durante 1 minuto y se añadieron 50 \mul de \alpha-trombina humana (0,25 NIH\alpha/ml). Se registraron las velocidades iniciales de reacciones inhibidas y sin inhibir a 4,5 nm. Se determina el aumento de la densidad óptica de acuerdo con el procedimiento de Lineweaver y Burke. Se determinaron la Km y la Km aparente y se calculó la Ki utilizando la relación.

V = \frac{V_{máx}}{1 + \frac{Km}{[S]} \cdot \left(1 + \frac{[I]}{Ki}\right)}

El tampón utilizado contenía 0,1 M de fosfato de sodio, 0,2 M de NaCl, 0,5% PEG y 0,02% de azida de sodio, ajustado a un pH de 7,5 con ácido ortofosfórico.

Las muestras constan del compuesto disuelto en DMSO.

Se refiere el lector a Dixon, M y Webb, E.C., "Enzymes", tercera edición, 1979, Academic Press, la revelación de la cual se incorpora en el presente documento por referencia, para una mayor descripción de la medición de Ki.

Se observó que la sal de calcio del TRI 50c tenía una Ki de 10nM.

Ejemplo 31 Preparación de sal de magnesio del TRI 50c

Se disolvió el TRI 50c (1,00 g, 1,90 mM) en metanol (10 ml) y se removió a temperatura ambiente. A esta disolución se le añadió metóxido de magnesio (Mg(CH_{3}O)_{2}) en metanol (1,05 ml, 7,84 % en peso). Se removió esta solución durante 2 horas a temperatura ambiente y se filtró y evacuó a 5 ml. Se añadió después agua (25 ml) y se evacuó la disolución hasta sequedad para producir un sólido blanco. Se secó esto sobre sílice durante 72 horas antes de enviarlo para el microanálisis. Rendimiento 760 mg.

RMN ^{1}H 300MHz, \delta_{H}(CD_{3}C(O)CD_{3}) 7,14 - 7,22 (20H, m), 6,90 (2H, m), 4,89 (4H, m, PhCH_{2}O), 4,38 (2H, m), 3,40 (2H, br s), 2,73 - 3,17 (20H, multipletes amplios sin resolver), 1,05 - 2.10 (16H, multipletes amplios sin resolver).

RMN^{13}C 75MHz \delta_{C}(CD_{3}C(O)CD_{3}) 206,56, 138,30, 130,76, 129,64, 129,31, 129,19, 129,09, 128,20, 128,04, 74,23, 73,55, 67,78, 58,76, 56,37, 56,03, 48,38, 47,87, 39,00, 25,42, 25,29.

FTIR (disco KBr) \nu_{máx.} (cm^{-1}) 3331,3, 3031,4, 2935,3, 2876,9, 2341,9, 1956,1, 1711,6, 1639,9, 1534,3, 1498,1, 1453,0, 1255,3, 1115,3, 1084,6, 1027,6, 917,3, 748,9, 699,6, 594,9, 504,5, 467,8.

Ejemplo 32 Solubilidad del TRI50c

Los espectros UV/visibles del TRI50c resultantes del procedimiento del Ejemplo 5 y su solubilidad fueron obtenidos tal y como se describe anteriormente en relación con las sales. La solubilidad del TRI50c cuando se disuelve a 50 mg/ml era de 8 mM (4 mg/ml).

Ejemplo 33 Análisis de las sales de sodio, calcio, magnesio y cinc del (R,S,R) TRI 50c

Se prepararon las siguientes sales utilizando una estequiometría borato:metal de n:1, donde n es la valencia del metal, utilizando (R,S,R) TRI 50c de pureza quiral superior a la que se utilizaba para preparar las sales descritas en los Ejemplos 8, 11, 14, 18, 21, 24 y 29.

A. Sal de sodio (Producto del Ejemplo 9)

\underbar{Datos analíticos}	\underbar{Propiedades físicas}
HPLC o LC/MS: Columna C18	Forma: Sólido amorfo
betabásica de HPLC, CH_{3}CN, Agua
	Color: Blanco
Pureza estimada: >95% por UV
(\lambda_{215nm})	Punto de fusión: No disponible

Microanálisis:

Solubilidad: Soluble en medios acuosos ca\sim50 mg/ml

	Calculado	Encontrado
C:	59,24	59,93
H:	6,44	6,47	M_{w}: \; 547,40
N:	7,67	7,31
Otros: B:	1,98	1,91
Na:	4,20	3,81

B. Sal de calcio (Producto del Ejemplo 26)

\underbar{Datos analíticos}	\underbar{Propiedades físicas}
HPLC o LC/MS: Columna C18	Forma: Sólido amorfo
betabásica de HPLC, CH_{3}CN, Agua
	Color: Blanco
Pureza estimada: >95% por UV
(\lambda_{215nm})	Punto de fusión: No disponible
Microanálisis:	Solubilidad: Soluble en medios acuosos ca\sim4 mg/ml

	Calculado	Encontrado
C:	59,27	55,08
H:	6,48	6,43	M_{w}: \; 1088,89
N:	7,71	7,08
Otros: B:	1,99	2,01
Ca:	3,68	3,65

C. Sal de magnesio (Producto del Ejemplo 31)

\underbar{Datos analíticos}	\underbar{Propiedades físicas}
HPLC o LC/MS: Columna C18	Forma: Sólido amorfo
betabásica de HPLC, CH_{3}CN, Agua
	Color: Blanco
Pureza estimada: >90% por UV
(\lambda_{215nm})	Punto de fusión: No disponible

Microanálisis:

Solubilidad: Soluble en medios acuosos ca\sim7 mg/ml

	Calculado	Encontrado
C:	60,44	57,25
H:	6,57	6,71	M_{w}: 1073,12
N:	7,83	7,45
Otros: B:	2,01	2,02
Mg:	2,26	2,12

D. Sal de cinc (Producto del Ejemplo 15)

\underbar{Datos analíticos}	\underbar{Propiedades físicas}
HPLC o LC/MS: Columna C18	Forma: Sólido amorfo
betabásica de HPLC, CH_{3}CN, Agua
	Color: Blanco
Pureza estimada: >95% por UV
(\lambda_{215nm})	Punto de fusión: No disponible

Microanálisis:

Solubilidad: Soluble en medios acuosos ca\sim2 mg/ml

	Calculado	Encontrado
C:	58,21	56,20
H:	6,33	6,33	M_{w}: 1114,18
N:	7,54	7,18
Otros: B:	1,94	1,84
Zn:	5,87	7,26

Notas: La fórmula trigonal del borato de ácido se utiliza en los microanálisis calculados. Se cree que el ejemplo 11 muestra una solubilidad de la sal de sodio inferior porque la sal sometida a ensayo en este ejemplo tenía una pureza quiral menor.

Conclusión

Las sales de cinc, calcio y magnesio han sido preparadas con una estequiometría de un ión de metal a dos moléculas de TRI 50c. Los valores encontrados para las sales de calcio y magnesio son cercanos y, por tanto, consistentes con los calculados para esta estequiometría 1:2. Para la sal de cinc, se encontró un exceso de cinc; no obstante, la sal de cinc contiene una proporción significativa de borato ácido. La sal de sodio se ha preparado con una estequiometría de un ión de metal a una molécula de TRI 50c. El valor encontrado para la sal de sodio es cercano a y por tanto consistente con el calculado para esta estequiometría 1:1.

Ejemplo 34 Estabilidad

Un ensayo del TRI 50c y sus sales de sodio y lisina antes y después de secar.

1. Resultados tabulados

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Compuesto	Cantidad [\mug/mL]	Pureza (% del área)
TRI 50c seco	1000,0	82,00
TRI 50c no secado	947,3	85,54
Sal de Na del TRI 50c seca	1024	98,81
Sal de Na del TRI 50c no secada	1005,8	98,61
Sal de Lys del TRI 50c seca	813,3	90,17
Sal de Lys del TRI 50c no secada	809,8	92,25

\vskip1.000000\baselineskip

La pureza del ácido se disminuyó mediante el procedimiento de secado pero la pureza de las sales se vio menos afectada; la purea de la sal de sodio no se redujo significativamente. Grandes diferencias en los factores de respuesta reducirán los niveles reales de impureza, no obstante.

2. Procedimiento analítico 2.1 Preparación de muestras

Se pesaron el TRI 50c y sus sales de Na, Li y Lys en viales de HPLC y se almacenaron en un desecador sobre pentóxido de fósforo durante 1 semana. Para el análisis de muestras, se pesaron 5 mg de material secado y no secado en un matraz volumétrico de 5 ml y se disolvieron en 1 mL de acetonitrilo y se llenaron con agua desmineralizada hasta 5 mL.

\newpage

3. Evaluación de datos

La evaluación cuantitativa se llevó a cabo utilizando un procedimiento de HPLC-PDA.

4. Parámetros analíticos 4.1 Equipamiento y software

	Muestreador automático	Waters Alliance 2795
	Bomba	Waters Alliance 2795
	Horno de columna	Waters Alliance 2795
	Detección	Ordenación de diodos Waters 996, cuadro simple MS-ZQ 2000
	Versión de software	Waters Millennium Release 4.0

4.2 Fase estacionaria

	Identificación de la columna analítica	S71
	Material	X-Terra^{TM} MS C_{18}, 5 \mum
	Proveedor	Waters, Eschborn, Alemania
	Dimensiones	150 mm x 2,1 mm (largo, diámetro interior)

4.3 Fase móvil

Fase acuosa:

A: H_{2}O + 0,1%

Fase orgánica:

C: ACN

Condiciones de gradiente:

Tiempo	Flujo	% A	% C
0,00	0,5	90	10
27,0	0,5	10	90
27,1	0,5	90	10
30,0	0,5	90	10

Este ejemplo indica que las sales de la revelación, en especial las sales metálicas, p.e., las sales de metales alcalinos, son más estables que los ácidos, especialmente el TRI 50c.

Ejemplo 35 Ensayo in vitro como inhibidor de trombina de sal de magnesio del TRI 50c Ensayo amidolítico de trombina

Se sometió a ensayo la sal de magnesio del TRI 50c (TRI 1405) en un ensayo amidolítico de trombina.

Reactivos

Tampón de ensayo:

100 mM de fosfato de Na

200 mM de NaCl (11,688 g/l)

0,5% PEG 6000 (5 g/l)

0,02% de azida de Na

pH 7,5

Sustrato cromogénico S2238 disuelto a 4 mM (25 mg + 10 ml) en agua. Diluido a 50 uM con tampón de ensayo para su uso en ensayo a 5 \muM. (S2238 es H-D-Phe-Pip-Arg-pNA).

Trombina obtenida a partir de HTI, a través de Cambridge Bioscience, y alicuotada a 1 mg/ml con tampón de ensayo. Diluir a 100 ng/ml con tampón de ensayo y posteriormente otro 1 en 3 para su uso en el ensayo.

Ensayo

110 \mul tampón de ensayo

50 ul 5 \mug/ml trombina

20 \mul disolución vehicular o de compuesto

\vskip1.000000\baselineskip

5 minutos a 37ºC

\vskip1.000000\baselineskip

20 \mul 50 \muM S2238

Lectura a 405 nm a 37ºC durante 10 minutos y Vmáx registrada

Resultados

Se presentan los resultados en la Fig. 1.

Discusión

En este ensayo, la sal de magnesio del TRI 50c muestra la misma actividad que la TRI 50b como un control externo.

Ejemplo 36 Inhibición del TRI 50b de la actividad procoagulante de plaquetas

La actividad procoagulante de las plaquetas puede observarse como el aumento, en la velocidad de activación de la protrombina por el factor Xa en presencia del factor Va tras la adición de plaquetas pretratadas con trombina, ocasionado por la trombina sola, el colágeno sólo o una mezcla de trombina y colágeno. Esta propiedad se debe a un aumento del fosfolípido aniónico en la superficie de la plaqueta con liberación concomitante de microvesícula desde la superficie. Esta es una reacción fisiológica esencial y las personas cuyas plaquetas tienen capacidad reducida para generar actividad procoagulante (síndrome de Scott) muestran un aumento de la tendencia a la hemorragia.

Procedimiento

Las plaquetas enjuagadas se trataron bien con trombina 1,15 nM, bien con colágeno 23 \mug/ml o bien con una mezcla de ambos en la misma concentración a 37ºC. Se añadió el TRI 50 b o bien 1 minuto antes de la adición del activador o inmediatamente después de la incubación con el activador. La actividad procoagulante de las plaquetas vino determinada tal y como se ha descrito anteriormente (Goodwin C A y col., Biochem J. 1995 8, 308: 15-21).

El TRI 50b demostró ser un potente inhibidor de la actividad procoagulante de las plaquetas con CI_{50} como se resume a continuación:

TABLA 2 Influencia del TRI 50b en la inducción de la actividad procoagulante de las plaquetas por varios agonistas

Agonista	Aceleración plegada	CI50 más preincubación	IC50 sin incubación
	sin TRI 50b	(nM)	(nM)
Trombina	30	8	3000
Colágeno	45	200	300
Trombina/colágeno	110	3	80

La tabla 2 registra, por ejemplo, que cuando las plaquetas fueron tratadas con trombina, causaron una aceleración de 30 pliegues de la velocidad de activación de la protrombina en comparación con las plaquetas de control. El tratamiento con TRI 50 redujo dicha aceleración a la mitad en los distintos niveles de concentración de TRI 50 dados. La potencia
significativa del TRI 50 queda demostrada por el hecho de que los valores del IC_{50} se encuentran en el rango nanomolar.

El TRI 50b no tiene un efecto sobre el ADP, el colágeno o la agregación inducida con epinefrina de plaquetas lavadas.

Ejemplo 37 Modelo de anastomosis extracorpórea de conejo Introducción

La técnica describe un modelo animal en el que se produce un trombo rico en plaquetas. Se compara la actividad del TRI 50b y de la heparina.

Se utilizaron la arteria carótida y la vena yugular de conejos anestesiados para crear un circuito extracorpóreo que contuviera una superficie extraña suspendida (hilo de seda). Se inicia la deposición del trombo mediante la creación de un flujo sanguíneo arterial turbulento de tensión alta pura, activación de plaquetas, seguida de coagulación en presencia de superficies trombogénicas. Estudios histopatológicos han demostrado que el trombo es rico en plaquetas.

Materiales y procedimientos Animales

Se utilizaron conejos NZW (machos de 2,5-3,5 kg). Se permitió comer y beber agua a los animales hasta la inducción de anestesia.

Anestesia

Se premedicó a los animales con 0,15 ml en total de fotanel/fluanisona (Hypnorm) mediante inyección intramuscular. Se indujo la anestesia general con metohexitona (10 mg/ml) para llevarse a cabo, seguida de intubación endotraqueal. Se mantuvo la anestesia con isoflurano (1-2,0%) transportada en oxígeno/óxido nitroso.

Preparación quirúrgica

Se colocó a los animales recostados dorsalmente y se preparó la región cervical ventral para cirugía. Se expusieron la arteria carótida izquierda y la vena yugular derecha. Se canuló la arteria con un catéter Portex® grande (vía amarilla) y se cortó a la longitud adecuada. Se canuló la vena con un catéter Silastic®. La anastomosis constaba de una línea de ``autoanalizador de 5 cm de longitud (vía morada/blanca). Las junturas a la anastomosis del lado arterial se efectuaron con tubos Silastic® de tamaño intermedio. La anastomosis se rellenó con salino antes de la exposición a la circulación. La arteria femoral derecha se canuló para la medición de la presión sanguínea.

Preparación del hilo e inserción

La sección central de la anastomosis contenía un hilo de 3 centímetros de largo. Consistía en un hilo de seda de coser Gutterman de calibre 000 para producir cuatro hebras con un solo nudo en el extremo. (La sección del nudo se encontraba fuera de la anastomosis).

Flujo sanguíneo

La velocidad del flujo sanguíneo vino determinada por el uso de sondas "Doppler" (Crystal Biotech). Se colocó una sonda silástica sobre la arteria carótida en el punto de inserción del catéter arterial. Se registró el flujo en un registrador gráfico utilizando papel térmico.

TABLA 3 Resultados

Tratamiento	Dosis	Peso del trombo tras 20 minutos	Actividad Antitrombótica
Control	No disponible	22,4 \pm 2,2 mg (n=5)
TRI 50b	10 mg/kg iv	9,78 \pm 1,9 mg (n=5)	Activa
	3,0 mg/kg iv	15,3 \pm 2,2 mg (n=5)	Activa
HEPARINA	100 u/kg iv	22,9 \pm 1,65 mg(n=4)	Inactiva
	300 u/kg iv	10,5 \pm 1,4 mg(n=4)	Activa (hemorragia grave)

Discusión

La tabla 3 muestra que, bajo condiciones de cizallamiento arterial alto, una dosis de TRI 50b de entre 3 mg/kg y 10 mg/kg iv inhibe de forma significativa la formación de trombos sin hemorragia, mientras que una dosis de heparina dentro del rango clínico normal para tratar la trombosis venosa (100 u/kg iv de heparina) resultó ineficaz. La mayor dosis de heparina, aunque resultó activa, causó una hemorragia grave. Estos resultados, los cuales muestran que el TRI 50b inhibe eficazmente la trombosis arterial sin causar hemorragia, son consistentes con la inhibición del TRI 50b de la actividad procoagulante de las plaquetas. Como contraposición, la heparina inhibidora de trombina, cuando se administró a una dosis aproximadamente igual de efectiva (en términos de inhibición de la trombosis arterial), produjo la hemorragia grave normal cuando se utilizan inhibidores de trombina para tratar la trombosis
arterial.

Ejemplo 38 Comparación de tiempos de hemorragia

El objetivo del estudio consistía en comparar los tiempos de hemorragia de la heparina con los del TRI 50b en un modelo adecuado. Se ha aceptado que la heparina es un pobre inhibidor de la actividad procoagulante de las plaquetas (J. Biol. Chem. 1978 Oct 10; 253(19):6908-16; Miletich JP, Jackson CM, Majerus PW1: J. Clin. Invest. 1983 Mayo; 71(5):1383-91).

Los tiempos de hemorragia vinieron determinados en un modelo de hemorragia de cola de rata tras la administración por vía intravenosa de heparina y TRI 50b. Las dosis empleadas fueron escogidas sobre la base de su eficacia en la rata Wessler y los modelos dinámicos y fueron como sigue:

TRI 50b:

5 y 10 mg/kg

Heparina:

100 unidades/kg

Materiales y procedimientos Anestesia

Las ratas se anestesiaron con pentabarbinona de sodio a 60 mg/kg (2,0 ml/kg de disolución de 30 mg/ml por inyección en paciente). Se suministró anestesia suplementaria i.p. si resultó necesario.

Preparación quirúrgica

Se canuló una vena yugular para la administración del compuesto de ensayo. También se canuló la tráquea con una cánula adecuada y se les dejó respirar a los animales "aire ambiente" de forma espontánea.

Administración del compuesto

Se les proporcionó mediante el medio adecuado a 1,0 ml/kg intravenosamente. Se administró la heparina en salino, mientras que se disolvió el TRI 50b en etanol, y se añadió posteriormente la disolución resultante a agua para su inyección (1 parte de etanol y 5 partes de agua).

Técnica

Dos minutos después de la administración del compuesto se seccionaron 2 mm de cola distal del animal con una hoja de bisturí nueva y se introdujo la cola en disolución salina caliente (37ºC) dentro de un contenedor "universal" estándar, de manera que fuese claramente visible la corriente sanguínea. El registro del tiempo de hemorragia se empezó inmediatamente después de la transección hasta el cese del flujo de sangre de la punta de la cola. Se dejó un tiempo adicional de 30 segundos después de que se hubo detenido el flujo de sangre de la cola para asegurar que no volviera a comenzar la hemorragia, si se volvía a producir hemorragia se continuaba con el tiempo de registro durante hasta un máximo de 45 minutos.

Resultados

La tabla 4 proporciona un resumen de los resultados de hemorragia y muestra los aumentos por encima de los valores de la línea de base.

TABLA 4 Tabla de resumen de resultados de hemorragia

Tratamiento	Tiempo de hemorragia en minutos (\pm SEM^{+})
Disolución salina	5,1 \pm 0,6
Heparina 100 u/kg iv	>40*
TRI 50b 5 mg/kg iv	11,3 \pm 1,2
TRI 50b 10 mg/kg iv	30,4 \pm 5,2
* Hemorragia grave en todos los animales sin cese después de 40 minutos.
^{+}SEM = error estándar de la media

Discusión

Los resultados muestran que el TRI 50b fue superior a la heparina (produjo menor hemorragia) en todas las dosis. Se debería tener en cuenta que cuando se comparan 100 u/kg de heparina con 5 mg/kg de TRI 50b, los animales tratados con heparina sangraron durante más tiempo que los que recibieron TRI 50b; se ha señalado previamente (Ejemplo 25) que la heparina a una dosis de 100 u/kg es un inhibidor menos eficaz de la trombosis arterial que el TRI 50b a una dosis de 3,0 mg/kg. La heparina es principalmente un inhibidor de trombina y un pobre inhibidor de la actividad procoagulante de las plaquetas; los resultados son, por tanto, consistentes con el hecho de que el TRI 50b ejerce una actividad anticoagulante mediante inhibición de la actividad coagulante de las plaquetas, además de la actividad de inhibición de trombina.

Ejemplo 39 El TRI 50b como un profármaco para el TRI 50c: Farmacocinética y Absorción Materiales y Procedimientos Animales

Se utilizaron ratas de un peso de alrededor de 250-300 g. Los animales ayunaron únicamente el día de su uso para el paso iv.

TABLA 5 Fase intravenosa

Tratamiento	Dosis mg/kg intravenosa	n
TRI 50b	1,0 mg/kg	3
TRI 50c	1,0 mg/kg	3

Dosis Formulación (TRI 50b/TRI 50c)

Estas se dosificaron en una formulación preparada como sigue: se disuelven 48 mg/ml de TRI 50b en etanol: PEG 300 (2:3 vol: vol). Justo antes de la administración, se mezclan 5 volúmenes de esta disolución con 3 volúmenes de kollidon 17 8F al 5%.

Fase intravenosa

Se administraron ambos compuestos a una dosis de 1,0 mg/kg por vía intravenosa.

Los compuestos se dosificaron en una formulación PEG/etanol/kollidon la cual se preparó inmediatamente antes, como se describe inmediatamente bajo el epígrafe "Dosis": Almacenaje 15,0 mg/ml. Esto se administró a una dosis de 1,33 ml/kg (equivalente a 30 mg/kg).

Muestreo de sangre

Se tomó una muestra previa de la dosis seguida de: 0, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 90 minutos después de la dosis.

Plasma

Este se obtuvo mediante centrifugación (3000 RPM durante 10 minutos) y se almacenó a -20ºC antes del análisis.

Resultados Análisis farmacocinético TABLA 6 Datos farmacocinéticos intravenosos

	TRI 50b	TRI 50c
Eliminación de media vida: minutos	35 minutos	36,6 minutos
Área bajo la curva	1,68	1,48
Tiempo Medio de Residencia	46 minutos	45 minutos
Espacio libre: ml/min/kg	10	11,3
Litros de Distribución de Volumen/Kg	0,5	0,59
Máxima Concentración de Plasma (observada)	2,24	2,35

Se representan los siguientes resultados en la Figura 2:

Fig. 2: espacio y cinética de la fase intravenosa tras una única dosis de TRI 50b o su ácido libre (TRI 50c). La figura muestra los datos de ensayo observados.

Conclusión

La cinética intravenosa fue similar tanto para el TRI 50b como para el TRI 50c. Los datos son consistentes con el hecho de que el TRI 50b se hidroliza rápidamente en plasma a TRI 50c y con TRI 50c siendo un principio activo.

Los resultados de los ejemplos de 36 a 39 indican que la administración del TRI 50c como una sal proporcionará una forma de tratamiento de la trombosis arterial y/o venosa.

Ejemplo 40 Administración intravenosa de la sal de sodio del TRI 50c

Se estudió la farmacocinética (PK) y la farmacodinámica (PD) de la sal de sodio del TRI 50c en perros de raza beagle tras administración intravenosa.

Se midió la PD como tiempo de trombina y APTT utilizando un coagulómetro automatizado. Las concentraciones de plasma fueron medidas utilizando un procedimiento LCEM /EM.

La sal de monosodio TRI 50c (108,8 g) se disolvió en cloruro de sodio al 0,9% (100 ml) y se administró la dosis por vía intravenosa a 1,0 mg/kg (1,0 ml/kg durante 30 segundos). Se tomaron muestras de sangre en citrato de tri-sodio al 3,8% (1 + 8) antes de la dosis, a 2, 5, 10, 20, 30, minutos tras dosis y después a las 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 y 24 horas después de la dosis. Se preparó el plasma mediante centrifugación y se congeló a menos 20ºC pendiente de análisis.

Resultados

Se toleró bien la sal de sodio sin efectos adversos durante la duración total del estudio.

Los perros machos y hembras respondieron de forma similar con una farmacodinámica C máxima: a 2 minutos (tiempo de trombina de 154 segundos elevado desde una línea base de 14,3 segundos). El tiempo de trombina fue de 26 segundos a una hora después de la dosis.

Existió una relación terapéutica excepcionalmente buena entre el tiempo de coagulación de trombina en perros que recibieron la sal de sodio a una dosis de 1,0 mg/kg por vía intravenosa. Se elevó el tiempo de coagulación de trombina 10,8 veces por encima de la línea de base (154,4 segundos a partir de 14,3 segundos) dos minutos tas la dosificación, en comparación con una elevación de sólo 1,3 veces en el APTT (de 19 segundos a 25 segundos después de la
dosis).

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Ejemplo 41 Estudios clínicos en humanos

En estudios clínicos sobre humanos voluntarios con dosis hasta 2,5 mg/kg i.v. (dosificaciones que prolongan significativamente el tiempo de coagulación de la trombina), el TRI 50b no tuvo efecto alguno sobre el tiempo Simplate de hemorragia (p.e., tiempo de hemorragia medido utilizando un dispositivo de tiempo de hemorragia Simplate®).

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Ejemplo 42 n-heptano residual de la sal de calcio del TRI 50c

Se sometió a ensayo la sal preparada siguiendo los procedimientos de los Ejemplos 1 y 3 mediante cromatografía de gas de cámara de aire. A continuación se muestran los datos:

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100

101

102

103

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Ejemplo 43 Cromatogramas HPLC

Se analizaron la sal de monosodio del TRI 50c creada mediante el procedimiento de los Ejemplos 1, 2 y 3 y la sal de hemicalcio del TRI 50c creada mediante el procedimiento de los Ejemplos 1, 2 y 4 mediante cromatografía HPLC.

1. Procedimiento 1.1 Equipamiento y software

	Muestreador automático	Waters Alliance 2795
	Bomba	Waters Alliance 2795
	Horno de columna	Waters Alliance 2795
	Detección	Ordenación de diodos Waters 2996,
		cuadro simple MS-ZQ
	Versión de software	Waters Millennium 4.0

1.2 Fase estacionaria

	Identificación de la columna analítica	S-71
	Material	XTerra^{TM} MS C_{18}, 5 \mum
	Proveedor	Waters, Eschborn, Alemania
	Dimensión	150 mm x 2,1 mm (largo, diámetro interior)
	Diámetro interior de precolumna	sin precolumna

\newpage

Xterra MS C_{18}, 5 \mum es un material de embalaje suministrado por columna de Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, MA 01757, EE.UU. y oficinas locales, como en los años 2002/2003. Comprende partículas híbridas orgánicas/inorgánicas, constituido por partículas esféricas de 5 \mum de tamaño, 125 \ring{A} de tamaño de poro y 15,5% de carga de carbono.

1.3 Fase móvil

Fase acuosa:

A: H_{2}O + 0,1% HCOOH

Fase orgánica:

C: ACN

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H_{2}O = H_{2}O mediante el sistema de purificación de agua Ultra Clear

ACN = acetonitrilo de grado de gradiente

Condiciones de gradiente

tiempo [min]	A%	C%	flujo [mL/min]	forma de gradiente
0,0	90,0	10,0	0,5
27,00	10,0	90,0	0,5	lineal
27,10	90,0	10,0	0,5	lineal
30,00	90,0	10,0	0,5	lineal

1.4 Parámetros instrumentales

	Flujo	0,5 mL-min^{-1}
	Temperatura	40 \pm 5°C
	Control HPLC	Waters Millennium Release 4.0
	Cálculo	Waters Millenium 4.0

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2. Parámetros 2.1 Longitud de onda/tiempo de retención/factores de respuesta TABLA Parámetro de retención y detección (k' F: 0,5 ml/minuto, t0 = 0,9 mL/ minuto)

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Sustancia	Tiempo de ret.	\lambda [nm]	m/z	factor de respuesta	Factor de respuesta
	[min]			[área/\mug]	recíproco
TRI 50c	11,68	258	508,33	660	1
Alcohol de bencilo	3,862	258	n.d.	1960	0,337
Benzaldehído	6,13	258	n.d.	79939	0,0083
Ácido benzoico	5,52	258	n.d.	5967	0,111
Impureza I	11,18	258	396,17	886	0,745
Impureza II	13,39	258	482,22	552	1,196

2.2 Linealidad Rango de linealidad 4000 - 10 \mug/mL (detección UV 258 nm)

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Tabla de linealidad, datos UV 258nm

Disolución de calibración	área [\muAU's]	conc. pretendida [\mug/mL]	conc. encontrada^{1} [\mug/mL]
Tri 50c	5353	10	20,44
Tri 50c	5301	10	20,37
Tri 50c	65809	100	113,35
Tri 50c	66365	100	114,17
Tri 50c	172019	250	270,43
Tri 50c	162587	250	256,48
Tri 50c	339503	500	518,13
Tri 50c	326912	500	499,51
Tri 50c	659257	1000	991,02
Tri 50c	647495	1000	973,63
Tri 50c	1322371	2000	1971,72
Tri 50c	1305196	2000	1946,32
Tri 50c	2724410	4000	4045,24
^{1} recalculada con ecuación lineal

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Parámetros de ecuación lineal

Y

= \hskip0,5cm 6,75e+002 X - 8,45e+003

r

= \hskip0,5cm 0,99975

r^{2}

= \hskip0,5cm 0,99950

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Rango de linealidad 10 -0,10 \mug/mL (detección SIR m/z 508,33) TABLA Datos de linealidad SIR 508,33

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Disolución de calibración	área media [\muAU's]	conc. pretendida [\mug/mL]	conc. encontrada^{1} [\mug/mL]
Tri 50c	2188860	0,01	0,022
Tri 50c	2702839	0,01	0,045
Tri 50c	3817226	0,1	0,094
Tri 50c	3833799	0,1	0,095

TABLA (continuación)

Disolución de calibración	área media [\muAU's]	conc. pretendida [\mug/mL]	conc. encontrada^{1} [\mug/mL]
Tri 50c	23153550	1	0,947
Tri 50c	24646892	1	1,013
Tri 50c	223007852	10	9,765
Tri 50c	233753043	10	10,239
^{1} recalculada con ecuación lineal

Parámetro de ecuación

Y

= \hskip0,5cm 2,27e+007 X + 1,69e+006

r

= \hskip0,5cm 0,99958

r^{2}

= \hskip0,5cm 0,99916

\vskip1.000000\baselineskip

2.3 Límite de cuantificación

El límite de cuantificación se determinó utilizando el criterio de relación de señal a ruido S/R > 19,

UV 258 nm:

10 \mug/mL

M/z 508,3:

0,1 \mug/mL

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2.4 Precisión

Inyección	Concentración	Área [\mug/mL]	Cantidad	Tiempo de retención
	pretendida			[min]
	[\mug/mL]
1	250	165805	261,24	11,690
2	250	168644	265,44	11,662
3	250	167858	264,27	11,686
4	250	166947	262,93	11,692
5	250	166925	262,89	11,679
6	250	166294	261,96	11,696
Media		167079	263,12	11,684
Desviación estándar		1033	1,528	0,01
% RSD		0,6	0,6	0,1

2.5 Robustez TABLA Datos de robustez; disolución acuosa de 250 \mug/mL estándar (que contiene < 1% de ACN)

Disolución de calibración	temp./tiempo [°C/h]	área [\muAU's]	recuperación [%]
250 \mug/mL Tri50c	-	172020	-
250 \mug/mL Tri50c	4ºC. 16 h	166294	96,67
2,5 \mug/mL TRI50c	-	88034891	-
2,5 \mug/mL TRI50c	37ºC. 4 h	88833175	100,9

Referencias

1. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE. TEXT ON VALIDATION OF ANALITICAL PROCEDURES Recomendado para la Adopción de la Etapa 4 del Procedimiento ICH el 27 de octubre de 1994 por parte del ICH Steering Committee

2. FDA Reviewer Guidance. Validation of chromatographic methods. Center for Drug Evaluation and Research. Nov. 1994

3. USP 23. <621> Cromatography

4. L. Huber. Validation of analytikal Methods. LC-GC International Feb. 1998

5. Handbuch Validierung in der Analytik. Dr. Stavros Kromidas (Ed.) Wiley-VCH Verlag. 2000. ISBN 3-527-29811-8

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3. Resultados 3.1 Nombre de la muestra: Sal de monosodio de TRI 50c

Volumen de inyección: 10 \muL

	Nombre	Tiempo de ret (Min)	Área %	Área [\muAU's]	Altura punta \muAU
	TRI 50c	12,136	100,0000	604,27228	32,05369

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3.2 Nombre de la muestra: Sal de hemicalcio de TRI 50c

Volumen de inyección: 10 \muL

	Nombre	Tiempo de ret (Min)	Área %	Área [\muAU's]	Altura punta \muAU
	TRI 50c	12,126	100,0000	597,11279	32,29640

Los procedimientos revelados se han utilizado para obtener sales sustancialmente libres de productos de degradación del enlace C-B, en particular sales que no contienen tales productos en una cantidad detectable mediante HPLC, específicamente mediante el procedimiento del Ejemplo 43. Los procedimientos revelados se han utilizado para obtener sales sustancialmente libres de Impureza I, en concreto, sales que no contienen la Impureza I en una cantidad detectable mediante HPLC, específicamente, mediante el procedimiento del Ejemplo 43. Los procedimientos revelados se han utilizado para obtener sales sustancialmente libres de la Impureza IV, en particular, sales que no contienen la Impureza IV en una cantidad detectable mediante HPLC, específicamente mediante el procedimiento del
Ejemplo 43.

Ejemplo 44 Determinación de exceso diastereomérico

El TRI 50b, en bruto, contiene tres centros quirales. Dos de ellos se han fijado mediante el uso de aminoácidos enantioméricamente ((R)-Phe and (S)-Pro). El tercero se forma durante la síntesis. El epímero favorecido es el TRI 50b deseado, Isómero I (R,S,R-TRI 50b). Ambos epímeros del TRI 50b están claramente separados por la línea base mediante el procedimiento de HPLC, permitiendo así la determinación del exceso diasteromérico (de) de TRI 50b.

El TRI 50d no es estable en condiciones aplicadas para la determinación de la pureza del HPLC, pero se descompone rápidamente en la preparación de muestra en TRI 50c, de manera que el TRI 50d y el TRI 50c muestran las mismas trazas de HPLC.

Los dos isómeros del TRI 50c no están separados por la línea base en HPLC, pero ambos isómeros son claramente visibles. Esto llega a ser obvio, cuando el TRI 50b, en bruto (mezcla de ambos isómeros) se convierte con ácido fenilborónico en TRI 50c, en bruto. Ambos isómeros del TRI 50c se observan en la HPLC casi a la misma relación que antes en el TRI 50b, en bruto.

En la síntesis del TRI 50d a partir del TRI 50b, en bruto, sólo se precipita un diastereómero. En este caso el HPLC muestra únicamente un pico para el TRI 50c, donde se observa un frente muy pequeño. La precipitación a partir del diclorometano/dielitéter elimina el frente de forma eficaz. El nivel de eliminación del Isómero II no puede cuantificarse mediante este procedimiento de HPLC. Por tanto las muestras antes de la reprecipitación y después de una y dos reprecipitaciones se esterificaron con pinacol y las muestras resultantes de TRI 50b se analizaron mediante HPLC. Así se determinó un de del 95,4% para la muestra en bruto. La muestra nuevamente precipitada resultó en un de del 99,0% y finalmente la muestra que se volvió a precipitar dos veces mostró un de del 99,5%.

Estos resultados muestran claramente la precipitación preferida del Isómero I, mientras que el Isómero II permanece en disolución.

Se puede apreciar de lo anterior que la revelación proporciona sales de ácido borónico útiles para propósitos farmacéuticos y que contienen uno o más de los siguientes atributos: (1) mejora de la estabilidad hidrolítica; (2) mejora de la estabilidad contra la desboración; y (3), en cualquier caso, no sugerido por la técnica anterior.

Claims (91)

1. Una formulación farmacéutica parenteral que comprende una sal de adición de base farmacéuticamente aceptable de ácido borónico de la fórmula (I):

25

donde

Y comprende una fracción hidrófoba la cual, junto con el residuo de aminoácido borónico

-NHCH(R^{9})-B(OH)_{2}, tiene afinidad por el lugar de enlace del substrato de trombina; y

R^{9} es un grupo alquilo de cadena recta interrumpido por uno o más enlaces de éter y en el cual el número total de átomos de oxígeno y carbono es 3, 4, 5 ó 6 o R^{9} es -(CH_{2})_{m}-W donde m es 2, 3, 4 ó 5 y W es -OH o halógeno (F, Cl, Br o I),

y, donde el YCO- es un residuo dipeptídico opcionalmente protegido N-terminalmente, los enlaces peptídicos en el ácido están opcionalmente e independientemente N-sustituidos por un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{13} que contiene opcionalmente nitrógeno, oxígeno o sulfuro en cadena o en anillo y sustituido opcionalmente por un sustituto seleccionado de halo, hidroxi y trifluorometilo.

2. Una formulación de la reivindicación 1 en la que R^{9} es un grupo alcoxialquilo.

3. Una formulación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la que todos los enlaces peptídicos en el ácido están insustituidos.

4. Una formulación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la que dicho grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{13} es un grupo hidrocarbilo saturado C_{1}-C_{6}.

5. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que YCO- comprende un aminoácido el cual se enlaza al subsitio S2 de trombina, estando el aminoácido unido N-terminalmente a un resto el cual se enlaza el subsitio S3 de trombina.

6. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que YCO- es opcionalmente un dipéptido N-terminalmente protegido el cual enlaza a los sitios de unión S3 y S2 de trombina.

7. Una formulación de la reivindicación 6 donde dicho dipéptido está N-terminalmente protegido.

8. Una formulación de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en la que Y contiene un residuo de P3 el cual tiene una cadena lateral de la fórmula (B):

(B)-(CO)_{a}-(CH_{2})_{b}-D_{c}-C_{e}(E^{1})(E^{2})(E^{3})

donde

a es 0 ó 1;

e es 1;

b es 0 o un número entero tal como (b+e) de 1 a 4;

c es 0 ó 1;

D es O o S;

los E^{1}, E^{2} y E^{3} se seleccionan cada uno independientemente de entre -R^{15} y -J-R^{15}, donde J es un anillo de 5-6 miembros y -R^{15} se selecciona de entre trialquilsililo C_{1}-C_{6}, -CN, -R^{13}, -R^{12}OR^{13}, -R^{12}COR^{13}, -R^{12}CO_{2}R^{13}, -R^{12}O_{2}CR^{13}, y uno o dos halógenos, en los que R^{12} es -(CH_{2})_{f}- y R^{13} es -(CH_{2})_{g}H en los que f y g son cada uno independientemente de 0 a 10, siempre que (f+g) sea 1, 2, 3 ó 4.

9. Una formulación de la reivindicación 8 en la que, cuando E^{1}, E^{2} o E^{3} contengan un grupo R^{13}, g es 0 ó 1.

10. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en la que YCO- comprende un residuo de P2 el cual es un residuo de un aminoácido.

11. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en la que el residuo dipeptídico comprende un residuo de aminoácido P3 de configuración (R) y un residuo P2 de configuración (S), y en la que el residuo -NHCH(R^{9})-B(OH) es de configuración R.

12. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la que el ácido borónico tiene una Ki para trombina de aproximadamente 100 nM o menor.

13. Una formulación de la reivindicación 12 en la que el ácido borónico tiene una Ki para trombina de alrededor de 20 nM o menor.

14. Una formulación de la reivindicación 1 donde el ácido borónico es de la fórmula (II):

26

donde:

X es H (para formar NH_{2}) o un grupo aminoprotector;

aa^{1} es un aminoácido que tiene una cadena lateral de hidrocarbilo que contiene no más de 20 átomos de carbono y comprende al menos un grupo cíclico que tiene hasta 13 átomos de carbono;

aa^{2} es un iminoácido que tiene de 4 a 6 miembros de anillo o está N-sustituido en Gly por un grupo hidrocarbilo C_{3}-C_{13};

R^{1} es un grupo de la fórmula -(CH_{2})_{s}-Z, donde s es 2, 3 ó 4 y Z es -OH, -OMe, -OEt o halógeno (F, Cl, Br o I).

15. Una formulación de la reivindicación 14 en la que aa^{1} se selecciona de Phe, Dpa y análogos total o parcialmente hidrogenados de los mismos.

16. Una formulación de la reivindicación 14 en la que aa^{1} se selecciona de entre Dpa, Phe, Dcha y Cha.

17. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en la que aa^{1} es de configuración (R).

18. Una formulación de la reivindicación 14 en la que aa^{1} es (R)-Phe o (R)-Dpa.

19. Una formulación de la reivindicación 14 en la que aa^{1} es (R)-Phe.

20. Una formulación de cualquiera de la reivindicaciones de 14 a 19 en la que aa^{2} es un residuo de un iminoácido de la fórmula

27

donde R^{11} es -CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -S-CH_{2}-, S-C(CH_{3})_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, cuyo iminoácido, cuando el anillo es de 5 ó 6 miembros, se sustituye opcionalmente por uno o más grupos -CH_{2}- mediante de 1 a 3 grupos alquilo C_{1}-C_{3}.

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21. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones entre 14 y 20 en la que aa^{2} es de configuración (S).

22. Una formulación de la reivindicación 20 en la que aa^{2} es un residuo de prolina (S).

23. Una formulación de la reivindicación 14, en la que aa^{1}-aa^{2} es (R)-Phe-(S)-Pro.

24. Una formulación de cualquiera de las reclamaciones 14 a 23 en la que el residuo -NH-CH(R^{1})-B(OH)_{2} es de configuración (R).

25. Una formulación de cualquiera de las reclamaciones 14 a 24 en la que R^{1} es 2-bromoetilo, 2-cloroetilo, 2-metoxietilo, 3-bromopropilo, 3-cloropropilo o 3-metoxipropilo.

26. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24 en la que R^{1} es 3-metoxipropilo

27. Una formulación de la reivindicación 14 en la que el ácido borónico es de fórmula (VIII):

(VIII).X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2}

28. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 27 donde X es R^{6}-(CH_{2})_{p}-C(O)-, R^{6}-(CH_{2})_{p}-S(O)_{2}-, R^{6}-(CH_{2})_{p}-NH-C(O)- o R^{6}-(CH_{2})_{p}-O-C(O)-, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 y R^{6} es H o un grupo cíclico de 5-13 miembros opcionalmente sustituido mediante 1, 2 ó 3 sustituyentes seleccionados de grupo halógeno, amino, nitro, hidroxi o C_{5}-C_{6} cíclico, alquilo C_{1}-C_{4} y alquilo C_{1}-C_{4} que contiene, y/o enlaza con el grupo cíclico a través de un O dentro de la cadena, estando los grupos alquilo anteriormente mencionados opcionalmente sustituidos mediante un sustituto seleccionado de grupo halógeno, amino, nitro, hidroxi y C_{5}-C_{6} cíclico.

29. Una formulación de la reivindicación 28 en la que dicho grupo cíclico de 5-13 miembros es aromático o heteroaromático.

30. Una formulación de la reivindicación 29 en la que dicho grupo cíclico de 5-13 miembros es fenilo o un grupo heteroaromático de 6 miembros.

31. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 en la que X es R^{6}-(CH_{2})_{p}-C(O)- o R^{6}-(CH_{2})_{p}-O-C(O)- y p es 0 ó 1.

32. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 26 en la que X es benciloxicarbonilo.

33. Una formulación de la reivindicación 14 en la que el ácido borónico es Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B
(OH)_{2}.

34. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal no contiene una sal de colina o de amonio.

35. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en la que la sal comprende iones borato derivados del ácido borónico y contraiones monovalentes.

36. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en la que la sal es una sal del ácido borónico peptídico con un metal alcalino o un compuesto que contiene nitrógeno orgánico fuertemente básico.

37. Una formulación de la reivindicación 36 en la que el compuesto de nitrógeno orgánico fuertemente básico tiene un pKb de aproximadamente 7 o más, p.e., alrededor de 7,5 o más.

38. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 en la que la sal es una sal de ácido borónico con un metal.

39. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 ó 37 en la que la sal es una sal del ácido borónico con un metal alcalino, un aminoazúcar, una guanidina o una amina de fórmula (XI):

28

donde n es de 1 a 6, R^{2} es H, carboxilato o carboxilato derivatizado, R^{3} es H, alquilo C_{1}-C_{4} o un residuo de un aminoácido natural o no natural.

40. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de L-arginina.

41. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de L-lysina.

42. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de potasio.

43. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de sodio.

44. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de litio.

45. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de glutamina, p.e. es una sal de N-metil-D-glucamina.

46. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de calcio o magnesio.

47. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46 en la que la sal comprende iones borato derivados del ácido borónico peptídico y tiene una estequiometría consistente con los iones borato que llevan una carga simple negativa.

48. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47 en la que la sal comprende un ión borato derivado del ácido borónico peptídico y un contraión donde la sal consiste esencialmente en una sal que tiene un único tipo de contraión.

49. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 en la que la sal es una sal de monolitio.

50. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 en la que la sal es una sal de monosodio.

51. Una formulación de la reivindicación 1 en la que la sal es la sal de monosodio de Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2}.

52. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 la cual comprende adicionalmente un diluyente, excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable.

53. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 en la que la sal está seca.

54. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 la cual está adaptada para administración intravenosa.

55. Una formulación de la reivindicación 54 la cual incluye un agente de tonicidad.

56. Una formulación de la reivindicación 54 ó 55 la cual está en una forma que requiere reconstitución antes de la administración.

57. Una formulación de la reivindicación 54 ó 55 la cual está en forma de una disolución.

58. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 53 la cual está adaptada para administración subcutánea.

59. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 35 la cual esté adaptada para administración intravenosa y comprende una disolución que contiene como la sal las siguientes primera y segunda especies y opcionalmente otros componentes, por ejemplo un agente de tonicidad o un tampón:

a)

una primera especie seleccionada de entre (a) ácidos borónicos de fórmula (I) o, como puede ser el caso, de fórmula (II), (b) aniones boratos de los mismos y (c) cualquier forma en equilibrio de lo anterior; y

b)

una segunda especie seleccionada del grupo constituido por iones de metal alcalino farmacéuticamente aceptables y compuestos que contienen nitrógeno orgnicos básicos que tienen un pKb de aproximadamente 7 o más (compuestos los cuales se entenderá comprenden los compuestos en forma protonada),

en la que la formulación tiene una estequiometría observada la cual debería ser consistente con la primera especie de iones borato que llevan una carga negativa única.

60. Una formulación de la reivindicación 59 la cual tiene una Ki para trombina de alrededor de 20 nM o menos.

61. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 60 la cual contiene una cantidad traza de un disolvente alifático o cicloalifático.

62. Una formulación de la reivindicación 61 en la que el disolvente es un n-alcano, opcionalmente n-heptano.

63. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62 en la que R^{9} (en el caso de una formulación que contiene una sal de ácido borónico de la fórmula (I)) o R^{1} (en el caso de una formulación que contiene una sal de ácido borónico de la fórmula (II)) es un grupo alcoxialquilo el cual puede representarse como R^{Z}-O-R^{Y}- y la formulación está libre de una especie de borato de impureza cuya estructura corresponde a aquella de la especie de la fórmula (I) o de la fórmula (II) cuando R^{9} o, como puede ser el caso, R^{1} se reemplace por un grupo alquilo R^{Y}.

64. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 63 la cual está sustancialmente libre de cualquier producto de degradación resultante de la escisión del enlace C-B.

65. Una formulación de la reivindicación 14 o cualquiera de las reivindicaciones 15 a 64 en combinación con la reivindicación 14 en la cual los iones de borato en los cuales aa^{1} es de configuración (R), aa^{2} es de configuración (S) y el residuo -NH-CH(R^{1})-B(OH)_{2} es de configuración (R) están en un exceso diastereomérico del 99% o superior, p.e., del 99,5% o más.

66. Una formulación de la reivindicación 33 o de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 62 ó 65 en combinación con la reivindicación 33 la cual está sustancialmente libre del compuesto:

29

67. Una formulación de la reivindicación 33 o de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 62 ó 65 en combinación con la reivindicación 33 o de la reivindicación 66 la cual está sustancialmente libre del compuesto:

30

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y sus formas de equilibrio.

68. Un producto para usar como un producto farmacéutico parenteral, que comprende una sal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51.

69. Un producto de la reivindicación 68 el cual tiene las características eumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67.

70. El uso de una sal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, o de una sal como se define en cualquiera de dichas reivindicaciones y que tiene las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67, para la fabricación de un medicamento parenteral para tratar trombosis por medio de profilaxis o terapia.

71. El uso de una sal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 51, o de una sal como se define en cualquiera de dichas reivindicaciones y que tiene las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 62, para la fabricación de un medicamento parenteral para prevenir trombosis en un circuito de hemodiálisis de un paciente, para prevenir un evento cardiovascular en un paciente con enfermedad renal en fase terminal, para prevenir eventos tromboembólicos venosos en un paciente que recibe quimioterapia a través de un catéter permanente, o para prevenir eventos tromboembólicos en un paciente que sufre un procedimiento reconstructivo arterial de miembros inferiores.

72. El uso de una sal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, o de una sal como se define en cualquiera de dichas reivindicaciones y que tiene las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67, para la fabricación de un medicamento oral para tratar por medio de terapia o profilaxis una enfermedad arterial seleccionada de síndromes coronarios agudos, trombosis cerebrovascular, oclusión arterial periférica y trombosis arterial resultante de fibrilación atrial, enfermedad cardiaca valvular, anastomosis arteriovenosas, catéteres permanentes o stents coronarios.

73. El uso de la reivindicación 70, reivindicación 71 o reivindicación 72 en las que el medicamento es un medicamento intravenoso, bien para su uso directamente o bien después de la reconstitución.

74. Una formulación farmacéutica parenteral que comprende una combinación de (i) una sal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 51, o una sal como se define en cualquiera de dichas reivindicaciones y que tiene las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67 y (ii) un agente farmacéuticamente activo adicional, p.e. otro agente de tratamiento cardiovascular, por ejemplo un fármaco para la disminución de lípidos, un fibrato, niacina, una estatina, un inhibidor de CETP, un secuestrante de ácido biliar, un antioxidante, un antagonista de IIb/IIIa, un inhibidor de aldosterona, un antagonista de A2, un agonista de A3, un beta-bloqueante, ácido acetilsalicílico, un diurético de bucle, un inhibidor de ACE, un agente antitrombótico con un mecanismo de acción diferente, un agente antiplaquetas, un receptor de tromboxano y/o un inhibidor de sintetasa, un antagonista de receptor de fibrinógeno, un mimético de prostaciclina, un inhibidor de fosfodiesterasa, un antagonista de receptor de ADP (P_{2} T), un trombolítico, un protector cardiaco o un inhibidor de COX-2.

75. El uso de una sal definida en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 51, o de una sal como se define en cualquiera de dichas reivindicaciones y que tiene las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67, para la fabricación de un medicamento parenteral para tratar, por ejemplo previniendo, un trastorno cardiovascular en coadministración con otro agente de tratamiento cardiovascular, por ejemplo uno de los enumerados en la reivindicación 74.

76. Un medicamento parenteral que comprende una sal de un ácido borónico el cual es un inhibidor selectivo de trombina y que tiene un residuo de ácido aminoborónico neutro capaz de enlazarse al subconjunto S1 de trombina enlazado a través de un enlace peptídico a un resto hidrófobo capaz de enlazar con los subsitios S2 y S3 de trombina, la sal comprenderá un catión que tiene una valencia n y que tiene una estequiometría observada consistente con una estequiometría nocional (ácido borónico:catión) de n:1.

77. Un medicamento de la reivindicación 76 en el que el ácido borónico tiene una Ki para trombina de aproximadamente 100 nM o menos, y opcionalmente de aproximadamente 20 nM o menos.

78. Un producto para administración intravenosa después de la reconstitución y que comprende, en forma de un sólido finamente dividido, una sal constituida esencialmente por una sal de monosodio o monolitio de un ácido de la fórmula Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2}, estando la sal opcionalmente en mezcla con uno o más antioxidantes, conservantes u otros aditivos.

79. Un producto para administración intravenosa que comprende, en forma de una disolución acuosa isotónica, una sal constituida esencialmente por una sal de monosodio o monolitio de un ácido de la fórmula Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2}, el producto contendrá adicionalmente opcionalmente uno o más antioxidantes, conservantes u otros aditivos.

80. El producto de la reivindicación 78 o la reivindicación 79 el cual tiene adicionalmente las características enumeradas en una o una combinación permitida de las reivindicaciones 61 a 67.

81. Un procedimiento para fabricar una formulación farmacéutica parenteral, que comprende:

hacer reaccionar un ácido borónico como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 33 con una base farmacéuticamente aceptable; y

formular el producto de reacción resultante en la formulación.

82. Un procedimiento de la reivindicación 81 el cual comprende adicionalmente obtener el ácido organoborónico mediante:

formar una disolución de un éster de diol del ácido borónico como se define en las reivindicaciones 1 a 33;

la combinación de la combinar la disolución con dietanolamina y permitir u ocasionar que la dietanolamina reaccione con el éster para formar un precipitado insoluble;

recuperar el precipitado;

convertir el precipitado en un ácido borónico libre.

83. Un procedimiento de la reivindicación 82 en el que el éter es éter dietílico y el éster es un éster de pinacol.

84. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83 en el que la base es un compuesto que contiene nitrógeno orgánico que tiene una pKb de 7 o más o de es una base de un metal.

85. Un procedimiento de la reivindicación 84 en el que la base orgánica tiene una pKb de 7,5 o más y no es colina o amoniaco.

86. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83 en el que la base es de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo.

87. Un procedimiento de la reivindicación 86 en el que la base es una base de sodio.

88. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 87 en el que el ácido borónico es como se define en cualquiera de la reivindicaciones 27 a 32.

89. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 87 en el que el ácido borónico es

Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)_{2}.

90. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 88 en el que la formulación comprende dicho producto de reacción en forma sólida para la reconstitución para administración intravenosa.

91. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 81 a 88 en el que la formulación es una formulación líquida intravenosa en un transportador de base acuosa.