DE69930854T2

DE69930854T2 - Von lipocortin-1 abgeleitete entzündungshemmende wirkstoffe

Info

Publication number: DE69930854T2
Application number: DE69930854T
Authority: DE
Inventors: Mauro Perretti; Roderick Abbots Langley FLOWER
Original assignee: Harvey William Research Ltd
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2019-07-23
Also published as: ATE323105T1; DK1100821T3; EP1100821B1; DE69930854D1; AU5055999A; WO2000005255A3; WO2000005255A2; EP1100821A2; GB9816235D0; PT1100821E; ES2263280T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen mit anti-entzündlichen Eigenschaften.
Hintergrund der Erfindung
Die Entzündung an Wundstellen und Stellen der Infektion ist häufig charakterisiert durch, inter alia, eine starke Infiltration von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Insbesondere sind polymorphonukleäre Zellen (PMN) der vorherrschende Zelltyp, der von den Stellen der Entzündung, wie entzündeten Gelenken (entzündete intraartikuläre und periartikuläre Räume) gewonnen werden (Terkeltaub, 1992; Dieppe et al., 1979).
Die Entzündung kann z.B. durch die Wirkung von solchen anti-entzündlichen Mitteln, wie Glucocorticoiden, die durch den Körper als Antwort auf Entzündung gebildet werden, verringert werden. Eine der vielen Wirkungen, die von Glucocorticoiden durchgeführt wird, ist die Induktion von Lipocortin 1 (LC1), das selbst die Arachidonsäurefreisetzung und Zellproliferation verhindert (Vorgänge, die für gewöhnlich mit Entzündung assoziiert sind).
Der zusammengefasste experimentelle Beweis (Flower and Rothwell, 1994) unterstützt das Konzept, dass Lipocortin (LC1) ein Schlüsselmediator von vielen Wirkungen von Glucocorticoiden, einschließlich der Suppression von Lipidmediatorfreisetzung (Cirino et al., 1987), der Inhibierung von Fieber (Carey of al., 1990; Davidson et al., 1991), Pfoten- bzw. Klauenödem (Cirino et al., 1989) und polymorphonukleäre Leukozyten (PMN) Migration (Perretti of al., 1993), die Inhibierung der Freisetzung des adrenocorticotrophen Hormons (ACTH) (Taylor et al., 1993) und anderen Hypophysenvorderlappen Hormonen (z.B. Taylor et al., 1993, 1995) und der Inhibierung der Enduktion durch Endotoxin von Stickoxidsynthase (Wu et al., 1995) ist.
LC1 ist ein Mitglied einer Superfamilie von Proteinen, die als Annexine bezeichnet werden (zusammengefasst von Raynal und Pollard, 1994). Mitglieder dieser Proteingruppe werden durch ein gemeinsames strukturelles Motiv identifiziert, das vier wiederholte Untereinheiten umfasst (in einigen Mitgliedern der Familie acht wiederholte Untereinheiten). Während diese Kerndomäne unter Mitgliedern der Annexinfamilie stark konserviert ist, weist jedes der einzelnen Proteine eine unterschiedliche N-terminale Domäne von variabler Länge auf, und es wurde vorgeschagen, weil dies ein unterscheidendes Merkmal ist, es möglicherweise zu der biologischen Aktivität beiträgt, die spezifisch mit jedem Mitglied assoziiert ist. Tatsächlich wurde in vorherigen Arbeiten gezeigt, dass LC1, dem die N-terminale Domäne fehlt, keine Aktivität in einigen Entzündungsassays und der Mediatorfreisetzung aufweist, wohingegen das Gesamtlängen N-Terminus N-Acetyl LC1_2-26 in einigen Systemen biologisch aktiv ist (Cirino et al., 1993; Perretti, 1994).
Die A549 Zelllinie ist ein nützliches Modell für die Untersuchung von LC1-Biologie. Die inhibitorische Wirkung von Glucocorticoiden auf die Zellproliferation in diesem Modell scheint durch die Induktion und Externalisierung von LC1 vermittelt zu sein, die anschließend die Arachidonsäurefreisetzung und deshalb die Freisetzung von Eicosanoiden vermittelt, die als autokrine Wachstumsstimulatoren in diesem Zellsystem fungieren (Croxtall und Flower, 1992). Die Glucocorticoidblockierung der Arachidonsäurefreisetzung und des Zellwachstums kann durch Anti-LC1-neutralisierende monoklonale Antikörper (Croxtall und Flower, 1992; Croxtall et al., 1995) oder Antisense Desoxynucleotide (Croxtall und Flower, 1994) neutralisiert werden, was die zentrale Rolle dieses Proteins in der Glucocorticoidwirkung bestätigt.
In vorherigen Publikationen (Croxtall et al., 1993) wurde gezeigt, dass die N-terminale Domäne von LC1 kritisch für das Ausüben dieser inhibitorischen Wirkung auf die A549 Zellfunktion ist, und dass diese biologische Eigenschaft in dem unterhalb gelegenen Abschnitt der N-terminalen Domäne (LC1_13-25) angeordnet zu sein scheint, weil LC1_1-12 in diesem Modell inaktiv ist.
Um die Region, die für die biologische Aktivität der Lipocortin-N-terminalen Domäne notwendig ist, zu definieren, wurden Experimente durchgeführt, in denen eine Familie von 25 Peptiden synthetisiert wurde, in der systematische Deletionen an den N- und C-Termini durchgeführt wurden. Dies erlaubte es, dass eine Suche mit größerer Präzision hinsichtlich der biologisch aktiven Region des Moleküls durchgeführt werden konnte (Croxtall et al., 1998). Die Ergebnisse dieser Studie unterstrichen die Wichtigkeit der Domäne EQEYV als eine hochkonservierte Sequenz, die alle aktiven Peptide enthält. Das kürzeste Peptid, das signifikante inhibitorische Aktivität herovrrief, war LC1 LC1_18-25 (EQEYVQTV), was vermittelt, dass die Domäne EQEYV, während sie essentiell ist, nicht ausreichend für die biologische Aktivität war.
Jedoch beruhten Studien, die von Croxtall und Kollegen (Croxtall et al., 1998) durchgeführt wurden, auf einem in vitro Assay, in dem Zellteilung gemessen wurde.
Überraschender Weise wurde jetzt gefunden, dass die in vivo anti-entzündlichen Eigenschaften von LC1 innerhalb eines unterschiedlichen Teils der N-terminalen Aminosäuresequenz von LC1, insbesondere LC1_2-6 (N-Acetyl LC1_2-6 = AMVSE), enthalten sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung von 5–30 Aminosäuren umfassend die Aminosäuresequenz AMVSE bereitgestellt, wobei die Verbindung nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfasst.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Verbindung von 5–30 Aminosäuren umfassend die Aminosäuresequenz AMVSE umfasst, wobei die Verbindung nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfasst, und die weiterhin einen oder mehrere pharma zeutisch verträgliche Träger umfasst. Beispiele von solchen Trägern schließen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) bei z.B. 0,1 M, pH 7,4, NaHCO₃ bei z.B. 0,2 M und andere solche physiologisch verträglichen Fluide ein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung einer Verbindung von 5–30 Aminosäuren umfassend die Aminosäuresequenz AMVSE bereit, wobei die Verbindung nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibierung von Leukozytenmigration oder für die Behandlung oder Vorbeugung einer Entzündung und/oder einer entzündlichen Antwort/Krankheit.
Die vorliegende Erfindung kann auch irgend eine Verbindung von 5–30 Aminosäuren umfassend die Aminosäuresequenz AMVSE einsetzen, vorausgesetzt, dass sie nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfasst. Vorzugsweise ist die Erfindung ein Polypeptid. Das Polypeptid kann azyklisch oder zyklisch sein.
Das Polypeptid kann 5–30 Aminosäurereste umfassen, vorausgesetzt, dass es die Sequenz AMVSE einschließt, aber die Sequenz EQEYVQTV nicht einschließt. Vorzugsweise umfasst das Polypeptid 5–20, weiter bevorzugt 5–11 Aminosäuren. Vorzugsweise umfasst das Polypeptid AMVSEFLKQAW.
Die Verbindung kann auch zusätzliche Aminosäuresequenzen oder chemische Gruppen, welche die Aminosäuresequenz AMVSE flankieren, einschließen, wobei die zusätzlichen Sequenzen oder Gruppen die anti-entzündlichen Eigenschaften der Verbindung verstärken.
Die Bezugnahme auf "Entzündung" oder "entzündliche Antwort/Krankheit" betrifft irgend eine entzündliche Antwort oder Krankheit, einschließlich Gicht, gichtische Arthritis, rheumatoide Arthritis, Asthma, Reperfusionsverletzung oder -beschädigung, Schlaganfall, Myokardinfarkt, septischer Schock oder ein Hautleiden wie Psoriasis oder Ekzem.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung wie oben beschrieben bereit, wobei das Medikament einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger einschließt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das Verfahren wie oben beschrieben bereit, wobei eine Zusammensetzung, die eine Verbindung von 5–30 Aminosäuren umfassend die Aminosäuresequenz AMVSE umfasst, wobei die Verbindung nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfasst, und die weiterhin ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger umfasst, wobei die Zusammensetzung an ein Tier verabreicht wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird jetzt, nur exemplarisch, unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beschrieben, in denen:
1 den Grad der Entzündungsantwort darstellt (gemessen durch PMN Migration), der durch die in vivo Aktivität von Lipocortin 1-abgeleiteten Peptiden (Scramble = LC1_2-6 (Ac-SVEMA); Ac = Acetyl) gebildet wird.
2 den Grad der Entzündungsantwort (wie durch PMN Migration gemessen) darstellt (als ein Balkendiagramm), die durch die in vivo Aktivität von 66 nmol Lipocortin 1-abgeleiteten Peptiden unter Bezugnahme auf 1 gebildet wird (Scramble = LC1_2-6 (Ac-SVEMA); Ac = Acetyl) gebildet wird.
Die in vivo anti-entzündlichen Eigenschaften der Aminosäuresequenz AMVSE wurden durch das Herstellen von Fragmenten aus N-Acetyl LC1_2-26 (AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) und ihre Untersuchung in einem Tiermodell für Entzündungen gezeigt. Das in vivo Tiermodell lieferte den Beweis, dass während N-Acetyl LC1_2-12 (AMVSEFLKQAW) in dem Modell aktiv war, LC1_13-25 (FIENEEQEYVQTV) es nicht war (Daten nicht gezeigt). Wenn AMVSE und LC1_7-12 (FLKQAW) untersucht wurden, war die zuerst Genannte aktiv, wohingegen es die zuletzt Genannte nicht war. Eine Scrambled-Version von AMVSE (nämlich SVEMA) war ebenfalls inaktiv.
Die hier beschriebenen Experimente zeigen eindeutig, dass die biologischen Eigenschaften von Lipocortin 1 (LC1) sich in in vivo Entzündungsmodellen im Vergleich zu dem in vitro A549 Modell unterscheiden.
Die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, werden vorzugsweise für die Verwendung als Pharmazeutika hergestellt. Die Polypeptide können über irgendeinen geeigneten Weg, einschließlich orale oder parenterale Verabreichung, verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die hier beschriebenen Verbindungen enthalten, werden typischer Weise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Salzlösung, Glycerol, Ethanol, etc. enthalten. Zusätzlich oder alternativ können Hilfssubstanzen, wie benetzende oder emulgierende Mittel, pH-puffernde Substanzen und ähnliche, in solchen Vehikeln anwesend sein. Die Polypeptid enthaltenden Zusammensetzungen werden vorzugsweise in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie 0,1 M PBS (pH 7,4), 0,2 M NaHCO₃ oder anderen pharmazeutisch verträglichen Fluiden verabreicht.
Typischer Weise werden die umfassten Zusammensetzungen als injizierbare Substanzen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; feste Formen, die zur Lösung in oder als Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann auch z.B. in Liposomen emulgiert oder verkapselt sein.
Zusammensetzungen, die als Pharmazeutika verwendet werden, umfassen eine wirksame Menge der Verbindung, ebenso wie irgend eine der oben erwähnten Verbindungen, wenn benötigt. Unter "wirksame Menge" wird verstanden, dass die Verabreichung jener Menge an ein Individuum, entweder in einer einzelnen Dosierung oder als Teil einer Reihe, wirksam in der Behandlung oder Vorbeugung ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von dem Gesundheitszustand, dem Alter und dem physikalischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z.B. nicht humaner Primate, Primate, etc.), der Behandlung einer medizinischen Situation gemäß der Einschätzung des Arztes oder anderer relevanter Faktoren. Die Menge fällt in einen relativ breiten Bereich, der durch Routineversuche bestimmt werden kann. Typische Dosierungen können innerhalb des Bereichs von 0,1–100 mg/kg, vorzugsweise 0,5–50 mg/kg, am meisten bevorzugt 1–10 mg/kg, fallen.
Die umfassten Verbindungen werden herkömmlich parenteral, z.B. durch Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär verabreicht. Weitere Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, schließen orale und pulmonare Formulierungen, Zäpfchen und transdermale Verabreichungen ein. Die Dosierungsbehandlung kann eine Verabreichung in einer einzelnen Dosis oder Verabreichungen mit multiplen Dosen sein. Die Zusammensetzung kann zusammen mit anderen anti-entzündlichen Mitteln verabreicht werden.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Polypeptid" ein Polymer von Aminosäuren und ist nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls beschränkt; somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Definition von Polypeptid eingeschlossen. Das Polypeptid kann durch chemische Synthese oder durch rekombinante DNA-Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Der Begriff "Polypeptid" schließt auch Modifikationen des Polypeptids, z.B. Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen, Zyklisierungen u.Ä. ein. In diese Definition sind z.B. Polypeptide eingeschlossen, die ein oder mehrere Analogon/Analoga einer Aminosäure (einschließlich z.B. unnatürliche Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, ebenso wie anderen im Stand der Technik bekannten Modifikationen, die sowohl natürlich vorkommend als auch nicht natürlich vorkommend sein können.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Es ist offensichtlich, dass das Folgende nur exemplarisch bereitgestellt wird und dass eine Modifikation in Details durchgeführt werden kann, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.
Experimentelles Protokoll
Tiere
Männliche Swiss Albino-Mäuse (20–22 g Körpergewicht) wurden von Interfauna (CFLP Stamm; Huntingdon, Cambridgeshire, UK) gekauft und bei einer Standardfutter Pellet-Diät mit Leitungswasser ad libitum gehalten. Die Tiere wurden spätestens eine Woche nach der Ankunft verwendet.
Maus Luftkissen Modell
Luftkissen wurden auf dem Rücken der Mäuse durch subkutane (s.c.) Injektion von 2,5 ml Luft am Tag 2 und Tag 5 gebildet. Drei Tage nach der letzten Luftinjektion (6 Tage alte Luftkissen) wurde ein 1 mg Zymosan (in 0,5 ml steriler Salzlösung) lokal injiziert (Perretti et al., 1996). Zymosan wurde zuvor für 30 min in Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) gekocht, intensiv in dem selben Medium gewaschen und bei –20°C vor der Verwendung gelagert.
Vier Stunden nach der lokalen Injektion von Zymosan wurden die Mäuse durch das Aussetzen gegenüber CO₂ getötet, und die Luftkissen wurden mit 2 ml PBS enthaltend Ethylendiamintetraessigsäurenatriumsalz (EDTA; 3 mM) und Heparin (25 U/ml) gewaschen. Die Spülflüssigkeiten (insbesondere die gesamten 2 ml wurden einheitlich gewonnen) wurden bei 200 g für 10 min bei 4°C zentrifugiert und die Zellpellets wurden 2 ml PBS/EDTA + Heparin resuspendiert. Die Zahl am PMN wurde unter Verwendung eines Neubauer Hämatozytometers nach dem Färben (1:10 Verdünnung) mit Turk'scher Lösung (kristallviolett 0,01 % w/v in Essigsäure 3 % v/v) bestimmt.
Peptide
Alle Peptide wurden einer herkömmlichen Festphasentechnik folgend von The Advanced Biotechnology Center, Charing Cross Westminster Medical School (London, UK) synthetisiert und durch Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt. Alle Peptide waren mehr als 95 % rein.
Arzneimittelbehandlung
Die folgenden Peptide wurden aus der Lipocortin 1 N-Terminus Region gewonnen: LC1_2-26 (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK), LC1_2-12 (Ac-AMVSEFLKQAW), LC1_12-25 (FIENEEQEYVQTV), LC1_2-6 (Ac-AMVSE) oder Scramble LC1_2-6 (Ac-SVEMA) wurden s.c. 30 min vor der Injektion von 1 mg Zymosan in die Luftkissen verabreicht. Die Kontrollmäuse wurden mit sterilem PBS (100 μl s.c.) behandelt.
Ergebnisse
Die 1 zeigt, dass die Fragmente von LC1_2-26, LC1_2-12 und LC1_2-6 das größte Potenzial zeigten mit nahezu identischer endprozentualer Inhibitionsantwort. Die Daten sind als Prozent der Kontrollinhibition von PMN Migration gezeigt, was die Leukozytenextravasation ist, die in den Vehikel(steriles PBS)-behandelten Mäusen gemessen wurde. Ungefähre jeweilige ED₅₀ von 45, 110 und 110 nmol wurden berechnet (n = 15; P < 0,01).
LC1_2-26 selbst zeigte das größte Potenzial. Dies liegt wahrscheinlich an der Anwesenheit von Resten, welche die AMVSE Sequenz flankieren, welche die PMN migrationsinhibitorische Aktivität des Pharmakors AMVSE steigerte.
Die 2 berichtet über die inhibitorische Wirkung einer äquimolaren Dosis des besagten Peptids und zeigt, dass die Aktivität, die in LC1_2-12 gefunden wird, innerhalb der LC1_2-12 Domäne enthalten ist.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig den inhibitorischen Effekt des AMVSE Pharmakors auf die PMN Migration und die Möglichkeit seines gesteigerten Potenzials in Kombination mit geeigneten flankierenden Sequenzen. Das AMVSE Pharmakor stellt die minimale aktive Sequenz dar, von der weitere nützliche Sequenzen abgeleitet werden können, durch das Kombinieren der AMVSE Kernsequenz mit zusätzlichen flankierenden Sequenzen, chemischen Gruppen, die gestaltet sind, um die Bindung oder Penetration des Peptids oder seiner aktiven Stelle zu verbessern, oder anderer chemischer Gruppen, die auf irgend eine Weise die antientzündlichen Eigenschaften einer Verbindung verbessern, die das Pharmakor AMVSE umfasst.
Referenzen

Carey, F. et al., Am. J. Physiol., 259: 266–269 (1990).
Cirino, G. et al., Nature, 328: 270–272 (1987).
Cirino, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3428–3432 (1989).
Cirino, G. et al., British Journal of Pharmacology, 108: 573–574 (1993).
Croxtall, J.D. und Flower, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3571–3575 (1992).
Croxtall, J.D. und Flower, R.J., Biochem. Pharmacology, 48: 1729–1734 (1994).
Croxtall, J.D. et al., Int. J. Cancer, 54: 153–158 (1993).
Croxtall, J.D. et al., Biochem. Pharmacol., 50: 465–474 (1995).
Croxtall, J.D. et al., British Journal of Pharmacology, 123: 975–983 (1998).
Davidson, J. et al., British Journal of Pharmacology, 102: 7–9 (1991).
Dieppe, P.A. et al., Q.J. Med., XLVIII: 533–553 (1979).
Flower, R.J. und Rothwell, N.J., Trends Pharmacol. Sci., 15: 71–76 (1994).
Perretti, M. et al., J. Immunol., 151: 4306–4314 (1993).
Perretti, M., Biochem. Pharmacology, 47: 931–938 (1994).
Perretti, M. et al., British Journal of Pharmacology, 117: 1145–1154 (1996).
Raynal, P. und Pollard, H.B., Biochim. Biophys. Acta. 1197: 63–93 (1994).
Taylor, A.D. et al., Neuroendocrinology, 58: 430–439 (1993).
Taylor, A.D. et al., Endocrinol., 147: 533–544 (1995).
Terkeltaub, R., "Gout. Crystal-induced inflammation", in: Inflammation. Basic Principles and Clinical Correlates, herausgegeben von Gallin, J.I. et al., S. 977–981,
Raven Press, New York (1992).
Wu, C.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3473–3477 (1995).

Claims

Verbindung von 5–30 Aminosäuren zur therapeutischen Verwendung umfassend die Amonisäuresequenz AMVSE, wobei die Verbindung nicht die Aminosäuresequenz EQEYVQTV umfaßt.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Inhibierung von Leukozytenmigration oder zur Behandlung oder Vorbeugung einer Entzündung und/oder einer entzündlichen Antwort/Krankheit.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, welche ein Polypeptid ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche AMVSEFLKQAW ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach einem vorangehenden Anspruch umfaßt und welche weiter einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger umfaßt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibierung von Leukozytenmigration oder für die Behandlung oder Vorbeugung einer Entzündung und/oder einer entzündlichen Antwort/Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die entzündliche Antwort/Krankheit Gicht, gichtische Arthritis, rheumatoide Arthritis, Asthma, Reperfusionsverletzung oder -beschädigung, Schlaganfall, Myokardinfarkt, septischer Schock oder ein Hautleiden ist.