ES2248826T3 - Amidas triciclicas utiles para la inhibicion de la funcion de la proteina g y para el tratamiento de enfermedades proliferativas. - Google Patents
Amidas triciclicas utiles para la inhibicion de la funcion de la proteina g y para el tratamiento de enfermedades proliferativas.Info
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Abstract
El uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento anormal de células.
Description
Amidas tricíclicas útiles para la inhibición de
la función de la proteína G y para el tratamiento de enfermedades
proliferativas.
La importancia biológica del oncogén Ras, y la
función, tanto de Ras como de la enzima conocida como farnesil
proteína transferasa, en la conversión de células normales a células
cancerígenas se describen en las publicaciones internacionales PCT
números WO 95/00497 y WO 95/10516. Cada una de dichas publicaciones
también describe una clase característica de compuestos que inhiben
la actividad de la enzima farnesil proteína transferasa y, de este
modo, la farnesilación de la proteína Ras.
La publicación internacional PCT número WO
95/10516 se refiere a compuestos de amida y urea tricíclicos de la
fórmula general (1.0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y a su uso en un procedimiento para
inhibir la función de Ras y el crecimiento anormal de células. Se
describen diversas clases subgenéricas de compuestos de fórmula
(1.0), que incluyen compuestos de las fórmulas (5.0c), (5.1c) y
(5.2a)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
así como el isómero
11-R y los isómeros 11-S de los
compuestos (5.0c) y (5.1c). Se describen en la misma también una
serie de compuestos específicos en cada subgénero, así como la
actividad biológica de estos
compuestos.
Conforme a la presente invención, se proporciona
un compuesto que tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a aspectos preferidos de la invención,
el compuesto anterior puede estar
- en forma de una mezcla racémica
- en forma del enantiómero (+)
Un compuesto particularmente preferido es la
estructura (68.0)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La rotación óptica de los compuestos ((+)- o (-))
se mide en metanol o etanol a 25ºC.
Esta invención incluye los compuestos anteriores
en el estado amorfo o en el estado cristalino.
Los expertos en la técnica apreciarán que el
sistema de anillo tricíclico se numera:
Los expertos en la técnica también apreciarán que
la estereoquímicas S y R en el enlace C-11 son:
La inhibición de la farnesil proteína transferasa
por los compuestos tricíclicos de esta invención no había sido
descrita previamente. Por lo tanto, esta invención proporciona
compuestos para inhibir la farnesil proteína transferasa usando
compuestos tricíclicos de esta invención que: (i) inhiben
potentemente la farnesil proteína transferasa, pero no la
geranilgeranil proteína transferasa I, in vitro; (ii)
bloquean el cambio fenotípico inducido por una forma de Ras
transformante que es un aceptor de farnesilo, pero no por una forma
de Ras transformante diseñada para que sea un aceptor de
geranilgeranilo; (iii) bloquean el procesamiento intracelular de Ras
que es un aceptor de farnesilo, pero no de Ras diseñado para que sea
un aceptor de geranilgeranilo; y (iv) bloquean el crecimiento
anormal de células en cultivo, inducido por Ras transformante. Los
compuestos de esta invención han demostrado tener actividad
antitumoral en modelos animales.
Los compuestos de esta invención se pueden usar
para inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo células
transformadas, mediante la administración de una cantidad eficaz de
un compuesto de esta invención. El crecimiento anormal de células se
refiere a un crecimiento celular independiente de los mecanismos
reguladores normales (por ejemplo, pérdida de la inhibición por
contacto). Esto incluye el crecimiento anormal de: (1) células
tumorales (tumores) que expresan un oncogén Ras activado; (2)
células tumorales en las que la proteína Ras resulta activada como
resultado de una mutación oncogénica en otro gen; y (3) células
benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que
se produce una activación de Ras aberrante.
Los compuestos de esta invención se pueden usar
para inhibir el crecimiento tumoral mediante la administración de
una cantidad eficaz de los compuestos tricíclicos descritos en la
presente memoria a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que
necesita dicho tratamiento. En particular, esta invención
proporciona un procedimiento para inhibir el desarrollo de tumores
que expresan un oncogén Ras activado, mediante la administración de
una cantidad eficaz de los compuestos anteriormente descritos. Los
ejemplos de tumores que pueden ser inhibidos incluyen, pero sin
quedar limitados a los mismos, cáncer de pulmón (por ejemplo,
adenocarcinoma de pulmón), cánceres pancreáticos (por ejemplo,
carcinoma pancreático, tal como, por ejemplo, carcinoma pancreático
exocrino), cánceres de colon (por ejemplo, carcinomas colorrectales
tales como, por ejemplo, adenocarcinoma de colon y adenoma de
colon), leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielógena aguda
(AML); del inglés, acute myelogenous leukemia), cáncer folicular de
tiroides, síndrome mielodisplásico ((MDS); del inglés,
myelodysplastic syndrome), carcinoma de vejiga, carcinoma
epidérmico, cánceres de mama y cánceres de próstata.
Se cree que los compuestos de esta invención
también son útiles para inhibir enfermedades proliferativas, tanto
benignas como malignas, en las que proteínas Ras resultan activadas
de forma aberrante como resultado de una mutación oncogénica en
otros genes, es decir, el propio gen Ras no resulta activado por
mutación hasta una forma oncogénica, llevándose a cabo dicha
inhibición mediante la administración de una cantidad eficaz de los
compuestos tricíclicos descritos en la presente memoria a un
mamífero (por ejemplo, un ser humano) que necesita dicho
tratamiento. Por ejemplo, la neurofibromatosis, un trastorno
proliferativo benigno, o tumores en que Ras resulte activado a causa
de una mutación o sobreexpresión de oncogenes de tirosina quinasa
(por ejemplo, neu, src, abl, lck y fyn) pueden inhibirse mediante
los compuestos tricíclicos descritos en la presente memoria.
Los compuestos de esta invención inhiben la
farnesil proteína transferasa y la farnesilación de la proteína Ras
oncogénica. Los compuestos se pueden usar para inhibir la Ras
farnesil proteína transferasa en mamíferos, especialmente en seres
humanos, mediante la administración de una cantidad eficaz de los
compuestos tricíclicos anteriormente descritos. La administración de
los compuestos de esta invención a pacientes para inhibir la
farnesil proteína transferasa es útil en el tratamiento de los
cánceres anteriormente descritos.
Los compuestos tricíclicos de esta invención
inhiben el crecimiento anormal de células. Sin pretender ningún
respaldo teórico, se cree que estos compuestos pueden actuar a
través de la inhibición de la función de la proteína G, tal como Ras
p21, al bloquear la isoprenilación de la proteína G, lo que les hace
útiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas tales como
el desarrollo tumoral y el cáncer. Sin pretender ningún respaldo
teórico, se cree que estos compuestos inhiben la Ras farnesil
proteína transferasa y, por lo tanto, presentan actividad
antiproliferativa contra células transformadas por Ras.
Tal y como se usan en la presente memoria, los
términos siguientes se usan tal como se definen a continuación a
menos que se indique de otro modo.
M^{+} representa el ion molecular de la
molécula en el espectro de masas.
MH^{+} representa el ion molecular más
hidrógeno de la molécula en el espectro de masas.
Los N-óxidos de piridilo se representan en la
presente memoria por el grupo
Se hace aquí referencia a los disolventes y
reactivos siguientes mediante las abreviaturas indicadas:
tetrahidrofurano (THF), etanol (EtOH), metanol (MeOH), ácido acético
(HOAc o AcOH), acetato de etilo (EtOAc),
N,N-dimetilformamida (DMF), ácido trifluoroacético
(TFA), anhídrido trifluoroacético (TFAA),
1-hidroxibenzotriazol (HOBT), ácido
m-cloroperbenzoico (MCPBA), trietilamina
(Et_{3}N), éter dietílico (Et_{2}O), cloroformiato de etilo
(ClCO_{2}Et), hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(DEC), hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL), isopropanol (iPrOH) y
dimetil sulfóxido (DMSO).
Los compuestos de la presente invención pueden
existir en diferentes formas isómeras (por ejemplo, enantiómeros o
diastereoisómeros), incluyendo atropoisómeros (es decir, compuestos
en los que el anillo de 7 miembros está en una conformación fija, de
modo que el átomo de carbono 11 está dispuesto por encima o por
debajo del plano de los anillos de benceno condensados a causa de la
presencia de un sustituyente bromo en posición 10). La invención
contempla todos los citados isómeros, tanto en forma pura como
mezclados, incluyendo las mezclas racémicas. También se incluyen las
formas enólicas.
Algunos compuestos tricíclicos básicos forman
también sales farmacéuticamente aceptables; por ejemplo, sales de
adición de ácido. Por ejemplo, los átomos de nitrógeno piridínicos
pueden formar sales con ácidos fuertes. Son ejemplos de ácidos
adecuados para la formación de sales los ácidos clorhídrico,
sulfúrico, fosfórico, acético, cítrico, oxálico, malónico,
salicílico, málico, fumárico, succínico, ascórbico, maleico,
metanosulfónico y otros ácidos minerales y carboxílicos bien
conocidos por los expertos en la técnica. Las sales se preparan
poniendo la forma de base libre en contacto con una cantidad
suficiente del ácido deseado para producir una sal de la manera
convencional. Las formas de base libre pueden ser regeneradas
tratando la sal con una solución acuosa diluida adecuada de una
base, tal como una solución acuosa diluida de NaOH, carbonato
potásico, amoniaco y bicarbonato sódico. Las formas de base libre
difieren algo de sus respectivas formas salinas en cuanto a ciertas
propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes
polares, pero, para los fines de la invención, las sales de ácido y
de base son por lo demás equivalentes a sus respectivas formas de
base libre.
Para los fines de la invención, se prevé que
todas las sales citadas son sales farmacéuticamente aceptables
dentro del alcance de la invención y se considera que todas son
equivalentes a las formas libres de los correspondientes
compuestos.
Los siguientes Ejemplos y Ejemplos de Preparación
describen la producción de (1) los compuestos reivindicados conforme
a la presente invención y (2) los compuestos descritos y
reivindicados en la solicitud divisional EP 03023192.2, en trámite
junto con la presente y del mismo solicitante (número de publicación
1380581).
Los compuestos de la presente invención se pueden
preparar por los procedimientos descritos en los Ejemplos 10 y
10B.
Los compuestos producidos conforme al resto de
Ejemplos no son el objeto de la presente solicitud; estos Ejemplos
se incluyen con el fin de ilustrar la producción de compuestos
incluidos en la sección encabezada con "ENSAYOS" y proporcionar
detalles de procedimientos de preparación aplicables a la producción
de compuestos de la invención.
El compuesto del Ejemplo 10 se obtiene en estado
cristalino. Los expertos en la técnica conocerán que los compuestos
obtenidos en estado amorfo se pueden obtener en estado cristalino
mediante cristalización del material amorfo en disolventes o mezclas
de disolventes tales como acetona, éter dietílico, acetato de etilo,
etanol, 2-propanol, éter terc-butílico, agua
y similares, conforme a procedimientos bien conocidos en la
técnica.
Ejemplo de preparación
1
Etapa
A
Se combinan 10 g (60,5 mmol) de
4-piridilacetato de etilo y 120 ml de
CH_{2}Cl_{2} seco a -20ºC, se añaden 10,45 g (60,5 mmol) de
MCPBA y se agita la mezcla a -20ºC durante 1 hora y luego a 25ºC
durante 67 horas. Se añaden 3,48 g adicionales (20,2 mmol) de MCPBA
y se agita la mezcla a 25ºC durante 24 horas. Se diluye con
CH_{2}Cl_{2} y se lava con solución acuosa saturada de
NaHCO_{3} y luego con agua. La mezcla se seca sobre MgSO_{4} y
se concentra a vacío hasta obtener un residuo que se somete a
cromatografía (gel de sílice; (NH_{4}OH al 10% en MeOH) al
2%-5,5%/CH_{2}Cl_{2}] obteniendo 8,12 g del compuesto producto.
Espectrometría de masas (MS; del inglés, mass spectrometry):
MH^{+} = 182,15.
Etapa
B
Se combinan 3,5 g (19,3 mmol) del producto de la
Etapa A, 17,5 ml de EtOH y 96,6 ml de NaOH acuoso al 10%, y se
calienta la mezcla a 67ºC durante 2 horas. Se añade HCl acuoso 2 N
para ajustar el pH a 2,37 y se concentra la mezcla a vacío hasta
obtener un residuo. Se añaden 200 ml de EtOH seco, se filtra la
mezcla a través de Celite® y se lava la torta de filtración con EtOH
seco (2 x 50 ml). Los productos de filtración combinados se
concentran a vacío obteniendo 2,43 g del compuesto del epígrafe.
Ejemplo de preparación
2
El compuesto del epígrafe se prepara mediante el
procedimiento descrito en la Publicación Internacional PCT nº
WO95/1056.
Ejemplo de preparación
3
Etapa
A
Se combinan 14,95 g (39 mmol) de
8-cloro-11-(1-etoxicarbonil-4-piperidinil)-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b]piridina
y 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y luego se añaden 13,07 g (42,9 mmol)
de (nBu)_{4}NNO_{3} y se enfría la mezcla hasta 0ºC. Se
añade lentamente (gota a gota) una solución de 6,09 ml (42,9 mmol)
de TFAA en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} a lo largo de 1,5 horas. La
mezcla se mantiene a 0ºC durante la noche y luego se lava
sucesivamente con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua y
salmuera. La disolución orgánica se seca sobre Na_{2}SO_{4} y se
concentra a vacío obteniendo un residuo que se somete a
cromatografía (gel de sílice, EtOAc/hexano en gradiente) obteniendo
4,32 g y 1,90 g, respectivamente, de los dos compuestos producto,
3A(i) y 3A(ii).
Espectrometría de masas para el Compuesto
3A(i): MH^{+} = 428,2.
Espectrometría de masas para el Compuesto
3A(ii): MH^{+} = 428,3.
Etapa
B
Se combinan 22,0 g (51,4 mmol) del producto
3A(i) procedente de la Etapa A, 150 ml de EtOH acuoso al 85%,
25,85 g (0,463 mol) de Fe en polvo y 2,42 g (21,8 mmol) de
CaCl_{2} y se calienta la mezcla a reflujo durante la noche. Se
añaden 12,4 g (0,222 mol) de Fe en polvo y 1,2 g (10,8 mmol) de
CaCl_{2} y se calienta la mezcla a reflujo durante 2 horas. Se
añaden otros 12,4 g (0,222 mol) de Fe en polvo y 1,2 g (10,8 mmol)
de CaCl_{2} y se calienta la mezcla a reflujo durante 2 horas más.
Se filtra la mezcla caliente a través de Celite®, se lava el Celite®
con 50 ml de EtOH caliente y se concentra el producto de filtración
a vacío obteniendo un residuo. Se añaden 100 ml de EtOH anhidro y se
concentra la mezcla hasta un residuo que se somete a cromatografía
(gel de sílice, MeOH/CH_{2}Cl_{2} en gradiente) dando 16,47 g
del compuesto producto. MH^{+} = 398.
\newpage
Etapa
C
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 16,47 g (41,4 mmol) del producto de
la Etapa B y 150 ml de HBr acuoso al 48% y se enfría la mezcla a
-3ºC. Se añaden lentamente (gota a gota) 18 ml de bromo y luego se
añade lentamente (gota a gota) una solución de 8,55 g (0,124 mol) de
NaNO_{2} en 85 ml de agua. Se agita la mezcla durante 45 minutos a
una temperatura de -3ºC a 0ºC y luego se ajusta el pH a 10 añadiendo
NaOH acuoso al 50%. La mezcla se somete a extracción con EtOAc y los
extractos se lavan con salmuera y se secan sobre Na_{2}SO_{4}.
Se realiza una concentración para obtener un residuo que se somete a
cromatografía (gel de sílice, EtOAc/hexano en gradiente) dando 10,6
g y 3,28 g, respectivamente, de los dos compuestos producto,
3C(i) y 3C(ii).
Espectrometría de masas del Compuesto
3C(i): MH^{+} = 461,2.
Espectrometría de masas del Compuesto
3C(ii): MH^{+} = 539
Etapa
D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se hidroliza el producto 3C(i) de la Etapa
C disolviéndolo en HCl concentrado y calentando la solución a
aproximadamente 100ºC durante 16 horas. La mezcla se enfría y luego
se neutraliza con NaOH acuoso 1 M. La mezcla se somete a extracción
con CH_{2}Cl_{2}, y los extractos se secan sobre MgSO_{4}, se
filtran y concentran a vacío obteniendo el compuesto del
epígrafe.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 466,9.
Ejemplo de preparación
4
Etapa
A
Se combinan 25,86 g (55,9 mmol) de éster etílico
del ácido
4-(8-cloro-3-bromo-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b]piridin-11-iliden)-1-piperidina-1-carboxílico
y 250 ml de H_{2}SO_{4} concentrado, a -5ºC, y luego se añaden
4,8 g (56,4 mmol) de NaNO_{3} y se agita la mezcla durante 2
horas. La mezcla se vierte en 600 g de hielo y se basifica con
solución concentrada de NH_{4}OH (acuosa). La mezcla se filtra, se
lava con 300 ml de agua y se somete luego a extracción con 500 ml de
CH_{2}Cl_{2}. El extracto se lava con 200 ml de agua, se seca
sobre MgSO_{4}, se filtra y luego se concentra a vacío obteniendo
un residuo. Se somete el residuo a cromatografía (gel de sílice,
EtOAc al 10%/CH_{2}Cl_{2}) obteniendo 24,4 g (86% de
rendimiento) del producto. Punto de fusión =
165-167ºC. Espectrometría de masas [ionización
química (CI; del inglés, chemical ionization)]: MH^{+} = 506.
| Análisis elemental: | calculado - C, 52,13; H, 4,17; N, 8,29 |
| encontrado - C, 52,18; H, 4,51; N, 8,16. |
Etapa
b
Se combinan 20 g (40,5 mmol) del producto de la
Etapa A y 200 ml de H_{2}SO_{4} concentrado, a 20ºC, y luego se
enfría la mezcla hasta 0ºC. Se añaden 7,12 g (24,89 mmol) de
1,3-dibromo-5,5-dimetil-hidantoína
a la mezcla y se agita la mezcla durante 3 horas a 20ºC. Se enfría
la mezcla hasta 0ºC, se añaden 1,0 g adicionales (3,5 mmol) de la
dibromohidantoína y se agita la mezcla a 20ºC durante 2 horas. La
mezcla se vierte en 400 g de hielo y se basifica con solución
concentrada de NH_{4}OH (acuosa) a 0ºC, y el sólido resultante se
recoge por filtración. El sólido se lava con 300 ml de agua y se
suspende en 200 ml de acetona, y la suspensión se filtra obteniendo
19,79 g (85,6% de rendimiento) del producto. Punto de fusión =
236-237ºC. Espectrometría de masas: MH^{+} = 584
(CI).
| Análisis elemental: | calculado - C, 45,11; H, 3,44; N, 7,17. |
| encontrado - C, 44,95; H, 3,57; N, 7,16. |
Etapa
C
Se combinan 25 g (447 mmol) de limaduras de Fe,
10 g (90 mmol) de CaCl_{2} y una suspensión de 20 g (34,19 mmol)
del producto de la Etapa B en 700 ml de EtOH/agua (90:10) a 50ºC. La
mezcla se calienta a reflujo durante la noche y se filtra a través
de Celite®, y la torta de filtración se lava con 2 x 200 ml de EtOH
caliente. Se combinan el producto de filtración y los productos de
lavado y se concentran a vacío obteniendo un residuo. El residuo se
somete a extracción con 600 ml de CH_{2}Cl_{2}, y el extracto se
lava con 300 ml de agua, y se seca sobre MgSO_{4}. Se filtra y se
concentra a vacío obteniendo un residuo que se somete luego a
cromatografía (gel de sílice, EtOAc al 30%/CH_{2}Cl_{2})
obteniendo 11,4 g (60% de rendimiento) del producto. Punto de fusión
= 211-212ºC. Espectrometría de masas: MH^{+} = 554
(CI).
| Análisis elemental: | calculado - C, 47,55; H, 3,99; N, 7,56. |
| encontrado - C, 47,45; H, 4,31; N, 7,49. |
Etapa
D
Se añaden lentamente (en porciones) 20 g (35,9
mmol) del producto de la Etapa C a una solución de 8 g (116 mmol) de
NaNO_{2} en 120 ml de HCl concentrado (acuoso) a -10ºC. Se agita
la mezcla resultante a 0ºC durante 2 horas y luego se añaden
lentamente (gota a gota) 150 ml (1,44 mol) de H_{3}PO_{2} al
50%, a 0ºC, a lo largo de un periodo de 1 hora. La mezcla se agita a
0ºC durante 3 horas, se vierte luego en 600 g de hielo y se basifica
con solución concentrada de NH_{4}OH (acuosa). La mezcla se somete
a extracción con 2 x 300 ml de CH_{2}Cl_{2}, y los extractos se
secan sobre MgSO_{4}, se filtran y luego se concentran a vacío
obteniendo un residuo. El residuo se somete a cromatografía (gel de
sílice, EtOAc al 25%/hexanos) obteniendo 13,67 g (70% de
rendimiento) del producto. Punto de fusión =
163-165ºC. Espectrometría de masas: MH^{+} = 539
(CI).
| Análisis elemental: | calculado - C, 48,97; H, 4,05; N, 5,22. |
| encontrado - C, 48,86; H, 3,91; N, 5,18. |
Etapa
E
Se combinan 6,8 g (12,59 mmol) del producto de la
Etapa D y 100 ml de HCl concentrado (acuoso) y se agita la mezcla a
85ºC durante la noche. La mezcla se enfría, se vierte en 300 g de
hielo y se basifica con solución concentrada (acuosa) de NH_{4}OH.
La mezcla se somete a extracción con 2 x 300 ml de CH_{2}Cl_{2},
y los extractos se secan luego sobre MgSO_{4}. Se filtra y se
concentra a vacío obteniendo un residuo que luego se somete a
cromatografía [gel de sílice, MeOH al 10%/EtOAc + NH_{4}OH
(acuoso) al 2%] obteniendo 5,4 g (92% de rendimiento) del compuesto
del epígrafe. Punto de fusión = 172-174ºC.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 467.
| Análisis elemental: | calculado - C, 48,69; H, 3,65; N, 5,97. |
| encontrado - C, 48,83; H, 3,80; N, 5,97. |
Ejemplo de preparación
5
Etapa
A
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Se hidrolizan 2,42 g de éster etílico del ácido
4-(8-cloro-3-bromo-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta-[1,2-b]piridin-11-iliden)-1-piperidina-1-carboxílico
por medio de un procedimiento sustancialmente igual que el descrito
en el Ejemplo de Preparación 3, Etapa D, obteniendo 1,39 g (69% de
rendimiento) del producto. MH^{+} = 389.
Etapa
B
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Se combinan 1 g (2,48 mmol) del producto de la
Etapa A y 25 ml de tolueno seco, se añaden 2,5 ml de DIBAL 1 M en
tolueno y se calienta la mezcla a reflujo. Después de 0,5 horas, se
añaden otros 2,5 ml de DIBAL 1 M en tolueno y se calienta la mezcla
a reflujo durante 1 hora [la reacción se controla mediante
cromatografía en capa fina (TLC; del inglés, thin layer
chromatography) usando MeOH al 50%/CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH
(acuoso)]. Se enfría la mezcla a temperatura ambiente, se añaden 50
ml de HCl (acuoso) 1 N y se agita la mezcla durante 5 minutos. Se
añaden 100 ml de NaOH (acuoso) 1 N y luego se realiza una extracción
con EtOAc (3 x 150 ml). Los extractos se secan sobre MgSO_{4}, se
filtran y se concentran a vacío obteniendo 1,1 g del compuesto del
epígrafe. MH^{+} = 391.
Ejemplo de preparación
6
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[racémico, así como los
enantiómeros (+) y
(-)]
Etapa
A
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Se combinan 16,6 g (0,03 mol) del producto del
Ejemplo de preparación 4, Etapa D, con una solución 3:1 de
CH_{3}CN y agua (212,65 ml de CH_{3}CN y 70,8 ml de agua) y se
agita la suspensión resultante durante la noche a temperatura
ambiente. Se añaden 32,833 g (0,153 mol) de NaIO_{4} y luego 0,31
g (2,30 mmol) de RuO_{2} y se agita la mezcla a temperatura
ambiente (la adición de RuO_{2} va acompañada de una reacción
exotérmica, y la temperatura asciende de 20ºC a 30ºC). La mezcla se
agita durante 1,3 horas (la temperatura descendió a 25ºC después de
aproximadamente 30 minutos) y los sólidos se separan luego por
filtración y se lavan con CH_{2}Cl_{2}. Se concentra a vacío el
producto de filtración obteniendo un residuo y se disuelve el
residuo en CH_{2}Cl_{2}. Los sólidos insolubles se separan por
filtración y se lavan con CH_{2}Cl_{2}. El producto de
filtración se lava con agua, se concentra hasta un volumen de
aproximadamente 200 ml y se lava con lejía y luego con agua. Se
realiza una extracción con HCl (acuoso) 6 N. Se enfría el extracto
acuoso hasta 0ºC y se añade lentamente NaOH acuoso al 50% para
ajustar el pH a 4 mientras se mantiene la temperatura por debajo de
30ºC. La mezcla se somete dos veces a extracción con
CH_{2}Cl_{2}, y los extractos se secan sobre MgSO_{4} y se
concentran a vacío obteniendo un residuo. Se suspende el residuo en
20 ml de EtOH y se enfría la suspensión hasta 0ºC. Los sólidos
resultantes se recogen por filtración y se secan a vacío obteniendo
7,95 g del producto. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,7 (s,
1H), 7,85 (m, 6H), 7,5 (d, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H).
Etapa
B
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Se combinan 21,58 g (53,75 mmol) del producto de
la Etapa A y 500 ml de una mezcla 1:1 anhidra de EtOH y tolueno, se
añaden 1,43 g (38,7 mmol) de NaBH_{4} y se calienta la mezcla a
reflujo durante 10 minutos. Se enfría la mezcla hasta 0ºC, se añaden
100 ml de agua y luego se ajusta a pH aproximadamente
4-5 con HCl 1 M (acuoso) mientras se mantiene la
temperatura por debajo de 10ºC. Se añaden 250 ml de EtOAc y se
separan las fases. La fase orgánica se lava con salmuera (3 x 50 ml)
y luego se seca sobre Na_{2}SO_{4}. Se concentra a vacío hasta
un residuo (24,01 g) y se somete el residuo a cromatografía (gel de
sílice, hexano al 30%/CH_{2}Cl_{2}) dando el producto. Las
fracciones impuras se purifican por una nueva cromatografía. Se
obtuvieron un total de 18,57 g del producto. RMN de ^{1}H
(DMSO-d_{6}, 400 MHz): 8,5 (s, 1H), 7,9 (s, 1H),
7,5 (d de d, 2H), 6,2 (s, 1H), 6,1 (s, 1H), 3,5 (m, 1H), 3,4 (m,
1H), 3,2 (m, 2H).
Etapa
C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 18,57 g (46,02 mmol) del producto de
la Etapa B y 500 ml de CHCl_{3}, luego se añaden 6,70 ml (91,2
mmol) de SOCl_{2} y se agita la mezcla a temperatura ambiente
durante 4 horas. Se añade una solución de 35,6 g (0,413 mol) de
piperazina en 800 ml de THF durante un período de 5 minutos y se
agita la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se
calienta a reflujo durante toda la noche, luego se enfría hasta
temperatura ambiente y se diluye la mezcla con 1 l de
CH_{2}Cl_{2}. Se lava con agua (5 x 200 ml) y se extrae el
lavado acuoso con CHCl_{3} (3 x 100 ml). Se combinan todas las
soluciones orgánicas, se lavan con salmuera (3 x 200 ml) y se secan
sobre MgSO_{4}. Se concentra a vacío hasta un residuo y se somete
a cromatografía (gel de sílice, gradiente del 5%, 7,5%, 10% de
MeOH/CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH) obteniendo 18,49 g del compuesto
del epígrafe como una mezcla racémica.
\newpage
Etapa
D
Se separa el compuesto del epígrafe racémico por
cromatografía quiral preparativa (Chiralpack AD, columna de 5 cm x
50 cm, caudal de 100 ml/min, iPrOH al 20%/hexano + dietilamina al
0,2%), obteniendo 9,14 g del enantiómero (+) y 9,30 g del
enantiómero (-).
Datos físicos para el enantiómero (+): Punto de
fusión = 74,5º-77,5ºC; Espectrometría de masas. MH^{+} =
471,9;
[\alpha]_{D}^{25} = +97,4º (8,48 mg/2 ml, MeOH).
[\alpha]_{D}^{25} = +97,4º (8,48 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero (-): Punto de
fusión = 82,9º-84,5ºC; Espectrometría de masas. MH^{+} =
471,8;
[\alpha]_{D}^{25} = -97,4º (8,32 mg/2 ml, MeOH).
[\alpha]_{D}^{25} = -97,4º (8,32 mg/2 ml, MeOH).
Ejemplo de preparación
7
Etapa
A
Se combinan 15 g (38,5 mmol) de éster etílico del
ácido
4-(8-cloro-3-bromo-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b]piridin-11-iliden)-1-piperidina-1-carboxílico
y 150 ml de H_{2}SO_{4} concentrado a 5ºC, luego se añaden 3,89
g (38,5 mmol) de KNO_{3} y se agita durante 4 horas. Se vierte la
mezcla en 3 l de hielo y se basifica con NaOH al 50% y se agita
durante 4 horas. Se vierte la mezcla en 3 l de hielo y se basifica
con NaOH al 50% (acuosa). Se extrae con CH_{2}Cl_{2}, se seca
sobre MgSO_{4}, luego se filtra y concentra a vacío hasta un
residuo. Se recristaliza el residuo en acetona obteniendo 6,69 g del
producto. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,5 (s, 1H); 7,75
(s,1H); 7,6 (s,1H); 7,35 (s,1H); 4,15 (c, 2H); 3,8 (m, 2H);
3,5-3,1 (m, 4H); 3,0-2,8 (m, 2H);
2,6-2,2 (m, 4H); 1,25 (t, 3H). MH^{+} =
506.
506.
Etapa
B
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Se combinan 6,69 g (13,1 mmol) del producto de la
Etapa A y 100 ml de EtOH al 85%/agua, luego se añaden 0,66 g (5,9
mmol) de CaCl_{2} y 6,56 g (117,9 mmol) de Fe y la mezcla se
calienta a reflujo durante toda la noche. La mezcla de reacción
caliente se filtra a través de Celite® y se aclara la torta de
filtración con EtOH caliente. El filtrado se concentra a vacío dando
7,72 g del producto. Espectrometría de masas: MH^{+} = 476,0.
Etapa
C
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\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 7,70 g del producto de la Etapa B y
35 ml de HOAc, luego se añaden 45 ml de una solución de Br_{2} en
HOAc y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante toda la
noche. Se añaden 300 ml de NaOH 1 N (acuoso), luego 75 ml de NaOH al
50% (acuoso) y se extrae con EtOAc. El extracto se seca sobre
MgSO_{4} y se concentra a vacío hasta un residuo. El residuo se
somete a cromatografía (gel de sílice, EtOAc al 20% - 30% /hexano)
obteniendo 3,47 g del producto (junto con otros 1,28 g de producto
parcialmente purificado). Espectrometría de masas: MH^{+} =
554.
554.
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz): 8,5 (s,1H);
7,5 (s,1H); 7,15 (s,1H); 4,5 (s, 2H); 4,15 (m, 3H); 3,8 (s ancho,
2H); 3,4-3,1 (m, 4H); 9-2,75 (m,1H);
2,7-2,5 (m, 2H); 2,4-2,2 (m, 2H);
1,25 (m, 3H).
\newpage
Etapa
D
Se combinan 0,557 g (5,4 mmol) de
t-butilnitrito y 3 ml de DMF, y la mezcla se
calienta a 60º-70ºC. Se añade lentamente (gota a gota) una mezcla de
2,00 g (3,6 mmol) del producto de la Etapa C y 4 ml de DMF, luego se
enfría la mezcla a temperatura ambiente. Se añaden otros 0,64 ml de
t-butilnitrito a 40ºC y se vuelve a calentar la
mezcla hasta 60º-70º durante 0,5 horas. Se enfría hasta temperatura
ambiente y se vierte la mezcla en 150 ml de agua. Se extrae con
CH_{2}Cl_{2}, el extracto se seca sobre MgSO_{4} y se
concentra a vacío hasta un residuo. El residuo se somete a
cromatografía (gel de sílice, EtOAc al 10%-20% /hexano) obteniendo
0,74 g del producto. Espectrometría de masas: MH^{+} = 539,0.
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,52 (s,
1H); 7,5 (d, 2H); 7,2 (s, 1H); 4,15 (c, 2H); 3,9-3,7
(m, 2H); 3,5-3,1 (m, 4H); 3,0-2,5
(m, 2H); 2,4-2,2 (m, 2H); 2,1-1,9
(m, 2H); 1,26 (t, 3H).
Etapa
E
Se combinan 0,70 g (1,4 mmol) del producto de la
Etapa D y 8 ml de HCl concentrado (acuoso) y la mezcla se calienta a
reflujo durante toda la noche. Se añaden 30 ml de NaOH 1 N (acuoso),
luego 5 ml de NaOH al 50% (acuoso) y se extrae con CH_{2}Cl_{2}.
El extracto se seca sobre MgSO_{4} y se concentra a vacío
obteniendo 0,59 g del compuesto del epígrafe. Espectrometría de
masas: MH^{+} = 467. Punto de fusión = 123,9º-124,2ºC.
Ejemplo de preparación
8
[mezcla racémica así como
enantiómeros (+) y
(-)]
\newpage
Etapa
A
Se prepara una solución de 8,1 g del compuesto
del epígrafe del Ejemplo de preparación 7 en tolueno y se añaden
17,3 ml de una solución 1M de DIBAL en tolueno. La mezcla se
calienta a reflujo y se añaden lentamente (gota a gota) otros 21 ml
de solución de DIBAL 1 M /tolueno durante un período de 40 min. La
mezcla de reacción se enfría hasta aproximadamente 0ºC y se añaden
700 ml de HCl 1 M (acuoso). La fase orgánica se separa y descarta.
La fase acuosa se lava con CH_{2}Cl_{2}, se descarta el extracto
y luego se basifica la fase acuosa añadiendo NaOH al 50% (acuoso).
Se extrae con CH_{2}Cl_{2}, el extracto se seca sobre MgSO_{4}
y se concentra a vacío obteniendo 7,30 g del compuesto del epígrafe,
que es una mezcla racémica de enantiómeros. MH^{+} = 469.
Etapa
B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se separa el compuesto del epígrafe racémico de
la Etapa A por cromatografía quiral preparativa (columna Chiralpack
AD, 5 cm X 50 cm, usando iPrOH al 20% /hexano + dietilamina al
0,2%), obteniendo el enantiómero (+) y el enantiómero (-) del
compuesto del epígrafe.
Datos físicos para el enantiómero (+): punto de
fusión = 148,8ºC;
Espectrometría de masas MH^{+} = 469;
[\alpha]_{D}^{25} = +65,6º (12,93 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero (-): punto de
fusión = 112ºC;
Espectrometría de masas MH^{+} = 469;
[\alpha]_{D}^{25} = -65,2º (3,65 mg/2 ml, MeOH).
Ejemplo de preparación
9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
[mezcla racémica así como el
enantiómero (+) y
(-)]
Etapa
A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 40,0 g (0,124 mol) de la cetona de
partida y 200 ml de H_{2}SO_{4} y se enfría hasta 0ºC. Se añaden
lentamente 13,78 g (0,136 mol) de KNO_{3} durante un período de
1,5 horas, luego se calienta hasta temperatura ambiente y se agita
durante toda la noche. Se trata la reacción usando sustancialmente
el mismo procedimiento que el descrito para el Ejemplo de
preparación 4, Etapa A. Se somete a cromatografía (gel de sílice,
EtOAc al 20%, 30%, 40%, 50% /hexano, luego EtOAc al 100%) obteniendo
28 g del producto 9-nitro, junto con una menor
cantidad del producto 7-nitro y 19 g de una mezcla
de los compuestos 7-nitro y
9-nitro.
MH^{+} (9-nitro) = 367.
Etapa
B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen reaccionar 28 g (76,2 mmol) del producto
9-nitro de la Etapa A, 400 ml de EtOH al 85% /agua,
3,8 g (34,3 mmol) de CaCl_{2} y 38,28 g (0,685 mol) de Fe usando
sustancialmente el mismo procedimiento que se ha descrito para el
Ejemplo de preparación 4, Etapa C, obteniendo 24 g del producto.
MH^{+} = 337.
Etapa
C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 13 g (38,5 mmol) del producto de la
Etapa B, 140 ml de HOAc y se añade lentamente una solución de 2,95
ml (57,8 mmol) de Br_{2} en 10 ml de HOAc durante un período de 20
min. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente, luego se
concentra a vacío hasta un residuo. Se añade CH_{2}Cl_{2} y
agua, luego se ajusta a pH = 8-9 con NaOH al 50%
(acuosa). Se lava la fase orgánica con agua, luego salmuera y se
seca sobre Na_{2}SO_{4}. Se concentra a vacío obteniendo 11,3 g
del producto.
RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): 8,73
(d,1H); 7,74 (d,1H); 7,14 (s, 1H); 4,63 (s, 2H);
3,23-3,15 (m, 2H); y 3,07-2,98 (m,
2H).
Etapa
D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se enfrían 100 ml de HCl concentrado (acuoso)
hasta 0ºC, luego se añaden 5,61 g (81,4 mmol) de NaNO_{2} y se
agita durante 10 min. Se añaden lentamente (en porciones) 11,3 g
(27,1 mmol) del producto de la Etapa C y la mezcla se agita a 0º -
3ºC durante 2,25 horas. Se añaden lentamente (gota a gota) 180 ml de
H_{3}PO_{2} al 50% (acuoso) y la mezcla se deja reposar a 0ºC
durante toda la noche. Se añaden lentamente (gota a gota) 150 ml de
NaOH al 50% durante 30 min., para ajustar a pH = 9, luego se extrae
con CH_{2}Cl_{2}. El extracto se lava con agua, luego con
salmuera y se seca sobre NaSO_{4}. Se concentra a vacío hasta un
residuo y se somete a cromatografía (gel de sílice, EtOAc al 2%
/
CH_{2}Cl_{2}) obteniendo 8,6 g del producto. MH^{+} = 399,9.
CH_{2}Cl_{2}) obteniendo 8,6 g del producto. MH^{+} = 399,9.
RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): 8,75 (d,
1H); 7,77 (d, 1H); 7,56 (d, 1H); 7,21 (d, 1H); y
3,3-3,0 (m, 4H).
Etapa
E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 8,6 g (21,4 mmol) del producto de la
Etapa D y 300 ml de MeOH y se enfría hasta 0º - 2ºC. Se añaden 1,21
g (32,1 mmol) de NaBH_{4} y la mezcla se agita a \sim0ºC durante
1hr. Se añaden otros 0,121 g (3,21 mmol) de NaBH_{4}, se agita
durante 2 horas a 0ºC, luego se deja reposar durante toda la noche a
0ºC. Se concentra a vacío hasta un residuo y luego se reparte el
residuo entre CH_{2}Cl_{2} y agua. La fase orgánica se separa y
se concentra a vacío (50ºC) obteniendo 8,2 g del producto.
RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): 8,44 (d,
1H); 7,63 (d, 1H); 7,47 (d, 1H); 7,17 (d, 1H); 6,56 (d, 1H);
4,17-4,0 (m, 1H); 7,39 (d, 1H);
3,46-3,3 (m, 1H); 3,05-2,74 (m,
2H).
\newpage
Etapa
F
Se combinan 8,2 g (20,3 mmol) del producto de la
Etapa E y 160 ml de CH_{2}Cl_{2}, se enfría hasta 0ºC, luego se
añaden lentamente (gota a gota) 14,8 ml (203 mmol) de SOCl_{2}
durante un período de 30 minutos. La mezcla se calienta hasta
temperatura ambiente y se agita durante 4,5 horas, luego se
concentra a vacío hasta un residuo, se añade CH_{2}Cl_{2} y se
lava con NaOH 1 N (acuoso), luego con salmuera y se seca sobre
Na_{2}SO_{4}. Se concentra a vacío hasta un residuo, luego se
añade THF seco y 8,7 g (101 mmol) de piperazina y se agita a
temperatura ambiente durante toda la noche. Se concentra a vacío
hasta un residuo, se añade CH_{2}Cl_{2}, y se lava con NaOH 0,25
N (acuoso), agua, luego salmuera. Se seca sobre Na_{2}SO_{4} y
se concentra a vacío obteniendo 9,46 g del producto bruto. Se somete
a cromatografía (gel de sílice, MeOH al 5% /CH_{2}Cl_{2} +
NH_{3}) obteniendo 3,59 g del compuesto del epígrafe, como
racemato, RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,43 (d, 1H); 7,55
(d, 1H); 7,45 (d, 1H); 7,11 (d 1H); 5,31 (s, 1H);
4,86-4,65 (m, 1H); 3,57-3,40 (m,
1H); 2,98-2,55 (m, 6H); 2,45-2,20
(m, 5H). MH^{+} = 470.
Etapa
G
Se somete a cromatografía el compuesto del
epígrafe racémico de la Etapa F (5,7 g) como se ha descrito para el
Ejemplo de preparación 6, Etapa D, usando iPrOH al 30% /hexano +
dietilamina al 0,2%, obteniendo 2,88 g del enantiómero R-(+) y 2,77
g del enantiómero S-(-) del compuesto del epígrafe.
Datos físicos para el enantiómero R-(+):
Espectrometría de masas MH^{+} = 470;
[\alpha]_{D}^{25} = +12,10º (10,9 mg/ 2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero S-(-):
Espectrometría de masas MH^{+} = 470;
[\alpha]_{D}^{25} = -13,20º (11,51 mg/ 2 ml, MeOH).
\newpage
Ejemplo de preparación
10
[mezcla racémica, así como
enantiómero (+) y
(-)]
Etapa
A
Se combinan 13 g (33,3 mmol) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 4, Etapa D, y 300 ml de tolueno
a 20ºC, luego se añaden 32,5 ml (32,5 mmol) de una solución 1M de
DIBAL en tolueno. La mezcla se calienta a reflujo durante 1 hora, se
enfría hasta 20ºC, se añaden otros 32,5 ml de solución 1 M de DIBAL
y se calienta a reflujo durante 1 hora. La mezcla se enfría hasta
20ºC y se vierte en una mezcla de 400 g de hielo, 500 ml de EtOAc y
300 ml de NaOH al 10% (acuoso). La fase acuosa se extrae con
CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml), se secan las fases orgánicas sobre
MgSO_{4}, luego se concentra a vacío hasta un residuo. Se somete a
cromatografía (gel de sílice, MeOH al 12% /CH_{2}Cl_{2} +
NH_{4}OH al 4%) obteniendo 10,4 g del compuesto del epígrafe como
racemato. Espectrometría de masas: MH^{+} = 469 (FAB (del inglés
Fast Atom Bombardment)). RMN de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 400
MHz): 8,38 (s, 1H); 7,57 (s, 1H); 7,27 (d, 1H); 7,06 (d, 1H); 3,95
(d,1H).
Etapa
B
Se separa el compuesto del epígrafe racémico de
la Etapa A por cromatografía quiral preparativa (Chiralpack AD,
columna de 5 cm X 50 cm, usando iPrOH al 5% /hexano + dietilamina al
0,2%), dando el enantiómero (+) y el enantiómero (-) del compuesto
del epígrafe.
Datos físicos para el enantiómero (+):
Espectrometría de masas MH^{+} = 469 (FABS);
[\alpha]_{D}^{25} = +43,5º (c=0,402, EtOH); RMN de
^{1}H (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,57 (s,1H); 7,27
(d,1H); 7,05 (d, 1H); 3,95 (d, 1H).
Datos físicos para el enantiómero (-):
Espectrometría de masas MH^{+} = 469 (FAB);
[\alpha]_{D}^{25} = -41,8º (c=0,328 EtOH); RMN de
^{1}H parcial (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,57 (s, 1H);
7,27 (d, 1H); 7,05 (d, 1H); 3,95 (d, 1H).
Ejemplo de preparación
11
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[mezcla racémica además del
enantiómero R-(+) y
S-(-)]
Se trata éster etílico del ácido
4-(8-cloro-3-bromo-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b]piridin-11-iliden)-1-piperidina-1carboxílico
sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe en
el Ejemplo de preparación 6, Etapas A-D, obteniendo
el producto de la Etapa C, el compuesto del epígrafe racémico y como
productos de la Etapa D el enantiómero R-(+) y el enantiómero S-(-)
del compuesto del epígrafe.
Datos físicos para el enantiómero R-(+): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 155,8 (C); 146,4 (CH); 140,5 (CH); 140,2 (C);
136,2 (C); 135,3 (C); 133,4 (C); 132,0 (CH); 129,9 (CH); 125,6 (CH);
119,3 (C); 79,1 (CH); 52,3 (CH_{2}); 52,3 (CH_{2}); 45,6
(CH_{2}); 45,6 (CH_{2}); 30,0 (CH2); 29,8 (CH_{2}).
[\alpha]_{D}^{25} = +25,8º (8,46 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero S-(-): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 155,9 (C); 146,4 (CH); 140,5 (CH); 140,2 (C);
136,2 (C); 135,3 (C); 133,3 (C); 132,0 (CH); 129,9 (CH); 125,5 (CH);
119,2 (C); 79,1 (CH); 52,5 (CH_{2}); 52,5 (CH_{2}); 45,7
(CH_{2}); 45,7 (CH_{2}); 30,0 (CH_{2}); 29,8 (CH_{2}).
[\alpha]_{D}^{25} = -27,9º (8,90 mg/2 ml, MeOH).
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\newpage
Etapa
A
Se disuelven 1,160 g (2,98 mmol) del compuesto
del epígrafe del Ejemplo de preparación 3 en 20 ml de DMF, se agita
a temperatura ambiente y se añaden 0,3914 g (3,87 mmol) de
4-metilmorfolina, 0,7418 g (3,87 mmol) de DEC,
0,5229 g (3,87 mmol) de HOBT y 0,8795 g (3,87 mmol) de ácido
1-N-t-butoxicarbonilpiperidinil-4-acético.
La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 días, luego se
concentra a vacío hasta un residuo y se reparte entre
CH_{2}CL_{2} y agua. La fase orgánica se lava sucesivamente con
NaHCO_{3} saturado (acuoso), NaH_{2}PO_{4} al 10% (acuoso) y
salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4}, se filtra y se
concentra a vacío hasta un residuo. El residuo se somete a
cromatografía (gel de sílice, MeOH al 2% /CH_{2}Cl_{2} +
NH_{3}) obteniendo 1,72 g del producto. Punto de fusión = 94,0º -
94,5ºC, Espectrometría de masas: MH^{+} = 614.
| Análisis elemental: | calculado - C, 60,54; H, 6,06; N, 6,83 |
| encontrado - C, 59,93; H, 6,62; N, 7,45. |
Etapa
B
Se combinan 1,67 g (2,7 mmol) del producto de la
Etapa A y 20 ml de CH_{2}Cl_{2} y se agita a 0ºC. Se añaden 20
ml de TFA, se agita la mezcla durante 2 horas, luego se basifica la
mezcla con NaOH 1N (acuoso). Se extrae con CH_{2}Cl_{2}, se seca
la fase orgánica sobre MgSO_{4}, se filtra y se concentra a vacío
obteniendo 1,16 g del producto. Punto de fusión = 140,2 - 140,8ºC,
Espectrometría de masas: MH^{+} = 514.
Etapa
C
Se combinan 0,50 g del producto de la Etapa B, 20
ml de CH_{2}Cl_{2} y 4,5 equivalentes de
(CH_{3})_{3}SiNCO y se agita a temperatura ambiente
durante 3 horas. La mezcla se extra con NaHCO_{3} saturado
(acuoso) y la fase orgánica se seca sobre MgSO_{4}. Se filtra y se
concentra a vacío obteniendo 0,8 g del producto bruto. El producto
bruto se somete a cromatografía (gel de sílice, MeOH al 5%
/CH_{2}Cl_{2} + NH_{3}) obteniendo 0,26 g del producto. Punto
de fusión = 170,2 - 170,5ºC. Espectrometría de masas: MH^{+} =
557.
Se combinan 0,5 g (1,06 mmol) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 4, 0,4 g (2,61 mmol) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 1, 5 ml de DMF
seco, y 0,5 ml (4,53 mmol) de 4-metilmorfolina, a
0ºC, luego se añaden 0,6 g (3,12 mmol) de DEC y 0,4 g (2,96 mmol) de
HOBT y se agita la mezcla durante toda la noche a 20ºC. Se concentra
a vacío hasta un residuo y se extrae el residuo con CH_{2}Cl_{2}
(2 X 50 ml). Los extractos se lavan con 25 ml de agua, se secan
sobre MgSO_{4}, luego se concentran a vacío hasta un residuo y se
somete a cromatografía (gel de sílice, MeOH al 10% /EtOAc +
NH_{4}OH al 2% (acuoso)) obteniendo 0,6 g (93,7% de rendimiento)
del compuesto del epígrafe. Espectrometría de masas: MH^{+} = 602
(FABS); RMN de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 300 MHz): 8,48 (s, 1H);
8,16 (d, 2H); 7,61 (s, 1H); 7,29 (m, 1H); 7,18 (d, 2H); 7,04 (d,1H);
3,71 (s, 2H).
| Análisis elemental: | calculado - C, 48,81; H, 4,10; N, 6,57 |
| encontrado - C, 49,10; H, 3,79; N, 6,74. |
Se disuelven 5,9 g (9,78 mmol) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo 2 en 300 ml de CH_{2}Cl_{2}/EtOAc 1:5 a
0ºC. Se añaden lentamente (gota a gota) 3 ml de HCl 4 N (acuoso) y
la mezcla se agita a 0ºC durante 5 min. Se añaden 200 ml de
Et_{2}O, se recogen los sólidos resultantes por filtración y se
lavan los sólidos con 50 ml de Et_{2}O. Los sólidos se secan a
20ºC y 26,6 Pa obteniendo 5,9 g (96% de rendimiento) del compuesto
del epígrafe. Espectrometría de masas: MH^{+} = 602 (FAB).
RMN de ^{1}H parcial
(DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 8,66 (d, 2H); 8,51
(s, 1H); 7,95 (s, 1H); 7,67 (d, 2H); 7,47 (m, 1H); 7,15 (m,1H); 3,99
(s, 2H).
| Análisis elemental: | calculado - C, 48,77; H, 3,62; N, 6,56 |
| encontrado - C, 48,34; H, 3,95; N, 6,84. |
Etapa
A
Se combinan 0,501 g (1,28 mmol) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 5 y 20 ml de DMF seco, luego se
añaden 0,405 g (1,664 mmol) de ácido
1-N-t-butoxicarbonilpiperidinil-4-acético,
0,319 g (1,664 mmol) de DEC, 0,225 g (1,664 mmol) de HOBT y 0,168 g
(1,664 mmol) de 4-metilmorfolina y la mezcla se
agita a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se
concentra a vacío hasta un residuo, luego se reparte el residuo
entre 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y 150 ml de NaHCO_{3} saturado
(acuoso). La fase acuosa se extrae con otros 150 ml de
CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y se
concentra a vacío hasta un residuo. El residuo se somete a
cromatografía (gel de sílice, 500 ml de hexano, 1 l de MeOH al 1%
/CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,1% (acuoso), luego 1 l de MeOH
al 2% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,1% (acuoso)) obteniendo
0,575 g del producto. Punto de fusión = 115 - 125ºC; Espectrometría
de masas: MH^{+} = 616.
Etapa
B
Se combinan 0,555 g (0,9 mmol) del producto de la
Etapa A y 15 ml de CH_{2}Cl_{2} y la mezcla se enfría hasta 0ºC.
Se añaden 15 ml de TFA y se agita a 0ºC durante 2 horas. Se
concentra a vacío a 40 - 50ºC hasta un residuo y luego se reparte
entre 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y 100 ml de NaHCO_{3} saturado
(acuoso). La fase acuosa se extrae con 100 ml de CH_{2}Cl_{2},
los extractos se combinan y se secan sobre MgSO_{4}. Se concentra
a vacío obteniendo 0,47 g del producto. Punto de fusión = 140
-150ºC; Espectrometría de masas: MH^{+} = 516.
\newpage
Etapa
C
Se combinan 0,449 g (0,87 mmol) del producto de
la Etapa B, 20 ml de CH_{2}Cl_{2} y 0,501 g (0,59 mmol) de
(CH_{3})_{3}
SiNCO y se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se añaden 50-75 ml de NaHCO_{3} saturado (acuoso) y se agita durante 0,5 horas. Se diluye con CH_{2}Cl_{2}, se separan las fases y la fase acuosa se extrae con 2 X 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se secan los extractos combinados de CH_{2}Cl_{2} sobre MgSO_{4} y se concentran a vacío hasta un residuo. El residuo se somete a cromatografía (gel de sílice, 500 ml de CH_{2}Cl_{2}; 1 l de MeOH al 1% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,1%; 1 l de MeOH al 2% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,2%; luego con MeOH al 3%/CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,3%) obteniendo 0,33 g del compuesto del epígrafe. Punto de fusión = 145º -155ºC; Espectrometría de masas: MH^{+} = 559.
SiNCO y se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se añaden 50-75 ml de NaHCO_{3} saturado (acuoso) y se agita durante 0,5 horas. Se diluye con CH_{2}Cl_{2}, se separan las fases y la fase acuosa se extrae con 2 X 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se secan los extractos combinados de CH_{2}Cl_{2} sobre MgSO_{4} y se concentran a vacío hasta un residuo. El residuo se somete a cromatografía (gel de sílice, 500 ml de CH_{2}Cl_{2}; 1 l de MeOH al 1% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,1%; 1 l de MeOH al 2% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,2%; luego con MeOH al 3%/CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 0,3%) obteniendo 0,33 g del compuesto del epígrafe. Punto de fusión = 145º -155ºC; Espectrometría de masas: MH^{+} = 559.
Se combinan 3,0 g (6,36 mmol) del enantiómero (-)
del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 6, Etapa D, y
70 ml de DMF seco. Se añaden 3,84 ml (34,94 mmol) de
N-metilmorfolina, 3,28 g (17,11 mmol) de DEC, 2,23 g
(16,52 mmol) de HOBT y 2,09 (13,55 mmol) de N-óxido del ácido
4-piridilacético del Ejemplo de preparación 1 y la
mezcla se agita a temperatura ambiente durante toda la noche. Se
concentra a vacío para eliminar el DMF, se añaden 100 ml de
NaHCO_{3} saturado (acuoso) y 10 ml de CH_{2}Cl_{2} y se agita
durante 15 min. La mezcla se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2 X 500
ml), los extractos se secan sobre MgSO_{4} y se concentra a vacío
hasta un residuo. El residuo se somete a cromatografía (500 g de
sílice C18 de fase inversa, gradiente de MeOH al 75%, 80%, luego 85%
/agua + HOAc al 0,1%). Las fracciones deseadas se concentran a vacío
para eliminar el MeOH y se añaden 50 ml de NaOH 1 M (acuoso). Se
agita durante 15 min, luego se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2 X 500
ml). El extracto se seca sobre MgSO_{4} y se concentra a vacío
obteniendo 3,4 g del compuesto del epígrafe. Punto de fusión =148,9
-150,5ºC; [\alpha]_{D}^{25} = -56,37º (9,4 mg/2 ml,
MeOH); Espectrometría de masas MH^{+} = 605.
El compuesto del epígrafe del Ejemplo 5 se puede
aislar también en forma de su sal hidrocloruro tratando una solución
del producto en HCl y CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente,
seguido por concentración a vacío obteniendo la sal HCl.
[\alpha]_{D}^{25} = -31,9º (4,80 mg/2 ml de MeOH + 1 ml
de agua).
Usando el enantiómero (+) del producto del
Ejemplo de preparación 6 y siguiendo esencialmente el mismo
procedimiento que se describe antes para el Ejemplo 5, se prepara el
enantiómero (+) análogo (Ejemplo 5A), es decir, el enantiómero del
compuesto del epígrafe del Ejemplo 5. Punto de fusión = 149,0
-150,5ºC; Espectrometría de masas: MH^{+}= 605;
[\alpha]_{D}^{25} = +67,1º (7,0 mg/2 ml, MeOH).
El compuesto del epígrafe del Ejemplo 5A también
se puede aislar como su sal hidrocloruro como se describe antes para
el Ejemplo 5. Punto de fusión = 152,9ºC (descomposición);
[\alpha]_{D25} = +41,70º (2 ml de MeOH + 1 ml de
agua).
Usando el compuesto del epígrafe racémico del
Ejemplo de preparación 6, Etapa C, y siguiendo esencialmente el
mismo procedimiento que se describe antes para el Ejemplo 5, se
prepara el racemato (Ejemplo SB). Punto de fusión = 84,3º -85,6ºC;
Espectrometría de masas: MH^{+} = 607.
Etapa
A
Se combinan 3,21 g (6,80 mmol) del enantiómero
(-) producto del Ejemplo de preparación 6 y 150 ml de DMF anhidro.
Se añaden 2,15 g (8,8 mmol) de ácido
1-N-t-butoxicarbonilpiperidinil-4-acético,
1,69 g (8,8 mmol) de DEC, 1,19 g (8,8 mmol) de HOBT y 0,97 ml (8,8
mmol) de N-metilmorfolina y la mezcla se agita a
temperatura ambiente durante toda la noche. Se concentra a vacío
para eliminar el DMF y se añaden 50 ml de NaHCO_{3} saturado
(acuoso). Se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2 X 250 ml). Los extractos
se lavan con 50 ml de salmuera y se secan sobre MgSO_{4}. Se
concentran a vacío hasta un residuo y se someten a cromatografía
(gel de sílice, MeOH al 2% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 10%)
obteniendo 4,75 g del producto. Punto de fusión = 75,7º -78,5ºC;
Espectrometría de masas: MH^{+} =25 695;
[\alpha]_{D}^{25} = -5,5º (6,6 mg/2 ml, MeOH).
[\alpha]_{D}^{25} = -5,5º (6,6 mg/2 ml, MeOH).
Etapa
B
Se combinan 4,70 g (6,74 mmol) del producto de la
Etapa A y 30 ml de MeOH, luego se añaden 50 ml de H_{2}SO_{4} al
10%/dioxano en alícuotas de 10 ml durante un período de 1 hora. Se
vierte la mezcla en 50 ml de agua y se añaden 15 ml de NaOH al 50%
(acuoso) para ajustar a pH = 10 - 11. Se filtra para eliminar los
sólidos resultantes y se extrae el filtrado con CH_{2}Cl_{2} (2
X 250 ml). La fase acuosa se concentra a vacío para eliminar el MeOH
y se extrae de nuevo con 250 ml de CH_{2}Cl_{2}. Los extractos
combinados se secan sobre MgSO_{4} y se concentran a vacío
obteniendo el producto. Punto de fusión = 128,1º -131,5ºC;
Espectrometría de masas: MH^{+} = 595;
[\alpha]_{D}^{25} = -6,02º (9,3 mg/2 ml,
MeOH).
MeOH).
Etapa
C
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\vskip1.000000\baselineskip
Se combinan 3,64 g (5,58 mmol) del producto de la
Etapa B y 30 ml de CH_{2}Cl_{2}, luego se añaden 6,29 ml (44,64
mmol) de (CH_{3})_{3}SiNCO y se agita la mezcla durante 2
días a temperatura ambiente. Se añaden 25 ml de NaHCO_{3}
(acuoso), luego se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2 X 250 ml). Los
extractos se lavan con 25 ml de salmuera y se secan sobre
MgSO_{4}. Se concentran a vacío hasta un residuo y se someten a
cromatografía (gel de sílice, gradiente de MeOH al 2,5%, 5,0% y
luego 7,5% /CH_{2}Cl_{2} + NH_{4}OH al 10%) obteniendo el
compuesto del epígrafe. Punto de fusión = 150,5º -153,0ºC;
Espectrometría de masas: MH^{+} = 638;
[\alpha]_{D}^{25} = -61,4º (8,18 mg/2 ml, MeOH).
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El compuesto del epígrafe del Ejemplo de
preparación 7 y el compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación
1 se hacen reaccionar usando sustancialmente el mismo procedimiento
que se describe para el Ejemplo 2, obteniendo 0,25 g del compuesto
del epígrafe, que es una mezcla racémica de atropoisómeros.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 602. Punto de fusión = 167,2º
-167,8ºC.
La sal HCl del compuesto del epígrafe de Ejemplo
7 se prepara agitando durante una hora con HCl/CH_{2}Cl_{2} y
concentrando luego a vacío obteniendo la sal.
\newpage
Ejemplos 7A y
7B
El compuesto del epígrafe del Ejemplo 7 es una
mezcla racémica de atropoisómeros. Estos atropoisómeros se separan
por cromatografía preparativa (HPLC) usando una columna Chiralpack
AD (5 cm x 50 cm) e i-PrOH al 40%/ hexano +
dietilamina al 0,2% como fase móvil obteniendo los enantiómeros (+)-
y (-), Ejemplos 7B y 7A, respectivamente.
Datos físicos para el enantiómero (-), Ejemplo
7A: punto de fusión = 114,2º -114,8ºC,
[\alpha]_{D}^{25} = -154,6º (8,73 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero (+), Ejemplo
7B: punto de fusión = 112,6º -113,5ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = +159,7º (10,33 mg/2 ml, MeOH).
Etapa
A
Se hacen reaccionar 6,0 g (12,8 mmol) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 7 con 3,78 g (16,6
mmol) de ácido
1-N-t-butoxicarbonilpiperidinil-4-acético
usando sustancialmente los mismos procedimientos que se describen
para el Ejemplo 6, Etapa A, obteniendo 8,52 g del producto.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 692 (FAB), RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}, 200 MHz): 8,5 (d, 1H); 7,5 (d, 2H); 7,2 (d, 1H);
4,15-3,9 (m, 3H); 3,8-3,6 (m, 1H);
3,5-3,15 (m, 3H); 2,9 (d, 2H);
2,8-2,5 (m, 4H); 2,4-1,8 (m, 6H);
1,8-1,6 (d ancho, 2H); 1,4 (s, 9H);
1,25-1,0 (m, 2H).
Etapa
B
Se combinan 8,50 g del producto de la Etapa A y
60 ml de CH_{2}Cl_{2}, luego se enfría hasta 0ºC y se añaden 55
ml de TFA. La mezcla se agita durante 3 horas a 0ºC y luego se
añaden 500 ml de NaOH 1 N (acuoso) seguido por 30 ml de NaOH al 50%
(acuoso). Se extrae con CH_{2}Cl_{2}, se seca sobre MgSO_{4} y
se concentra a vacío obteniendo 7,86 g del producto. Espectrometría
de masas: MH^{+} = 592 (FAB). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200
MHz): 8,51 (d, 1H); 7,52 (d de d, 2H); 7,20 (d, 1H);
4,1-3,95 (m, 2H); 3,83,65 (m, 2H);
3,5-3,05 (m, 5H); 3,0-2,5 (m, 6H);
2,45-1,6 (m, 6H); 1,4-1,1 (m,
2H).
Etapa
C
Se tratan 7,80 g (13,1 mmol) del producto de la
Etapa B con 12,1 g (105 mmol) de (CH_{3})_{3}SiNCO usando
sustancialmente el mismo procedimiento que se describe para el
Ejemplo 6, Etapa C, obteniendo 5,50 g del compuesto del epígrafe,
que es una mezcla racémica de atropoisómeros. Punto de fusión =
163,6º -164,0ºC. Espectrometría de masas: MH^{+} = 635 (FAB). RMN
de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,5 (d, 1H); 7,52 (d, 1H); 7,48
(d, 1H); 7,21 (d, 1H); 4,54, (s, 2H); 4,1-3,6 (m,
4H); 3,45-3,15 (m, 4H); 3,02,5 (m, 5H);
2,45-1,6 (m, 7H); 1,4-1,0, (m,
2H).
Ejemplos 8A y
8B
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto del epígrafe del Ejemplo 8 es una
mezcla racémica de atropoisómeros. Estos atropoisómeros se separan
por cromatografía preparativa (HPLC), usando una columna Chiralpack
AD (5 cm x 50 cm) e iPrOH al 20% / hexano + dietilamina al 0,2% como
la fase móvil, a un caudal de 100 ml/min, obteniendo los
enantiómeros (+)- y (-), Ejemplos 8B y 8A, respectivamente.
Datos físicos para el enantiómero (-), Ejemplo
8A: punto de fusión = 142,9º -143,5ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = -151,7º (11,06 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero (+), Ejemplo
8B: punto de fusión = 126,5º -127,0ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = +145,6º (8,38 mg/2 ml, MeOH).
Se combinan 3,32 g del enantiómero (+) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 8, Etapa B, 2,38 g
del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 1, 1,92 g de
HOBT, 2,70 g de DEC, 1,56 ml de N-metilmorfolina y
50 ml de DMF seco y se agita a 25ºC durante 24 horas. Se concentra a
vacío, luego se diluye el residuo con CH_{2}Cl_{2}. Se lava con
NaOH 1 N (acuoso), luego con NaH_{2}PO_{4} saturado (acuoso) y
se seca sobre MgSO_{4}. Se concentra a vacío hasta un residuo y se
somete a cromatografía (gel de sílice, MeOH al 2%/CH_{2}Cl_{2} +
NH_{4}OH) obteniendo 3,82 g del compuesto del epígrafe.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 604 (FAB).
La sal hidrocloruro se prepara por disolución del
compuesto del epígrafe del Ejemplo 9 en diclorometano saturado con
cloruro de hidrógeno. La concentración a vacío proporcionó el
compuesto del epígrafe del Ejemplo 9 como la sal HCl. Punto de
fusión = 166,5ºC; [\alpha]_{D}^{22} = +70,8º (9,9 mg/2
ml, MeOH).
Ejemplos 9A y
9B
Se hace reaccionar el enantiómero (-) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 8, Etapa B, (3,38
g) con 2,20 g del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación
1, sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe
para el Ejemplo 9 obteniendo 3,58 g del compuesto del epígrafe del
Ejemplo 9A.
La sal HCl del compuesto del epígrafe del Ejemplo
9A se prepara disolviendo el compuesto del epígrafe en
CH_{2}Cl_{2}, añadiendo HCl 6M (g) en CH_{2}Cl_{2} y luego
concentrando a vacío obteniendo la sal. Punto de fusión =129ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = -72,3º (3,32 mg/2 ml, MeOH).
Se hace reaccionar el compuesto del epígrafe
racémico del Ejemplo de preparación 8, Etapa A con el compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 1, sustancialmente mediante el
mismo procedimiento que se describe para el Ejemplo 9 obteniendo el
compuesto del epígrafe del Ejemplo 9B. Punto de fusión =145,0ºC.
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Etapa
A
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Se hacen reaccionar 1,33 g del enantiómero (+)
del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 8, Etapa B,
con 1,37 g de ácido
1-N-t-butoxicarbonilpiperidinil-4-acético
usando sustancialmente los mismos procedimientos que se describen
para el Ejemplo 6, Etapa A, obteniendo 2,78 g del producto.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 694,0 (FAB);
[\alpha]_{D}^{25} = +34,1º (5,45 mg/2 ml, MeOH).
Etapa
B
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Se tratan 2,78 g del producto de la Etapa A
sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe para
el Ejemplo 8, Etapa B, obteniendo 1,72 g del producto. Punto de
fusión = 104,1ºC; Espectrometría de masas: MH^{+} = 594;
[\alpha]_{D}^{25} = +53,4º (11,42 mg/2 ml, MeOH).
Etapa
C
Se tratan 1,58 g del producto de la Etapa B con 6
ml de (CH_{3})_{3}SiNCO usando sustancialmente el mismo
procedimiento que se describe para el Ejemplo 6, Etapa C, obteniendo
1,40 g del compuesto del epígrafe. Punto de fusión = 140ºC;
Espectrometría de masas: MH^{+} = 637;
[\alpha]_{D}^{25} = +49,1º (4,24 mg/2 ml, MeOH).
La recristalización en acetona proporcionó el
compuesto del epígrafe como un sólido. Punto de fusión
=214,5-215,9ºC.
Ejemplos 10A y
10B
Se convierte el enantiómero (-) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 8, Etapa B, (3,38 g) en el
compuesto del epígrafe (Ejemplo 10A) sustancialmente mediante el
mismo procedimiento que se describe para el Ejemplo 10, Etapas
A-C, obteniendo el compuesto del epígrafe del
Ejemplo 10A. Punto de fusión = 152ºC; Espectrometría de masas:
MH^{+} = 637; [\alpha]_{D}^{25} = -62,5º (1,12 mg/2
ml, MeOH).
Se convierte el compuesto del epígrafe racémico
del Ejemplo de preparación 8, Etapa A, en el compuesto del epígrafe
(Ejemplo 10B) sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se
describe para el Ejemplo 10, Etapas A-C obteniendo
el compuesto del epígrafe Ejemplo 10B. Punto de fusión = 111,2ºC
(descomposición).
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El compuesto del epígrafe se prepara usando el
compuesto del epígrafe racémico del Ejemplo de preparación 9, Etapa
F, siguiendo sustancialmente el mismo procedimiento que se describe
para el Ejemplo 2.
RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,44 (d,
1H); 8,14 (d, 2H): 7,58 (d, 1H); 7,47 (d,1H); 7,14 (m, 3H); 5,32 (s,
1H); 4,65-4,57 (m, 1H); 3,68 (s, 2H);
3,65-3,39 (m, 4H); 2,91-2,87 (m,
1H); 2,69-2,63 (m, 1H); 2,45-2,33
(m, 4H). MH^{+} = 605.
Ejemplos 11A y
11B
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Usando el enantiómero R-(+)- o S-(-) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 9, Etapa G, se
prepara el enantiómero R- (+) (Ejemplo 11A) o el enantiómero S-(-)
(Ejemplo 11B) usando sustancialmente el mismo procedimiento que se
describe para el Ejemplo 2.
Datos físicos para el enantiómero R-(+), Ejemplo
11 A: Punto de fusión = 167,0º - 167,8ºC
[\alpha]_{D}^{25} = +32,6º (c = 1, MeOH); RMN de
^{1}H (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,44 (d, 1H); 8,14 (d, 2H): 7,58 (d,
1H); 7,47 (d, 1H); 7,14 (m, 3H); 5,32 (s, 1H);
4,65-4,57 (m, 1H); 3,68 (s, 2H);
3,65-3,39 (m, 4H); 2,91-2,87 (m,
1H); 2,69-2,63 (m, 1H); 2,45-2,33
(m, 4H). MH^{+} = 605.
Datos físicos para el enantiómero S-(-), Ejemplo
11B: [\alpha]_{D}^{25} = -38,2º (14,67 mg/2 ml,
MeOH); RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,44 (d, 1H); 8,14 (d,
2H): 7,58 (d, 1H); 7,47 (d, 1H); 7,14 (m, 3H); 5,32 (s, 1H);
4,64-4,57 (m, 1H); 3,67 (s, 2H);
3,70-3,34 (m, 4H); 2,95-2,87 (m,
1H); 2,69-2,63 (m, 1H); 2,45-2,31
(m, 4H). MH^{+} = 605.
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El compuesto del epígrafe de este Ejemplo se
prepara usando el compuesto del epígrafe racémico del Ejemplo de
preparación 9, Etapa F, siguiendo sustancialmente los mismos
procedimientos que se describen para el Ejemplo 8, Etapas
A-C. Este compuesto es un racemato.
\newpage
Ejemplos 12A y
12B
El compuesto del epígrafe del Ejemplo 12 es una
mezcla racémica. Se someten a cromatografía 2,45 g del compuesto del
Ejemplo 12 usando una columna Chiralpack AD e i-PrOH
al 20% / hexano + dietilamina al 0,2% como la fase móvil, a un
caudal de 100 ml/min, obteniendo 0,970 g del enantiómero (+) y 0,982
g del enantiómero (-), Ejemplos 12B y 12A, respectivamente.
Datos físicos para el enantiómero (-), Ejemplo
12A: RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,43 (d, 1H); 7,58 (d,
1H); 7,48 (d, 1H); 7,14 (d, 1H); 5,32 (s, 1H);
4,5-4,75 (m, 1H); 4,4 (s, 2H); 3,9 (d, 2H);
3,2-3,7 (m, 5H); 2,52-3,05 (m, 4H);
1,85-2,5 (m, 6H), 1,5-1,85 (m, 4H),
1,0-1,4 (m, 1H). [\alpha]_{D}^{25} =
-31,2º (c, = 0,453, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero (+), Ejemplo
12B: RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 200 MHz): 8,43 (d, 1H); 7,58 (d,
1H); 7,48 (d, 1H); 7,14 (d, 1H); 5,32 (s, 1H);
4,5-4,75 (m, 1H); 4,4 (s, 2H); 3,9 (d, 2H);
3,2-3,7 (m, 5H); 2,52-3,05 (m, 4H);
1,85-2,5 (m, 6H), 1,5-1,85 (m, 4H),
1,0-1,4 (m, 1H). [\alpha]_{D}^{25} =
+29,8º (c = 0,414, MeOH).
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Etapa
A
Se hacen reaccionar 1,35 g del enantiómero (-)
del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 10, Etapa B,
con 1,4 g de ácido
1-N-t-butoxi-carbonilpiperidinil-4-acético
siguiendo sustancialmente los mismos procedimientos que se describen
para el Ejemplo 6, Etapa A, obteniendo 2,0 g del producto.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 694 (FAB). RMN de ^{1}H
parcial (CDCl_{3}, 300 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,25 (d,
1H); 7,05 (m,1H); 1,45
(s, 9H).
(s, 9H).
Etapa
B
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Se tratan 1,95 g del producto de la Etapa A
sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe para
el Ejemplo 8, Etapa B, obteniendo 1,63 g del producto.
Espectrometría de masas MH^{+} = 594 (FAB). RMN de ^{1}H parcial
(CDCl_{3}, 300 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,25 (d, 1H);
7,03 (m, 1H); 4,64 (d, 1H); 3,90 (m, 2H).
Etapa
C
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Se tratan 1,6 g del producto de la Etapa B con
1,3 ml de (CH_{3})_{3}SiNCO usando sustancialmente el
mismo procedimiento que se describe para el Ejemplo 6, Etapa C,
obteniendo 1,27 g del compuesto del epígrafe. Espectrometría de
masas: MH^{+} = 637 (FABS); [\alpha]_{D}^{25} =
-33,1º (c=0,58, EtOH). RMN de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 400 MHz):
8,38 (s, 1H); 7,59 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,04 (m,1H); 4,60 (d, 1H);
4,41 (s, 2H).
\newpage
Ejemplos 13A y
13B
Se convierte el enantiómero (+) del compuesto del
epígrafe del Ejemplo de preparación 10, Etapa B, (2,1 g) en el
compuesto del epígrafe sustancialmente mediante el mismo
procedimiento que se describe para el Ejemplo 10, Etapas
A-C, obteniendo el compuesto del epígrafe, Ejemplo
13A. Espectrometría de masas: MH^{+} = 637 (FABS);
[\alpha]_{D}^{25} = +32,4º (c=0,57, EtOH).
RMN de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 400 MHz):
8,39 (s, 1H); 7,59 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,04 (m, 1H); 4,60 (d,
1H); 4,41 (s, 2H). RMN de ^{1}H parcial
(DMSO-d_{6}, 400 MHz): 8,42 (s, 1H); 7,88 (s, 1H);
7,41 (d, 1H); 7,29 (m, 1H); 5,85 (s, 2H); 4,20 (d, 1H).
Se convierte el compuesto del epígrafe racémico
del Ejemplo de preparación 10, Etapa A, en el compuesto del epígrafe
racémico, Ejemplo 13B, de una forma análoga. RMN de ^{1}H parcial
(CDCl_{3}, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,59 (s, 1H); 7,25 (d, 1H);
7,04 (m, 1H); 4,60 (d, 1H); 4,41 (s, 2H). RMN de ^{1}H parcial
(DMSO-d_{6}, 400 MHz): 8,42 (s, 1H); 7,88 (s, 1H);
7,41 (d, 1H); 7,29 (d, 1H); 5,85 (s, 2H); 4,20 (d, 1H).
Se hacen reaccionar 2,6 g del enantiómero (+) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 10, Etapa B y 1,68
g del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 1 siguiendo
sustancialmente el mismo procedimiento que se describe para el
Ejemplo 9 obteniendo 2,10 g del compuesto del epígrafe.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 604 (FAB);
[\alpha]_{D}^{25} = +34,1º (10,98 mg/2 ml, EtOH). RMN
de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 8,15 (d,
2H); 7,58 (s, 1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d, 2H); 7,03 (d, 1H); 4,57
(d, 1H).
Para preparar la sal HCl del compuesto del
epígrafe del Ejemplo 14 se disuelven 700 mg del compuesto del
epígrafe en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}, se añaden 4 ml de Et_{2}O,
se enfría hasta 0ºC y se añade lentamente (gota a gota) 1 ml de HCI
(g) en dioxano. Se añaden 2 ml de Et_{2}O y se agita a 0ºC durante
7 minutos. Se diluye con 30 ml de Et_{2}O, se filtra para recoger
el producto sólido y se lava con 30 ml de Et_{2}O. Se secan los
sólidos a vacío obteniendo 0,836 g de la sal HCl del Ejemplo 14.
[\alpha]_{D}^{25} = +64,8º (9,94 mg/2 ml, EtOH).
Ejemplo 14A y
14B
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Se hace reaccionar el enantiómero (-) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 10, Etapa B, (0,60
g) con 0,39 g del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación
1, sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe
para el Ejemplo 9 obteniendo 0,705 g del compuesto del epígrafe.
Espectrometría de masas: MH^{+} = 604 (FABS);
[\alpha]_{D}^{25} = -41,0º (EtOH).
RMN de ^{1}H parcial (CDCl_{3}, 300 MHz):
8,38 (s, 1H); 8,15 (d, 2H); 7,58 (s, 1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d,
2H); 7,03 (d, 1H); 4,57 (d, 1H).
La sal HCl del compuesto del epígrafe de Ejemplo
14A se prepara sustancialmente por el mismo procedimiento que se
describe para el Ejemplo 14. [\alpha]_{D}^{25} = -63,2º
(EtOH).
Se convierte el compuesto del epígrafe racémico
del Ejemplo de preparación 10, Etapa A, en el compuesto del epígrafe
racémico del Ejemplo 14B siguiendo sustancialmente el mismo
procedimiento que se describe para el Ejemplo 9. RMN de ^{1}H
parcial (CDCl_{3}, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 8,15 (d, 2H); 7,58 (s,
1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d, 2H); 7,03 (d, 1H); 4,57 (d, 1H). RMN de
^{1}H parcial (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 8,77 (d,
2H); 8,47 (s, 1H); 7,95 (s, 1H); 7,74 (d, 2H); 7,43 (m, 1H); 7,27
(d, 1H); 4,35 (d, 1H).
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Se hace reaccionar el compuesto del epígrafe del
Ejemplo de preparación 4 sustancialmente mediante el mismo
procedimiento que se describe para el Ejemplo 8, Etapas
A-C, obteniendo el compuesto del epígrafe, que es un
racemato. Espectrometría de masas: MH^{+} = 635 (FAB). RMN de
^{1}H parcial (CDCl_{3}): 8,45 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,35 (d,
1H); 7,05 (d, 1H); 4,45 (s, 1H).
\newpage
Ejemplo 16A y
16B
El enantiómero R-(+) o el enantiómero S-(-) del
compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 11 se trata
sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe para
el Ejemplo 2 obteniendo el enantiómero R-(+) del compuesto del
epígrafe o el enantiómero S-(-) del compuesto del epígrafe, Ejemplos
16A y 16B, respectivamente.
Datos físicos para el enantiómero R-(+): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 166,5 (C); 154,8 (C); 146,6 (CH); 140,8 (CH);
140,4 (C); 138,5 (CH); 138,5 (CH); 136,3 (C); 134,6 (C); 133,8 (C);
133,6 (C); 132,0 (CH); 130,0 (CH); 126,3 (CH); 126,3 (CH); 125,8
(CH); 119,6 (C); 78,4 (CH); 51,1 (CH_{2}); 50,6 (CH_{2}); 45,4
(CH_{2}); 41,5 (CH_{2}); 38,0 (CH_{2}); 30,1 (CH_{2}); 30,0
(CH_{2}). [\alpha]_{D}^{25} = +30,7º (10,35 mg/2 ml,
MeOH).
Datos físicos para el enantiómero S-(-): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 166,5 (C); 154,8 (C); 146,6 (CH); 140,8 (CH);
140,4 (C); 138,5 (CH); 138,5 (CH); 136,3 (C); 134,6 (C); 133,8 (C);
133,6 (C); 132,0 (CH); 130,0 (CH); 126,3 (CH); 126,3 (CH); 125,8
(CH); 119,6 (C); 78,4 (CH); 51,1 (CH_{2}); 50,6 (CH_{2}); 45,4
(CH_{2}); 41,5 (CH_{2}); 38,0 (CH_{2}); 30,1 (CH_{2}); 29,9
(CH_{2}). [\alpha]_{D}^{25} = -30,9º (9,70 mg/2 ml,
MeOH).
Ejemplos 17 y
17A
Se trata el enantiómero (+) o el enantiómero (-)
del compuesto del epígrafe del Ejemplo de preparación 11
sustancialmente mediante el mismo procedimiento que se describe para
el Ejemplo 1, Etapas A-C, obteniendo el enantiómero
R-(+) del compuesto del epígrafe o el enantiómero S-(-) del
compuesto del epígrafe, Ejemplos 17 y 17A, respectivamente.
Datos físicos para el enantiómero R-(+): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 169,3 (C); 157,5 (C); 155,0 (C); 146,6 (CH);
140,8 (CH); 140,4 (C); 136,3 (C); 134,8 (C); 133,7 (C); 132,0 (CH);
130,0 (CH); 125,8 (CH); 119,6 (C); 78,5 (CH); 51,4 (CH_{2}): 50,9
(CH_{2}); 45,2 (CH_{2}); 43,9 (CH_{2}); 43,9 (CH_{2}); 41,1
(CH_{2}); 38,8 (CH_{2}); 32,5 (CH); 31,5 (CH_{2}); 31,5
(CH_{2}); 30,1 (CH_{2}); 30,0 (CH_{2}).
[\alpha]_{D}^{24,8}= +28,7 (10,1 mg/2 ml, MeOH).
Datos físicos para el enantiómero S-(-): RMN de
^{13}C (CDCl_{3}): 169,3 (C); 157,6 (C); 155,0 (C); 146,6 (CH);
140,8 (CH); 140,4 (C); 136,3 (C); 134,8 (C); 133,7 (C); 132,0 (CH);
130,0 (CH); 125,8 (CH); 119,6 (C); 78,5 (CH); 51,4 (CH_{2}); 50,9
(CH_{2}); 45,2 (CH_{2}); 43,9 (CH_{2}); 43,9 (CH_{2}); 41,1
(CH_{2}); 38,8 (CH_{2}); 32,5 (CH); 31,5 (CH_{2}); 31,5
(CH_{2}); 30,1 (CH_{2}); 30,0 (CH_{2}).
[\alpha]_{D}^{24,8} = -28,5 (10,1 mg/2 ml, MeOH).
Etapa
A
Se disuelven 9,90 g (18,9 mmol) del producto del
Ejemplo de preparación 7, Etapa B, en 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y
200 ml de CH_{3}CN y se calienta hasta 60ºC. Se añaden 2,77 g
(20,8 mmol) de N-clorosuccinimida y se calienta
hasta reflujo durante 3 horas, controlando la reacción por TCL
(EtOAc al 30% /H_{2}O). Se añaden otros 2,35 g (10,4 mmol) de
N-clorosuccinimida y reflujo durante otros 45
minutos. La mezcla de reacción se enfría hasta temperatura ambiente
y se extrae con NaOH 1N y CH_{2}Cl_{2}. Se seca la capa de
CH_{2}Cl_{2} sobre MgSO_{4}, se filtra y se purifica por
cromatografía ultrarrápida (1200 ml de gel de sílice en la fase
normal, eluyendo con EtOAc al 30% /H_{2}O) obteniendo 6,24 g del
producto deseado. Punto de fusión 193-195,4ºC.
MH^{+} = 510.
Etapa
B
Se añaden 2,07 g (30,1 mmol) de NaNO_{2} a 160
ml de HCl concentrado a -10ºC y se agita durante 10 min. Se añaden
5,18 g (10,1 mmol) del producto de la Etapa A y la mezcla de
reacción se calienta desde -10ºC hasta 0ºC durante 2 horas. La
reacción se enfría hasta -10ºC, se añaden 100 ml de H_{3}PO_{2}
y se deja reposar durante toda la noche. Para extraer la mezcla de
reacción, se vierte sobre hielo picado y se basifica con NaOH al 50%
/CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4}, se
filtra y se concentra hasta sequedad. Se purifica por cromatografía
ultrarrápida (600 ml de gel de sílice como fase normal, eluyendo con
EtOAc al 20% /hexano) obteniendo 3,98 g de producto. Espectrometría
de masas: MH^{+} = 495.
Etapa
C
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Se disuelven 3,9 g del producto de la Etapa B en
100 ml de HCl concentrado y se mantiene a reflujo durante toda la
noche. La mezcla se enfría, se basifica con NaOH al 50% p/p y se
extrae la mezcla resultante con CH_{2}Cl_{2}. La fase de
CH_{2}Cl_{2} se seca sobre MgSO_{4}, se evapora el disolvente
y se seca a vacío obteniendo 3,09 g del producto deseado.
Espectrometría de masas: MH^{+}= 423.
Etapa
D
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Usando un procedimiento similar al que se
describe en el Ejemplo de preparación 8, se obtienen 1,73 g del
producto deseado, punto de fusión 169,6-170,1ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = +48,2º (c=1, MeOH). MH^{+} =
425.
Etapa
E
Se usa un procedimiento similar al del Ejemplo 4
con el producto de la Etapa D como material de partida, obteniendo
el compuesto del epígrafe. Punto de fusión
152,3-153,3ºC; [\alpha]_{D}^{25} =
+53,0º (c=1, MeOH). MH^{+} = 593.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Etapa
A
Se tratan 15,0 g (44,4 mmol) del producto del
Ejemplo de preparación 9, Etapa B, con 6,52 g (48,9 mmol) de
N-clorosuccinimida de un modo similar al que se
describe en el Ejemplo 18, Etapa A y se extrae como se describe
obteniendo 16,56 g del producto deseado, punto de fusión
234,7-235,0ºC. MH^{+} = 370.
Etapa
B
Se tratan 16,95 g (45,6 mmol) del producto de la
Etapa A del modo que se describe en el Ejemplo 18, Etapa B,
obteniendo 13,07 g del producto deseado, punto de fusión
191,7-192,1ºC. MH^{+} = 356.
Etapa
C
Usando el procedimiento sustancialmente como se
describe en el Ejemplo de preparación 9, Etapa E, se tratan 10,0 g
(28,0 mmol) del producto de la Etapa B con NaBH_{4} obteniendo el
producto deseado, que se usa en la siguiente etapa sin purificación
adicional.
Etapa
D
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Se disuelven 10,0 g (27,9 mmol) del producto de
la Etapa C en 200 ml de CH_{2}Cl_{2} en N_{2} con agitación a
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfría hasta 0ºC y se
añaden 2,63 g de trietilamina y 4,80 g (41,9 mmol) de cloruro de
metanosulfonilo. Se añade a la solución resultante a 0ºC una
solución de 16,84 g (19,6 mmol) de piperazina y 100 ml de THF,
seguido inmediatamente por 100 ml de DMF. Se agita durante toda la
noche a temperatura ambiente. El disolvente se evapora y se extrae
el residuo resultante con CH_{2}Cl_{2} y NaHCO_{3} saturado.
La fase de CH_{2}Cl_{2} se seca sobre MgSO_{4}, se filtra y se
concentra obteniendo el producto bruto. El producto bruto se somete
a cromatografía sobre 1200 ml de sílice, eluyendo con CH_{3}OH al
5% (saturado con NH_{3}) en CH_{2}Cl_{2} obteniendo una mezcla
racémica. El compuesto racémico se separa por cromatografía quiral
usando una columna Chiralpack AD (5 cm x 50 cm), eluyendo con iPrOH
al 30% /hexano con dietilamina al 0,2%. Espectrometría de masas:
MH^{+}= 426. El isómero deseado es el enantiómero (+).
Etapa
E
Se agitan 2,0 g (4,7 mmol) del producto de la
Etapa D en 40 ml de DMF en N_{2}, se enfría la mezcla hasta 0ºC y
se añaden 0,615 g (6,1 mmol) de N-metilmorfolina,
1,1668 g (6,1 mmol) de DEC, 0,8225 g (6,1 mmol) de HOBT y 1,6042 g
(6,1 mmol) del producto del Ejemplo de preparación 1. Se agita
durante toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se
evapora y se extrae el residuo resultante con CH_{2}Cl_{2}/agua,
NaHCO_{3} saturado, NaH_{2}PO_{4} al 10% y salmuera. La fase
de CH_{2}Cl_{2} se separa, se seca sobre MgSO_{4}, se filtra y
se concentra hasta sequedad. El residuo resultante se purifica por
cromatografía ultrarrápida sobre 400 ml de fase normal de gel de
sílice, eluyendo con CH_{3}OH al 5%
/NH_{3}-CH_{2}Cl_{2}, obteniendo 2,43 g del
compuesto del epígrafe, punto de fusión
145,3-146,1ºC;
[\alpha]_{D}^{25} = +33,6º (c=1, MeOH). MH^{+} = 561.
[\alpha]_{D}^{25} = +33,6º (c=1, MeOH). MH^{+} = 561.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
A
\vskip1.000000\baselineskip
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Se calientan 200 mg del material de partida ciano
en 17 g de ácido polifosfórico a 190-200ºC durante
45 min. La mezcla resultante se vierte en hielo, se añade HCl al 30%
y se agita durante 30 minutos. Se extrae con CH_{2}Cl_{2}, se
lava con salmuera, se seca sobre Na_{2}SO_{4}, se filtra y se
concentra. Se purifica por TLC preparativa, eluyendo con
EtOAc/hexano, obteniendo 21 mg del producto deseado (también se
obtienen 59 mg del producto 10-cloro).
Etapa
B
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\vskip1.000000\baselineskip
Usando el procedimiento sustancialmente como se
describe en el Ejemplo de preparación 9, Etapa E, se tratan 1,75 g
(5,425 mmol) del producto de la Etapa A con NaBH_{4}, obteniendo
el producto deseado.
\newpage
Etapa
C
Se disuelve el residuo obtenido en la Etapa B en
50 ml de CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente, se añaden 3,95 ml
(5,425 mmol) de SOCl_{2} y se agita a temperatura ambiente durante
toda la noche. Se elimina el exceso de SOCl_{2} y de disolvente a
vacío. El residuo se disuelve en CH_{2}Cl_{2}, se lava con
NaHCO_{3} saturado y salmuera, se seca sobre Na_{2}SO_{4}, se
filtra y se concentra. Se añaden 25 ml de THF al residuo resultante,
se añaden 2,33 g (27,125 mmol) de piperazina y se agita a
temperatura ambiente durante toda la noche. El disolvente se
evapora, se añade CH_{2}Cl_{2}, se lava con NaHCO_{3} saturado
y salmuera, se seca sobre Na_{2}SO_{4}, se filtra y se
concentra. El residuo resultante se purifica por cromatografía
quiral usando una columna Chiralpack AD y eluyendo con iPrOH al 20%
/hexano con dietilamina al 0,2%. Espectrometría de masas: MH^{+}=
392. El isómero deseado es el enantiómero (+).
Etapa
D
Se combinan 770 mg (1,960 mmol) del producto de
la Etapa C, 323 \mul (2,548 mmol) de
N-metilmorfolina, 344 mg (2,548 mmol) de HOBT, 487
mg (2,548 mmol) de DEC y 390 mg (2,548 mmol) del compuesto del
Ejemplo de preparación 1 en 8 ml de DMF y se agita a temperatura
ambiente durante toda la noche. El disolvente se evapora, se añade
EtOAc y se lava con NaHCO_{3} saturado, agua y salmuera y se seca
sobre Na_{2}SO_{4}. Se purifica por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice, eluyendo con gradiente de EtOAc hasta
(NH_{4}OH al 10%/CH_{3}OH) al 10, 12% /EtOAc. Después se
purifica por TLC preparativa (1000 gel de sílice), obteniendo 750 mg
del compuesto del epígrafe, [\alpha]_{D}^{25} = +23,3º
(c=0,322, MeOH).
Etapa
A
Se disuelven 10,0 g (29,6 mmol) del producto del
Ejemplo de preparación 9, Etapa B, en 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y
200 ml de CH_{3}CN a temperatura ambiente. La mezcla se calienta
hasta 60ºC, se añaden 10,45 g (32,6 mmol) de bis-(tetrafluoroborato)
de
1-fluoro-4-hidroxi-1,4-diazoniabiciclo[2,2,2]octano
y se calienta hasta reflujo durante 4 horas. La mezcla se enfría
hasta temperatura ambiente, se extrae con CH_{2}Cl_{2} y NaOH 1
N. La fase de CH_{2}Cl_{2} se seca sobre MgSO_{4}, se filtra y
se concentra hasta sequedad. El residuo resultante se purifica por
cromatografía ultrarrápida usando 1400 ml de gel de sílice como fase
normal eluida con EtOAc al 10% -CH_{2}Cl_{2} + 2 gotas de
NH_{4}OH, obteniendo 2,00 g de producto, punto de fusión
103,2-103,5ºC. MH^{+} = 355.
Etapa
B
Usando un procedimiento sustancialmente como se
describe en el Ejemplo de preparación 9, Etapa D, se tratan 1,80 g
(5,1 mmol) del producto de la Etapa A. El producto bruto se purifica
por cromatografía ultrarrápida usando 200 ml de gel de sílice como
fase normal, eluida con EtOAc al 20% /hexano. Espectrometría de
masas: MH^{+} = 339.
Etapa
C
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\vskip1.000000\baselineskip
Usando el procedimiento sustancialmente como se
describe en el Ejemplo de preparación 9, Etapa E, se tratan 0,47 g
(1,4 mmol) del producto de la Etapa B con NaBH_{4}, obteniendo el
producto deseado. Espectrometría de masas: MH^{+} = 342.
Etapa
D
Se disuelven 0,37 g (1,1 mmol) del producto de la
Etapa C en 20 ml de tolueno en N_{2} y se enfría desde
temperatura ambiente hasta 0ºC. Se añaden 0,3855 g (3,2 mmol) de
SOCl_{2} y se agita a temperatura ambiente, luego se añaden 10 ml
de CHCl_{3} y se agita durante 3 h. El disolvente se evapora, el
residuo resultante se extrae con NaOH
1N-CH_{2}Cl_{2}, la fase de CH_{2}Cl_{2} se
seca sobre MgSO_{4}, se filtra y se concentra hasta sequedad. El
residuo se disuelve en 10 ml de THF en N_{2}, se añaden 0,465 g
(5,4 mmol) de piperazina, 10 ml de THF y se agita durante toda la
noche a temperatura ambiente. El procedimiento de extracción se
repite obteniendo el producto deseado. Espectrometría de masas:
MH^{+}= 410.
Etapa
E
Se tratan 0,44 g (1,1 mmol) del producto de la
Etapa D con N-metilmorfolina, N-óxido del ácido
4-piridilacético, DEC y HOBT en DMF como se describe
en el Ejemplo 5. El disolvente se evapora y el residuo resultante se
extrae con CH_{2}Cl_{2}-H_{2}O, NaHCO_{3}
saturado, NaH_{2}PO_{4} al 10% y salmuera. La fase de
CH_{2}Cl_{2} se seca sobre MgSO_{4}, se filtra y se concentra
hasta sequedad. El residuo resultante se purifica por cromatografía
ultrarrápida sobre 150 ml de fase normal de gel de sílice, eluyendo
con CH_{3}OH al 5%/NH_{3}-CH_{2}Cl_{2},
obteniendo 0,41 g del compuesto del epígrafe, punto de fusión
155,0-155,6ºC; Espectrometría de masas: MH^{+}=
545.
Usando materiales de partida y procedimientos
apropiados como se han descrito antes se podrían preparar los
siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron parcialmente farnesil proteína
transferasa (FPT) y geranilgeranil proteína transferasa (GGPT) I a
partir de cerebro de rata por fraccionamiento con sulfato amónico,
seguido por cromatografía de intercambio aniónico en
Q-Sepharose (Pharmacia, Inc.) básicamente como se
describe por Yokoyama et al (Yokoyama, K., et al.,
(1991), A protein geranylgeranyltransferase from bovine brain:
Implications for protein prenylation specificity (Una proteína
geranilgeranil transferasa de cerebro bovino: Implicaciones para la
especificidad de prenilación de proteínas) Proc. Natl. Acad. Sci
USA 88: 5302-5306, cuya
descripción se incorpora en la presente memoria como referencia). Se
expresó también farnesil proteína transferasa humana en E.
coli, usando clones de ACNc que codifican tanto las subunidades
a como las b. Los procedimientos usados fueron similares a los
publicados (Omer, C. et al., (1993), Characterization of
recombinant human farnesyl protein transferase: Cloning, expression,
farnesyl diphosphate binding, and functional homology with yeast
prenyl-protein transferases, (Caracterización de
farnesil proteína transferasa humana recombinante: Clonación,
expresión, unión a difosfato de farnesilo y homología funcional con
prenil proteína transferasas de levaduras) Biochemistry
32: 5167-5176). La farnesil proteína
transferasa humana se purificó parcialmente a partir de la fracción
soluble de E. coli como se ha descrito antes. Los inhibidores
de farnesil proteína transferasa tricíclicos descritos en la
presente memoria inhibieron tanto la enzima de rata como la humana
con proteínas similares. Se prepararon dos formas de proteína
val^{12}-Ha-Ras como sustratos
para estas enzimas, diferenciándose en su secuencia del extremo
carboxilo terminal. Una forma terminaba en
cisteína-valina-leucina-serina
(Ras-CVLS) y la otra en
cisteína-valina-leucina-leucina
(Ras-CVLL). Ras-CVLS es un sustrato
para la farnesil proteína transferasa mientras que
Ras-CVLL es un sustrato para la geranilgeranil
proteína transferasa I. Los ADNc que codifican estas proteínas se
construyeron de modo que las proteínas contenían una extensión
amino-terminal de 6 residuos histidina. Ambas
proteínas se expresaron en Escherichia coli y se purificaron
usando una cromatografía de afinidad a quelato metálico. Los
sustratos de pirofosfato de isoprenilo radiomarcados, pirofosfato de
[^{3}H]farnesilo y pirofosfato de
[^{3}H]geranilgeranilo se adquirieron de DuPont/New England
Nuclear.
Se han descrito varios procedimientos para medir
la actividad de farnesil proteína transferasa (Reiss et al
1990, Cell 62: 81; Schaber et al 1990, J.
Biol. Chem. 265: 14701; Manne et al 1990,
PNAS 87: 7541; y Barbacid & Manne 1993, patente de
Estados Unidos nº 5.185.248). Se ensayó la actividad midiendo la
transferencia de [^{3}H]farnesilo desde pirofosfato de
[^{3}H]farnesilo a Ras-CVLS usando
condiciones similares a las descritas por Reiss et al. 1990
(Cell 62: 81). La mezcla de reacción contenía Hepes 40
mM, pH 7,5; cloruro de magnesio 20 mM; ditiotreitol 5 mM;
pirofosfato de [^{3}H]farnesilo 0,25 \muM; 10 ml de
farnesil proteína transferasa purificada en
Q-Sepharose; la concentración indicada de compuesto
tricíclico o dimetil sulfóxido (DMSO) como control vehículo (DMSO
final al 5%); y Ras-CVLS 5 mM en un volumen total de
100 ml. Se dejó la mezcla de reacción durante 30 minutos a
temperatura ambiente y luego se paró con 0,5 ml de dodecil sulfato
sódico al 4% (SDS), seguidos por 0,5 ml de TCA al 30% frío. Las
muestras se dejaron reposar en hielo durante 45 minutos y luego se
recogió la proteína Ras precipitada en hojas de papel de filtro GF/C
usando un recolector de células Brandel. Las hojas de filtro se
lavaron una vez usando TCA al 6%, SDS al 2% y se midió la
radiactividad en un contador de centelleo líquido Wallac 1204
Betaplate BS. Se calculó la inhibición porcentual con respeto al
vehículo control DMSO.
El ensayo de geranilgeranil proteína transferasa
I fue esencialmente idéntico al ensayo de farnesil proteína
transferasa descrito antes, con dos salvedades: pirofosfato de
[^{3}H]geranilgeranilo reemplaza a pirofosfato de farnesilo
como donante de isoprenoide y el aceptor de proteína fue
Ras-CVLL. Este es similar al ensayo descrito por
Casey et al (Casey, P.J., et al., (1991), Enzymatic
modification of proteins with a geranylgeranyl isoprenoid
(Modificación enzimática de proteínas con un isoprenoide
geranilgeranilo), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88:
8631-8635, cuya descripción se incorpora en la
presente memoria como referencia).
2. Ensayo con la base celular: Expresión
transitoria de
val^{12}-Ha-Ras-CVLS
y
val^{12}-Ha-Ras-CVLL
en células de riñón de mono COS: Efecto de inhibidores de farnesil
proteína transferasa en el procesamiento de Ras y en el crecimiento
celular desordenado inducido por Ras transformante.
Se transfectaron células de riñón de mono COS por
electroporación con el plásmido pSV-SPORT
(Gibco/BRL) que contenía un inserto de ADNc que codifica bien
Ras-CVLS o Ras-CVLL, conduciendo a
la sobreexpresión transitoria de un sustrato Ras para farnesil
proteína transferasa o geranilgeranil proteína transferasa I,
respectivamente (véase anteriormente).
Después de la electroporación, se cultivaron las
células en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contenían
1,5 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO, Inc.)
suplementado con suero bovino fetal al 10% y los inhibidores
apropiados de farnesil proteína transferasa. Después de 24 horas, se
retiraron los medios y se volvieron a añadir medios nuevos que
contenían los fármacos apropiados.
48 horas después de la electroporación se
examinaron las células al microscopio para controlar el crecimiento
desordenado inducido por Ras transformante. Las células que expresan
Ras transformante se hicieron más redondeadas y refringentes y con
proliferación de la monocapa, reminiscentes del fenotipo
transformante. Las células se fotografiaron seguidamente, se lavaron
dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y
se separaron de la placa raspando con una banda de goma en 1 ml de
un tampón que contenía Tris 25 mM, pH 8,0; ácido
etilendiaminotetraacético 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1
mM; leupeptina 50 mM; y pepstatina 0,1 mM. Las células se lisaron
homogeneizando y se separaron los restos celulares por
centrifugación a 2000 x g durante 10 min.
Las proteínas celulares se precipitaron mediante
adición de ácido tricloroacético enfriado en hielo y se volvieron a
disolver en 100 ml de tampón de muestra para electroforesis en SDS.
Las muestras (5-10 ml) se cargaron en minigeles de
poliacrilamida al 14% (Novex, Inc.) y se realizó la electroforesis
hasta que el colorante de seguimiento apareció cerca de la parte
inferior del gel. Las proteínas resueltas en los geles se sometieron
a electrotransferencia en membranas de nitrocelulosa para su
inmunodetección.
Las membranas se bloquearon por incubación
durante toda la noche a 4ºC en PBS que contenía leche en polvo al
2,5% y Tween-20 al 0,5% y luego se incubaron con un
anticuerpo monoclonal específico para Ras, Y13-259
(Furth, M.E., et al., (1982), Monoclonal antibodies to the
p21 products of the transforming gene of Harvey murine sarcome virus
and of the cellular ras gene family (anticuerpos
monoclonales para los productos p21 del gen transformante del virus
de sarcoma murino Harvey y de la familia de genes ras), J.
Virol. 43: 294-304), en PBS que contiene
suero bovino fetal al 1% durante una hora a temperatura ambiente.
Después de lavar, se incubaron las membranas durante una hora a
temperatura ambiente con una dilución 1:5000 de anticuerpo
secundario, IgG antirrata de conejo conjugado con peroxidasa de
rábano picante, en PBS que contenía suero bovino fetal al 1%. La
presencia de Ras-CVLS o Ras-CVLL
procesado y no procesado se detectó usando un reaccionante
colorimétrico para peroxidasa
(4-cloro-1-naftol)
como se describe por el fabricante (Bio-Rad).
Se sembraron fibroblastos HEPM humanos normales
en placas de 3,5 cm a una densidad de 5 x 10^{4} células/placa en
2 ml de medio de cultivo y se incubaron durante 3 a 5 días hasta
conseguir confluencia. El medio se aspiró de cada placa y las
células indicadoras de tumor, células de carcinoma de vejiga humana
T24-BAG4 que expresan un gen ras humano activado se
sembraron en la parte superior de la monocapa de fibroblastos a una
densidad de 2 x 10^{3} células/placa en 2 ml de medio de cultivo y
se dejó que se adherieran durante toda la noche. La inhibición de
las colonias inducida por el compuesto se ensayó mediante adición de
diluciones en serie de compuesto directamente en el medio de
crecimiento después de 24 horas de sembrar las células tumorales y
se incubaron las células durante otros 14 días para permitir la
formación de colonias. Los ensayos finalizaron aclarando las
monocapas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS),
fijando las monocapas con una solución de glutaraldehído al 1% en
PBS, luego visualizando las células tumorales por tinción con
X-Gal (Price, J., et al., Lineage analysis
in the vertebrate nervous system by
retrovirus-mediated gene transfer (Análisis de
linaje en el sistema nervioso de vertebrados por transferencia
génica mediada por retrovirus), Proc. Natl. Acad. Sci,
84, 156-160 (1987)). En el ensayo de
inhibición de colonias, los compuestos se evaluaron en base a dos
valores de CI_{50}: la concentración de fármaco requerida para
prevenir el aumento en el número de células tumorales en un 50%
(CI_{50}t) y la concentración de fármaco requerida para reducir la
densidad de células que comprenden el tapiz celular en un 50%
(CI_{50}m). Ambos valores de CI_{50} se obtuvieron determinando
la densidad de células tumorales y el tapiz celular por inspección
visual y enumeración de células por colonia de las colonias al
microscopio. El índice terapéutico del compuesto se expresó de forma
cuantitativa como la relación de CI_{50}m/CI_{50}t, siendo los
valores mayores que uno indicadores de especificidad de la diana
tumoral.
Se llevaron a cabo ensayos adicionales siguiendo
básicamente el mismo procedimiento que se ha descrito antes, pero
con la sustitución de líneas celulares tumorales indicadoras
alternativas en lugar de las células T24-BAG. Los
ensayos se llevaron a cabo usando bien células de carcinoma de colon
humano DLD-1-BAG que se expresan
como gen K-ras activado o células de carcinoma de
colon humano SW620-BAG que expresan un gen
K-ras activado. Usando otras líneas celulares
tumorales conocidas en la técnica se puede demostrar la actividad de
los compuestos de esta invención contra otros tipos de células
cancerígenas (tales como las descritas en la presente memoria en las
páginas 15 y 16).
El crecimiento independiente del anclaje es una
característica de las líneas celulares tumorogénicas. Se suspenden
células tumorales humanas en medio de crecimiento que contiene
agarosa al 0,3% y una concentración indicada de un inhibidor de
farnesil proteína transferasa. Se coloca la solución sobre medio de
crecimiento solidificado con agarosa al 0,6% que contiene la misma
concentración de inhibidor de farnesil transferasa que la capa
superior. Después de que solidifica la capa superior, se incuban las
placas durante 10 a 16 días a 37ºC en CO_{2} al 5% para permitir
el crecimiento de colonias. Después de la incubación, se tiñen las
colonias cubriendo el agar con una solución de MTT (bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio,
azul de tiazolilo) (1 mg/ml en PBS). Se realiza el recuento de
colonias y se determinan las CI_{50}.
| Ejemplo | CI_{50} para FPT (\muM) | Ejemplo | CI_{50} para FPT (\muM) |
| 1 | <0,034 | 2 | 0,010 |
| 0,016 | |||
| 4 | 0,046 | 16A | 0,032 |
| 0,026 | |||
| 16B | 0,038 | 11B | >0,095 |
| 0,023 | |||
| 15 | 0,022 | 7 | 0,012 |
| 8 | 0,021 | 11A | 0,0018 |
| 0,0021 | |||
| 5 | 0,0023 | 12B | 0,0025 |
| 9 | 0,0013 | 10 | 0,0019 |
| 7B | <0,003 | 8B | 0,013 |
| 14A | 0,0026 | 14 | 0,062 |
| 13A | 0,078 | 13 | 0,005 |
| 5A | >0,099 | 7A | >0,1 |
| 8A | >0,094 | 10A | >0,094 |
| 9A | >0,088 | 6 | 0,0031 |
| 11 | 0,002 | 5B | \sim 0,003 |
| 12A | >0,094 | 13B | 0,005 |
| 14B | 0,005 | 5 \cdot sal HCl | 0,0038 |
| 14A \cdot sal HCl | <0,0031 | 9B | 0,003 |
| Ejemplo | CI_{50} para FPT (\muM) | Ejemplo | CI_{50} para FPT (\muM) |
| 10B | 0,003 | 17 | 0,043 |
| 17A | 0,048 | 18 | 0,0031 |
| 19 | <0,0038 | 20 | 0,0062 |
| 21 | 0,0084 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Ejemplo | Inhibición Enzimática | Inhibición Enzimática |
| CI_{50} para FPT (\mum) | CI_{50} para GGPT (\mum) | |
| 2 | 0,010 | >300 |
| 0,016 | ||
| 4 | 0,046 | >35,7 |
| 5B | \sim0,003 | >300 |
| 16A | 0,032 | >38 |
| 0,026 | ||
| 16B | 0,038 | >76 |
| 0,023 | ||
| 7 | 0,012 | >300 |
| 11A | 0,0018 | >66 |
| 0,0021 | ||
| 9 | 0,0013 | >59 |
| 5 | 0,0023 | >66 |
| 14A | 0,0026 | >62 |
| 13 | 0,005 | >63 |
| 7B | <0,003 | >66 |
| 8B | 0,013 | >60 |
| 18 | 0,0031 | >50 |
| 20 | 0,0062 | >38 |
| Ejemplo | Inhibición de procesado | Ejemplo | Inhibición de procesado |
| de Ras CI_{50} (\mum) | de Ras CI_{50} (\mum) | ||
| 8 | <0,25 | 2 | 0,25 |
| 15 | 0,60 | 16A | 0,5 |
| 16B | 0,125 | 11 | <0,25 |
| 7 | <0,25 | 5B | 0,05 |
| 10 | <0,025 | 10A | 2,0 |
| 12B | <0,025 | 12A | 0,95 |
| 11A | <0,025 | 11B | 2,25 |
| 5 | 0,098 | 14A \cdot sal HCl | 0,015 |
| 13 | 0,420 | 9 | 0,010 |
| 7B | 0,025 | 8B | 0,280 |
| 9A | 0,85 | 5 \cdot sal HCl | 0,010 |
| 5A | 5,0 | 14A | 0,480 |
| 1,0 | |||
| 14 | >1,0 | 13A | >1,0 |
| 7A | >1,0 | 8A | >1,0 |
| 17 | 0,350 | 17A | 0,500 |
| 14B | 0,045 | 6 | 0,040 |
| 18 | 0,025 | 19 | 0,045 |
| 20 | -0,030 | 21 | 0,42 |
Inhibición de crecimiento de
células tumorales
Ensayo del tapiz
celular
| Ejemplo | Tumor (T-24) | Tumor (DLD-1) | Tumor (SW620) | Normal |
| CI_{50} (\muM) | CI_{50} (\muM) | CI_{50} (\muM) | CI_{50} | |
| 1 | < 1,6 | - | - | >25 |
| 4 | 3,1 | - | - | >25 |
| 7 | <1,6 | <1,6 | 6,25 | >25 |
| 5B | <1,6 | 3,1 | 10 | >25 |
| 13B | <1,6 | 3,1 | >3,1 | 25 |
| 11B | <1,6 | 8 | 18 | >25 |
| Ejemplo | Tumor (T-24) | Tumor (DLD-1) | Tumor (SW620) | Normal |
| CI_{50} (\muM) | CI_{50} (\muM) | CI_{50} (\muM) | CI_{50} | |
| 9A | <1,6 | 12,5 | 12,5 | 18 |
| 10A | <1,6 | 2,0 | 1,6 | 8 |
| 5 | <1,6 | 3,1 | 6,25 | >25 |
| 14A | <1,6 | 6,25 | 12,5 | >25 |
| 13A | 3,1 | 6,25 | 6,25 | >25 |
| 7B | <1,6 | 1,6 | 3,1 | >25 |
| 8A | <1,6 | <1,6 | 3,1 | >25 |
| 2 | <1,6 | 6,25 | 6,25 | >25 |
| 16B | <1,6 | 6,25 | 25 | >25 |
| 8 | <1,6 | 3,1 | 3,1 | >25 |
| 15 | 3,1 | 6,25 | >6,25 | >25 |
| 11A | <1,6 | <1,6 | >6,25 | >25 |
| 9 | <1,6 | <1,6 | 6,25 | >25 |
| 10 | <1,6 | <1,6 | 3,1 | >25 |
| 12A | <1,6 | 2,0 | 4 | >25 |
| 5A | 12,5 | 12,5 | >25 | >25 |
| 14 | <1,6 | 6,25 | >12,5 | >25 |
| 13 | <1,6 | 3,1 | >1,6 | >25 |
| 8B | <1,6 | <1,6 | 3,1 | >25 |
| 17 | 1,6 | 6,25 | 25 | >25 |
| 17A | 3,1 | 4 | 18 | >25 |
| 10B | <1,6 | 1,6 | 1,6 | >25 |
| 12B | <1,6 | 3,1 | 6,25 | >25 |
| 7A | <1,6 | 1,6 | 3,1 | >25 |
| 6 | <1,6 | 4,0 | 6,24 | - |
| 19 | <1,6 | <1,6 | 6,25 | >25 |
Se realizó un Ensayo en Agar Blando con el
compuesto del Ejemplo 10 y las siguientes líneas celulares
tumorales: K ras NIH 3T3; H ras NIH 3T3; HTB 177 (NSCLC) mutación en
K ras; HTB 173 (NCI H146) (SCLC) mutación en ras no detectada; A549
(pulmón) mutación en K ras; HTB 175 (SCLC) mutación en ras no
detectada; HTB 119 (NCI H69) (SCLC); HTB 183 (NCIH661) (NSCLC)
mutación en ras no detectada; HPAF II (pancreático) mutación en K
ras; MCF-7 (mama) mutación en ras no detectada;
HBL100 (mama) mutación en ras no detectada; Du4475 (mama) mutación
en ras no detectada; MDA MB 468 (mama) mutación en ras no detectada;
DU 145 (próstata) mutación en ras no detectada; MDA MB453 (mama);
BT474 (mama); PC3 (próstata); DLD 1 (colon) mutación en K ras; y
AsPc-l (pancreático) mutación en K ras. El estado de
mutación en Ras se determinó por ELISA (Oncogene Science). Las
CI_{50} (\muM) para cada línea celular variaron en el intervalo
de 0,04 a 3,0.
Se realizó un Ensayo en Agar Blando con el
compuesto del Ejemplo 18 y las siguientes líneas celulares
tumorales: K ras NIH 3T3; H ras NIH 3T3; HTB 177 (NSCLC) mutación en
K ras; A549 (pulmón) mutación en K ras; y HTB 175 (SCLC) mutación en
ras no detectada. El estado de mutación en Ras se determinó por
ELISA (Oncogene Science). Las CI_{50} (\muM) para cada línea
celular variaron en el intervalo de 0,175 a 0,8.
Los datos demuestran que los compuestos de la
invención son inhibidores de la farnesilación de
Ras-CVLS por farnesil proteína transferasa (FPT) de
cerebro de rata parcialmente purificada. Los datos también muestran
que existen compuestos de la invención que se pueden considerar como
inhibidores muy potentes (CI_{50} < 0,1 \muM) de la
farnesilación de Ras CVLS por FPT de cerebro de rata parcialmente
purificada.
Los datos también demuestran que los compuestos
de la invención son peores inhibidores de geranilgeranil proteína
transferasa (GGPT) ensayada usando Ras-CVLL como
aceptor isoprenoide. Esta selectividad es importante para el
potencial terapéutico de los compuestos usados en los procedimientos
de esta invención, y aumenta el potencial de que los compuestos
tengan propiedades de inhibición de crecimiento selectivas contra
células transformadas por Ras.
El análisis de transferencia Western de proteína
Ras expresada en células COS transformadas con Ras después de
tratamiento con inhibidores de farnesil proteína transferasa
tricíclicos de esta invención indicó que éstos inhibían el procesado
de Ras-CVLS, causando la acumulación de Ras no
procesado (véase la Tabla 3). El compuesto del Ejemplo 2, por
ejemplo, inhibió el procesado de Ras-CVLS con un
valor de CI_{50} de 0,025 \muM, pero no bloqueo la
geranilgeranilación de Ras-CVLL en concentraciones
de hasta 33 \muM.
Estos resultados proporcionan evidencia de la
inhibición específica de farnesil proteína transferasa, pero no de
geranilgeranil proteína transferasa I, por los compuestos de esta
invención en células intactas e indican su posibilidad de bloquear
la transformación celular por oncogenes Ras activados.
Los inhibidores de farnesil proteína transferasa
tricíclicos de esta invención también inhibieron el crecimiento de
células tumorales transformadas por Ras en el tapiz celular sin
presentar actividad citotóxica contra la monocapa normal.
Se inoculan células tumorales (5 X 10^{5} a 8 X
10^{6}) de DLD-l (células de carcinoma de colon
humano, ATCC nº CCL 221) de forma subcutánea en el costado de
ratones hembra nu/nu de 5 a 6 semanas. Los animales que portan
tumores se seleccionan y se distribuyen al azar cuando los tumores
se establecen. Se tratan los animales con vehículo
(\beta-ciclodextrina para administración
intraperitoneal o aceite de maíz para administración oral) solo o
con un compuesto de la presente invención en vehículo cuatro veces
al día (QID) durante 7 días a la semana durante 4 semanas. La
inhibición porcentual del crecimiento del tumor con respecto a los
controles con vehículo se determina por medidas de los tumores.
La inhibición tumoral porcentual promedio para
cada compuesto de los Ejemplos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 7A, 8B, 9, 10, 11A,
11B, 12B, 13, 14A, 16B y 18 fue de 7 a 50% para una dosis oral de 10
mg/kg, y de 35,4 a 83 para una dosis oral de 50 mg/kg.
Para preparar composiciones farmacéuticas a
partir de los compuestos descritos por esta invención, los vehículos
farmacéuticamente aceptables inertes pueden ser sólidos o líquidos.
Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos,
granulados dispersables, cápsulas, sellos y supositorios. Los polvos
y comprimidos pueden comprender de aproximadamente 5 a
aproximadamente 70 por ciento de ingrediente activo. Los vehículos
sólidos adecuados se conocen en la técnica, por ejemplo, carbonato
de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa. Los
comprimidos, polvos, sellos y cápsulas se pueden usar como formas de
dosificación sólida adecuadas para administración oral.
Para preparar supositorios, se funde primero una
cera de bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de
ácidos grasos o manteca de cacao, y se dispersa el ingrediente
activo de forma homogénea en el mismo por agitación. La mezcla
fundida homogénea se vierte entonces en moldes de tamaño
conveniente, se deja enfriar y solidifica.
\newpage
Las preparaciones en forma líquida incluyen
soluciones, suspensiones y emulsiones. Como ejemplo se pueden citar
agua o soluciones agua-propilenglicol para inyección
parenteral.
Las preparaciones en forma líquida también pueden
incluir soluciones para administración intranasal.
Las preparaciones en aerosol adecuadas para
inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvo,
que pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, tal como un gas comprimido inerte.
También se incluyen preparaciones en forma sólida
que están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en
preparaciones en forma líquida, para administración oral o
parenteral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones
y emulsiones.
Los compuestos de la invención también se pueden
administrar por vía transdérmica. Las composiciones transdérmicas
pueden adoptar la forma de cremas, lociones, aerosoles y/o
emulsiones y se pueden incluir en un parche transdérmico del tipo
matriz o depósito como son habituales en la técnica para este
propósito.
Con preferencia, el compuesto se administra por
vía oral.
Con preferencia, la preparación farmacéutica es
una forma de dosis unitaria. En dicha forma, la preparación se
subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del
componente activo, por ejemplo, una cantidad eficaz para conseguir
el propósito deseado.
La cantidad de compuesto activo en una dosis
unitaria de preparación puede variar o ajustarse de aproximadamente
0,1 mg a 1000 mg, más preferiblemente, de aproximadamente 1 mg a 300
mg, de acuerdo con la aplicación particular.
La dosis real empleada puede variar dependiendo
de los requerimientos del paciente y la intensidad del trastorno que
se está tratando. La determinación de la dosis apropiada para una
situación particular está dentro del conocimiento del experto. Por
lo general, el tratamiento se inicia con dosis menores que son más
pequeñas que la dosis óptima del compuesto. Seguidamente, se aumenta
la dosis mediante pequeños incrementos hasta que se alcanza el
efecto óptimo bajo las circunstancias particulares. Por
conveniencia, si se desea, la dosis diaria total se puede dividir y
administrarse en porciones durante el día.
La cantidad y frecuencia de administración de los
compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables
se regulará conforme al criterio del médico encargado considerando
factores tales como la edad, estado y peso del paciente, así como la
intensidad de los síntomas que se están tratando. Una pauta de
dosificación típica recomendada es administración oral de 10 mg a
2000 mg/día, con preferencia de 10 a 1000 mg/día, en dos a cuatro
dosis divididas para bloquear el crecimiento del tumor. Los
compuestos son no tóxicos cuando se administran en este intervalo de
dosificación.
A continuación se presentan ejemplos de formas de
dosificación farmacéutica que contienen un compuesto de la
invención. El alcance de la invención en su aspecto de composición
farmacéutica no queda limitado por los ejemplos aportados.
Ejemplo
A
| Nº | Ingrediente | mg/comprimido | mg/comprimido |
| 1. | Compuesto activo | 100 | 500 |
| 2. | Lactosa, USP | 122 | 113 |
| 3. | Almidón de maíz, calidad alimentaria, como | 30 | 40 |
| una pasta al 10% en agua purificada | |||
| 4. | Almidón de maíz, calidad alimentaria | 45 | 40 |
| 5. | Estearato de magnesio | 3 | 7 |
| Total | 300 | 700 |
Se mezclan los componentes número 1 y 2 en un
mezclador adecuado durante 10-15 minutos. La mezcla
se granula con el componente nº 3. Se muelen los gránulos húmedos a
través de una malla gruesa (por ejemplo, 0,63 cm) si fuera
necesario. Se secan los gránulos húmedos. Se tamizan los gránulos
secos si fuera necesario y se mezclan con el componente nº 4 y se
mezcla durante 10 a 15 minutos. Se añade el componentes nº 5 y se
mezcla durante 1 a 3 minutos. La mezcla se comprime al tamaño y peso
apropiado en una máquina de preparación de comprimidos adecuada.
Ejemplo
B
| Nº | Ingrediente | mg/cápsula | mg/cápsula |
| 1. | Compuesto activo | 100 | 500 |
| 2. | Lactosa, USP | 106 | 123 |
| 3. | Almidón de maíz, calidad alimentaria | 40 | 70 |
| 4. | Estearato de magnesio, FN | 7 | 7 |
| Total | 253 | 700 |
Se mezclan los componentes números 1, 2 y 3 en
una mezcladora adecuada durante 10 a 15 minutos. Se añade el
componente nº 4 y se mezcla durante 1 a 3 minutos. Se llena la
mezcla en cápsulas de gelatina dura de dos piezas adecuadas en una
máquina encapsuladora adecuada.
Claims (13)
1. Un compuesto que tiene la fórmula
2. Un compuesto según la reivindicación 1 en
forma de una mezcla racémica.
3. Un compuesto según la reivindicación 1 en
forma del enantiómero (+).
4. Un compuesto según la reivindicación 1 que
tiene la fórmula
5. Una sal farmacéuticamente aceptable de un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Una composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz de un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en combinación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
7. El uso de un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para la
inhibición de farnesil proteína transferasa.
8. El uso de un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, leucemia
mieloide, cáncer folicular de tiroides, síndrome mielodisplásico,
carcinoma epidérmico, carcinoma de vejiga, cáncer de colon, cáncer
de mama o cáncer de próstata.
9. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para uso en la inhibición de farnesil
proteína transferasa en un paciente.
10. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de cáncer de
páncreas, cáncer de pulmón, leucemia mieloide, cáncer folicular de
tiroides, síndrome mielodisplásico, carcinoma epidérmico, carcinoma
de vejiga, cáncer de colon, cáncer de mama o cáncer de próstata.
11. El uso de un compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento
para inhibir el crecimiento anormal de células.
12. El uso de un compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento
para inhibir el crecimiento anormal de células, en el que las
células inhibidas son células tumorales que expresan un oncogen Ras
activado.
13. El uso de un compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento
para inhibir el crecimiento anormal de células, en el que la
inhibición es de células tumorales en las que la proteína Ras se
activa como resultado de mutación oncogénica en genes distintos del
gen Ras.
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