CN101795672A - 硼酸化合物的脂质体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述一种由脂质体构成的脂质体组合物，所述脂质体具有包封于其中的肽硼酸蛋白酶体抑制剂化合物。更具体而言，将具有包封于内部水性隔室内的式I或II化合物的脂质体装载肽硼酸化合物，以在所述脂质体水性隔室内形成硼酸酯化合物。在一个实施例中，所述脂质体具有亲水聚合物链的外包衣并用于在受试者治疗实体肿瘤。

Description

硼酸化合物的脂质体制剂
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2007年8月21日提交的美国临时专利申请序列号60/957,045的优先权，藉此将该专利以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明提供包含硼酸化合物特别是肽硼酸化合物的脂质体组合物。更具体而言，本发明提供包含肽硼酸化合物和如下面定义的式I和/或式II化合物的脂质体组合物。
背景技术
脂质体(或脂质双层小泡)是由可包封水相的同心有序脂质双层构成的圆形小泡。脂质体可作为包含于水相或脂质双层中的治疗和诊断剂的递送载体。以脂质体包封形式递送药物可提供许多优势，视药物而定，包括例如降低药物毒性、改变药代动力学或提高药物溶解度。脂质体在被配制成包括亲水聚合物链的表面包衣，即所谓的
Figure GPA00001040294300011
或长循环脂质体时，可提供另一优势即长的血液循环寿命，这部分归因于单核吞噬细胞系统对脂质体的清除减少。通常，延长的寿命是必要的，以使脂质体从注射部位到达它们的理想靶区域或细胞。
理想的是，可制备这类脂质体以包括被包封的治疗或诊断化合物，其(i)具有高的载药效率，(ii)被包封化合物的浓度高，和(iii)处于稳定的形式，即在储存期间几乎没有化合物渗漏。一类尤其令人感兴趣的治疗化合物为肽硼酸化合物，其为在肽序列的酸性末端或C-端含有a-氨基硼酸的肽蛋白酶体抑制剂化合物。一种该类肽硼酸化合物为硼替佐米，以前称作PS-341(
Figure GPA00001040294300012
Millennium Pharmaceuticals，Inc，Cambridge，MA)。硼替佐米为二肽硼酸衍生物并被合成为Ki为0.6nmol/L的高选择性、强效、可逆蛋白酶体抑制剂(Adams，Semin.Oncol.28(6)：613-619(2001))。使用国家癌症中心(National Cancer Institute)的体外筛选，硼替佐米显示出对一系列肿瘤系的细胞毒性(Adams，同上)并对人前列腺癌异种移植物模型(Frankel等人，Clin.Cancer Res.6(9)：3719-3728(2000)；DiPaola等人，Hematol.Oncol.Clin.North Am.15(3)：509-524(2001))和肺癌异种移植物模型(Oyaizu等人，Oncol.Rep.8(4)：825-829(2001))具有抗肿瘤活性。
由具有包封于脂质体中的肽硼酸蛋白酶体抑制剂化合物的脂质体构成的脂质体组合物在国际申请案WO 2006/052734中有所描述，该申请案于2006年5月18日在专利合作条约(Patent Cooperation Treaty)下出版。肽硼酸化合物以硼酸酯的形式包封于脂质体中，该硼酸酯是在与脂质体包封的多元醇反应后形成的。在一个实施例中，脂质体包封的多元醇为含有醇羟基基团的单体或多聚体化合物，其中所述多元醇可为脂族化合物、环状化合物二醇、多酚等。在另一个实施例中，单体多元醇包括糖类、甘油、二醇类、碳水化合物、氨基糖类(尤其是氨基-山梨醇)、糖-醇类、脱氧山梨醇、葡糖酸、酒石酸、没食子酸等。
期望将该肽硼酸化合物包封于脂质体载体中。然而，如何有效装载这些相对非极性的二肽并使它们以稳定的被包封形式滞留在脂质体存在困难。更具体而言，本主题涉及用可改善肽硼酸化合物在脂质体内的装载和滞留的组分制备的脂质体。
发明内容
因此，本发明的一个目标在于提供包含稳定包封于脂质体中的肽硼酸化合物的脂质体组合物。
另一目标为提供具有以肽硼酸酯的稳定形式包封于脂质体中的肽硼酸化合物的脂质体混悬液。
在一个实施例中，提供一种脂质体组合物，其包含稳定包封于脂质体中的肽硼酸化合物，其中所述肽硼酸化合物为二肽基硼酸化合物。一种示例性的二肽基硼酸化合物为硼替佐米。
在一方面，本发明提供一种组合物，其包含由小泡形成脂质形成的脂质体和包封于所述脂质体中的硼酸酯化合物，该硼酸酯化合物由肽硼酸化合物和式I化合物及其任何对映异构体或非对映异构体构成。
式I
Figure GPA00001040294300021
Figure GPA00001040294300031
R1＝(H，A)
R2＝(H，A)
R3＝(H，A)
R4＝(H，A)
R5＝(H，A)
R6＝(H，A)
R7＝(H，A)
Figure GPA00001040294300032
Y＝(---H，---B，---E)
Figure GPA00001040294300041
(n＝1，2，3，4)
其中X、Y、A、B、E、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如上文所述，然而前提条件是Y、R1、R2、R3、R4和R5不各自为H。
在另一个实施例中，式I化合物为其中Y为H的化合物。一种示例性化合物中Y为H并且R1为H。另一示例性化合物中Y为H并且R2为H。另一示例性化合物中Y为H并且R3为H。另一示例性化合物中Y为H并且R4为H。另一示例性化合物中Y为H并且R5为H。另一示例性化合物中Y为H并且R3为A。特别是，化合物中Y、R1、R2、R4、R5为H且R3为A。
在另一个实施例中，式I化合物为其中Y为B的化合物。一种示例性化合物中Y为B并且R1为H。另一示例性化合物中Y为B并且R2为H。另一示例性化合物中Y为B并且R3为H。另一示例性化合物中Y为B并且R4为H。另一示例性化合物中Y为B并且R5为H。特别是，Y为B并且1、R2、R3、R4且R5为H。另一示例性化合物中Y为B并且R3为A。特别是，化合物中Y为B并且R1、R2、R4、R5为H且R3为A。
在另一个实施例中，式I化合物为其中Y为E的化合物。一种示例性化合物中Y为E并且R1为H。另一示例性化合物中Y是E并且R2为H。另一示例性化合物中Y是E并且R3为H。另一示例性化合物中Y是E并且R4为H。另一示例性化合物中Y是E并且R5为H。另一示例性化合物中Y是E并且R6为H。另一示例性化合物中Y是E并且R7为H。特别是，化合物中Y是E且R1、R2、R3、R4、R5、R6且R7为H。另一示例性化合物中Y是E且R3为A。特别是，化合物中Y是E并且R1、R2、R4、R5、R6、R7为H且R3为A。
在一方面，本发明提供一种组合物，其包含由小泡形成脂质形成的脂质体和包封于所述脂质体中的硼酸酯化合物，该硼酸酯化合物由肽硼酸化合物和为共轭树枝状聚合物的式II化合物构成。
式II
Figure GPA00001040294300051
n＝3-30
R1＝(H，A)
R2＝(H，A)
R3＝(H，A)
R4＝(H，A)
R5＝(H，A)
Figure GPA00001040294300061
其中D、X、A、R1、R2、R3、R4和R5是如上文所述。
在一个实施例中，式II化合物为其中树枝状聚合物为G1或G2树枝状聚合物的化合物。一种示例性化合物中树枝状聚合物为G1。另一示例性化合物中树枝状聚合物为G2。
在另一个实施例中，式II化合物为其中n为3至30之间整数的化合物。一种示例性化合物中R1为H。另一示例性化合物中R2为H。另一示例性化合物中R3为H。另一示例性化合物中R4为H。另一示例性化合物中R5为H。特别是，化合中R1、R2、R3、R4和R5为H。特别是，该化合物为共轭G2树枝状聚合物。在一个实施例中，G2树枝状聚合物每分子具有16个氨基基团。
在另一个实施例中，脂质体还包括内部较高/外部较低的离子梯度。该离子梯度可为例如氢离子(pH)梯度。当离子梯度为pH梯度时，脂质体的内部pH可为约7.5-8.5，并且脂质体外部环境的pH可为约6-7。
在另一个实施例中，脂质体还包括约1-20摩尔百分比的用亲水聚合物衍生的疏水部分。
在脂质体包括与亲水聚合物共价连接的疏水部分的实施例中，优选的聚合物为聚乙二醇。优选的疏水部分为脂质，并且优选为小泡形成脂质。
在另一方面，本发明提供递送肽硼酸化合物的方法，其包括制备脂质体在水溶液中的混悬液，所述脂质体具有被包封的与式I或II化合物共价结合以形成肽基硼酸酯化合物的肽硼酸化合物，并将该脂质体混悬液施用给受试者。
在一个实施例中，通过注射施用脂质体。
在另一方面，本发明提供在接受放射治疗的荷瘤受试者中选择性破坏肿瘤组织的方法，该方法包括给荷瘤受试者施用脂质体，该脂质体具有被包封的与式I或II化合物共价结合以形成肽基硼酸酯化合物的肽硼酸和硼同位素；并让所述受试者接受中子放射疗法。
在一个实施例中，硼同位素是在肽硼酸中，例如10B。
除了上述的示例性方面和实施例，通过参照附图和下文描述的试验，本发明其他方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1A-1C示出了示例性的硼酸化合物的结构。
图2示出了在内部较高/外部较低的pH梯度下装载硼酸化合物至脂质体中以在脂质体内形成硼酸酯化合物。
具体实施方式
I.定义
“肽硼酸化合物”意指下式化合物：
Figure GPA00001040294300071
其中R1、R2和R3为彼此相同或不同的独立选择部分，并且n为1-8，优选1-4。
“亲水聚合物”意指在室温下在水中具有一定量溶解度的聚合物。示例性的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙基酯、聚丙烯酸羟乙基酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列。这些聚合物可作为均聚物或作为嵌段共聚物或无规共聚物使用。优选的亲水聚合物链为聚乙二醇(PEG)，优选分子量为500-10,000道尔顿的PEG链，更优选为750-10,000道尔顿，还更优选为750-5,000道尔顿。
“内部较高/外部较低的pH梯度”指脂质体内部(较高pH)和脂质体悬浮于其中的外部介质(较低pH)之间的跨膜pH梯度。通常，脂质体内部pH至少比外部介质pH大1个pH单位，并优选大2-4个单位。
“脂质体包封的”意指隐蔽在脂质体中心的水性隔室中、脂质体脂质双层之间的水性空间，或双层本身内的化合物。
II.脂质体制剂
在一个方面，本发明提供具有被包封的肽硼酸化合物的脂质体组合物。在这部分，将描述脂质体组合物和制备方法。
A.脂质体组分
如上文所述，脂质体制剂由包含被包封的肽硼酸化合物的脂质体构成。肽硼酸化合物是在肽序列的酸性末端或C末端包含α-氨基硼酸的肽。一般而言，肽硼酸化合物的形式如下：
Figure GPA00001040294300081
其中R1、R2和R3为彼此相同或不同的独立选择部分，并且n为1-8，优选1-4。还可以考虑具有以硼酸作为侧链的天冬氨酸残基或谷氨酸残基的化合物。
优选的是，R1、R2和R3独立地选自氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷氧基、环烷基或杂环；或R1、R2和R3中任意一者可与肽骨架中的相邻氮原子形成杂环。烷基包括烷氧基、芳烷基和芳烷氧基中的烷基组分，优选为1至10个碳原子，更优选1至6个碳原子，并且可为直链或支链。芳基包括芳氧基、芳烷基和芳烷氧基中的芳基组分，优选为单核或双核(即两个稠环)，更优选为单核，例如苄基、苯甲氧基或苯基。芳基还包括杂芳基，即在环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的芳香环，例如呋喃基、吡咯、吡啶、吡嗪或吲哚。环烷基优选为3-6个碳原子。杂环指在环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的非芳香环，优选具有3-6个碳原子的5元至7元环。这类杂环包括(例如)吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉。环烷基或杂环可与烷基组合；例如环己基甲基。
上述任何基团(不包括氢)可被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素，优选氟或氯；羟基；低级烷基；低级烷氧基，例如甲氧基或乙氧基；酮；醛；羧酸、酯、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯；磺酸或酯；氰基；伯、仲或叔胺；硝基；脒基；和硫基或烷硫基。优选的是，该基团包括最多两个这类取代基。
示例性的肽硼酸化合物显示于图1A-1C中。R1、R2和R3的具体例子在图1A-1C中示出，包括正丁基、异丁基和新戊基(烷基)；苯基或吡唑基(芳基)；4-((叔-丁氧基羰基)氨基)丁基、3-(硝基脒基)丙基和(1-环戊基-9-氰基)壬基(经取代的烷基)；萘基甲基和苄基(芳烷基)；苯甲氧基(芳烷氧基)；和吡咯烷(R2与相邻的氮原子形成杂环)。
一般而言，肽硼酸化合物可为单肽、二肽、三肽或更高级的肽化合物。其他示例性的肽硼酸化合物在美国专利No.6,083,903、No.6,297,217和No.6,617,317中有所描述，将所述专利以引用的方式并入本文。
肽硼酸化合物例如硼替佐米为在序列的酸性末端、C-末端包含氨基硼酸的通常2-4个氨基酸短肽的衍生物(Zembower等人，Int.J.Pept.Protein Res.47(5)：405-413(1996))。由于可在硼酸基团和活性位点丝氨酸或苏氨酸部分之间形成稳定的四面体硼酸酯复合物，肽硼酸为强效的丝氨酸蛋白酶抑制剂。通过改变肽硼酸的序列并引入非天然氨基酸残基和其他取代基通常可增强该活性并使其对特定蛋白酶体有高度特异性。这使得可选择具有强效抗病毒活性(Priestley，E.S.和Decicco，C.P.，Org.Lett.2(20)：3095-3097(2000)；Bukhtiyarova，M.等人，Antivir.Chem.Chemother.12(6)：367-73(2001)；Archer，S.J.等人，Chem.Biol.9(1)：79-92(2002)；Pristley，E.S.等人，Bioorg.Me d.Chem.Lett.12(21)：3199-202和细胞毒性活性(Teicher，B.A.等人，Clin.Cancer Res.，5(9)：2638-45(1999)；Frankel等人，Clin.Cancer Res.6(9)：3719-28(2000)；Lightcap，E.S.等人，Clin.Chem.46(5)：673-83(2000)；Adams，J.，Semin.Oncol.，28(6)：613-19(2001)；Cusack，J.C.，Jr.等人，Cancer Res.61(9)：3535-40(2001)；Shah，S.A.等人，J.Cell.Biochem.82(1)：110-22，(2001)；Adams，J.，Curr.Opin.Chem.Biol.6(4)：493-500(2002)；Orlowski，R.Z.和Dees，E.C.，BreastCancer Res.5(1)：1-7(2002)；Orlowski，R.Z.等人，J.Clin.Oncol.20(22)：4420-27，(2002)；Schenkein，D.，Clin.Lymphoma3(1)：49-55(2002)；Ling，Y.H.等人，Clin Cancer Res 9(3)：1145-54(2003))的肽硼酸。这些衍生物受累于和其他短肽相同的问题，最值得注意到是清除非常快速和不能到达体内靶部位。
许多肽硼酸化合物缺乏易于离子化的氨基基团，或极性较大，并因此使用上文讨论的常规远距离装载操作难以装载至脂质体中。因此，已经设计了适用于肽硼酸化合物的装载方法，以提供其中肽硼酸化合物以肽硼酸酯的形式包封于脂质体中的脂质体制剂，如现在将会参照图2所描述的。图2示出了具有脂质双层膜(由单实线12表示)的脂质体10。应当理解，在多室脂质体中脂质双层膜由具有居间的水性空间的多个脂质双层构成。脂质体10悬浮于外部介质14中，其中外部介质的pH约7.0，通常在5.5-7.0之间，更通常在6.0-7.0之间。脂质体10具有由脂质双层膜限定的内部水性隔室16。包封在内部水相室中的是化合物18，优选式I化合物。式I化合物优选为具有多个羟基官能团的部分，下面提供了示例性的化合物。内部水相室的pH优选大于约7.0，更优选7.1-9.0，还更优选在7.5和8.5之间。
也包封在脂质体中的有肽硼酸化合物，在图2中由硼替佐米代表。在通过脂质双层膜之前，硼替佐米也显示在外部水性介质中。在外部水相介质中，该化合物绝大部分不带电荷，这归因于该略微酸性的介质。在其不带电状态下，该化合物可自由渗透穿过脂质双层。硼酸酯的形成将使该平衡改变而引起更多化合物从外部介质渗透通过脂质双层，导致该化合物在脂质体中的积聚。在另一个实施例中，外部混悬介质中较低pH和脂质体内部较高pH，结合脂质体内部的络合剂，诱导药物积聚在脂质体的水性内部隔室中。一旦进入脂质体，该化合物与络合剂反应而形成硼酸酯。硼酸酯基本不能跨过脂质体双层，从而硼酸酯形式的药物化合物积聚在脂质体内部。
脂质体内部络合剂的浓度优选为使得带电的基团(例如羟基基团)的浓度高于硼酸化合物的浓度。例如，在药物终浓度为100mM的组合物中，聚合物带电基团的内部化合物浓度将通常至少为这么大。
络合剂以高-内部/低-外部的浓度存在；即，存在跨越脂质体脂质双层膜的络合剂浓度梯度。如果在外部体相中存在大量的络合剂，则该络合剂与外部介质中的肽硼酸化合物反应，减慢化合物在脂质体内部的积聚。因此，优选的是，如下文所述制备脂质体，以使得该组合物在体相(水相之外)中基本不含该络合剂。
适合用做络合剂的各种分子为上面示出的式I或式II化合物。式I或II化合物可形成硼酸酯。可考虑可利用式I或II化合物之间的反应性差异来制备具有包封强度梯度的脂质体制剂，由此可微调药物释放特性。一般而言，络合剂的滞留强度与络合剂的分子量和疏水性质相关。络合剂的分子量越大以及疏水性越低，硼酸化合物的滞留时间则越长。
在一个实施例中，式I化合物为其中Y为H的化合物。一种示例性化合物中Y为H且R1为H。另一示例性化合物中Y为H且R2为H。另一示例性化合物中Y为H且R3为H。另一示例性化合物中Y为H且R4为H。另一示例性化合物中Y为H且R5为H。另一示例性化合物中Y为H且R3为A。特别是，化合物中Y、R1、R2、R4、R5为H且R3为A。
其中Y为H的式I化合物可商购获得或根据实例1列出的操作制备。
在另一个实施例中，式I化合物为其中Y为B的化合物。一种示例性化合物中Y为B且R1为H。另一示例性化合物中Y为B且R2为H。另一示例性化合物中Y为B且R3为H。另一示例性化合物中Y为B且R4为H。另一示例性化合物中Y为B且R5为H。特别是，化合物中Y为B且R1、R2、R3、R4和R5为H。另一示例性化合物中Y为B且R3为A。特别是，化合物中Y为B且R1、R2、R4、R5为H且R3为A。
其中Y为B的式I化合物可商购获得或根据实例2-3列出的操作制备。
在另一个实施例中，式I化合物为其中Y为E的化合物。一种示例性化合物中Y是E且R1为H。另一示例性化合物中Y是E且R2为H。另一示例性化合物中Y是E且R3为H。另一示例性化合物中Y是E且R4为H。另一示例性化合物中Y是E且R5为H。一种示例性化合物中Y是E且R1、R2、R3、R4和R5为H。另一示例性化合物中Y是E且R3为A。特别是，化合物中Y是E且R1、R2、R4、R5为H且R3为A。
其中Y为E的式I化合物可商购获得或根据实例5列出的操作制备。
在一个实施例中，式II化合物为其中树枝状聚合物为G1或G2树枝状聚合物的化合物。一种示例性化合物中树枝状聚合物为G1。另一示例性化合物中树枝状聚合物为G2。
在另一个实施例中，式II化合物为共轭树枝状聚合物。一种示例性化合物为化合物D，其中n为3至30之间整数。一种示例性化合物中R1为H。另一示例性化合物中R2为H。另一示例性化合物中R3为H。另一示例性化合物中R4为H。另一示例性化合物中R5为H。特别是，化合中R1、R2、R3、R4和R5为H。特别是，化合物为共轭G2树枝状聚合物。在一个实施例中，G2树枝状聚合物每分子具有16个氨基基团。
式II化合物可商购获得或根据实例4列出的操作制备。
组合物中的脂质体主要由小泡形成脂质构成。该类小泡形成脂质为可在水中自发形成双层小泡的脂质，例如磷脂类，其疏水部分与内部(双层膜的疏水区)接触，其头部基团部分朝外部(该膜的极性表面)取向。能够稳定掺入脂质双层的脂质(例如胆固醇及其多种类似物)也可用于脂质体中。小泡形成脂质优选为具有两个烃链(通常为酰基链)和一个极性或非极性头部基团的脂质。有许多合成的小泡形成脂质和天然的小泡形成脂质，包括磷脂类，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两条烃链的长度通常为约14-22个碳原子，并且具有不同程度的不饱和度。其酰基链具有不同饱和度的上述脂质和磷脂可商购获得或根据公开的方法制备。其他合适的脂质包括糖脂类、脑苷脂类和甾醇类例如胆固醇。
可选择小泡形成脂质以实现特定程度的流动性或刚度，以控制脂质体在血清中的稳定性和/或控制脂质体中被包封物质的释放速率。具有刚性更大的脂质双层或液晶双层的脂质体可通过掺入相对刚性的脂质(例如具有相对较高的相变温度，如高达60℃)的脂质来获得。刚性的、即饱和的脂质有助于使脂质双层具有更大的膜刚性。其他脂质组分例如胆固醇也已知可有助于脂质双层结构的膜刚性。另一方面，脂质流动性可通过掺入相对流动的脂质来实现，通常为具有相对低的液相至液晶相转变温度(例如室温或低于室温)的脂相的脂质。
脂质体可任选包括与亲水聚合物共价连接的小泡形成脂质。如美国专利No.5,013,556已描述的，在脂质体组合物中包括这样一种聚合物衍生的脂质可在脂质体周围形成亲水聚合物链的表面包衣。与缺少这种包衣的脂质体相比，亲水化合物链表面包衣可有效增加该脂质体的体内血液循环寿命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂酰乙醇胺(例如二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺)构成的具有各种mPEG分子量(350、550、750、1,000、2,000、3,000和5,000道尔顿)的聚合物衍生的脂质可购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)。mPEG-神经酰胺的脂质聚合物也可购自Avanti Polar Lipids，Inc。脂质-聚合物缀合物的制备也在文献中有所描述，参见美国专利No.5,631,018、No.6,586,001和No.5,013,556；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8：111(1997)；Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.387：50(2004)。这些脂质聚合物可制备成具有高纯度和最小分子量分散度的明确定义的均相材料(Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8：111(1997)；Wong，J.等人，Science 275：820(1997))。脂质聚合物也可为“中性”脂质聚合物，例如聚合物-二硬脂酰缀合物，如美国专利No.6,586,001中所述，将该专利以引用的方式并入本文。
当脂质体中包含脂质-聚合物缀合物时，通常将1-20摩尔百分比的脂质-聚合物缀合物掺入总体脂质混合物中(参见，例如，美国专利No.5,013,556)。
脂质体可另外包含经改性而包括配基的脂质聚合物，形成脂质-聚合物-配基缀合物，本文中也称作“脂质聚合物-配基缀合物”。该配基可为治疗分子，例如药物或具有体内活性的生物分子，可为诊断分子，例如造影剂或生物分子，或对结合配偶体(优选细胞表面的结合配偶体)具有结合亲和力的靶向分子。优选的配基对细胞表面具有结合亲和力并辅助脂质体通过细胞内化作用进入胞质。存在于包括该脂质聚合物-配基的脂质体中的配基从脂质体表面朝外取向，并因此可与其同源受体相互作用。
将配基连接至脂质聚合物的方法是已知的，其中该聚合物可经官能化以用于和所选配基的后续反应。(美国专利No.6,180,134；Zalipsky，S.等人，FEBS Lett.353：71(1994)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.4：296(1993)；Zalipsky，S.等人，J.Control.Rel.39：153(1996)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8(2)：111(1997)；Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.387：50(2004))。官能化的聚合物-脂质缀合物，例如末端官能化的PEG-脂质缀合物也可以商购获得(Avanti Polar Lipids，Inc.)。配基和聚合物之间的键合可以是稳定的共价键合或可响应刺激(例如pH变化或还原剂存在)而裂解的可释放键合。
配基可以是对细胞受体或对循环于血液中的病原体具有结合亲和力的分子。配基也可为治疗或诊断分子，特别是当以游离形式施用时具有较短血液循环寿命的分子。在一个实施例中，配基为生物配基，并优选为对细胞受体具有结合亲和力的配基。示例性生物配基为对以下分子的受体具有结合亲和力的分子：CD4、叶酸、胰岛素、LDL、维生素、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、选择蛋白(例如E、L和P选择蛋白)、Flk-1，2、FGF、EGF、整联蛋白特别是α4β1、αvβ3、αvβ1、αvβ5、αvβ6整联蛋白、HER2，以及其他。优选的配基包括蛋白质和肽，包括抗体和抗体片段，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv(由重链和轻链可变区组成的片段)和scFv(其中的轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子)等。配基也可为小分子模拟肽。应当理解，细胞表面受体或其片段可作为配基。其他示例性靶向配基包括但不限于维生素分子(例如生物素、叶酸、氰钴胺素)、寡肽、寡糖。其他示例性的配基在美国专利No.6,214,388、No.6,316,024、No.6,056,973和No.6,043,094中示出，将这些专利以引用的方式并入本文。
B.脂质体制剂的制备
肽硼酸化合物通过在脂质体包封的式I化合物的羟基官能团和硼酸化合物之间形成硼酸酯的形式积累和包封于脂质体中(Eggert，H.等人，J.Org.Chem.64：3846-52(1999))。简而言之，将含有多个羟基官能团的式I化合物置于脂质体内，肽硼酸化合物扩散穿过脂质体脂质双层膜，并形成硼酸酯，将肽硼酸化合物包封于脂质体中。
在一个实施例中，该过程由pH驱动，其中脂质体外部pH较低(如pH6-7)而脂质体内部pH稍高(pH7.5-8.5)，加上式I或II化合物的存在，诱导了该化合物的积聚和装载。在该实施例中，通过配制具有内部较高/外部较低的式I或II化合物梯度的脂质体来制备组合物。制备所需浓度(如上文所述测定)的式I或II化合物(如上文所述选择)的水溶液。优选式I或II化合物在溶液中时具有适于脂质水合的粘度，如下文所述。式I或II化合物水溶液的pH优选大于7.0。
含水的式I或II化合物化合物被用于使干燥的脂质膜水合，该脂质膜是用小泡形成脂质、非小泡形成脂质(例如胆固醇、DOPE等)、脂质聚合物例如mPEG-DSPE和任何其他需要的脂质双层组分制备。干燥的脂质膜可这样制备：将所选的脂质溶解于适当的溶剂中，通常为挥发性有机溶液，并使溶剂挥发以留下干燥膜。用含有式I或II化合物的溶液水合该脂质膜，调节至大于约7.0的pH，以形成脂质体。
实例1-5描述了制备由脂质磷脂酰胆碱酰胆碱(PC)、胆固醇和聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)构成的脂质体。将PC∶CHOL∶PEG-DSPE摩尔比为10∶5∶1的脂质溶解于氯仿中并蒸发溶剂以形成脂质膜。用聚乙烯醇水溶液pH7.5水合脂质膜，以形成式I或II化合物包封在内的脂质体。
脂质体形成后，可对脂质体进行整粒以得到具有基本均一大小范围的脂质体群体，通常在约0.01至0.5微米之间，更优选在0.03-0.40微米之间。一种用于REV和MLV的有效整粒方法涉及将脂质体的含水混悬液挤压透过具有所选择的均一孔径(在0.03至0.2微米的范围内，通常为0.05、0.08、0.1或0.2微米)的一系列聚碳酸酯膜。该膜的孔径大致对应于由挤压透过该膜，尤其是两次或更多次挤压透过相同膜进行制备时而产生的脂质体的最大尺寸。匀化方法也可用于减小脂质体至大小为100nm或更小(Martin，F.J.，Specialized Drug Delivery Systems-Manufacturing and Production Technology，P.Tyle(编辑)，Marcel Dekker，New York，第267-316页(1990))。
整粒后，通过适当的技术例如透析、离心、尺寸排阻色谱法或离子交换移除未包封的体相式I或II化合物，以获得具有内部高浓度的式I或II化合物并优选外部几乎没有式I或II化合物的脂质体混悬液。同样在脂质体形成后，通过滴定、透析等调节脂质体的外部相至低于pH7.0。
接着将硼酸化合物加入脂质体混悬液中以主动装载至脂质体中。加入的肽硼酸化合物的量可根据待包封药物的总量，假设100％的包封率，即加入的化合物最终全部以硼酸酯的形式装载进脂质体中来确定。
将化合物和脂质体分散体的混合物在这样的条件下孵育：使得脂质体摄取化合物达到的化合物浓度为主体介质中化合物浓度的数倍，这可通过在脂质体中形成沉淀来表明。后者可通过(例如)标准的电子显微镜或X-射线衍射技术来确认。通常在高温下，并优选在高于脂质体脂质的相变温度Tp下进行孵育。例如，对于T为50℃的高相变脂质，可在55-60℃下进行孵育。孵育时间可在一小时至小于12小时或更长时间内变化，视孵育温度而定。
在该孵育步骤结束时，可进一步处理混悬液以移除游离的(未包封的)化合物，例如使用上文提及的用于从含有被包封的式I或II化合物的起始脂质体分散体中移除游离聚合物的任何方法。
实例1-5描述了制备包含硼酸酯形式的硼酸化合物和式I或II化合物的脂质体的方法，其中式I或II化合物为络合剂。在这些实例中，制备卵PC和胆固醇的薄脂质膜。用式I或II化合物的溶液水合脂质膜，以形成具有包封于内部水性隔室内的式I或II化合物的脂质体。通过适当的技术例如透析、离心、尺寸排阻色谱法或离子交换移除未包封的式I或II化合物，以获得具有内部高浓度的式I或II化合物并优选外部几乎没有式I或II化合物的脂质体混悬液。然后，将所需肽硼酸化合物加入外部介质。非离子状态的化合物可自由渗透穿过脂质体脂质双层。一旦进入脂质体，该化合物则与被包封的式I或II化合物反应而形成硼酸酯，将平衡移向更多的药物穿过脂质双层。通过这一方式，肽硼酸化合物积累在脂质体中并且稳定地包封于其中。
包括脂质-聚合物-配基靶向缀合物的脂质体制剂可通过多种方法制备。一种方法涉及制备包括末端官能化的脂质-聚合物衍生物的脂质小泡；即，其中游离聚合物末端为反应性的或“活化的”的脂质-聚合物缀合物(参见例如美国专利No.6,326,353和No.6,132,763)。这种活化缀合物包括在脂质体组合物中并且在脂质体形成后活化的聚合物末端可与靶向配基反应。在另一方法中，脂质-聚合物-配基缀合物在脂质体形成时包括于脂质组合物中(参见，美国专利No.6,224,903和No.5,620,689)。在又一方法中，将脂质-聚合物-配基缀合物的胶束溶液与脂质体混悬液孵育并将脂质-聚合物-配基缀合物插入预形成的脂质体中(参见，例如，美国专利No.6,056,973和No.6,316,024)。
III.使用方法
具有以硼酸酯形式包封的肽硼酸化合物的脂质体制剂可用于治疗荷瘤患者。在肽硼酸化合物包括硼同位素的实施例中，该脂质体制剂可用于硼中子捕获疗法。现描述这些用途
A.肿瘤治疗
硼酸化合物属于被称作蛋白酶体抑制剂的一类药物。蛋白酶体抑制剂可通过它们抑制细胞蛋白酶体活性的能力诱导细胞凋亡。更具体而言，在真核细胞中，泛素-蛋白酶体途径是胞内蛋白质的蛋白降解的中心途径。通过连接多聚泛素链蛋白质首先被靶向以进行蛋白水解，接着通过蛋白酶体快速降解成小肽并释放和回收泛素。这一协调的蛋白水解途径依赖于泛素-缀合系统和26S蛋白酶体的协同活性。26S蛋白酶体为存在于真核细胞的细胞核和胞质中的大分子量(1,500-2,000kDa)多亚基复合物。该复合物的催化核心，称作20S蛋白酶体，是由四个包含-和-亚基的七聚体环组成的圆柱结构。该蛋白酶体是苏氨酸蛋白酶，-亚基的N-端苏氨酸提供攻击靶蛋白质中的肽键羰基基团的亲核体。至少有三种不同的蛋白水解活性与该蛋白酶体相关：糜蛋白酶、胰蛋白酶和肽基谷氨酰胺酶活性。识别和结合多泛素化底物的能力来自19S(PA700)亚基，其结合至20S蛋白酶体的各个末端。这些附属亚基使底物去折叠并将它们提供至20S催化复合物中，同时移除连接的泛素分子。26S蛋白酶体的组装和蛋白质底物的降解均为ATP-依赖性的(Almond，Leukemia16：433(2002))。
泛素-蛋白酶体系统通过蛋白质的协同和暂时性降解调节许多细胞过程。通过控制许多关键细胞蛋白质的水平，蛋白酶体可作为细胞生长和凋亡的调节剂并且对其活性的破坏对细胞周期具有深远影响。例如，缺陷凋亡与数种疾病包括一些癌症例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(存在静止期肿瘤细胞的积聚)的发病机理相关。
作为一类化合物，蛋白酶体抑制剂通常通过抑制蛋白酶体对蛋白质的降解来发挥作用。这类化合物包括肽醛、肽乙烯基砜，其通过结合并直接抑制蛋白酶体20S核心内的活性位点来发挥作用。然而你，肽醛和肽乙烯基砜以不可逆方式结合20S核心颗粒，从而在将它们去除时蛋白水解活性不可恢复。相反，肽硼酸化合物可稳定抑制蛋白酶体，但可从蛋白酶体缓慢解离。肽硼酸化合物比它们的肽醛类似物作用更强，并更特异性地发挥作用，因为硼和硫之间的弱相互作用意味着肽硼酸酯不抑制巯基蛋白酶(Richardson，P.G.，等人，Cancer Control.10(5)：361，(2003))。
将各种肿瘤衍生细胞系与蛋白酶体抑制剂接触可引发凋亡，很可能是对数个途径作用的结果，包括细胞周期调节蛋白p53和核因子B(NF-κB)(Grimm，L.M.和Osborne，B.A.，Results Probl.Cell.Differ.23：209-28(1999)；Orlowski，R.Z.，Cell Death Differ.6(4)：303-13(1999))。许多证明蛋白酶体抑制剂介导的凋亡的初步研究使用造血源细胞，包括成单核细胞(Imajoh-Ohmi，S.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.217(3)：1070-77(1995))、T-细胞和淋巴细胞性白血病细胞(Shinohara，K.等人，Biochem.J.317(Pt 2)：385-88，(1996))、淋巴瘤细胞(Tanimoto，Y.等人，J.Biochem.(Tokyo)121(3)：542-49(1997))和前髓细胞性白血病细胞(Drexler，H.C.，Proc.Natl，Acad，Aci.U.S.A.94(3)：855-60(1997))。对蛋白酶体抑制剂的体内抗肿瘤活性的第一次阐述使用了人淋巴瘤异种移植物模型(Orlowski，R.Z.等人，Cancer Res 58(19)：4342-48(1998))。而且，据报导，蛋白酶体抑制剂可诱导患者衍生的淋巴瘤(Orlowski，R.Z.等人，Cancer Res 58(19)：4342-48(1998))和白血病细胞(Masdehors，P.等人，Br.J.Haematol.105(3)：752-57(1999))的优先凋亡并优先抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖(Hideshima，T.等人，Cencer Res.，61(7)：3071-76(2001))，而对对照、非转化细胞则相对不足。因此，蛋白酶体抑制剂尤其可用作患有难以治愈的血液恶性肿瘤的患者的治疗药物。
在一个实施例中，包含肽硼酸化合物的脂质体制剂被用于治疗癌症，更具体而言用于在癌症患者中治疗肿瘤。
多发性骨髓瘤是一种不可治愈的恶性肿瘤，在美国每年有大约15,000人被诊断出该疾病(Richardson，P.G.等人，Cancer Control.10(5)：361(2003))。它是一种血液恶性肿瘤，其特征通常在于同源浆细胞在骨髓的多个位点积聚。大部分患者可响应化疗和放射的初步治疗，然而由于抗性肿瘤细胞的增殖绝大多数最终会复发。在一个实施例中，本发明提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法通过施用包含硼酸酯形式的包封的肽硼酸化合物的脂质体制剂。
该脂质体制剂还可通过帮助克服癌细胞抵抗化疗作用的一些主要途径，而有效用于乳腺癌治疗。例如，通过NF-kB(凋亡调节剂)的信号转导和p44/42分裂素活化蛋白激酶途径可以抗凋亡。因为蛋白酶体抑制剂可阻断这些途径，所以这些化合物可激活凋亡。因此，本发明提供了用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，该方法是通过施用包含肽硼酸化合物的脂质体。此外，因为化疗药物例如紫杉烷类和蒽环类已显示可激活这些途径之一或二者，蛋白酶体抑制剂与常规化疗药物结合使用可增强药物例如紫杉醇和多柔比星的抗肿瘤活性。因此，在另一个实施例中，本发明提供一种治疗方法，其中游离形式或脂质体包封形式的化疗药物与脂质体包封的肽硼酸化合物联合使用。
脂质体制剂的剂量和给药方案取决于所治疗的癌、癌阶段、患者的体型大小和健康状况以及对医护人员而言显而易见的其他因素。此外，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米、Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)进行的临床研究提供了适当剂量和给药方案的充分指导。例如，每周一次或两次静脉内给药，实体瘤患者的最大耐受剂量为1.3mg/m2(Orlowski，R.Z.等人，Breast Cancer Res.5：1-7(2003))。在另一试验中，在为期3周的周期的第1、4、8和11天静脉内推注硼替佐米表明最大耐受剂量为1.56mg/m2(Vorhees，P.M.等人，Clinical Cancer Res.9：6316(2003))。
通常肠胃外施用脂质体制剂，优选静脉内施用。应当理解，制剂可包括辅助递送的任何必要的或需要的药用辅料。
在上述治疗方法中，优选的蛋白酶体抑制剂为硼替佐米(Pyz-Phe-boroLeu；Pyz：2，5-吡嗪酸；PS-341)，其具有以下结构：
Figure GPA00001040294300191
硼替佐米已显示对各种癌组织包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌以及对各种肿瘤例如胰腺瘤、淋巴瘤和黑素瘤具有活性。(Teicher，B.A.等人，Clin.Cancer Res.5(9)：2638-45(1999)；Adams，J.，Semin.Oncol.，28(6)：613-19(2001)；Orlowski，R.ZS.和Dees.E.C.，Breast CancerRes.5(1)：1-7(2002)；Frankel等人，Clin.Cancer Res.6(9)：3719-28(2000)；Shah，S.A.等人，J.Cell.Biochem.82(1)：110-22(2001))。
B.硼中子捕获疗法
在另一方面，本发明提供施用硼-10同位素至肿瘤，用于硼-中子捕获疗法(10B-NCT)的方法。根据以下等式，用于癌症治疗的中子-捕获疗法是基于10B同位素与热中子(各自均相对无害)的相互作用：
10B+1n→7Li+4He+2.4MeV
该反应导致限定至单个癌细胞或邻近的癌细胞的强烈电离辐射。因此，对于成功的治疗，需要递送足够量的硼-10同位素至肿瘤。本文描述的脂质体制剂提供了将带有10B同位素的肽硼酸化合物包封在脂质体内的手段。由于这种脂质体长的血液循环寿命，包括表面包覆有亲水聚合物链的该脂质体优先积聚在肿瘤中(参见例如美国专利No.5,013,556和No.5,213,804)。装载了带有10B同位素的肽硼酸化合物的脂质体通过两种独立的机制根除肿瘤：脂质体在肿瘤中作为药物贮库起作用并在该肿瘤中逐渐释放抗癌化合物；以及脂质体用于在肿瘤中积聚大量的硼10同位素，促进硼中子捕获疗法的效率。
根据上述内容，本发明的各个方面和特征将显而易见。本文描述了包含水溶性的不可渗透脂质双层的式I或II化合物和肽硼酸化合物的脂质体。该脂质体通过如下方式制备：将式I或II化合物包封在脂质体的内部水性隔室内，从外部介质移除任何未包封的式I或II化合物，加入可渗透脂质双层的硼酸化合物，其穿过脂质双层膜与式I或II化合物的邻位羟基部分形成不可逆的酯键。通过该方式，正常情况下可自由渗透通过脂质双层的硼酸化合物被稳定地包封于脂质体中。肽硼酸化合物向脂质体内积聚发生在无离子梯度存在的情况下，然而，需要时可存在离子梯度。
实例
以下实例进一步说明了本文描述的发明并且绝不旨在限制本发明的范围。
实例1
化合物1络合剂的合成
将乳糖(4.1g，12mmol)、盐酸甲胺(1.35g，20mmol)和氰基硼氢化钠(5M，1.2mL，6mmol)加入压力管，充氩气，调pH至7.0(pH试纸)。密封反应管，在室温下搅拌反应混合物24小时，然后于40-50℃加热16小时。通过TLC(SiO2，乙醇/乙酸/水5∶1∶2)监测反应。在乙醇(400mL)中沉淀反应混合物。过滤分离沉淀，在离子交换树脂柱(Bio-Rex 70，水为洗脱剂)上纯化。通过离子交换纯化产物两次。合并产物级分，冻干得到1.373g白色固体产物。1H NMR(400MHz，D2O)δ4.53(d，J＝8Hz，1H)，4.23-4.19(m，1H)，3.97-3.53(m，10H)，3.55(dd，J＝10 and 8Hz，1H)，3.361(dd，J＝13 and 3Hz，1H)，3.14(dd，J＝13 and 10Hz，1H)，2.77(s，3H)。
装载硼替佐米的脂质体
将化合物1溶解于水中并调pH至7.4。将摩尔比为10∶5∶1的卵磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)混合物溶解于氯仿中，真空蒸干溶剂，将脂质膜在化合物1溶液中振摇孵育，在压力下将脂质分散体挤压透过2层重叠的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的凝胶色谱将外缓冲液交换为pH6.5包含5mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)的0.14M NaCl；与此同时，移除未包封的化合物1。向如此获得的脂质体中加入硼替佐米。将混合物于37℃振摇孵育过夜，用Dowex50W×4(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)处理，并用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通过滤过0.2μm滤器将所得脂质体除菌。
实例2
化合物2络合剂的合成
将乳糖(4.79g，14mmol)、L-赖氨酸(0.985g，6mmol)、氰基硼氢化钠(5M，3mL，15mmol)和MilliQ水(8mL)加入装有磁性搅拌棒的压力管中。向管中充入氩气，密封，并在50-60℃下搅拌2天。在乙醇中沉淀反应混合物。分离沉淀，然后溶于MilliQ水，加入透析管(MWCO＝500)中，在水中透析。在乙醇中再次沉淀产物，过滤，并将固体真空干燥2天，获得3.081g白色固体产物。1H NMR(400MHz，D2O)δ4.52(d，J＝6Hz，1H)，4.50(d，J＝6Hz，1H)，4.25-4.12(m，2H)，3.97-3.50(m，28H)，3.07(m，2H)，1.70(broad.m，4H)，1.40(broad m，2H)。
装载硼替佐米的脂质体
将化合物2溶解于水中并调pH至7.4。将摩尔比为10∶5∶1的卵磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)混合物溶解于氯仿中，真空蒸干溶剂，将脂质膜在化合物.2溶液中振摇孵育，并在压力下将脂质分散体挤压透过两层重叠的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的凝胶色谱将外缓冲液交换为pH6.5包含5mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)的0.14M NaCl；与此同时，移除未包封的化合物2。向如此获得的脂质体中加入硼替佐米。将混合物于37℃振摇孵育过夜，用Dowex50W×4(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)处理，并用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通过滤过0.2μm滤器将所得脂质体除菌。
实例3
化合物3络合剂的合成
将右旋糖(4.5g，25mmol)、L-赖氨酸(0.985g，6mmol)、氰基硼氢化钠(5M，5mL，25mmol)和MilliQ水(8mL)加入装有磁性搅拌棒的压力管中。向管中充入氩气，密封，在50-60℃下搅拌2天。在乙醇中沉淀反应混合物。分离沉淀，然后溶解于MilliQ水中，加入透析管(MWCO＝500)，在水中透析。在乙醇中再次沉淀产物，过滤，并将固体真空干燥16小时，获得3.22g白色固体产物。1H NMR(400MHz，D2O)δ3.84-3.60(m，15H)，3.09(broad m，4H)，1.70(broad.m，4H)，1.40(broadm，2H)。
装载硼替佐米的脂质体
将化合物3溶解于水中并调pH至7。将摩尔比为10∶5∶1的卵磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)混合物溶解于氯仿中，真空蒸干溶剂，将脂质膜在化合物3溶液中振摇孵育，在压力下将脂质分散体挤压透过2层重叠的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的凝胶色谱将外缓冲液交换为pH6.5包含5mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)的0.14M NaCl；与此同时，移除未包封的化合物3。向如此获得的脂质体中加入硼替佐米。将混合物于37℃振摇孵育过夜，用Dowex50W×4(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)处理，并用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通过滤过0.2μm滤器将所得脂质体除菌。
实例4
化合物4络合剂的合成
将树枝状聚合物(PAMAM，第二代，分子量为3284，在MeOH中为20重量％，2g)减压蒸干。将残余物溶解于水(5mL)中，转移至压力管，并用盐酸调pH至7.0。将右旋糖(0.51g，2.83mmol)和氰基硼氢化钠(5M，3mL，15mmol)加入装有磁性搅拌棒的压力管中。向管中充入氩气，密封，在40℃下搅拌16小时。在乙醇中沉淀反应混合物。分离沉淀，然后溶于MilliQ水，加入透析管(MWCO＝1,000)中，在水中透析。然后在乙醇中沉淀产物，过滤，并将固体真空干燥16小时，获得0.48g白色固体产物。所用的树枝状体每分子具有16个氨基。分子量为3284。化合物4是数种不同缀合物数目的混合物。
装载硼替佐米的脂质体
将化合物4溶解于水中并调pH至7.4。将摩尔比为10∶5∶1的卵磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)混合物溶解于氯仿中，真空蒸干溶剂，将脂质膜在化合物4溶液中振摇孵育，在压力下将脂质分散体挤压透过2层重叠的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的凝胶色谱将外缓冲液交换为pH6.5包含5mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)的0.14M NaCl；与此同时，移除未包封的化合物4。向如此获得的脂质体中加入硼替佐米。将混合物于37℃振摇孵育过夜，用Dowex50W×4(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)处理，并用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通过滤过0.2μm滤器将所得脂质体除菌。
实例5
化合物5络合剂的合成
将乳糖(5.13g，25mmol)、3-氨基-1，2-丙二醇(1.64g，18mmol)、氰基硼氢化钠(5M，3.6mL，18mmol)和MilliQ水(6mL)加入装有磁性搅拌棒的压力管中。向管中充入氩气，密封，并在40-50℃下搅拌2天。在乙醇中沉淀反应混合物。分离沉淀，然后溶解于MilliQ水中，加入透析管(MWCO＝100)中，在水中透析。然后在乙醇中沉淀产物，过滤，将固体真空干燥16小时，获得1.07g白色固体产物。1H NMR(400MHz，D2O)δ3.84-3.60(m，15H)，3.09(宽峰，m，4H)，1.70(宽峰，m，4H)，1.40(宽峰，m，2H)。
装载硼替佐米的脂质体
将化合物5溶解于水中并调pH至7.4。将摩尔比为10∶5∶1的卵磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)混合物溶解于氯仿中，真空蒸干溶剂，将脂质膜在化合物5溶液中振摇孵育，在压力下将脂质分散体挤压透过2层重叠的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的凝胶色谱将外缓冲液交换为pH6.5包含5mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)的0.14M NaCl；与此同时，移除未包封的化合物5。向如此获得的脂质体中加入硼替佐米。将混合物于37℃振摇孵育过夜，用Dowex50W×4(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)处理，并用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通过滤过0.2μm滤器将所得脂质体除菌。
实例6
脂质体包封的硼替佐米的体外活性
让多发性骨髓瘤细胞在微量滴定板上生长至汇合。将这些细胞与如实例1-5所述以不同浓度的肽硼酸化合物制备的脂质体一起孵育。在24小时孵育期后，检测细胞的凋亡。发现，经脂质体制剂处理的细胞比对照细胞具有更高的凋亡发生率。
实例7
脂质体包封硼替佐米的体外活性
对如实例1-5所述制备的脂质体进行数个体外试验，用以葡甲胺作为络合剂的脂质体包封的硼替佐米作为对照。数据来自(1)硼替佐米与脂质体中所用的络合剂的ITC结合试验，(2)脂质体的药物释放试验；和(3)载药稳定性试验。
ITC药物结合试验
通过可控参数下的温滴定微量热仪(VP-ITC，MicroCal，Northampton，MA)来研究多种络合剂与硼替佐米的结合。在相同的甘氨酸储液(Sigma-Aldrich，100mM，pH9.5)中溶解所需量的材料来单独制备实例1-5的络合剂、葡甲胺(1mM)和硼替佐米(18.2mM)溶液，以保证与甘氨酸浓度和pH匹配。检查pH水平两次，必要时调整至0.2个单位以内。将溶液脱气10-15分钟。将硼替佐米溶液上样至自动注射器中并滴定(每次注射5-10μL)至已载入ITC样品细胞的络合剂(CR)溶液。该试验在30℃下进行。使用与活性操作相同的参数将相同的药物溶液滴定至100mM甘氨酸溶液进行基准操作。用ITC生产商提供的软件程序(Microcal origin v5.0)进行数据处理以产生结合参数。
CR pH   K(mol-1)   ΔH(Kcal/mol)
  葡甲胺   9.5   5526   -4.1
  实例2   9.5   2589   -6.9
  实例3   9.5   1350   -9.1
  实例4   9.5   1569   -5.4
  实例5   9.5   2366   -6.3
  实例1   9.5   10810   -9.4
全血中的体外药物释放测定法
将体积比为1∶4的试验制剂和大鼠全血的混合物以500rpm在37℃下振摇24小时。在时间点0、1、2、6和24小时取样，并于以低的RPM旋转数分钟。取出上清血浆并用MS/MS分析游离药物。在药物释放上，根据实例1制备的脂质体和以葡甲胺为络合剂的脂质体包封的硼替佐米之间无显著性差异。
载药稳定性试验
于25℃孵育脂质体包封的硼替佐米制剂，检测其粒径、pH和药物包封率。用尺寸排阻色谱法测定药物包封率。将样品(100uL)上样至Bio-Gel，P-6柱(0.5×30cm)中，用pH7.0，100mM HEPES-NaCl(150mM)溶液洗脱，并收集级分(1mL/管)。检测脂质体和游离药物级分在270nm处的紫外吸收，并分别合并，然后用HPLC分析。
Figure GPA00001040294300251
E.E.＝包封率
尽管已就具体的实施例描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见的是，可进行各种变化和修改而不偏离本发明。

Claims (21)

1.一种组合物，包含由小泡形成脂质形成的脂质体和包封于所述脂质体中由肽硼酸化合物和式I或II化合物构成的硼酸酯化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽硼酸化合物为二肽基硼酸化合物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽硼酸化合物为硼替佐米。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物为式II化合物，并且其中R1、R2、R3、R4和R5为H。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中D为每分子具有16个氨基基团的共轭G2树枝状聚合物。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物为式I化合物，并且其中Y为H、B或E。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中R1为H，或R2为H，或R3为H或A，或R4为H，或R5为H。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中Y、R1、R2、R4、R5各自为H并且R3为A。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体进一步包括内部较高/外部较低的离子梯度。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述离子梯度为氢离子梯度。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述氢离子梯度提供约7.5-8.5的内部pH和约6-7的外部pH。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体进一步包含约1-20摩尔百分比的用亲水聚合物衍生的疏水部分。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述用亲水聚合物衍生的疏水部分为用聚乙二醇衍生的疏水部分。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述疏水部分为脂质。
15.一种用于使用肽硼酸化合物的疗法的组合物，包含根据权利要求1所述的组合物，其中将所述组合物施用给受试者。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物经注射施用。
17.根据权利要求15所述的组合物，用于治疗多发性骨髓瘤。
18.一种用于治疗多发性骨髓瘤的组合物，包含根据权利要求1所述的脂质体组合物。
19.一种用于在接受放射疗法的荷瘤受试者中选择性破坏肿瘤组织的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的脂质体混悬液，其中所述混悬液与硼的同位素联合施用给所述受试者；并且其中所述受试者接受放射疗法。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述硼的同位素是在肽硼酸中。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述硼的同位素为10B。
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