ES2263280T3 - Compuestos antiinflamatorios derivados de lipocortina-1. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, en el que dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV, para su uso en terapia.

Description

Compuestos antiinflamatorios derivados de lipocortina-1.

Campo técnico

La presente invención se refiere a compuestos que tienen propiedades antiinflamatorias.

Antecedentes de la invención

La inflamación en sitios con herida y sitios de infección a menudo está caracterizada por, entre otros, una fuerte infiltración de leucocitos en el sitio de inflamación. En particular, las células polimorfonucleadas (PMN) son el tipo celular predominante recuperado de los sitios de inflamación, tales como articulaciones inflamatorias (espacios intraarticulares y periarticulares inflamados) (Terkeltaub, 1992; Dieppe y col., 1979).

La inflamación puede reducirse por la acción de, por ejemplo, agentes antiinflamatorios tales como glucocorticoides, producidos por el cuerpo en respuesta a la inflamación. Una de las muchas acciones realizadas por los glucocorticoides es la inducción de lipocortina 1 (LC1), que por sí misma inhibe la liberación de ácido araquidónico y la proliferación celular (procesos habitualmente asociados con la inflamación).

La evidencia experimental revisada (Flower y Rothwell, 1994) apoya el concepto de que la lipocortina (LC) 1 es un mediador clave de muchos efectos de los glucocorticoides incluyendo la supresión de la liberación de mediador lipídico (Cirino y col., 1987), la inhibición de la fiebre (Carey y col., 1990; Davidson y col., 1991), edema de las extremidades (Cirino y col., 1989) y migración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) (Peretti y col., 1993), la inhibición de la liberación de hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (Taylor y col., 1993) y otras hormonas de la pituitaria anterior (por ejemplo, Taylor y col., 1993, 1995) y la inhibición de la inducción por endotoxina de óxido nítrico sintasa (Wu y col., 1995).

LC1 es un miembro de una superfamilia de proteínas llamadas las anexinas (revisado por Raynal y Pollard, 1994). Los miembros de este grupo de proteínas están identificados por un motivo estructural común que comprende cuatro subunidades de repetición (en algunos miembros de la familia, ocho subunidades de repetición). Aunque este dominio central está altamente conservado entre los miembros de la familia de anexinas cada una de las proteínas individuales tiene un dominio N-terminal distinto de longitud variable y se ha sugerido que ya que es una característica de distinción, probablemente contribuye a la actividad biológica específicamente asociada con cada miembro. De hecho, un trabajo previo ha demostrado que LC1 que carece del dominio N-terminal no tiene actividad en algunos ensayos de inflamación y liberación de mediador, mientras que en la LC1_{2-26} con N-acetilo en el extremo N, de longitud completa es biológicamente activa en varios sistemas (Cirino y col., 1993; Perretti, 1994).

La línea celular A549 es un modelo útil para estudiar la biología de LC1. La acción inhibidora de los glucocorticoides en la proliferación celular en este modelo padece estar mediada por la inducción y externalización de LC1, que posteriormente afecta a la liberación de ácido araquidónico y por lo tanto la liberación de eicosanoides que funcionan como estimuladores autocrinos del crecimiento en este sistema celular (Croxtall y Flower, 1992). El bloqueo por glucocorticoides de la liberación de ácido araquidónico y el crecimiento celular puede neutralizarse por anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-LC1 (Croxtall y Flower, 1992; Croxtall y col., 1995) o desoxinucleótidos antisentido (Croxtall y Flower, 1994), confirmando de este modo el papel central de esta proteína en la acción de los glucocorticoides.

En publicaciones previas (Croxtall y col., 1993), se ha demostrado que el dominio N-terminal de LC1 es crucial para ejercer este efecto inhibidor sobre la función de células A549 y que esta propiedad biológica parece residir en la porción cadena abajo del dominio N-terminal (LC1_{13-25}) ya que LC1_{1-12} es inactiva en este modelo.

Para definir adicionalmente la región necesaria para la actividad biológica del dominio N-terminal de la lipocortina, se realizaron experimentos en los que se sintetizó una familia de 25 péptidos en la que se hicieron deleciones sistemáticas de los extremos N y C-terminales. Esto posibilitó realizar una búsqueda con más precisión de la región activa biológica de la molécula (Croxtall y col., 1998). Los resultados de estos estudios pusieron de relieve la importancia del dominio EQEYV, como una secuencia altamente conservada que todos los péptidos activos presentan. El péptido más corto que producía una actividad significativamente inhibidora fue LC1_{18-25} (EQEYVQTV), que implica que el dominio EQEYV, aunque esencial, no era suficiente para la actividad biológica.

Sin embargo, los estudios realizados por Croxtall y sus colegas (Croxtall y col., 1998) se basó en un ensayo in vitro en el que se midió la división celular.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que las propiedades antiinflamatorias in vivo de LC1 están contenidas en una parte diferente de la secuencia de aminoácidos N-terminal de LC1, específicamente LC1_{2-6} (N-acetil LC1_{2-6}=AMVSE).

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, donde dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, donde dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV, y que comprende adicionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de dichos excipientes incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) a, por ejemplo, 0,1 M, pH 7,4, NaHCO_{3} a, por ejemplo, 0,2 M y otros fluidos fisiológicamente aceptables.

La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, donde dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV, en la fabricación de un medicamento para inhibir la migración de leucocitos, o tratar o prevenir la inflamación y/o respuesta/enfermedad inflamatoria.

La presente invención puede emplear cualquier compuesto de 5-30 aminoácidos que comprenda la secuencia de aminoácidos AMVSE con la condición de que no comprenda la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV. Preferiblemente, el compuesto es un polipéptido. El polipéptido puede ser acíclico o cíclico.

El polipéptido puede comprender 5-30 restos de aminoácidos con la condición de que incluya la secuencia AMVSE pero no incluya la secuencia EQEYVQTV. Preferiblemente, el polipéptido comprende 5-20, más preferiblemente 5-11 aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido comprende AMVSEFLKQAW.

El compuesto también puede incluir secuencias de aminoácidos o grupos químicos adicionales que flanquean la secuencia de aminoácidos AMVSE, donde las secuencias o grupos adicionales potencian las propiedades antiinflamatorias del compuesto.

Una referencia a "inflamación" o "respuesta/enfermedad inflamatoria" se refiere a cualquier respuesta o enfermedad inflamatoria, incluyendo gota, artritis gotosa, artritis reumatoide, asma, lesión o daño por reperfusión, apoplejía, infarto de miocardio, choque séptico, o un trastorno cutáneo inflamatorio, tal como psoriasis o eczema.

La presente invención también proporciona el uso que se ha descrito anteriormente, donde el medicamento incluye uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención también proporciona el método que se ha descrito anteriormente, donde se administra a un animal una composición que comprende un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, donde dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV, y que comprende adicionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 ilustra el grado de respuesta inflamatoria (medida por migración de PMN) generada por la actividad in vivo de péptidos derivados de lipocortina 1 (Cambio de orden = LC1_{2-6} (Ac-SVEMA); Ac = acetilo).

La Figura 2 ilustra (como diagrama de barras) el grado de respuesta inflamatoria (medida por migración de PMN) generada por la actividad in vivo de 66 nmoles de péptidos derivados de lipocortina 1 con referencia a la Figura 1 (Cambio de orden = LC1_{2-6} (Ac-SVEMA); Ac = acetilo).

Las propiedades antiinflamatorias in vivo de la secuencia de aminoácidos AMVSE se demostraron preparando fragmentos de N-acetil LC1_{2-26} (AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) y ensayándolos en un modelo animal de inflamación. El modelo animal in vivo proporcionó evidencia de que mientras que N-acetil LC1_{2-12} (AMVSEFLKQAW) era activo en el modelo, LC1_{13-25} (FIENEEQEYVQTV) no (datos no mostrados). Cuando se ensayó AMVSE y LC1_{7-12} (FLKQAW), el primero fue activo mientras que el segundo no. También se descubrió que una versión con el orden cambiado de AMVSE (concretamente, SVEMA) era inactiva.

Los experimentos descritos en este documento indican claramente que las propiedades biológicas de la lipocortina 1 (LC1) difieren en modelos inflamatorios in vivo en comparación con el modelo A549 in vitro.

Los compuestos usados en la presente invención se preparan preferiblemente para su uso como compuestos farmacéuticos. Los polipéptidos pueden administrarse por cualquier vía adecuada incluyendo administración oral o parenteral. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos típicamente contendrán diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicional o alternativamente, pueden presentarse sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH, y similares, en dichos vehículos. Las composiciones que contienen polipéptidos se administran preferiblemente en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como PBS 0,1 M (pH 7,4), NaHCO_{3} 0,2 M u otros fluidos farmacéuticamente aceptables.

Típicamente, las composiciones contempladas se preparan como composiciones inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. La preparación también pueden estar emulsionada o encapsulada en, por ejemplo, liposomas.

Las composiciones usadas como compuestos farmacéuticos comprenden una cantidad eficaz del compuesto, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. Por "cantidad eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud, edad y estado físico del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la evaluación del doctor que le está tratando la situación médica, y otros factores relevantes. La cantidad pertenece a un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. Las dosificaciones típicas pueden estar en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, preferiblemente 0,5-50 mg/kg, mucho más preferiblemente 1-10
mg/kg.

Las composiciones contempladas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una única dosis o un programa de múltiples dosis. La composición puede administrarse junto con otros agentes antiinflamatorios.

Como se usa en este documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no está limitado a una longitud específica de la molécula; por tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos, y proteínas en la definición de polipéptido. El polipéptido puede producirse por síntesis química o por técnicas de ADN recombinante bien conocidas para los especialistas en la técnica. El término "polipéptido" también incluye modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, ciclaciones y similares. En la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Se apreciará que lo siguiente se proporciona sólo a modo de ejemplo y que pueden hacerse modificaciones de los detalles sin alejarse del alcance de la invención.

Protocolo Experimental Animales

Se adquirieron ratones macho Swiss Albino (20-22 g de peso corporal) de Interfauna (cepa CFLP; Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido) y se mantuvieron con una dieta de gránulos de pienso convencional con agua corriente ad libitum. Los animales se usaron al menos una semana después de su llegada.

Modelo de Bolsa de Aire en Ratones

Se formaron bolsas de aire en la espalda de los ratones por inyección subcutánea (s.c.) de 2,5 ml de aire en el día 2 y en el día 5. Tres días después de la última inyección de aire (bolsas de aire de 6 días) se inyectó 1 mg de zymosan (en 0,5 ml de solución salina estéril) de forma local (Perretti y col., 1996). El zymosan se había hervido previamente durante 30 minutos en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se había lavado minuciosamente en el mismo medio y almacenado a -20ºC antes de su uso.

Cuatro horas después de la inyección local de zymosan, los ratones se sacrificaron por exposición a CO_{2} y las bolsas de aire se lavaron con 2 ml de PBS que contenía sal sódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 3 mM) y heparina (25 U/ml). Los fluidos del lavado (se recuperaron oportunamente esencialmente los 2 ml completos) se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos a 4ºC y los sedimentos celulares se resuspendieron en 2 ml de PBS/EDTA + heparina. Se determinó la cantidad de PMN, usando un hematocitómetro Neubauer, después de tinción (dilución 1:10) con solución de Turk (violeta cristal al 0,01% p/v en ácido acético al 3% v/v).

Péptidos

Todos los péptidos se sintetizaron siguiendo la técnica en fase sólida convencional por The Advanced Biotechnology Centre, Charing Cross Westminster Medical School (Londres, Reino Unido) y se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución. Todos los péptidos tuvieron una pureza de más del 95%.

Tratamiento con fármaco

Los siguientes péptidos se extrajeron de la región N-terminal de la lipocortina 1: LC1_{2-26} (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK), LC1_{2-12} (Ac-AMVSEFLKQAW), LC1_{13-25} (FIENEEQEYVQTV), LC1_{2-6} (Ac-AMVSE), o scramble LC1_{2-6} (Ac-SVEMA) que se administraron s.c. 30 minutos antes de la inyección de 1 mg de zymosan en las bolsas de aire. Los ratones de control se trataron con PBS estéril (100 \mul s.c.).

Resultados

La Figura 1 muestra que de los fragmentos de LC1_{2-2,} LC1_{2-12} y LC1_{2-6} mostraron la mayor potencia, teniendo respuestas finales en porcentaje de inhibición casi idénticas. Los datos se muestran como porcentaje de la inhibición de control de la migración de PMN, que es la extravasación de leucocitos medida en ratones tratados con vehículo (PBS estéril). Se calcularon los DE_{50} aproximados de 45, 110 y 1100 nmoles (n=15; P<0,01), respec-
tivamente.

LC1_{2-26} por sí mismo mostró la mayor potencia. Esto probablemente se debe a la presencia de restos que flanquean la secuencia AMVSE que aumentan la actividad inhibidora de la migración de PMN del núcleo farmacéutico
AMVSE.

La Figura 2 presenta la acción inhibidora de una dosis equimolar de los péptidos mencionados, e indica que la actividad encontrada en LC1_{2-12} está contenida en el dominio LC1_{2-16}.

Los resultados indican claramente el efecto inhibidor del núcleo farmacéutico AMVSE sobre la migración de PMN y la posibilidad de su potencia mejorada en combinación con secuencias flanqueantes adecuadas. El núcleo farmacéutico AMVSE representan la secuencia activa mínima de la que pueden obtenerse secuencias útiles adicionales combinando la secuencia AMVSE central con secuencias flanqueantes adicionales, grupos químicos diseñados para mejorar la unión o penetración del péptido en su sitio activo u otros grupos químicos que de algún otro modo mejoran las propiedades antiinflamatorias de un compuesto que comprende el núcleo farmacéutico
AMVSE.

Referencias

Carey, F. y col., Am. J. Physiol.,259 266-269 (1990).

Cirino, G. y col., Nature, 328: 270-272 (1987).

Cirino, G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3428-3432 (1989).

Cirino, G. y col., British Journal of Pharmacology, 108: 573-574 (1993).

Croxtall, J.D. y Flower, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3571-3575 (1992).

Croxtall, J.D. y Flower, R.J., Biochem. Pharmacology, 48: 1729-1734 (1994).

Croxtall, J.D. y col., Int. J. Cancer, 54: 153-158 (1993).

Croxtall, J.D. y col., Biochem. Pharmacol., 50: 465-474 (1995).

Croxtall, J.D. y col., British Journal of Pharmacology, 123: 975-983 (1998).

Davidson, J. y col., British Journal of Pharmacology, 102: 7-9 (1991).

Dieppe, P.A. y col., Q. J. Med., XLVIII: 533-553 (1979).

Flower, R.J. y Rothwell, N.J., Trends Pharmacol. Sci., 15: 71-76 (1994).

Perretti, M. y col., J. Immunol., 151: 4306-4314 (1993).

Perretti, M., Biochem. Pharmacology, 47: 931-938 (1994).

Perretti y col., British Journal of Pharmacology, 117: 1145-1154 (1996).

Raynal, P. y Pollard, H.B., Biochim. Biophys. Acta. 1197: 63-93 (1994).

Taylor, A.D. y col., Neuroendocrinology, 58: 430-439 (1993).

Taylor, A.D. y col., J. Endocrinol., 147: 533-544 (1995).

Terkeltaub, R., "Gout. Crystal-induced inflammation", en: Inflammation. Basic Principles and Clinical Correlates, editado por Gallin, J.I. y col., páginas 977-981, Raven Press, Nueva York (1992).

Wu, C.-C. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3473-3477 (1995).

Claims (7)

1. Un compuesto de 5-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos AMVSE, en el que dicho compuesto no comprende la secuencia de aminoácidos EQEYVQTV, para su uso en terapia.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, para inhibir la migración de leucocitos, o tratar o prevenir la inflamación y/o respuesta/enfermedad inflamatoria.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que es un polipéptido.

4. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es AMVSEFLKQAW.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación precedente y que comprende adicionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la fabricación de un medicamento para inhibir la migración de leucocitos, o tratar o prevenir la inflamación y/o respuesta/enfermedad inflamatoria.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la respuesta/enfermedad inflamatoria es gota, artritis gotosa, artritis reumatoide, asma, lesión o daño por reperfusión, apoplejía, infarto de miocardio, choque séptico, o un trastorno cutáneo.