ES2258297T3 - Proteina de fusion antigenica portadora de epitopos gal-alfa-1,3gal. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA DE FUSION ANTIGENICA, QUE LLEVA MULTIPLES EPITOPOS GAL-ALFA-1,3-GAL. DICHA PROTEINA PUEDE ESTAR CONSTITUIDA ASIMISMO POR UNA PARTE DE MUCINA CON ALTO NIVEL DE GLICOSILACION, LA CUAL MEDIA LA UNION A SELECTINAS, COMO PSGL-1, Y POR UNA PARTE QUE PRESENTA PROPIEDADES INMUNOLOGICAS, COMO LA PARTE FC DE LA IGG. LA PROTEINA DESCRITA EN LA INVENCION SE UTILIZA PREFERIBLEMENTE COMO UN ABSORBEDOR, PARA EVITAR EL RECHAZO HIPERAGUDO DE UN XENOTRASPLANTE, COMO EN EL CASO DE UN TEJIDO U ORGANO DE CERDO TRASPLANTADO EN UN PACIENTE HUMANO. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREVENCION DE UNA REACCION DE RECHAZO HIPERAGUDA EN UN PACIENTE QUE TIENE QUE RECIBIR UN XENOTRASPLANTE.

Description

Proteína de fusión antigénica portadora de epítopos Gal-\alpha-1,3Gal.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión antigénicas que portan múltiples epítopos Gal\alpha1,3Gal para la eliminación de anticuerpos foráneos, tales como los anticuerpos anticerdo xenorreactivos humanos, mediante absorción.

Muchas enfermedades en la actualidad sólo resultan curables mediante un trasplante de tejido o de un órgano, tal como un riñón o el corazón. En ocasiones resulta posible localizar un donante vivo con marcadores inmunológicos compatibles con el receptor del trasplante, aunque la donación de órganos por un donante vivo implica grandes riesgos y efectos sobre la salud posiblemente perjudiciales para el donante. Si no se dispone de ningún donante vivo, el órgano debe obtenerse de un cadáver humano a corazón latiente de calidad elevada y, nuevamente, debe existir una buena correspondencia inmunológica entre el donante y el receptor. En la actualidad, la situación es de una demanda en constante crecimiento de órganos humanos adecuados para el trasplante y el salto entre dicha demanda y la disponibilidad de órganos es probable que crezca todavía más a la vista de las mejoras continuas en los procedimientos y resultados de los trasplante. La respuesta posible más prometedora a este problema es el xenotrasplante, es decir, el trasplante de tejido o de órganos entre diferentes especies. Para los pacientes humanos, el cerdo se considera la especie donante más adecuada por motivos médicos, prácticos, éticos y económicos.

El problema principal de la xenoinjertación entre especies discordantes, tales como el cerdo y el ser humano, es el rechazo hiperagudo (HAR), que conduce al cese del flujo sanguíneo minutos después del trasplante. Aunque aparecen otros mecanismos de rechazo tras el HAR, la creencia general es que si pudiese prevenirse el HAR, el sistema inmunológico del paciente podría experimentar un proceso de acomodación, por el que un régimen inmunosupresor convencional podría mantener la compatibilidad del paciente y el xenoinjerto.

El HAR está causado por anticuerpos naturales preformados en la especie receptora que reaccionan con antígenos situados sobre el endotelio en los órganos del donante, una interacción que conduce a la activación del complemento y de las células endoteliales, a trombosis, a extravasación de los glóbulos blancos y finalmente al rechazo. Los antígenos de cerdo que reaccionan con los anticuerpos humanos naturales han resultado ser carbohidratos (7-10); siendo el principal, el epítopo Gal\alpha1,3Gal, que no se expresa en monos, primates y seres humanos del Viejo Mundo debido a la inactivación de la \alpha1,3-galactosiltransferasa (GT) (10-12).

Se han propuesto varios procedimientos para la eliminación o destrucción de anticuerpos xenorreactivos de la sangre del receptor. Bach et al. (Xenotransplantation, editores: Cooper, D.K.C. et al., Springer Verlag, 1991, capítulo 6) propusieron la perfusión de la sangre del receptor a través de un órgano de la especie donante propuesta previamente al trasplante de otro órgano fresco, de manera que se eliminasen los anticuerpos anticerdo.

También se ha propuesto la plasmaféresis para la eliminación no específica de anticuerpos naturales, de manera que se prolongue la supervivencia del injerto (por ejemplo Cairns et al., Rydberg et al.). Sin embargo, la plasmaféresis convencional, o intercambio de plasma, tiene como resultado la pérdida de volumen sanguíneo, que a su vez puede requerir una restitución de volumen con preparaciones agrupadas de plasma recién congelado, albúmina humana, inmunoglobulina, etc. Además, también deben reemplazarse los factores de coagulación, las plaquetas y los factores antitrombóticos. Este tratamiento comporta no sólo el riesgo de transferir virus, tales como el VIH, sino que también comporta el riesgo de una reacción anafiláctica frente a sustancias foráneas. Otros efectos secundarios negativos de la plasmaféresis en el receptor son la sensibilización y la activación del sistema del complemento y del sistema de la coagulación. De acuerdo con ello, la plasmaféresis aparentemente no resulta ni práctica ni segura.

Otros procedimientos para la eliminación de anticuerpos xenorreactivos implican la eliminación no específica de anticuerpos. La proteína A, un componente importante de la pared celular de S. aureus, presenta una elevada afinidad por una porción de la región Fc de las subclases 1, 2 y 4 de la inmunoglobulina G (IgG1, IgG2, IgG4) y se ha utilizado para la eliminación no específica de los anticuerpos anti-HLA de pacientes hipersensibilizados que requieren un trasplante de riñón. Se ha informado de la eficacia del tratamiento con columna de proteína A tras el trasplante de riñón (Dantal J. et al., New England J. Med. 550:7-14, 1994; Nilsson, I.M. et al., Blood 58:38-44, 1981; Palmer, A. et al., The Lancet, 7 de enero, 1989, páginas 10-12). Sin embargo, una desventaja esencial de la utilización de la técnica de la columna de proteína A en el contexto del xenotrasplante es el hecho de que únicamente se eliminan las IgG. Últimamente se ha demostrado que los anticuerpos implicados en el HAR durante un trasplante de cerdo a ser humano podrían ser de otras clases de inmunoglobulina. Además, la eliminación no específica de anticuerpos causa un deterioro general de las defensas inmunológicas del paciente, que bastante naturalmente no resulta deseable durante este proceso como procedimiento de trasplante, en el que el paciente se encuentra inmunodeprimido.

Leventhal et al. (patente WO 95/31209) proponen un procedimiento para la prevención o alivio de una reacción hiperaguda tras el trasplante de un órgano de cerdo en un receptor primate, incluyendo un ser humano. El procedimiento implica pasar el plasma del receptor por una columna con una proteína acoplada, que liga, y de esta manera elimina, la inmunoglobulina presente en el plasma. La proteína se selecciona de entre un grupo que consiste en proteína A de Staphylococcus aureus, proteína G de Streptococcus, y anticuerpos inmunoglobulina antihumana. Este procedimiento adolece de las mismas desventajas ilustradas anteriormente para la columna de proteína A.

Se ha demostrado (Platt et al., Good et al., Holgersson et al.) que los antígenos de cerdo que reaccionan con anticuerpos naturales humanos son carbohidratos, siendo el principal, el epítopo Gal\alpha1,3Gal, que no se expresa en los monos, primates y seres humanos del Viejo Mundo debido a la inactivación de la \alpha1,3-galactosiltransferasa.

Recientemente, McKenzie et al. han demostrado que las células COS transfectadas con el ADNc de \alpha1,3-galactosiltransferasa expresaban el epítopo Gal\alpha1,3Gal sobre su superficie y podían absorber la mayor parte de la actividad anticerdo humana presente en el suero humano.

Además, las columnas derivatizadas con Gal\alpha1,3Gal se han utilizado para eliminar específicamente la actividad anticerdo del suero humano (22), se ha demostrado que los disacáridos Gal\alpha1,3Gal libres evitan la unión de los anticuerpos anticerdo a las células porcinas, incluyendo el endotelio (23), y también la mucina estomacal porcina (24). Sin embargo, la síntesis orgánica de sacáridos resulta un procedimiento muy laborioso y caro, que además es bastante lento, y de acuerdo con ello, no ha encontrado una aplicación generalizada.

Aparte del HAR, los xenoinjertos todavía resultan típicamente rechazados tras unos días en un proceso que se ha denominado "rechazo retardado del xenoinjerto" (DXR) (29). El DXR se caracteriza por la activación de las células mononucleares y por la infiltración del injerto, así como por la producción de citoquinas (29). Se desconoce cuál es la importancia del epítopo Gal\alpha1,3Gal para estos sucesos celulares, aunque recientemente se ha demostrado que los anticuerpos humanos anti-Gal\alpha1,3Gal se encuentran implicados en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células porcinas (30).

De esta manera, todavía existe una necesidad de procedimientos más económicos y más eficientes para la eliminación de los anticuerpos foráneos, tales como los anticuerpos de cerdo, de la sangre de un recipiente al que se destina un xenotrasplante. Además, dentro del campo de los xenotrasplantes, todavía existe una necesidad de procedimientos para la prevención del DXR.

El objetivo de la presente invención es satisfacer la necesidad anteriormente indicada.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención se proporciona un polipéptido de fusión según la reivindicación 1 posteriormente.

En una realización preferente, el polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención comprende una parte de mucina intensamente glucosilada, que puede mediar en la unión a las selectinas, y una parte que proporciona las propiedades de inmunoglobulina. El polipéptido de fusión de acuerdo con la invención puede portar múltiples epítopos Gal\alpha1,3Gal que efectivamente absorben anticuerpos foráneos, tales como los anticuerpos anticerdo, implicados en la eliminación y la ADCC de las células endoteliales, tales como las células porcinas, dependiente de anticuerpos y mediada por el complemento.

El polipéptido de fusión antigénico de acuerdo con la presente invención es capaz de unirse a anticuerpos preformados, así como a anticuerpos producidos en respuesta al trasplante de tejido o de un órgano originado en la especie en la que se expresa el epítopo Gal\alpha1,3Gal, siendo dicha especie preferentemente una especie diferente de la especie productora del anticuerpo. En una realización preferente, la especie productora del anticuerpo es un ser humano que produce anticuerpos contra un trasplante foráneo, por ejemplo un órgano de cerdo, en cuyo caso los epítopos Gal\alpha1,3Gal resultan sintetizados por una \alpha-1,3-galactosiltransferasa derivada de una especie porcina.

De esta manera, debido a que el polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención puede prepararse mediante el cultivo de células manipuladas genéticamente, tales como las células COS, resulta más económico y más sencillo de producir que los sacáridos producidos anteriormente mediante síntesis orgánica. Aunque se ha descrito una célula COS que expresa el epítopo Gal\alpha1,3Gal sobre su superficie (12), la presente invención es la primera propuesta de una proteína de fusión recombinante que porta una multiplicidad de dichos epítopos. El polipéptido de fusión de acuerdo con la invención puede diseñarse fácilmente para que incluya otros péptidos y partes, que pueden resultar ventajosos para una aplicación particular. Posteriormente se describen en más detalle ejemplos de otros componentes del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención.

El polipéptido de fusión antigénico de acuerdo con la invención comprende una parte que media en la unión a la selectina, tal como la selectina P. Dicha parte preferentemente es una proteína altamente glucosilada, tal como una proteína de tipo mucina. Las mucinas, debido a su elevado contenido en carbohidratos unidos mediante un O, resultan especialmente ventajosas, junto con el epítopo Gal\alpha1,3Gal, en el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención, debido a que las propiedades antigénicas resultan de esta manera muy incrementadas en el presente contexto. De esta manera, se ha demostrado que la unión de anticuerpos que son reactivos con el epítopo Gal\alpha1,3Gal resulta todavía más eficiente si dicho epítopo lo presenta una proteína de tipo mucina, indicando que de hecho la unión podría implicar más que dicho epítopo solamente.

En la realización más preferente hasta el momento del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención, la parte que media en la unión a la selectina es el ligando 1 de la glucoproteína selectina P (PSGL-1) o una parte esencial del mismo. Sin embargo, se han caracterizado otras proteínas ancladas en la membrana celular que contienen dominios de tipo mucina y que podrían utilizarse en el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención según resulte apropiado, tales como CD34, CD43, GlyCAM-1, PSGL-1, MAdCAM, CD96, CD45 y las glucoforinas RBC. En la parte experimental de la presente solicitud, se muestra un ejemplo en el que dicho ligando 1 de la glucoproteína selectina P (PSGL-1) se deriva de las células HL-60. En teoría, el repertorio de anticuerpos anticerdo podría reconocer el epítopo Gal\alpha1,3Gal en diversos contextos estructurales determinados por el sacárido central que presenta el epítopo, los puntos de ramificación vecinos, y la proximidad a otros residuos de azúcar, tales como la fucosa y el ácido siálico (31-33). Si se utilizan los disacáridos Gal\alpha1,3Gal o los trisacáridos Gal\alpha1,3Gal\beta1,4GlcNAc como absorbentes, algunas especificidades del repertorio podrían no absorberse eficientemente.

Las propiedades de la parte del polipéptido de fusión que media en la unión de la selectina de acuerdo con la invención, así como razonamientos adicionales referentes a la selección del mismo, se comentan posteriormente, ver la sección titulada "Comentario".

El polipéptido de fusión antigénico de acuerdo con la presente invención comprende además una parte que proporciona propiedades de inmunoglobulina. Las partes de inmunoglobulina resultan ventajosas para el diseño de un procedimiento eficiente y simple de unión del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención a un soporte sólido a utilizar para purificar el plasma de un receptor de un xenotrasplante respecto a anticuerpos contra dicho trasplante. También puede incluirse una parte inmunoglobulina en el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención en el caso preferente, en el que se produce el polipéptido de fusión en una célula que lo secreta, utilizando la parte inmunoglobulina para la purificación del cultivo respecto a dicho polipéptido de fusión secretado.

De esta manera, de acuerdo con la presente invención, la parte que proporciona propiedades de inmunoglobulina es un polipéptido inmunoglobulina, tal como IgG, o una parte del mismo. Preferiblemente, dicha parte que proporciona propiedades de inmunoglobulina es la parte Fc de una inmunoglobulina, preferentemente de IgG, o una parte esencial de la misma. En una realización particular de la presente invención, dicha parte que proporciona propiedades de inmunoglobulina es IgG_{2b}, preferentemente la parte Fc de la misma. En un ejemplo de un polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención, dicha parte que proporciona propiedades de inmunoglobulina es de origen no humano, y preferentemente se deriva del ratón. Sin embargo, para determinadas aplicaciones, dicha parte más preferentemente es de origen humano.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención preferentemente es un polipéptido de fusión recombinante. Puede haberse producido en una línea celular recombinante, preferiblemente en una línea celular eucariótica, por ejemplo en una línea celular COS, tras la cotransfección del ADNc para la proteína de fusión mucina/inmunoglobulina y el ADNc para la \alpha1,3-galactosiltransferasa porcina.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, como un absorbente para la eliminación de anticuerpos del plasma sanguíneo. Esta utilización se comenta con más detalle posteriormente, en la sección titulada "Comentario".

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. Dicho vector puede comprender, además, secuencias de control apropiadas, tales como cebadores, etc. El experto en la materia puede seleccionar fácilmente elementos apropiados para este fin.

En un aspecto diferente de la presente invención se proporciona una línea celular transfectada con el vector de acuerdo con la invención. La línea celular preferentemente es eucariótica, por ejemplo una línea celular COS. En la realización preferente, dichas células secretan el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención hacia el medio de cultivo, haciendo que la recuperación del mismo resulte más fácil y, de acuerdo con ello, más económica de lo que resultarían los procedimientos correspondientes para la síntesis del mismo.

Parte experimental

En la presente solicitud, se utilizan las abreviaturas siguientes:

ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo; BSA, albúmina de suero bovino; DXR, xenorechazo retardado; ELISA, ensayo de inmunosorción ligado a enzima; FT, fucosiltransferasa; Gal, D-galactosa; GT, galactosiltransferasa; Glc, D-glucosa; GlcNAc, D-N-acetilglucosamina; GlyCAM-1, molécula de adhesión celular 1 dependiente de glucosilación; HAR, rechazo hiperagudo; Ig, inmunoglobulina; MAdCAM, molécula de adhesión celular de adresina mucosal; PAEC, células endoteliales aórticas porcinas; PBMC, células mononucleares de sangre periférica; PSGL-1, ligando 1 de la glucoproteína selectina P; RBC, glóbulo rojo; SDS-PAGE, electroforesis en dodecil sulfato sódico-gel de poliacrilamida.

Materiales y procedimientos

Cultivo celular. Se cultivaron células COS-7 m6 (35) y la línea celular endotelial aórtica porcina inmortalizada con antígeno T grande de SV40, PEC-A (36), en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), con suero fetal bovino (FBS) al 10% y 25 \mug/ml de sulfato de gentamicina. La línea celular eritroleucémica humana, K562, y la línea celular del linfoma de Burkitt, Raji, se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio RPMI 1640 con FBS al 10% tamponado con HEPES, 100 IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.

Construcción de vectores de expresión. El epítopo \alpha1,3GT (37-39) se amplificó por PCR a partir de ADNc de bazo de cerdo utilizando un cebador forward con seis codones de complementariedad con el extremo 5' de la secuencia codificante, una secuencia de consenso de inicio traduccional Kozak y un sitio de restricción Hind3, y un cebador reverso con seis codones de complementariedad con el extremo 3' de la secuencia codificante, un codón de parada traduccional y un sitio de restricción NotI. El ADNc de \alpha1,3GT se clonó en el polilínker de CDM8 utilizando Hind3 y NotI 35). La secuencia codificante del ligando 1 de la glucoproteína selectina P (PSGL-1), una proteína de tipo mucina altamente glucosilada que media en la unión a la selectina P (40), se obtuvo por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de HL-60, se clonó en CDM8 con Hind3 y NotI, y se confirmó mediante secuenciación de ADN. El plásmido de expresión de mucina/inmunoglobulina se construyó mediante la fusión del ADNc amplificado por PCR de la parte extracelular de PSGL-1 en el mismo marco de lectura a través de un sitio BamH1, con la parte Fc (bisagra, CH2 y CH3) del IgG_{2b} de ratón transportado por un cassette de expresión en CDM7 (Seed, B. et al., no publicado).

Producción y purificación de quimeras de mucina/inmunoglobulina secretadas. Se transfectaron células COS m6 utilizando el protocolo de DEAE-dextrano y 1 \mug de plásmido de ADN purificado con un gradiente de CsCl por ml de cóctel de transfección. Las células COS se transfectaron a una confluencia de aproximadamente el 70% con vector vacío (CDM8), con el plásmido PSGL1/mIgG_{2b} solo o con este plásmido en combinación con plásmido codificante de \alpha1,3GT. Las células transfectadas se tripsinizaron y se transfirieron a matraces nuevos el día después de la transfección. Tras aproximadamente 12 horas de adherencia, se descartó el medio, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y posteriormente se incubaron otros 7 días en medio AIM-V libre de suero (nº de cat. 12030, Life Technologies Inc.). Tras la incubación, se recogieron los sobrenadantes, se peletizaron los residuos (1.400 x g, 20 minutos) y se añadió NaN_{3} al 0,02%. Se purificó la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} sobre perlas de agarosa (A-6531, Sigma) con IgG de cabra antiratón con agitación durante la noche a 4ºC. Las perlas se lavaron en PBS y seguidamente se utilizaron para SDS-PAGE y para el análisis de transferencia Western o para la absorción de suero AB humano y de las inmunoglobulinas humanas purificadas.

Purificación de IgG, IgM e IgA humanas. Se purificaron IgG, IgM e IgA humanas a partir de suero AB humano, agrupado a partir de más de 20 donantes de sangre sanos, utilizando perlas de agarosa con IgG de cabra antihumano (específico para Fc; A-3316, Sigma), IgM (cadena \mu-específico; A-9935, Sigma) e IgA (cadena \alpha-específico; A-2691, Sigma). En resumen, se vertieron 5 ml de mezcla (2,5 ml de perlas empaquetadas) en una columna de 10 mm de diámetro y se lavaron con PBS. Se aplicaron diez mililitros de suero AB humano agrupado a 1 ml/minuto utilizando una bomba peristáltica, se lavaron con varios volúmenes de columna de PBS, y se eluyeron con glicina 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 2,4, utilizando un caudal de 1 ml/minuto. Se recogieron fracciones de un mililitro en tubos que contenían 0,7 ml de tampón neutralizador (Tris/HCl 0,2 M, pH 9). Se leyó espectrofotométricamente la absorbancia a 280 nm y se agruparon los tubos que contenían proteína, se dializaron frente a PBS al 1%, y se liofilizaron. Las inmunoglobulinas liofilizadas se resuspendieron en agua destilada y las concentraciones se ajustaron a 16 mg/ml para IgG, a 4 mg/ml para IgA y a 2 mg/ml para IgM.

SDS-PAGE y transferencia Western. Se corrió el SDS-PAGE mediante el procedimiento de Leammli con un gel de carga al 5% y un gel resolutivo al 6% o al 10% utilizando un sistema de electroforesis Mini-PROTEAN II vertical (Bio-Rad, Herculus, CA) (41). Las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente sobre membranas Hybond^{TM}-C extra (Amersham) utilizando una célula de transferencia electroforética Trans-Blot (Bio-Rad, Herculus, CA) (42). Los geles de proteína se tiñeron utilizando un kit de tinción con plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad, Herculus, CA). Tras el bloqueo durante por lo menos 2 horas en BSA al 3% en PBS, las membranas se sondearon durante 2 horas a temperatura ambiente con isolectina B_{4} de Bandereia simplicifolia conjugada con peroxidasa (L-5391, Sigma) diluida a una concentración de 1 \mug/ml en PBS, pH 6,8, que contenía CaCl_{2} 0,2 mM. Las membranas se lavaron 5 veces con PBS, pH 6,8, y la lectina unida se visualizó mediante quimioluminiscencia utilizando el kit ECL^{TM} de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

Cuantificación de PSGL1/mIgG_{2b} mediante ELISA de Fc de IgG antiratón. Se determinó la concentración de proteína de fusión en sobrenadantes de cultivo celular antes y después de la determinación de la absorción mediante un ensayo ELISA de 96 pocillos, en el que se capturaron las proteínas de fusión con un anticuerpo Fc de IgG policlonal de cabra antiratón purificado por afinidad (nº de cat. 55482, Cappel/Organon Teknika, Durham, NC). Tras el bloqueo con BSA al 3% en PBS, las proteínas de fusión se capturaron y se detectaron con un anticuerpo Fc de IgG policlonal antiratón purificado por afinidad (nº de cat. 55566, Organon Teknika, Durham, NC) utilizando dihidrocloruro de O-fenilendiamina como sustrato (Sigma). La placa se leyó a 492 nm y la ELISA se calibró utilizando una serie de dilución de fragmentos Fc de IgG de ratón purificados (nº de cat. 015-000-008, Jackson ImmunoResearch Labs., Inc., West Grove, PA) resuspendidos en medio AIM V libre de suero.

ELISA de células endoteliales aórticas porcinas. Se sembraron células PEC-A a una densidad de 15.000 células/
pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina (Nunclon, Dinamarca) y se cultivaron durante 48 horas en medio AIM V libre de suero. La placa se lavó 5 veces en NaCl 0,15 M que contenía Tween 20 al 0,02% y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 \mul/pocillo de IgG, IgM e IgA humanas purificadas en PBS, partiendo de una concentración de 8, 1 y 2 mg/ml, respectivamente. La placa se lavó nuevamente, tal como anteriormente, y se añadieron 50 \mul de fragmentos F(ab)'_{2} de IgG de cabra antihumana conjugada con fosfatasa alcalina (cadena \gamma-específica; A3312, Sigma), IgM (cadena \mu-específica; A1067, Sigma) e IgA (cadena \alpha-específica; A3062, Sigma) diluidos 1:200 en PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tal como anteriormente, se incubó con el sustrato fosfato de p-nitrofenilo (Sigma 104-105) y se leyó a 405 nm.

Ensayo de citotoxicidad de células endoteliales aórticas porcinas. Se sembraron y se cultivaron células PEC-A en placas de 96 pocillos tal como se ha descrito para la ELISA de las PEC-A. Tras 48 horas de cultivo, las células se cargaron durante 1 hora a 37ºC con Na_{2}^{51}CrO_{4} (nº de cat. CJS4, Amersham), 1 \muCi/pocillo, y se lavaron 3 veces con medio AIM V. Se añadieron cincuenta microlitros de suero AB humano absorbido o no absorbido y diluido sucesivamente, o anticuerpos IgG, IgA o IgM humanos purificados, conjuntamente con 50 \mul de suero de conejo (nº de cat. 439665, Biotest AG, Dreieich, Alemania) como fuente de complemento. Tras 4 horas de incubación a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}, se recogieron los sobrenadantes utilizando un sistema de recolección de sobrenadantes Skatron (Skatro Instruments, Noruega) y se analizaron en un contador \gamma (1282 Compugamma, LKB Wallac). Se analizó cada muestra sérica y de Ig por triplicado. Se calculó el porcentaje de eliminación como la liberación medida menos la liberación espontánea, dividido por la diferencia entre la liberación máxima y la espontánea.

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se aislaron PBMC humanos a partir de capas leucoplaquetarias frescas preparadas a partir de donantes sanos en el banco de sangre del South Hospital, Estocolmo. Se mezclaron seis mililitros de capa leucoplaquetaria en un tubo de 50 ml de polipropileno con 15 ml de PBS que contenía 1 mg/ml de BSA y 3,35 mg/ml de EDTA. Tras la centrifugación a 500 x g durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante rico en plaquetas, y se mezclaron 6 ml de la fase inferior con 6 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se introdujo una subcapa de 6 ml de Lymphoprep^{TM} (Nycomed Pharma AS). Tras la centrifugación (800 x g, 20 minutos), se transfirió la interfase a un tubo nuevo, se lavó tres veces con HBSS, y se resuspendió en medio AIM V libre de suero. La etapa final de la preparación de las células efectoras fue transferir las PBMC a matraces de cultivo de tejido que se incubaron durante 1 hora a 37ºC y 5% de CO_{2} con el fin de eliminar las células adherentes al plástico. Las células diana eran células K562 y células Raji mantenidas tal como se ha descrito anteriormente, o células PEC-A que habían sido tripsinizadas el día antes del ensayo y posteriormente cultivadas en medio AIM V libre de suero con el fin de prevenir la readhesión a la superficie de plástico. Las células diana se cargaron con Na_{2}^{51}CrO_{4}, 100 \muCi/l x 10^{6} células durante 1 hora a 37ºC, se lavaron 3 veces en HBSS y se resuspendieron en AIM V a una concentración final de 5 x 10^{4}/ml. Se añadieron cinco mil células diana a cada pocillo con células efectoras en 200 \mul de medio AIM V con y sin suero AB humano inactivado por calor al 10% a una proporción de efector (E):diana (T) de entre 50:1 en diluciones dobles y 6,25:1.

Se leyó la liberación espontánea en pocillos con 5.000 células diana incubadas en 200 \mul de medio AIM V sin células efectoras y se leyó la liberación máxima en pocillos en los que se incubaron 5.000 células diana en 100 \mul de AIM V con 100 \mul de Triton X-100 al 5%. Se analizó cada proporción E:T por triplicado. Tras la incubación a 37ºC durante 4 horas, se recolectaron los sobrenadantes utilizando un sistema de recolección de sobrenadantes Skatron (Skatro Instruments, Noruega) y se analizaron en un contador \gamma (LKB Wallac). Se calculó el porcentaje eliminado como la liberación medida menos la liberación espontánea, dividido por la diferencia entre la liberación máxima y la espontánea.

Resultados

Expresión y caracterización de la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b}. Los sobrenadantes de células COS-7 m6 transfectados con el vector plásmido CDM8, con el plásmido PSGL1/mIgG_{2b} o con el plásmido PSGL1/mIgG_{2b} conjuntamente con el plásmido porcino \alpha1,3GT, se recogieron aproximadamente 7 días después de la transfección. Las proteínas de fusión mucina/Ig se purificaron mediante absorción con perlas de agarosa IgG antiratón y se sometieron a SDS-PAGE y a transferencia Western utilizando la isolectina B_{4} de Bandereia simplicifolia (IB_{4} de BSA). Tal como se observa en la Fig. 1, la proteína de fusión migró bajo condiciones reductoras formando una banda ancha con un peso molecular aparente de 145 kDa que se tiñó relativamente mal con plata. La heterogeneidad de tamaño, aproximadamente 125 a 165 kDa, y la mala tinción concuerdan con observaciones anteriores con respecto al comportamiento de las proteínas de tipo mucina altamente glucosiladas (43, 44). La proteína de fusión muy probablemente se produce en forma de homodímero debido a que el SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras reveló una banda doble de un peso molecular aparente de más de 250 kDa. Las cantidades de proteína de fusión purificada por afinidad procedentes de los dos sobrenadantes derivados del mismo número de células COS transfectadas con el plásmido PSGL1/mIgG_{2b} solo o conjuntamente con el plásmido \alpha-1,3-GT, respectivamente, resultaron similares. El sondeo de las membranas electrotransferidas con IB_{4} de BSA reveló una fuerte tinción de la proteína de fusión obtenida tras cotransfectar con \alpha-1,3-GT porcino (Fig. 1). Resulta evidente, sin embargo, que la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} producida en las células COS-7 m6 sin cotransfección del ADNc de \alpha1,3GT también mostró una tinción débil con la lectina IB_{4} de BSA, a pesar del hecho de que las células COS se derivan del mono-simio, un mono del Viejo Mundo que carece de actividad \alpha1,3GT. Ello indica que la lectina IB_{4} de BSA presenta una especificidad ligeramente más amplia que únicamente los epítopos Gal\alpha1,3Gal (45). Sin embargo, la cotransfección del ADNc de \alpha1,3GT porcino permitió la expresión de la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} altamente sustituida con Gal\alpha1,3Gal.

Cuantificación de quimeras PSGL1/mIgG_{2b} en sobrenadantes de células COS transfectadas, y sobre perlas de agarosa con IgG de cabra antiratón tras la absorción. Se utilizó una ELISA sándwich para cuantificar la cantidad de PSGL1/mIgG_{2b} en los sobrenadantes de células COS transfectadas. Típicamente, se transfectaron 5 matraces de cultivo (matraces de 260 ml, Nunclon^{TM}) con células COS al 70% de confluencia y se incubaron tal como se ha descrito en la sección titulada "Materiales y procedimientos". Tras un periodo de incubación de 7 días en 10 ml de medio AIM V por matraz, se recogió el medio. Se determinó la concentración de proteína de fusión en el sobrenadante de dicha transfección, así como en diferentes volúmenes de sobrenadante tras la absorción con 100 \mul de mezcla de gel de perlas de agarosa con IgG antiratón (correspondientes a 50 \mul de perlas empaquetadas), utilizando una ELISA calibrada con fragmentos Fc purificados de IgG de ratón (Fig. 2). La concentración de PSGL1/mIgG_{2b} en los sobrenadantes se encontraba comprendida entre 150 y 200 ng/\mul, y en el presente experimento particular era de aproximadamente 160 ng/\mul (Fig. 2A, la columna de no absorbido). La concentración de PSGL1/mIgG_{2b} remanente en los 2, 4 y 8 ml de sobrenadante tras la absorción con 50 \mul de perlas de agarosa empaquetadas con IgG antiratón era de 32, 89 y 117 ng/\mul, respectivamente. Ello corresponde a la absorción de 260, 290 y 360 ng de PSGL1/mIgG_{2b} sobre 50 \mul de perlas de agarosa empaquetadas con IgG antiratón procedentes de 2, 4 y 8 ml de sobrenadante, respectivamente. El análisis de transferencia Western con la lectina IB_{4} de B. simplicifolia reveló que 50 \mul de perlas empaquetadas podían absorber la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} de 1 ml de sobrenadante hasta niveles por debajo del nivel detectable y de 2 ml hasta niveles prácticamente indetectables (no mostrado).

Capacidad de absorción de PSGL1/mIgG_{2b} inmovilizada Gal\alpha1,3Gal-sustituida. Veinte ml de sobrenadante de células COS transfectadas con el plásmido PSGL1/mIgG_{2b}, solo o conjuntamente con el ADNc de \alpha1,3GT porcino, se mezclaron con 500 \mul de mezcla de gel de perlas de agarosa con IgG antiratón en cada caso. Tras un lavado extensivo, las perlas se separaron en alícuotas de manera que se mezclasen 100 \mul de mezcla de gel (50 \mul de perlas empaquetadas) con 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 y 4,0 ml de suero AB humano agrupado y con agotamiento del complemento, y se agitó a 4ºC durante 4 horas. Tras la absorción con PSGL1/mIgG_{2b} y sobre PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida, se sometió a ensayo el suero para citotoxicidad de células endoteliales porcinas en presencia de complemento de conejo utilizando un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas (Fig. 3). Tal como se muestra en la Fig. 3, 100 \mul de perlas que portan aproximadamente 300 ng de PSGL1/mIgG_{2b} (ver anteriormente) pueden reducir la citotoxicidad de 4 y de 2 ml de suero AB en cada etapa de dilución, y absorber completamente la citotoxicidad presente en 1 ml o menos de suero AB humano. Obsérvese que la misma cantidad de PSGL1/mIgG_{2b} no Gal\alpha1,3Gal-sustituida reduce la citotoxicidad de 0,25 ml de suero AB humano absorbido sólo ligeramente (Fig. 3).

Efecto de PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida sobre la citotoxicidad y la unión de células endoteliales porcinas dependientes del complemento. Con el fin de investigar la eficiencia con la que PSGL1/mIgG_{2b} podía absorber clases individuales de inmunoglobulina humana, se purificaron IgG, IgM e IgA humanas a partir de suero AB humano mediante cromatografía de inmunoafinidad sobre perlas de agarosa con IgG, IgM e IgA antihumanas. Tras su aislamiento, se pasó IgA a través de columnas anti-IgG y anti-IgM con el fin de eliminar las trazas de IgG y de IgM. Este procedimiento también se llevó a cabo para las otras clases de Ig. Se comprobó la pureza de la fracción de Ig mediante SDS-PAGE (Fig. 4). En las concentraciones encontradas en el suero normal, las IgG e IgM humanas, pero no la IgA, eran citotóxicas para las PEC-A en presencia de complemento de conejo (Fig. 5). Se eliminó la citotoxicidad presente en las fracciones de IgG y de IgM mediante absorción con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida. Con el fin de investigar si la falta de citotoxicidad mostrada por la fracción de IgA se debía a la falta de unión de los anticuerpos IgA humanos a PEC-A, se llevó a cabo una ELISA celular con las mismas fracciones de Ig utilizadas en el ensayo de citotoxicidad con el fin de detectar las IgG, IgM e IgA unidas. Se utilizaron fragmentos F(ab)'_{2} específicos de clase conjugados con fosfatasa como anticuerpos secundarios. Aunque la citotoxicidad de IgG y de IgM se eliminó por completo mediante absorción con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida, la unión en ningún caso pudo reducirse en más del 70% (entre el 30% y el 70%) para IgG, y en ningún caso en más del 55% (entre el 10% y el 55%) para IgM (Fig. 5). La IgA humana se unía claramente a las PEC-A, y la unión sólo se redujo ligeramente (no más del 29%) tras la absorción con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida. Por lo tanto, la falta de citotoxicidad de la fracción IgA podría explicarse por una incapa-
cidad de la fracción IgA para unirse a las PEC-A, pero podría deberse a una incapacidad para activar el complemento.

Efecto de PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida sobre la ADCC de las células endoteliales porcinas. Se llevaron a cabo varios ensayos bajo condiciones libres de suero en las que PEC-A presentaba una sensibilidad intermedia frente a la eliminación directa por células PBMC recién aisladas, en comparación con la sensibilidad de las células K562 y de las células Raji; siendo las células K562 sensibles y las Raji no sensibles a la eliminación por las células NK humanas (Fig. 6 A). En presencia de suero AB humano al 10% inactivado por complemento, la tasa de eliminación prácticamente se duplicó, apoyando la existencia de un efecto ADCC in vitro (Fig. 6B), en consistencia con datos publicados con anterioridad (30). Sin embargo, si el suero se absorbe con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida bajo condiciones, que se conoce que eliminan todos los anticuerpos citotóxicos de PEC-A (ver anteriormente), la tasa de eliminación se reduce a niveles ligeramente inferiores a los observados bajo condiciones libres de suero. Por otra parte, la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} misma sin epítopos Gal\alpha1,3Gal no era capaz de absorber lo que causaba la tasa incrementada de destrucción en presencia de suero AB humano (Fig. 6B). Estos datos apoyan la idea de que los anticuerpos anticerdo con especificidad para Gal\alpha1,3Gal pueden proporcionar una citotoxicidad in vitro mediada celularmente dependiente de anticuerpos, y que la proteína de fusión PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida puede eliminar con efectividad estos anticuerpos, de la misma manera que elimina con efectividad los anticuerpos anticerdo citotóxicos fijadores del complemento.

Descripción de los dibujos

Fig. 1. SDS-PAGE al seis por ciento de proteínas aisladas de sobrenadantes de células COS transfectados con vector únicamente (CDM8), o con plásmidos de expresión PSGL1/mIgG_{2b}, o PSGL1/mIgG_{2b} + \alpha1,3GT porcino. Se utilizaron perlas de agarosa con IgG antiratón para la purificación por inmunoafinidad de las proteínas de fusión. Tras un lavado extensivo, las perlas se hirvieron en tampón de muestra bajo condiciones reductoras y no reductoras con el fin de liberar las proteínas absorbidas. Los geles se corrieron en paralelo con tinción de plata o se utilizaron para la transferencia electroforética de las proteínas separadas sobre membranas de nitrocelulosa. Éstas seguidamente se sondearon con isolectina B_{4} de Bandereia simplicifolia conjugada con peroxidasa y se visualizaron mediante quimioluminiscencia para detectar los epítopos Gal\alpha1,3Gal sobre las proteínas purificadas inmunológicamente. Se indica en el margen izquierdo la longitud de migración en el gel de las proteínas de pesos moleculares de 220, 97 y 66 kDa.

Fig. 2. Cuantificación mediante ELISA de Fc de IgG antiratón de la concentración de proteína de fusión PSGL1/mIgG2b en volúmenes crecientes de sobrenadantes de células COS transfectadas y tras la absorción con 50 \mul de perlas de agarosa con IgG antiratón. Se analizaron tripletes de muestras.

Fig. 3. Citotoxicidad mediada por el complemento dependiente de anticuerpos de las células PEC-A por diferentes volúmenes de suero AB humano tras la absorción con 50 \mul de perlas de agarosa con IgG antiratón que portan aproximadamente 300 ng de PSGL1/mIgG2b Gal\alpha1,3Gal-sustituida o no sustituida según se estima en un ensayo de liberación de 51Cr.

Fig. 4. SDS-PAGE al diez por ciento de IgG, IgM e IgA humanas purificadas por inmunoafinidad. Se corrieron cuatro microgramos de cada muestra bajo condiciones reductoras y no reductoras, y las proteínas se visualizaron mediante tinción con plata. Se indica en el margen izquierdo la longitud de migración en el gel de las proteínas de pesos moleculares 220, 97, 66, 46 y 30 kDa.

Fig. 5. Citotoxicidad sobre células PEC-A mediada por el complemento y dependiente de anticuerpos de IgG, IgM e IgA humanas purificadas por inmunoafinidad antes y después de la absorción con PSGL1/mIgG2b Gal\alpha1,3Gal-sustituidal, investigada mediante ensayos de liberación de ^{51}Cr (eje Y derecho; % destrucción). La unión a células PEC-A de IgG, IgM e IgA purificadas por inmunoafinidad antes y después de la absorción con PSGL1/mIgG2b Gal\alpha1,3Gal-sustituida se estimó en una ELISA celular (eje Y izquierdo; D.O. a 405 nm). Se realizaron dos ensayos en paralelo sobre fracciones de Ig absorbidas y no absorbidas. Se seleccionó la concentración de las diferentes clases de Ig para que fuera aproximadamente la mitad del máximo observado normalmente en el suero humano.

Fig. 6. Se investigó el efecto citotóxico directo (condiciones libres de suero) de PBMC humanas sobre células K562, Raji y PEC-A y el efecto intensificador de la destrucción debido a la adición de suero AB humano inactivado por calor, en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas (gráfico A). Se estudió el efecto del suero AB humano inactivado por calor sobre la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos sobre células PEC-A en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas antes y después de la absorción con PSGL1/mIgG2b sustituida y no Gal\alpha1,3Gal-sustituida, respectivamente (gráfico B).

Comentario

Se han seguido tres líneas principales de investigación con el fin de desarrollar estrategias para prevenir el HAR. Los procedimientos: (i) eliminar o neutralizar los anticuerpos anticerdo, (ii) interferir con la activación del complemento, y (iii) eliminar o modificar los determinantes Gal\alpha1,3Gal, se evaluaron en ensayos in vitro, en perfusiones de órganos ex vivo y en trasplantes de cerdo a primate.

Se ha utilizado la perfusión pre-trasplante de órganos de cerdo (46), la plasmaféresis (13, 14, 20), la inmunoabsorción (13, 14, 17) y la absorción con oligosacáridos de síntesis que contienen Gal\alpha1,3Gal unidos a una fase sólida (22), para eliminar los anticuerpos anticerdo. Recientemente, se ha demostrado que los oligosacáridos derivados de mucina gástrica de cerdo eliminan con eficiencia los anticuerpos específicamente anti-Gal\alpha1,3Gal y, de esta manera, la citotoxicidad anticerdo (24). La inyección de sacáridos libres para bloquear los anticuerpos antiratón en la circulación es una vía alternativa utilizada para prevenir el HAR. Se ha utilizado con éxito la terapia intravenosa de carbohidratos en un modelo de aloinjerto cardíaco heterotópico ABO-incompatible en el babuino (47) y en neonatos con enfermedad hemolítica ABO (48). No se observó ningún efecto perjudicial en babuinos receptores tras inyectarles trisacáridos libres de grupo sanguíneo a tasas correspondientes a 500 mg/h tras una inyección de bolo de 4 g del trisacárido (47). Se han utilizado in vitro sacáridos libres que contienen Gal\alpha1,3Gal para neutralizar anticuerpos anticerdo (23), pero los oligosacáridos sintéticos que contienen Gal\alpha1,3Gal en cantidades suficientes para la utilización en modelos de xenotrasplante cerdo a primate no se encuentran disponibles todavía. Sin embargo, se han utilizado concentraciones elevadas de melibiosa (Gal\alpha1,6Glc) o el arabinogalactano, un polisacárido vegetal de origen natural que contiene \alpha-D-galactosa no reductora, para prevenir el efecto tóxico del suero de babuino sobre las células PK15 porcinas in vitro y para prolongar la supervivencia del xenotrasplante cardíaco porcino en babuinos trasplantados (49). En este estudio se observaron efectos tóxicos letales del carbohidrato (49). Los péptidos que imitaban la estructura de Gal\alpha1,3Gal (50, 51) y los anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales murinos dirigidos contra los idiotopos frecuentes en los anticuerpos humanos anticerdo de origen natural (52) son nuevos reactivos que podrían utilizarse para absorber o para bloquear los anticuerpos anticerdo. Además, se han utilizado anticuerpos anti-cadena-\mu en un modelo de xenotrasplante cobaya a rata para agotar los anticuerpos IgM xenorreactivos in vivo (15, 16), una estrategia que merece investigarse más a fondo en la combinación cerdo a primate.

Se ha utilizado el factor del veneno de cobra (20) y el receptor soluble del complemento de tipo 1 (21) para alterar la activación del complemento y prolongar de esta manera la supervivencia de un xenoinjerto en trasplantes de cerdo a primate no humano. Se han obtenido cerdos transgénicos en los que los ADNc que codifican secuencias humanas de las proteínas reguladoras del complemento restringidas a una especie, CD55 y CD59, se expresan en el endotelio porcino (53-55). Se ha demostrado que los órganos de los cerdos transgénicos presentan una menor tendencia a HAR tras la perfusión de los órganos con sangre humana o el trasplante en primates no humanos (56-59).

El enfoque más reciente en la prevención del HAR implica la modulación de la expresión de los epítopos Gal\alpha1,3
Gal sobre el endotelio porcino. Sandrin y McKenzie sugirieron y demostraron que la expresión de una glucosiltransferasa, tal como una \alpha1,2-FT, en competición con la \alpha1,3-glucosiltransferasa endógena por el mismo carbohidrato precursor, evitaba la expresión de epítopos Gal\alpha1,3Gal tras la transfección en células LLC-PK1 porcinas (26). Como resultado, estas células eran menos sensibles a la lisis mediada por anticuerpos y dependiente del complemento (26). Recientemente, dos grupos independientes han informado de la obtención de cerdos transgénicos que expresan este H-\alpha1,2-FT de grupo sanguíneo, pero no se dispone de datos sobre la sensibilidad del endotelio derivado de estos cerdos frente a la citotoxicidad mediada por anticuerpos (27, 28).

Los presentes inventores describen la construcción y producción de un nuevo y eficiente absorbente que puede producirse económicamente en grandes cantidades y que puede unirse con facilidad a una fase sólida, facilitando la inmunoabsorción extracorpórea de sangre humana con el fin de eliminar anticuerpos anticerdo previamente a la xenoinjertación de órganos de cerdo. Con el fin de permitir la producción de una proteína recombinante altamente glucosilada sustituida con grandes cantidades de epítopos Gal\alpha1,3Gal (Fig. 1), los presentes inventores construyeron una proteína quimérica mediante la fusión del ADNc que codifica la parte extracelular de una mucina anclada a membrana, PSGL-1 (40), con la parte Fc del IgG de ratón, y la coexpresaron con la \alpha1,3-GT porcina. Las mucinas son los constituyentes principales del moco, que es el gel que cubre todas las membranas mucosas. Las características físicas de las mucinas se deben a su elevado contenido de carbohidratos unidos por O (habitualmente más del 60% del PM). Se han caracterizado varias proteínas ancladas a membrana que contienen dominios de tipo mucina: CD34, CD43, GlyCAM-1, PSGL-1, MAdCAM, CD96, CD45 y glucoforinas RBC, entre otros (43, 44). Este grupo de proteínas ha recibido mucha atención debido a que muchas de ellas se ha demostrado que portan ligandos carbohidrato de la familia de la selectina de moléculas de adhesión; CD34, MAdCAM y GlyCAM-1 portan el epítopo carbohidrato reconocido por la L-selectina, y PSGL-1 porta los epítopos reconocidos por tanto la selectina E como la selectina P (60). Se seleccionó la parte extracelular de PSGL-1 como pareja de fusión por dos motivos. En primer lugar, presenta uno de los dominios mucina más largos conocidos en esta familia de proteínas y, por lo tanto, es previsible que porte la mayoría de los carbohidratos unidos por O (44, 60). En segundo lugar, PSGL-1 no sólo es un ligando funcional para la selectina E, sino que es el único andamiaje proteico identificado hasta el momento que presenta sialil-Le^{x} a la selectina P (61). Por lo tanto, en caso de que se prepare una proteína de fusión que exprese sialil-Le^{x} con el fin de inhibir la adhesión mediada por selectina P y selectina E, debería contener la parte extracelular de PSGL-1. En la actualidad, los presentes inventores investigan la posibilidad de preparar una proteína de fusión que exprese tanto Gal\alpha1,3Gal como sialil-Le^{x}, mostrando de esta manera las características de un inhibidor doble; neutralizando una parte los anticuerpos anticerdo, y previniendo, la otra parte, la adhesión transitoria dependiente de la selectinas E y P, lo que puede constituir un requisito previo para la extravasación leucocitaria en el rechazo del xenotrasplante.

En una situación de xenotrasplante, en la que se encontrarían fácilmente disponibles órganos de cerdo para el trasplante, el receptor podría prepararse mediante la inmunoabsorción extracorpórea para eliminar los anticuerpos anticerdo, previniendo de esta manera el HAR. Podrían seleccionarse estrategias alternativas (ver anteriormente), pero una eliminación específica de anticuerpos antiratón dejaría al paciente en un estado más favorable con respecto a la inmunidad humoral en comparación con la plasmaféresis y la absorción con proteína A. Por lo tanto, resultarían ideales los medios de inmunoabsorción que contienen los epítopos reconocidos por los anticuerpos anticerdo mismos. La producción de disacáridos y trisacáridos que contienen Gal\alpha1,3Gal es laboriosa y costosa, aunque una combinación de síntesis orgánica y enzimática han simplificado y reducido el coste del procedimiento (34). Además, no es improbable que la especificidad del repertorio humano de anticuerpos anticerdo sea más amplio que sólo el epítopo Gal\alpha3Gal\beta4GlcNAc, es decir, el reconocimiento podría encontrarse modulado por la cadena de sacárido central, por los puntos de ramificación y por monosacáridos vecinos, así como por modificaciones, tales como las sulfataciones. En este contexto, resultaría mejor utilizar una glucoproteína recombinante glucosilada modificada mediante la acción de \alpha1,3GT porcino mismo, resultando en una serie más natural de estructuras que contienen Gal\alpha1,3Gal. Trescientos ng de la proteína de fusión de los presentes inventores fueron capaces de eliminar por completo los anticuerpos citotóxicos de células endoteliales porcinas de 1 ml de suero AB humano (Fig. 3), que, se compara con otros estudios en los que 1 g de oligosacárido unido a una fase sólida se utilizó para absorber 3 ml de suero AB humano (23). Sin embargo, se requieren comparaciones directas para establecer una diferencia de capacidad de absorción. La proteína de fusión es probable que sea eficiente debido a una expresión polivalente de determinantes que contienen Gal\alpha1,3Gal y una posible expresión de un espectro más amplio del repertorio humano anticerdo. Recientemente, algunos estudios con oligosacáridos derivados de mucina gástrica de cerdo indican que la polivalencia resulta importante para la efectividad de absorción (24).

Se purificaron IgG, IgM e IgA humanas a partir de suero AB humano agrupado (Fig. 4) con el fin de investigar su unión con las células endoteliales aórticas porcinas y su citotoxicidad para las mismas, y con el fin de evaluar la eficacia de absorción específica de clases de proteína de fusión (Fig. 5). La citotoxicidad para las PAEC de la IgG humana a 8 mg/ml y de IgM a 1 mg/ml se eliminó por completo con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida. Sin embargo, no se bloqueó por completo la unión, según se estimó mediante una ELISA de las PAEC con alícuotas de las mismas preparaciones de anticuerpo que en el ensayo de citotoxicidad. En la actualidad sigue sin saberse si ello representa la unión de IgG e IgM residuales a epítopos aparte de Gal\alpha1,3Gal en las PAEC, epítopos que no son capaces de inducir un efecto citotóxico mediado por anticuerpos, unión de receptores de Fc, o simplemente una unión no funcional no específica. En los experimentos realizados por los presentes inventores, la IgA purificada no era citotóxica para las PAEC, aunque se unió claramente a estas células (Fig. 5). Ello contrastó con un estudio anterior de Schaapherder et al., quienes demostraron la citotoxicidad de la IgA humana dimérica a través de la vía alternativa de la activación del complemento (62). Sin embargo, utilizaron suero procedente de donantes humanos agammaglobulinémicos como fuente del complemento, mientras que los presentes inventores utilizaron suero de conejo (62). Además, los presentes inventores no obtuvieron evidencia clara de la presencia de IgA dimérico en las preparaciones de IgA (Fig. 4). En cualquier caso, IgA se une claramente a las PAEC y podría estar implicado en el rechazo del xenoinjerto de cerdo a través de otros mecanismos efectores mediados, por ejemplo, por la unión de receptores de Fc en macrófagos y en neutrófilos (63, 64). Ello enfatiza la importancia de utilizar absorbentes que eliminen todas las clases de Ig anticerdo, algo que no consiguen las absorciones con proteína A y con anticuerpo anti-cadena \mu.

Aunque los anticuerpos anticerdo en gran parte se apoyan en la activación del complemento para el efecto citotóxico completo, existen mecanismos efectores que implican anticuerpos que podrían provocar la citotoxicidad de las células endoteliales porcinas. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos es uno de estos mecanismos, en los que los anticuerpos anticerdo con especificidad para Gal\alpha1,3Gal resulta importante para la citotoxicidad incluso en ausencia del complemento (30). Por lo tanto, los presentes inventores examinaron cómo el suero AB humano absorbido y no absorbido contribuía a la citotoxicidad para las PAEC por parte de células PBMC humanas (Fig. 6). Tal como se muestra en la Fig. 6, el suero AB agotado en complemento humano incrementó la citotoxicidad para las PEC-A en prácticamente el 10% en 3 de 4 proporciones de efecto a diana. Esta citotoxicidad incrementada que aporta el suero AB humano resultó completamente eliminada por la absorción con PSGL1/mIgG_{2b} Gal\alpha1,3Gal-sustituida, mientras que la absorción con PSGL1/mIgG_{2b} sin Gal\alpha1,3Gal no tuvo ningún efecto. Ello demuestra claramente que los anticuerpos específicos de Gal\alpha1,3Gal no sólo contribuyen a la ADCC contra células endoteliales porcinas, sino que son responsables de todos los efectos citotóxicos incrementados al añadir suero AB humano a un cultivo mixto de PBMC/PAEC humanas. Si este efecto de ADCC también se encuentra presente in vivo, las estrategias destinadas a inhibir la activación del complemento podrían no resultar suficientes para prevenir el rechazo agudo del xenoinjerto de cerdo.

Los presentes inventores han presentado la construcción y producción de un nuevo y efectivo absorbente Gal\alpha1,3
Gal-sustituido y que contiene dominio mucina, que puede utilizarse en un contexto de inmunoabsorción extracorpórea previa al trasplante con el fin de eliminar los anticuerpos anticerdo implicados en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, mediada por el complemento, así como por células, de las células endoteliales porcinas. Mediante la transfección estable de células para que expresen los ADNc de PSGL1/mIgG_{2b} y de \alpha1,3GT porcino, pueden producirse grandes cantidades de proteína de fusión a bajo coste para la evaluación en modelos de xenotrasplante de cerdo a primate.

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Claims (11)

1. Polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido ligado operablemente a un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido:

(a)

comprende una parte de un ligando 1 de glucoproteína selectina P que media en la unión a selectina, y

(b)

es glucosilado por una \alpha1,3-galactosiltransferasa;

y el segundo polipéptido comprende un polipéptido inmunoglobulina.

2. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que dicho primer polipéptido comprende la parte extracelular de un ligando 1 de glucoproteína selectina P.

3. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que dicho primer polipéptido comprende un ligando 1 de glucoproteína selectina P.

4. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que el primer polipéptido comprende múltiples epítopos Gal\alpha1,3Gal.

5. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que la \alpha1,3-galactosiltransferasa es porcina.

6. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que el segundo polipéptido comprende un polipéptido cadena pesada de inmunoglobulina.

7. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que dicho segundo polipéptido comprende una región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina.

8. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Célula transfectada con un vector según la reivindicación 9.

11. Célula según la reivindicación 10, que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una \alpha1,3-galactosiltransferasa.