CZ292791B6 - Tricyklické amidy, které se používají pro inhibici G-proteinové funkce a k léčení proliferativních onemocnění - Google Patents

Abstract

Deriváty tricyklického amidu obecného vzorce I.0 dále farmaceutický přípravek, metody pro inhibici abnormálního růstu buněk, pro inhibici farnesyl protein transferázy a pro léčení rakovin za použití těchto nových sloučenin.ŕ

Description

Tricyklické amidy, které se používají pro inhibici G—proteinové funkce a k léčení proliferativních onemocnění

Oblast techniky

Vynález se týká tricyklických amidů, které jsou užitečné pro inhibici g-proteinové funkce a k léčení proliferativních onemocnění. Zároveň se týká způsobů jejich přípravy a přípravy farmaceutických prostředků.

Dosavadní stav techniky

Biologický význam Ras onkogenu a úloha jak Ras, tak enzymu, který je známý jako famesyl 15 protein transferáza, v konverzi normálních buněk na rakovinné buňky, je popsána v PCT mezinárodní přihlášce W095/00497 a WO95/10516. Každá z těchto publikací také popisuje rozdílnou třídu sloučenin, které inhibují aktivitu enzymu famesyl protein transferázy a tím také inhibují famesylaci Ras proteinu.

PCT mezinárodní přihláška WO95/10516 se týká tricyklických sloučenin amidu a močoviny o obecného vzorce (I.O).

(r. o>

a jejich využití v metodě pro inhibici Ras funkce a abnormálního růstu buněk. Je popsáno množství sub-generických tříd sloučenin vzorce (I.O.) Popis zahrnuje sloučeniny vzorců (V. Oc), 25 (V.Ic) a (V. Ha)

-1 CZ 292791 B6

a také 11-R-izomer a 11-S-izomer sloučenin (V.Oc) a (V.Ic). Je popsáno množství specifických sloučenin, které spadají do takových sub-generických sloučenin. Je zde také popsána biologická aktivita těchto sloučenin.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje nové tricyklické amidové sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, 10 která se skládá z:

-2CZ 292791 B6

-3CZ 292791 B6

(-) - cnantiomer

(+) - enantiomcr

(+)-enantiomer

-4CZ 292791 B6

-5CZ 292791 B6

nebo z jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Optické otáčivosti sloučenin ((+) nebo (-)) jsou měřeny v methanolu nebo v ethanolu při 25 °C.

Tento vynález zahrnuje výše uvedené sloučeniny v amorfním stavu nebo v kiystalickém stavu.

Sloučeniny z tohoto vynálezu zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá ze sloučenin I.O, V.O, VI.O, VII.O, VIII.O, VIII.OA, IX.O, X.O, XI.O, XIV.O nebo zjejich farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá ze sloučenin XXII.O, XXV.O, XXVII.O, XXIX.O, XXXI.O, XXXII.O, XXXVI.O, XXXVII.O, XXXIX.O a XLI.O nebo zjejich farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z: (+)-enantiomerů sloučenin LXXIII.O a LXXX.O nebo zjejich farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definovány výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá ze sloučenin XLIII.O, LIII.O, LV.O, LVII.O, LVffl.O, LXII.O, LXVI.O, LXVIII.O nebo zjejich farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše.

Preferované sloučeniny zahrnují 3,7,8-trihalogensloučeniny, které mají optickou otáčivost (-). Například sloučeniny XXII.O, XXV.O a XXVII.

Preferované sloučeniny také zahrnují 3,8,10-trihalogensloučeniny, které mají optickou otáčivost (+). Například sloučeniny XXIX.O, XXXI.O, XXXII.O, XXXVI.O, XXXVII.O, XXXIX.O a XLI.O.

Preferované sloučeniny také zahrnují 3,10-dihalogensloučeniny, které mají optickou otáčivost (+), například sloučeninu XX.O.

-6CZ 292791 B6

Preferované sloučeniny zahrnují také 3,10-dibrom-8-chlor-sloučeniny, které mají S konfiguraci v poloze C-l 1. Například sloučeniny LIII.O, LV.O, LVII.O.

Preferované sloučeniny také zahrnují 3,10-dibrom-8-chlorsloučeniny, které mají R konfiguraci v poloze C-l 1. Například sloučeniny LXII.O, LXVI.O a LXVIII.O.

Preferované sloučeniny také zahrnují sloučeniny XVI.O, XXXIX.O, XLI.O, LXVIII.O.

Více se dává přednost sloučeninám XVI.O, XXXIX.O, LXVIII.O. Ještě více se dává přednost sloučeninám XVI.O, XXXIX.O, a LXVIII.O a nejvíce se dává přednost sloučeninám XXXIX.O nebo LXVIII.O.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že tricyklický systém je očíslován:

Odborníkovi v oboru je také zřejmé, že S a R konfigurace vazby v poloze C-l 1 je:

Proto tento vynález poskytuje způsob pro inhibici famesyl protein transferázy za použití tricyklických sloučenin z tohoto vynálezu které:

(i) silně inhibují famesyl protein transferázu, ale ne generalgeranyl protein transferázu I, in vitro (ii) blokují fenotypovou změnu indukovanou formou transformujícího se Ras, který je akceptor famesylu, ale ne změnu indukovanou formou transformujícího se Ras, který je akceptor geranylgeranyl zbytku (iii) blokují intrabuněčný vývoj Ras, který je akceptorem famesylu, ale ne Ras, který je konstmován jako geranylgeranyl akceptor (iv) blokují abnormální růst buněk v kultuře, který je indukovaný transformujícím se Ras.

Ukazují se, že sloučeniny z tohoto vynálezu vykazují protinádorovou aktivitu na zvířecích modelech.

Tento vynález poskytuje způsob pro inhibici abnormálního růstu buněk, který zahrnuje transformované buňky, podáváním účinného množství sloučeniny z tohoto vynálezu. Abnormální růst buněk se týká růst buněk, který je závislý na normálních regulačních mechanismech (např. ztrátě kontaktní inhibice). Toto zahrnuje abnormální růst:

(1) nádorových buněk (nádorů), které se vyznačují aktivovaným Ras onkogenem (2) nádorových buněk, ve kterých je Ras protein aktivován jako výsledek onkogenní mutace jiného genu (3) benigní a maligní buňky jiných proliferativních onemocnění, ve kterých se nenormální aktivace Ras vyskytuje.

Tento vynález se také týká způsobu inhibice růstu nádoru podáváním účinného množství tricyklické sloučeniny, která je zde popsána, savcům (např. lidem), kteří takovou léčbu potřebují. Zejména tento vynález poskytuje způsob inhibice růstu národů, které se vyznačují aktivovaným Ras onkogenem, podáváním účinného množství výše popsaných sloučenin. Příklady národů, které lze inhibovat zahrnují, ale nevymezují: rakovinu plic (např. adenokarcinom plic), rakovinu pankreatu (např. karcinom pankreatu jako je exokrinní karcinom pankreatu), rakovinu tračníku (kolorektální karcinomy jako je např. adenokarcinom tračníku a adenom tračníku), myeloidní leukemie (například akutní myelogenní leukémii (AML)), thyroidní karcinom folikula, myelodysplastický syndrom (MDS), karcinom močového měchýře, epidermální karcinom, rakovinu prsu a prostaty.

Tento vynález také poskytuje způsob pro inhibici proliferativních onemocnění, jak benigních, tak maligních, kde jsou Ras proteiny nenormálně aktivovány jako výsledek onkogenní mutace jiných genů- tj. Ras protein sám není aktivován mutací na onkogenní formu. Tato inhibice je prováděna podáváním účinného množství tricyklických sloučenin, které jsou zde popsány, savcům (např. lidem), kteří takovou léčbu potřebují. Například benigní proliferativní onemocnění n eurofibromatosa, nebo nádor, ve kterém je Ras aktivován kvůli mutaci nebo přeznačení onkogeny tyrasin kinasy (např. neu, src, abl, lek, a fyn) lze inhibovat tricyklickými sloučeninami, které jsou zde popsány.

Sloučeniny z tohoto vynálezu inhibují famesyl protein transferázu a famesylaci onkogenního proteinu Ras. Tento vynález dále poskytuje způsob inhibování Ras famesyl protein transferázy u savců, zvláště u lidí, podáváním účinného množství tricyklických sloučenin, které jsou popsán výše. Podávání sloučenin z tohoto vynálezu pacientům aby se inhibovala famesyl protein transferáza, je užitečné v léčbě nádorů, které jsou popsané výše.

Tricyklické sloučeniny z tohoto vynálezu se používají ve způsobech z tohoto vynálezu, které inhibují abnormální růst buněk. Bez podložení teorie se uvažuje, že tyto sloučeniny mohou fungovat přes inhibici g-proteinové funkce, jak je ras p21, tím že blokují isoprenylaci g-proteinu. Proto jsou užitečné při léčbě proliferativních onemocnění jako je růst nádoru nebo rakovina. Bez podložení teorie se uvažuje, že tyto sloučeniny inhibují ras famesyl protein transferázu a právě proto vykazují antiproliferativní aktivitu proti buňkám transformovaných ras.

Příklady provedení vynálezu

Následující termíny, které jsou zde použity, jsou definovány níže, jestliže není jinak uvedeno.

M⁺ odpovídá molekulárnímu iontu molekuly v hmotovém spektru.

MH* představuje molekulární ion plus atom vodíku v hmotovém spektru.

-8CZ 292791 B6

Pyridyl N-oxidy jsou zde reprezentovány skupinou

Následující rozpouštědla a činidla jsou zde uvedena podle dále uvedenými zkratkami: tetrahydrofuran (THF), ethanol (EtOH), methanol (MeOH), kyselina octová (HOAC nebo AcOH), ethylacetát (EtOAc), Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), kyselina trifluoroctová (TFA), anhydrid kyseliny trifluoroctové (TFAA), 1-hydroxybenzotriazol (HOBT), kyselina m-chlorperbenzoová (MCPBA), triethylamin (Et₃N), diethylether (Et₂O), chlormravenčan ethylnatý (ClCO₂Et), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl karbodiimidu (DEC), diisobutylaluminium hydrid (DIBAL), isopropyl alkohol (iPrOH), dimethylsulfoxid (DMSO).

Určité sloučeniny z tohoto vynálezu existují v rozdílných izomemích formách (tj. jako enantiomery nebo diastereomery), které zahrnují atropoizomery (tj. sloučeniny, kde 7-členný kruh je ve fixní konformaci tak, že uhlíkový atom v poloze 11 je umístěn nad a nebo pod rovinu připojených benzenových kruhů kvůli přítomnosti brom substituentu v poloze 10). Vynález uvažuje všechny takové izomery, jak v čisté formě, tak ve směsích, které zahrnují i racemické směsi.

Určité bazické tricyklické sloučeniny tvoří také farmaceuticky přijatelné soli, např. soli s kyselinami. Například pyrido-dusíkové atomy mohou tvořit sole se silnými kyselinami. Příklady vhodných kyselin pro tvorbu solí jsou kyseliny chlorovodíková, sírová, fosforečná, octová, citrónová, šťavelová, malonová, salicylová, jablečná, fumarová, jantarová, askorbová, maleinová, methansulfonová a další minerální a karboxylové kyseliny, které jsou v tomto oboru známé. Soli se připravují běžným způsobem smísením sloučeniny ve formě volné báze s dostatečným množstvím požadované kyseliny, tak aby vznikla sůl. Volná báze může být opět uvolněna ze soli působením vhodného zředěného vodného roztoku alkálie jako je zředěný vodný roztok hydroxidu sodného, uhličitanu draselného, hydroxidu amonného, hydrogenuhličitanu sodného. Formy volné báze se liší od odpovídajících soli v určitých fyzikálních vlastnostech jako je rozpustnost v polárních rozpouštědlech. Ale kyselé i zásadité soli jsou ekvivalentní s odpovídajícími formami volné báze pro účely tohoto vynálezu.

Všechny tyto sole jsou uvažovány, že jsou farmaceuticky přijatelné v rozsahu tohoto vynálezu a všechny jsou považovány za ekvivalentní k odpovídajícím formám volné báze sloučenin pro účely tohoto vynálezu.

Sloučeniny z tohoto vynálezu se připravují způsoby popsanými níže.

Sloučenina z příkladu 10 je získána v krystalickém stavu. Odborník se uvědomí, že sloučeniny, které se získají v amorfním stavu se mohou převést do stavu krystalického dobře známými způsoby krystalizace amorfních materiálů z rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel jako je aceton, diethylether, ethylacetát, ethanol, 2-propanol, terc.butylether, voda a tak podobně.

Odborník si uvědomí, že racemická směs sloučeniny VII.OA se připraví podle způsobu popsaného níže. Například meziprodukt z preparativního příkladu 6 se využije pro přípravu sloučeniny VII.OA.

-9CZ 292791 B6

Preparativní příklad 1

(PI)

Krok A:

·>

g (60,5 mmol) ethyl 4-pyridylacetátu (PI) se smísí se 120ml suchého CH2CI2 při -20 °C, přidá se 10,45 g (60,5 mmol) MCPBA a míchá se při -20 °C 1 hodinu a pak při 25 °C 67 hodin. Pak se přidá dalších 3,48 g, (20,2 mmol) MCPBA a míchá se 24 hodin při 25 °C. Reakční směs se zředí CH2CI2 a promyje se nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ a vodou. Suší se MgSO₄, zkoncentruje se ve vakuu do sucha a odparek se chromatografuje (silikagel 2%-5,5%, (10% NH4OH v MeOH/CH₂Cl₂) a získá se 8,12 g produktu PIA. Hmotové spektrum MI1⁺ =182,15.

KrokB:

Smíchá se 3,5 g (19,3 mmol) produktu z kroku A (PIA), 17,5 ml EtOH a 96,6 ml 10% NaOH (vodného) a směs se zahřívá při 67 °C 2 hodiny. pH se upraví 2N HC1 (vodnou) na 2,37 a reakční směs se zkoncentruje ve vakuu do sucha. Přidá se 200ml suchého EtOH, zfiltruje se přes celit, filtrační koláč se promyje suchým EtOH (2x50 ml). Spojené filtráty se zkoncentrují ve vakuu a poskytnou 2,43 g požadované sloučeniny (PI).

Preparativní příklad 2

O (CHgJgC-O

(PII)

Požadovaná sloučenina PII se připravuje způsobem popsaným v PCT mezinárodní přihlášce č. WO95/10516.

-10CZ 292791 B6

Preparativní příklad 3

H (PIU)

Krok A:

i

CO₂Et

14,95 g (39 mmol) 8-chlor-ll-(l-ethoxykarbonyl-4—piperidinyl)-llH-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridinu (III) se smísí se 150 ml CH₂C1₂, pak se přidá 13,07 g (42,9 mmol) (nBu)₄NNO₃ a směs se ochladí na 0°C. Pomalu po kapkách se během 1,5 hodiny přidá roztok 6,09 ml (42,9 mmol) TFAA v 20 ml CH₂C1₂. Směs se udržuje při 0 °C přes noc, pak se opatrně promyje nasyceným vodným roztokem NaHCO₃, vodou a solankou. Organická fáze se suší Na₂SO₄, 10 zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, EtOAc/hexan, gradient) poskytne dva produkty, 4,32 g sloučeniny IIIA(i) a 1,90 g sloučeniny IIIA(ii).

Hmotové spektrum pro sloučeninu IIIA(i) MH⁺ = 428,2

IIIA(ii) MH= 428,3.

-11 CZ 292791 B6

Krok B:

IIl.A(i) III.B

22,0 g (51,4 mmol) produktu IIIA(i) z kroku A se smísí se 150 ml 85% vodného EtOH, 25,85 g (0,463 mol) práškového železa a 2,42 g (21,8 mmol) CaCl₂ a zahřívá se k refluxu přes noc. Přidá se 12,4 g (0,222 mol) práškového železa a 1,2 g (10,8 mml) CaCl₂ a reakční směs se zahřívá k refluxu ještě 2 hodiny. Horká reakční směs se zfíltruje přes Celit, celit se promyje 50 ml horkého EtOH a filtrát se zkoncentruje ve vakuu do sucha. Přidá se 100 ml bezvodého EtOH, zkoncentruje se do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, MeOH/CH₂Cl₂, gradient) poskytne 16,47 g produktu (Illb).

Mřf = 398.

Krok C:

CO₂Et

16,47 g (41,4 mmol) produktu z kroku B (ΠΙΒ) se smísí se 150ml 4% HBr (vodného) a ochladí na -3 °C. Pomalu se přidá (po kapkách) 18 ml bromu, pak se pomalu (po kapkách) přidá roztok 8,55 g (0,124 mol) NaNO₂ v 85 ml vody. Reakční směs se míchá 45 minut při teplotě od -3 °C do 0 °C, pak se upraví pH na hodnotu 10 přídavkem 50% vodného roztoku NaOH. Extrahuje se EtOAc, extrakty se promyjí solankou a suší se Na₂SO₄. Zkoncentruje se do sucha a chromatografuje (silikagel, EtOAc/hexan, gradient). Získají se dva produkty, 10,6g sloučeniny IIIC(i) a 3,28 g sloučeniny IIIC(ii).

-12CZ 292791 B6

Hmotová spektra pro sloučeninu

IIIC(i) MH⁺ = 461,2

IIIC(ii) MH¹ = 539.

Krok D:

Produkt niC(i) z kroku C se hydrolyzuje rozpouštěním v koncentrované HC1 a zahříváním na teplotu 100 °C po dobu 16 hodin. Směs se ochladí, pak se zneutralizuje 1M vodným roztokem NaOH. Směs se extrahuje CH₂C1₂, extrakty se suší MgSO₄, zfíltrují se a zkoncentrují ve vakuu na ío požadovanou sloučeninu (PIU).

Hmotové spektrum: MH⁺ = 466,9.

Preparativní příklad 4

(PIV>

(PIVA)

- 13CZ 292791 B6

25,86 g (55,9 mmol) ethylesteru 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l lHbenzo-1 lHbenzo[5,6Jcyklohepta[l,2]pyridin-l l-yliden)-l-piperidin-l-karboxylové kyseliny (IV) se smísí s 250 ml koncentrované H₂SO₄ při -5 °C, pak se přidá 4,8 g (56,4 mmol) NaNO₃ a míchá se 2 hodiny. Směs se nalije na 600 g ledu a zalkalizuje koncentrovaným vodným roztokem NH₄OH. Směs se zflltruje, promyje 300 ml vody, pak se extrahuje 500 ml CH₂C1₂. Extrakt se promyje 200 ml vody, suší se MgSO₄, pak se zflltruje a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 10%N EtOAc/CH₂Cl₂) poskytne 24,4 g (86 %) produktu (PIVA).

t.t. = 165 až 167 °C

Hmotové spektrum ΜΙ-Γ = 506 (Cl)

Elementární analýza: vypočteno: C 52,13, H 4,17, N 8,29 nalezeno: C 52,18, H 4,51, N 8,16

KrokB:

g (40,5 mol) produktu z kroku A (PVIA) a 200 ml koncentrované H₂SO₄ se smísí při 20 °C. Pak se směs ochladí na 0 °C. Do směsi se přidá 7,12 g (24,89 mmol) l,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoinu a míchá se 3 hodiny při 20 °C. Reakční směs se ochladí na 0 °C a přidá se další 1,0 g (3,5 mol) dibromhydantoinu a míchá se při 20 °C 2 hodiny. Smě se nalije na 400 g ledu, zalkalizuje se koncentrovaným vodným roztokem NH|OH při 0 °C. Výsledná pevná látka se spojí filtrací. Pevná látka se promyje 300 ml vody, rozmíchá se ve 200 ml acetonu na kaši a zflltruje se. Získá se 19,79 g (85,6%) produktu (PIVB).

t.t. = 236 až 237 °C

Hmotové spektrum ΜΙ-Γ = 584 (Cl)

Elementární analýza: vypočteno: C 45,11, H 3,44, N 7,17 nalezeno: C 44,95, H 3,57, N 7,16

-14CZ 292791 B6

Krok C:

g (447 mmol) železných pilin se smísí s 10 g (90mol) CaCl₂ a suspenzí 20 g (34,19 mmol) produktu z kroku B (PIVB) v 700 ml 90:10 EtOH/voda při 50 °C. Směs se zahřívá k refluxu přes noc, zfiltruje se přes celit, filtrační kláč se promyje 2x 200 ml horkého EtOH. Filtráty a proplachy se spojí a koncentrují ve vakuu do sucha. Odparek se extrahuje 600 ml CH₂C1₂, promyje 300 ml vody a suší se MgSO₄. Zfiltruje se a zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Pak se chromatografuje (silikagel, 30% EtOAc/CH₂Cl₂) a získá se 11,4 g (60%) produktu (PIVC).

t.t. = 211 až 212 °C

Hmot, spek.: Mřf = 554 (Cl)

Elementární analýza:

vypočteno: C 47,55, H 3,99, N 7,56 nalezeno: C 47,45, H 4,31, N 7,49.

KrokD:

Pomalu (po částech) se přidá při -10 °C 20 g (35,9 mmol) produktu z kroku C (PIVC) do roztoku 8 g (116 mmol) NaNO₂ ve 120 ml koncentrované vodné HC1. Výsledná směs se míchá při 0 °C po 2 hodiny. Pak se pomalu (po kapkách) při 0 °C přidává 150 ml (1,44 mol) 50% H3PO₂ po dobu 1 hodiny. Míchá se při 0 °C 3 hodiny, pak se nalije na 600 g ledu a zalkalizuje se koncentrovaným vodným NH₄OII. Extrahuje se 2x300 ml CH₂C1, extrakt se suší MgSO₄. Zfíltrují se a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 25% EtOAc/hexan) poskytne 13,67 g (70%) produktu (PIVD).

-15CZ 292791 B6

t.t. 163 až 165 °C

Hmot, spek.: MH⁺ = 539 (Cl)

Elementární analýza: vypočteno: C 48,97, H 4,05, N 5,22 nalezeno: C 48,86, H 3,91, N 5,18

Krok E:

6,8 g (12,59 mmol) produktu z kroku D (PIVD) se smísí se 100 ml koncentrované vodné HC1 a míchá při 85 °C přes noc. Směs se ochladí a nalije na 300 g ledu, zalkalizuje se koncentrovaným vodným roztokem NH4OH. Extrahuje se 2 x 300 ml CH2CI2, extrakty se pak suší MgSC>4. Zfiltrují se, zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 10%MeOH/EtOAc + 2% NH4OH(vodný)) poskytne 5,4 g (92%) požadované sloučeniny (PIV).

t.t= 172 až 174 °C

Hmot. spek. MlT = 467

Elementární analýza: vypočteno: C 48,69, H 3,65, N 5,97 nalezeno: C 48,83, H 3,80, N 5,97

Preparativní příklad 5

(PV>

-16CZ 292791 B6

Krok A:

2,42 g ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l lH-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin-1 l-yliden)-l-piperidinkarboxylové se hydrolyzuje stejným způsobem, který je popsaný v preparativním příkladu 3, krok D a poskytne 1,39 g (69%) produktu (PVA).

ΜΡΓ = 389.

KrokB:

g (2,48 mmol) produktu z kroku A (PVA) se smíchá s 25 ml suchého toluenu, přidá se 2,5 ml 1 M DIBAL v toluenu a směs se zahřeje krefluxu. Po 0,5 hodině se přidá dalších 2,5 ml 1M DIBAL v toluenu a zahřívá se k refluxu 1 hodinu. (Reakce je sledována TLC za použití 50% MeOH/CH₂Cl₂ + NH4OH (vodný).) Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, přidá se 50 ml IN HC1 (vodný) a míchá se 5 minut. Přidá se 100 ml IN NaOH (vodný) a pak se extrahuje EtOAc (3 x 150 ml). Extrakty se suší MgSO₄, zfiltrují se a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Získá se 1,1 g požadované sloučeniny (PV).

MH⁺ = 391.

-17CZ 292791 B6

Preventivní příklad 6

(PVI)

Krok A:

PVIA

16,6 g (0,03 mol) produktu z preparativního příkladu 4, krok D (PIVD) se smísí s 3:1 roztokem CH₃CN a vody (212,65 ml CH₃CN a 70,8 ml vody) a výsledná kaše se míchá přes noc při teplotě místnosti. Přidá se 32,833 g (0,153 mol) NaIO₄ a pak 0,31 g (2,30 mmol) RuO₂ a pak se míchá při teplotě místnosti (přídavek RuO₂ je spojen s exotermní reakcí, teplota směsi vzroste z 20 °C na 30 °C). Směs se míchá 1,3 hodiny (teplota klesne zpět na 25 °C během 30 minut). Reakční směs se zfiltruje, aby se odstranila pevná fáze. Pevná fáze se promyje CH₂C1₂. Filtrát se zkoncentruje ve vakuu do sucha a odparek se rozpustí v CH₂C1₂. Zfiltruje se, aby se odstranily nerozpuštěné částice, které se promyjí CH₂C1₂. Filtrát se promyje vodou, zkoncentruje na objem 200 ml a promyje bělidlem a pak vodou. Extrahuje se 6N HC1 (vodnou). Vodný podíl se ochladí na 0 °C a pomalu se přidává 50% vodný roztok NaOH, kterým se upraví pH = 4. Teplota při předávání se udržuje pod 30 °C. Pak se 2 x extrahuje CH₂C1₂, extrakty se suší MgSO₄ a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Odparek se rozmíchá na kaši v 20 ml EtOH a ochladí na 0 °C. Výsledná pevná látka, která se spojí na filtru, se suší ve vakuu. Získá se 7,95 g produktu (PVIA).

*H NMR (CDClj, 200 Mhz): 8,7 (s, 1H), 7,85 (m, 6H), 7,5 (d, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H).

KrokB:

-18CZ 292791 B6

21,58 g (53,75 mmol) produktu z kroku A (PVIA) se smíchá s 500 ml bezvodé 1:1 směsi EtOH a toluenu, přidá se 1,43 g (37,8 mmol) NaBH₄ a směs se zahřívá k refluxu 10 min. Směs se ochladí na 0 °C, přidá se 100 ml vody a pH se upraví na 4-5 1M HC1 (vodnou), zatímco se teplota udržuje pod 10 °C. Přidá se 250 ml EtOAc a vrstvy se oddělí. Organická vrstva se promyje solankou (3 x 50 ml), pak se suší Na₂SO₄. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha (24,01 g). Chromatografie odparku (silikagel, 30% hexan/CH₂Cl₂) poskytne produkt. Čisté frakce byly čištěny opakovanou chromatografií. Celkově bylo získáno 18,57 g produktu (PVIB).

’HNMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,5 (s. 1H), 7,9 (s, 1H), 7,5 (dd, 2H), 6,2 (s, 1H), 6,1 (s, 1H), 3,5 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,2 (m, 2H).

Krok C:

PIVB

PVI

18,57 g (46,01 mmol) produktu z kroku B (PVIB) se smísí s 500 ml CHCI3, pak se přidá 6,70 ml (91,2 mmol) SOC1₂ a směs se míchá při teplotě místnosti 4 hodiny. Během 5 minut se přidá roztok 35,6 g (0,413 mol) piperazinu v 800 ml THF a reakční směs se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. Směs se zahřívá k refluxu přes noc, pak se ochladí na teplotu místnosti a zředí se 1000 ml CH₂C1₂. Roztok se promyje vodou (5 x 200 ml), vodný podíl se extrahuje CHCI3 (3 x 100 ml). Všechny organické podíly se spojí a promyjí solankou (3 x 200 ml) a suší se MgSO4. Ve vakuu se zkoncentrují do sucha a chromatografie (silikagel, gradient 5%, 7,5% a 10% MeOH/CH₂Cl₂ + NH4OH) poskytne 18,49g požadované sloučeniny (PVI), což je racemická směs.

Krok D - dlení enantiomerů:

-19CZ 292791 B6

Racemická směs sloučeniny z kroku C (PVI) je dělena chirální chromatografíí (Chiralpack AD, kolona 5 cm x 50 cm, průtok 100 ml/min, 20% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Bylo získáno 9,14 g (+) enantiomeru a 9,30 g (-)-enantiomeru.

Fyzikální data pro (+)-enantiomer:

t.t. = 74,5 až 77,5 °C hmotn. spek. MH* = 471,9, [a]_D ²⁵ = +97,4° (8,32 mg/2ml MeOH).

Fyzikální data pro (-)-enantiomer:

t.t. = 82,9 až 84,5 °C hmot. spek. MFT = 471,8, [a]_D ²⁵ = -97,4° (8,32 mg/2 ml MeOH).

Preparativní příklad 7

Krok A:

g (38,5 mmol) ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-llH-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin-ll-yliden)-l-piperidin-l-karboxylové (VII) se smísí se 150 ml koncentrované H2SO4 při -5 °C, pak se přidá 3,89 g (38,5 mmol) KNO₃ a míchá se 4 hodiny. Reakční směs se nalije na 3000 ml ledu a zaíkalizuje 50% vodným roztokem NaOH. Extrahuje se CH₂C1₂ a suší MgSO₄. Pak se zfiltruje a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Odparek se rekrystalizuje z acetonu a získá se 6,69 g produktu (PVHA).

’HNMR (CDCI3, 200 MHz): 8,5 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,6 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 4,15 (q, 2H), 3,8 (m, 2H), 3,5-3,1 (m, 4H), 3,0-2,8 (m, 2H), 2,6-2,2 (m, 4H), 1,25 (t, 3H). ΜΗ* = 506.

-20CZ 292791 B6

KrokB:

PVIIA PVIIB

6,69 g (13,1 mmol) produktu z kroku A (PVIIA) se smísí s 100 ml 85% EtOH/voda, pak se přidá 0,66 g (5,9 mmol) CaCl₂ a 6,56 g (117,9 mmol) železa a reakční směs se zahřívá k refluxu přes noc. Horká reakční směs se zfiltruje přes Celit a filtrační koláč se propláchne horkým EtOH. Filtrát se zkoncentruje ve vakuu a získá se 7,72 g produktu (PVIIB).

Hmot. spek. Mlf = 476,0.

KrokC:

7,70 g produktu z kroku B (PVIIB) se smísí s 35 ml HOAc, pak se přidá 45 ml roztoku bromu v AcOH a reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Přidá se 300 ml 1N vodného roztoku NaOH. Pak 75 ml 50% vodného roztoku NaOH a extrahuje se EtOAc. Extrakty se vysuší MgSO₄ a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 20-30% EtOAc/hexan) poskytne 3,47 g produktu (PVIIC) spolu s dalšími 1,28 g částečně vyčištěného produktu).

Hmot. spek. MH⁺ = 554 'H NMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,5 (s, 1H), 7,5 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 4,5 (s, 2H), 4,15 (m, 3H), 3,8 (br s, 2H), 3,4-3,1 (m, 4H), 9-2,75 (m, 1H), 2,7-2,5 (m, 2H), 2,4-2,2 (m, 2H), 1,25 (m, 3H).

-21 CZ 292791 B6

Krok D:

Směs 0,557 g (5,4 mmol) t-butylnitritu a 3 ml DMF se zahřeje na 60 až 70 °C. Pomalu po kapkách se přidá směs 2,00 g (3,6 mmol) produktu z kroku C (PVIIC) a 4 ml DMF. Pak se reakční směs ochladí na teplotu místnosti. Přidá se dalších 0,64 ml t-butylnitritu při 40 °C a reakční směs se znovu zahřeje na 60 až 70 °C na 0,5 hodiny. Pak se směs ochladí na teplotu místnosti a nalije se do 150 ml vody. Extrahuje se CH2CI2, extrakt se suší MgSO₄ a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografíe odparku (silikagel, 10-20% EtOAc/hexan) poskytne 0,74 g produktu (PVIID).

Hmot. spek. MH⁺ = 539,0 ’H NMR (CDClj, 200 MHz): 8,52 (s, 1H), 7,5 (d, 2H),7,2 (s, 1H), 4,15 (q, 2H), 3,9-3,7 (m, 2H), 3,5-3,1 (m, 4H), 3,0-2,5 (m, 2H), 2,4-2,2 (m, 2H), 2,1-1,9 (m, 2H), 1,26 (t, 3H).

Krok E:

PVIID PVH.

Směs 0,70 g (1,4 mmol) produktu z kroku D (PVHD) a 8 ml koncentrované HC1 (vodné) se zahřívá k refluxu přes noc. Přidá se 30 ml IN vodného NaOH, pak 5 ml 50% vodného NaOH a extrahuje se CH₂C1₂. Extrakt se suší MgSO₄ a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 0,59 g požadované sloučeniny (PVII).

Hmot. spek. MlT = 467, t.t. = 123,9 až 124,2 °C.

-22CZ 292791 B6

Preparativní příklad 8

Připraví se roztok 8,1 g sloučeniny z preparativního příkladu 7 (PVII) v toluenu a přidá se

17,3 ml 1M roztoku DIBAL v toluenu. Reakční směs se zahřeje k refluxu a pomalu (po kapkách) se přidá dalších 21 ml 1M DIBAL/toluen roztoku během 40 minut. Reakční směs se ochladí na 0 °C a přidá se 700 ml 1M HC1 (vodné). Organické fáze se oddělí a odstraní. Vodná fáze se promyje CH₂C1₂, extrakt se odstraní a vodná fáze se zalkalizuje přídavkem 50% vodného roztoku 10 NaOH. Vodná fáze se pak extrahuje CH₂C1₂, extrakt se vysuší MgSO₄ a zkoncentruje ve vakuu.

Získá se 7,30 g požadované sloučeniny (PVIII), což je racemická směs enantiomerů.

MíT = 469.

Krok B: Dělení enantiomerů

-23CZ 292791 B6

Racemická sloučenina z kroku A (PVIII) je dělena chirální chromatografií (Chiralpack AD, kolona 5 cm x 50 cm za použití 20% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Získá se (+)-enantiomer a (-)-enantiomer požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer:

t.t. = 148,8 °C, hmotn. spek. MH~ = 469 [a]_D ²⁵ = +65,6 (12,93 mg/2ml MeOH).

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer:

t.t. = 112 °C, hmot. spek. MH⁺ = 469 [a]_D ²⁵ =-65,2 (3,65 mg/2ml MeOH).

Preparativní příklad 9

Krok A:

40,0 g (0,124 mol) výchozího ketonu (IX) se smíchá s 200 ml H2SO4 a ochladí na 0 °C. Pomalu během 1,5 hodiny se přidá 13,78 g (0,136 mol) KNO₃. Pak se reakční směs zahřeje na teplotu místnosti a míchá se přes noc. Reakční směs se zpracovává za použití v podstatě stejného způsobu, který je popsán pro preparativní příklad 4, krok A. Chromatografie (silikagel, 20%, 30%, 40%, 50% EtOAc/hexan, pak 100% EtOAc) poskytne 28 g 9-nitroproduktu (PIXA) spolu s malým množstvím 7-nitroproduktu a 19 g směsi 7-nitro a 9-nitro sloučenin.

-24CZ 292791 B6

ΜΗ* (9-nitro) = 367.

Krok B:

Reakce 28 g (76,2 mmol) 9-nitroproduktu z kroku A (PIXA), 400 ml 85% EtOH/voda, 3,8 g (34,3 mmol) CaCl₂ a 38,28 g (0,65 mol) železa probíhá stejným způsobem, který je popsán v preparativním příkladu 4, krok C. Získá se 24 g produktu (PIXB).

MIT = 337.

Krok C:

PIXB PIXC

13g (38,5 mmol) produktu z kroku B (PIXB) se smísí se 140 ml AcOH a pak se pomalu během 20 minut přidá roztok 2,95 ml (57,8 mmol) bromu v 10 ml AcOH. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti, pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha, přidá se CH₂CI₂ a voda, pak se upraví pH na 8-9 50% vodným roztokem NaOH. Organická fáze se promyje vodou, pak solankou a suší se Na₂SO₄. Zkoncentruje se ve vakuu a poskytne 11,3 g produktu (PIXC).

’HNMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,73 (d, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,14 (s, 1H), 4,63 (s, 2H), 3,23-3,15 (m, 2H) a 3,07-2,98 (m, 2H).

Krok D:

100 ml koncentrované vodné HC1 se ochladí na 0 °C, pak se přidá 5,61 g (81,4 mmol) NaNO₂ a míchá se 10 minut. Pomalu (po částech) se přidá 11,3 g (27,1 mmol) produktu z kroku C (PIXC) a reakční směs se míchá 2,25 hodiny při 0 až 3 °C. Pomalu (po kapkách) se přidá 180 ml

-25CZ 292791 B6

50% HjPO, (vodné) a reakční směs se ponechá stát při 0 °C přes noc. Pak se pomalu během 30 minut (po kapkách) přidá 150 ml 50% NaOH, aby se pH upravilo na 9. Pak se reakční směs extrahuje CH₂C1₂. Extrakt se promyje vodou, pak solankou a suší se Na₂SO₄. Zkoncentruje se ve vaku do sucha a chromatografie odparku (silikagel, 2% EtOAc/CH₂Cl₂) poskytne 8,6 g produktu (P1XD).

MÍT = 399,9.

‘H NMR (CDCIj, 200 MHz): 8,75 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,56 (d, 1H), 7,21 (d, 1H) a 3,3-3,0 (m,4H).

Krok E:

PIXD

8,6 g (21,4 mmol) produktu z kroku D (PIXD) se smíchá s 300 ml MeOH a ochladí na 0 °C až 2 °C. Přidá se 1,21 g (32,1 mmol) NaBH₄ a reakční směs se míchá při -0 °C 1 hodinu. Přidá se další 0,121 g (3,21 mmol) NaBH₄ a míchá se 2 hodiny při 0 °C. Pak se ještě ponechá stát při 0 ;C přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a pak se odparek rozdělí mezi CH₂C1₂ a vodu. Organická fáze se oddělí a zkoncentruje ve vakuu (50 °C) a získá se 8,2 g produktu (PIXE).

'H NMR (CDClj, 200 MHz): 8,44 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,17 (d, 1H), 6,56 (d, 1H), 4,17-4,0 (m, 1H), 7,39 (d, 1H), 3,46-3,3 (m, 1H), 3,05-2,74 (m, 2H).

Krok F:

PIXE PIX

8,2 g (20,3 mmol) produktu z kroku E (PIXE) se smíchá s 160 ml CH₂C1₂ a ochladí se na 0 °C. Pak se pomalu (po kapkách) během 30 minut přidá 14,8 ml (203 mmol) SOC1₂. Reakční směs se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se při této teplotě 4,5 hodiny. Pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha, přidá se CH₂C1₂. Promyje se 1 N NaOH (vodným), pak solankou a suší se Na₂SO₄. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha, pak se přidá suchý THF a 8,7 g (101 mmol) piperazinu a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha, přidá se CH₂C1₂. Promyje se s 0,25 N NaOH (vodným), vodou a pak solankou. Suší se Na₂SO₄ a zkoncentruje se

-26CZ 292791 B6 ve vakuu. Získá se 9,46 g surového produktu. Jeho chromatografie (silikagel, 5% MeOH/CH₂Cl₂ + NH₃) poskytne 3,59 g požadované sloučeniny (PIX) jako racemát.

’H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,43 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,11 (d, 1H), 5.31 (s, 1H), 4,86-4,65 (m, 1H), 3,57-3,40 (m, 1H), 2,98-2,55 (m, 6H), 2,45-2,20 (m, 5H).

MH⁺ = 470.

Krok G: Dělení enantiomerů

Racemická sloučenina z kroku F (PIX) (5,7 g) je dělena chromatografícky jak je popsáno v preparativním příkladu 6, krok D. Byl použit 30% iPrOH/hexan + 0,2% diethylenamin. Bylo získáno 2,88 g R-(+)-enantiomeru a 2,77 S-(-)-enantiomeru.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer:

Hmot.spek. MFT = 470, [a]_D ²⁵ = +12,1° (10,9 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer: Hmot. spek. MFF = 470, [a]_D ^2:> = -13,2° (11,51 mg/2mlMeOH).

Preparativní příklad 10

-27CZ 292791 B6

Krok A:

g (33,3 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 4, krok D se smíchá s 300 ml toluenu při 20 °C, pak se přidá 32,5 ml (32,5 mmol) 1M roztoku DIBAL v toluenu, Reakční směs se zahřívá k refluxu 1 hodinu. Ochladí se na 20 °C a přidá se dalších 32,5 ml 1M roztoku DIBAL a směs se opět zahřívá 1 hodinu k refluxu. Směs se ochladí na 20 °C a nalije do směsi 400 g ledu, 500 ml EtOAc a 300 ml 10% NaOH (vodného). Vodná vrstva se extrahuje CH₂C1₂ (3 x 200 ml), organické vrstvy se suší MgSOj, pak se MeOH, CH₂C1₂ + 4% NHjOH) poskytne 10,4 g požadované sloučeniny jako racemát (PX).

Hmot. spek. MH⁺ = 469 (FAB) částečně *H NMR (CDC1₃,400 MHz), 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 3,95 (d, 1H).

Krok B: Dělení enantiomerů

Racemická sloučenina z kroku A (PX) je dělena preparativní chirální chromatografíí (Chiralpack AD, kolona 5 cm x 50 cm za použití 5% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Získá se (+)-enantiomer a (-)-enantiomer požadované sloučeniny.

-28CZ 292791 B6

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer:

Hmot. spek. MH = 469 (FABS), [a]_D ²⁵ = +43,5° (c =0,402, EtOH), částečně ‘H NMR (CDC1₃, 400 MHz), 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 3,95 (d, 1H).

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer:

Hmotn. spek. MH* = 469 (FABS), [a]_D ²⁵= -41,8° (c=0,328, EtOH) částečně ’H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 3,95 (d, 1H).

Preparativní příklad 11

H

PXI

Ethylester kyseliny

4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l 1 H-benzo[5,6]cyklohepta[ 1,2-b]-pyridin-l 1 —yl iden)—1— piperidin-l-karboxylové reaguje stejným způsobem jako je popsáno v preparativním příkladu 6, kroky A-D. Získá se produkt jako v kroku C PXI), což je racemát a dále se získají jako produkty v kroku D R-(+)-enantiomer a S-(-)-enantiomer požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+}-enantiomer:

¹³C NMR (CDC1₃): 155,8 (C), 146,4 (CH), 140,5 (CH), 140,2 (C), 136,2 (C), 135,3 (C), 133,4 (C), 132,0(CH), 129,9(CH), 125,6 (CH), 119,3 (C), 79,1 (CH), 52,3 (CH₂), 52,3 (CH₂), 45,6 (CH₂), 45,6 (CH₂), 30,0 (CH₂), 29,8 (CH₂).

[a]_D ²⁵= + 25,8° (8,46 mg/2ml MeOH).

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer:

¹³C NMR (CDC1₃): 155,9 (C), 146,4 (CH), 140,5 (CH), 140,2 (C), 136,2 (C), 135,3 (C), 133.3 (C), 132,0 (CH), 129,9 (CH), 125,5 (CH), 119,2 (C), 70,1 (CH), 52,5 (CH₂), 52,5(CH₂), 45,7 (CH₂), 45,7 (CH₂), 30,0 (CH₂), 29,8 (CH₂).

[a]_D ²⁵ = -27,9° (8,90 mg/2ml MeOH).

-29CZ 292791 B6

Příklad 1

Krok A:

1,160 g (2,98 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 3 (PIU) se rozpustí v 20 ml DMF, míchá se za teploty místnosti. Pak se přidá 0,3914 g (3,87 mmol) 4-methylmorfolinu, 0,7418 g (3,87 mmol) DEC, 0,5229 g (3,87 mmol) HOBT a 0,8795 g (3,87 mmol) 1-N-t-butoxykarbonyl-piperidinyl-4-octové kyseliny. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 2 dny. Pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha a odparek se rozdělí mezi CH2CI2 a vodu. Organická fáze se 10 opatrně promyje nasyceným vodným roztokem NaHCO₃, 10% vodným NaF^POí a solankou.

Suší se MgSO₄, zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 2% meOH/CH₂C12 + NH₃) poskytne 1,72 g produktu (IA).

t.t. = 94,0-94,5 °C, hmot. spek. MFT = 614

Elementární analýza: vypočteno: C 60,54, H 6,06, N 6,83 nalezeno : C 59,93, H 6,62, N 7,45

-30CZ 292791 B6

ΙΑ

IB

1,67 g (2,7 mmol) produktu z kroku A (IA) se smíchá s 20 ml CH2CI2 a míchá při 0 °C. Přidá se TFA, směs se míchá 2 hodiny. Pak se reakční směs zalkalizuje IN NaOH (vodným). Extrahuje se CH2CI2. Organická fáze se suší MgSO₄, zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 1,16 g produktu (IB).

t.t. = 140,2 až 140,8 °C, hmot. spek. ΜΙ-Γ = 514.

Krok C:

IB I

0,5 g produktu z kroku B (IB) se smíchá s 20 ml CH2CI2 a 4,5 ekvivalenty (CH₃)₃SiNCO a míchá se při teplotě místnosti 3 hodiny. Reakční směs se extrahuje nasyceným vodným NaHCO₃ a organická fáze se suší MgSO₄. Zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 0,8 g surového produktu. Chromatografie surového produktu (silikagel, 5% MeOH/CH₂C12 + NH₃) poskytne 0,26 g produktu (I).

t.t. = 170,2 až 170,5 °C, hmotn. spek. MFT = 557.

-31 CZ 292791 B6

Příklad 2

PIV II

0,5 g (1,06 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 4 (PIV) se smíchá při 0 °C s 0,4 g (2,61 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI), 5 ml suchého DMF a 0,5 ml (4,53 mmol) 4-methylmorfolinu. Pak se přidá 0,6 g (3,12 mmol) DEC a 0,4 g (2,96 mmol) HOBT a reakční směs se míchá při 20 °C přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a odparek se extrahuje CH₂CI₂ (2 x 50 ml). Extrakty se promyjí 25 ml vody, suší MgSO₄, pak se zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografíe odparku (silikagel, 10%MeOH/EtOAc + 2% NH₄OH (vodný)) poskytne 0,6 g (93,7%) požadované sloučeniny (II).

Hmot. spek.MH* = 602 (FABS) částečné *H NMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,48 (s, 1H), 8,16 (d, 2H), 7,61 (s, 1H), 7,29 (m, 1H), 7,18 (d,2H),7,04(d, 1H), 3,71 (s, 2H).

Elementární analýza: vypočteno: C 48,81, H 4,10, N 6,57

Nalezeno: C 49,10, H 3,79, N 6,74

Příklad 3

5,9 (9,78 mmol) sloučeniny z příkladu 2 (Π) se rozpustí v 300 ml 1:5 CH₂Cl₂/EtOAc při 0 °C. Pomalu se přidá (po kapkách) 3 ml 4N HC1 (vodné) a reakční směs se míchá při 0 °C 5 min. Přidá se 200 ml Et₂O, výsledná pevná látka se spojí filtrací a pevná látka se promyje 50 ml Et₂O.

-32CZ 292791 B6

Pevná látka se pak suší při teplotě 20 °C a tlak 27 Pa (0,2 mm Hg) a získá se 5,9 g (96 %) požadované sloučeniny (III).

Hmot. spek. MH = 602 (FAB) částečné ’HNMR (DMSO-d₆, 300 MHz), 8,66 (d, 2H), 8,51 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,67 (d, 2H), 7,47 (m, 1H), 7,15 (m, 1H), 3,99 (s, 2H).

Elementární analýza:

vypočteno: C 48,77, H 3,62, N 6,56 Nalezeno: C 48,34, H 3,95, N 6,84.

Příklad 4

0,501 g (1,28 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 5 (PV) se smíchá s 20 ml suchého DMF, pak se přidá 0,405 g (1,664 mmol) l-N-t-butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové kyseliny, 0,319 g (1,664 mmol) DEC, 0,225 g (1,664 mmol) HOBT a 0,168 g (1,664 mmol) 4-methylmorfolinu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Odparek se rozdělí mezi 150 ml ΟΗ₂Ο1₂ a 150 ml nasyceného roztoku NaHCO₃ (vodného). Vodná fáze se extrahuje dalšími 150 ml CH2CI2. Organická fáze se suší MgSO₄ a zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 500 ml hexanu, 1000 ml 1% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,1% NH₄OH (vodný)) poskytne 0,575 g produktu (IVA).

t.t = 115 až 125 °C, hmotn. spek. MH* = 616.

-33CZ 292791 B6

Krok B:

IVA IVB

0,555 g (0,9 mmol) produktu z kroku A (IVA) se smíchá s 15 ml CH₂C1₂ a směs se ochladí na 0 °C. Přidá se 15 ml TFA a míchá se při 0 °C 2 hodiny. Reakční směs se při 40 až 45 °C zkoncentruje ve vakuu do sucha, pak se odparek rozdělí mezi 150 ml CH₂C1₂ a 100 ml nasyceného vodného NaHCO₃. Vodná fáze se extrahuje 100 ml CH₂C1₂. Spojené extrakty se suší MgSO₄. Zkoncentrují se ve vakuu a získá se 0,47 g produktu (IVB).

t.t. = 140 až 150 °C, hmot. spek. MFT = 516

KrokC:

IVB IV

0,449 g (0,87 mmol) produktu z kroku B (IVB) se smíchá s 20 ml CH₂C1₂ a 0,501 g (0,59 mmol) (CH₃)₃SiNCO a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Pak se přidá 50 až 75 ml nasyceného vodného NaHCO₃ a míchá se 0,5 hodiny. Reakční směs se zředí CH₂C1₂, vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 2 x 100 ml CH₂C1₂. Spojené CH₂C1₂ extrakty se suší MgSO₄ a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 500 ml CH₂C1₂, 100 ml 1% MeOH/CH₂C1₂ + 0,1% ΝΗ,ΟΗ (vodný), 1000 ml 2% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,2% NH₄OH a nakonec 3% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,3% NH₄OH) poskytne 0,33 g požadované sloučeniny (IV).

t.t. = 145 až 155 °C, hmot. spek. MH⁺ = 559.

-34CZ 292791 B6

Příklad 5

3,0 g (6,36 mmol) (-)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 6, krok D se smíchá se 70 ml suchého DMF. Přidá se 3,84 ml (34,94 mmol) N-methylmorfolinu, 3,28 g, (17,11 mmol) DEC, 2,23 g (16,52 mmol) HOBT a 2,09 g (13,55 mmol) N-oxidu 4-pyridyloctové kyseliny z preparativního příkladu 1 (PI). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu, aby se odstranil DMF, přidá se 100 ml nasyceného vodného NaHCO₃ a 10 ml CH₂C1₂ a míchá se 15 minut. Reakční směs se extrahuje CH₂C1₂ (2 x 500 ml). Extrakty se suší MgSO₄ a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Odparek se chromatografuje (500 g reversní fáze Cl8 silica, gradient 75%, 80% a pak 85% MeOH/voda + 0,1% AcOH). Požadované frakce se zkoncentrují ve vakuu, aby se odstranil MeOH a přidá se 50 ml 1M NaOH (vodného). Míchá se 15 minut, pak se extrahuje CH₂C1₂ (2 x 500 ml). Extrakt se suší MgSO₄ a zkoncentruje se ve vakuu. Získá se 3,5 g požadované sloučeniny (V).

t.t. = 148,9 až 150,5 °C, hmotn. spek. MFT = 605 [a]_D ²⁵ = -56,37° (9,4 mg/2ml MeOH).

Sloučenina z příkladu 5 lze izolovat také jako hydrochlorid reakcí roztoku produktu (V) v HC1 a CH₂C1₂ při teplotě místnosti. Dále se reakční směs zkoncentruje ve vakuu a poskytne hydrochlorid.

[a]_D ²⁵ = -31,9° (4,80 mg/2 ml MeOH + 1 ml vody)

Při použití (+)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 6 se stejným způsobem, jako je popsaný výše pro příklad 5, připraví analogický (+)-enantiomer (příklad 5A), tj. enantiomer sloučeniny z příkladu 5.

t.t. = 149,0 až 150,5 °C, hmot. spek. MH = 605 [a]_d ²⁵ = +67,1° (7,0 mg/2ml MeOH).

Sloučenina z příkladu 5A lze izolovat jako hydrochlorid stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 5.

t.t. 152,9 °C.

[a]_D ²⁵ = +41,7° (2 ml MeOH + 1 ml vody).

-35CZ 292791 B6

Při použití racemické sloučeniny z preparativního příkladu 6, krok C (PVIC) se stejnou procedurou jako je popsána výše pro příklad 5 připraví racemát (Příklad 5B).

t.t. = 84,3 až 85,6 °C, hmot. spek. MH⁺ = 607

Příklad 6

Krok A:

3,21 g (6,80 ml) (-)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 6 se smíchá se 150 ml bezvodého DMF. Přidá se 2,15 g (8,8 mmol) l-N-t-butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové kyseliny, 1,69 g (8,8 mmol) DEC, 1.19 g (8,8 mmol) HOBT a 0,97 ml (8,8 mmol) N-methylmorfolinu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Pak se zkoncentruje ve vakuu, aby se odstranil DMF a přidá se 50 ml nasyceného vodného NaHCOj. Extrahuje se CH2CI2 (2 x 250 ml), extrakty se promyjí 50 ml solanky a suší MgSO₄. Zkoncentrují se ve vakuu do sucha a chromatografie (silikagel, 2% MeOH/CH₂Cl + 10% NH₄OH) poskytne 4,75 g produktu (VIA).

t.t. 75,7 až 78,5 °C, Hmot. spek. MH⁺ = 695 [a]_D ²⁵ = -5,5° (6,6 mg/2 ml MeOH).

-36CZ 292791 B6

KrokB

4,70 g (6,74 mmol) produktu z kroku A (VIA) se smíchá s 50 ml MeOH, pak se přidá během 1 hodiny 50 ml 10% H₂SO₄/dioxan po 10 ml podílech. Reakční směs se nalije do 50 ml vody 5 a přidá se 15 ml 50% NaOH (vodného), aby se pH upravilo 10-11. Směs se zfiltruje, aby se odstranila vzniklá pevná látka a filtrát se extrahuje CH2CI2 (2 x 250 ml). Vodná vrstva se zkoncentruje ve vakuu, aby se odstranil MeOH a opět se extrahuje 250 ml CH₂C1₂. Spojené extrakty se suší MgSO₄ a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Získá se produkt (VIB).

t.t. = 128,1 až 131,5 °C, hmotn. spek. MH⁺ = 595.

[a]_D ²⁵ = -6,01 (9,3 mg/2 ml MeOH).

KrokC

3,64 g (5,58 mmol) produktu z kroku B (VIB) se smíchá s 30 ml CH₂C1₂, pak se přidá 6,29 ml (44,64 mmol) (CH₃)₃SiNCO. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 2 dny. Přidá se 25 ml NaHCO₃ (vodného), pak se extrahuje CH₂C1₂ (2 x 250 ml). Extrakty se promyjí 25 ml solanky a suší MgSO₄. Zkoncentrují se ve vakuu do sucha a chromatografují (silikagel, gradient 2,5%, 20 5,0% pak 7,5% MeOH/CH₂Cl₂ + 10% NH₄OH). Získá se požadovaná sloučenina (VI).

t.t. = 150,5 až 153,0 °C, hmot. spek. MH' = 638 [a]_D ²⁵ = -61,4° (8,18 mg/2 ml MeOH).

-37CZ 292791 B6

Příklad 7

Sloučenina z preparativního příkladu 7 (PVII) reaguje se sloučeninou z preparativního příkladu 1 (PI) stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2. Získá se 0,25 g požadované sloučeniny (VII), což je racemická směs atropoizomerů.

Hmot. spek. MH' = 602, t.t. = 167,2 až 167,8 °C.

Hydrochlorid sloučeniny z příkladu 7 se připravuje mícháním s HCI/CH2CI2 po dobu 1 hodiny. Pak se reakční směs odpaří ve vakuu a získá se sůl.

Příklady 7A & 7B

Sloučeniny z příkladu 7 (VII) je racemická směs atropoizomerů. Tyto atropoizomery jsou děleny preparativní chromatografií (HPLC) s použitím kolony Chiralpack AD (5 cm x 50 cm) a 40% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu jako mobilní fáze. Získají se (+)- a (-)-enantiomery, příklad 7A a 7B.

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer, příklad 7A

t.t. = 114,2 až 114,8 °C, [a]_D ²⁵ = -154,6° (8,73 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer, příklad 7B

t.t. = 112,6 až 113,5 °C, [a]_D ²⁵ = +159,7° (10,33 mg/2 ml MeOH).

-38CZ 292791 B6

Příklad 8

VIII

Krok A:

VIIIA

6,0 g (12,8 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu (PVII) se ponechá reagovat s 3,78 g (16,6 mmol) l-N-t-butylkarbonylpiperidinyl-4-octové kyseliny stejným způsobem jako je popsán pro příklad 6, krok A. Získá se 8,52 g produktu (VIIIA).

Hmot. spek. ΜίΓ = 692 (FAB) 'H NMR (CDCIj, 200 MHz): 8,5 (d, 1H), 7,5 (d, 2H), 7,2 (d, 1H), 4,15-3,9 (m, 3H), 3,8-3,6 (m, 1H), 3,5-3,15 (m, 3H), 2,9 (d, 2H), 2,8-2,5 (m, 4H), 2,4-1,8 (m, 6H), 1,8-1,6 (br d 2H), 1,4 (s, 9H), 1,25-1,0 (m, 2H).

Krok B

-39CZ 292791 B6

8,5 g produktu z kroku A (VIIIA) se smíchá s 60 ml CH2CI2 a ochladí se na 0 °C. Pak se přidá 55 ml TFA. Reakční směs se míchá 3 hodiny při 0 °C. Pak se přidá 500 ml IN NaOH (vodného) a dále 30 ml 50% NaOH (vodného). Extrahuje se CILCk Extrakt se suší MgSO₄ a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 7,86 g produktu (VIIIB).

Hmot. spek. MT = 592 (FAB).

’H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8.51 (d. 1H), 7,52 (dd, 2H), 7,20 (d, 1H), 4,1-3,95 (m, 2H), 3,8-3,65 (m, 2H), 3,5-3,05 (m, 5H), 3,0-2,5 (m, 6H), 2,45-1,6 (m, 6H), 1,4-1,1 (m, 2H).

Krok C:

VIIIB

VIII

7,80 g (13,1 mmol) produktu z kroku B (VIIIB) se ponechá reagovat s 12,1 g (105 mmol) (CH3)₃SiNCO stejným způsobem jako je popsaný v příkladu 6, krok C. Získá se 5,50 g požadované sloučeniny (VIII), která se racemickou směsí atropoizomerů.

t.t = 163,6 až 164,0 °C, hmotn. spek. MH' = 635 (FAB).

’H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,5 (d. 1H), 7,52 (d. 1H), 7,48 (d, 1H), 7,21 (d, 1H), 4,54 (s, 2H), 4,1-3,6 (m, 4H), 3,45-3,15 (m, 4H), 3,0-2,5 (m, 5H), 2,45-1,6 (m, 7H), 1,4-1,0 (m, 2H).

-40CZ 292791 B6

Sloučenina z příkladu 8 (VIII) je racemická směs atropoizomerů. Tyto atropoizomery jsou děleny preparativní chromatografií (HPLC) za použití kolony Chiralpack AD (5 cm x 50 cm) a 20% iPrOH/hexan + 0,2% ethylaminu jako mobilní fáze. Průtok byl nízká 100 ml/min. Získá se (+)- a (-)-enantiomery, příklad 8B a 8A.

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer, příklad 8A

t.t. = 142,9 až 143,5 °C, [cx]_D ²⁵ = -151,7° (11,06 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer, příklad 8B

t.t. = 126,5 až 127,0 °C, [a]_D ²⁵ = +145,6° (8,38 mg/2 ml MeOH).

Příklad 9

3,32 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok B (PVIIB) se smíchá s2,38g sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI), 1,92 g HOBT, 2,70 g DEC, 1,56 ml Nmethylmorfolinu a 50 ml suchého DMF. Míchá se při 25 °C 24 hodin. Zkoncentruje se ve vakuu, pak se odparek zředí CH₂C1₂. Promyje se IN NaOH (vodným), pak nasyceným roztokem NaH₂PO₄ (vodným) a suší se MgSO₄. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a chromatografie odparku (silikagel, 2% MeOH/CH₂Cl₂ + NH₄OH) poskytne 3,82 g požadované sloučeniny (IX).

Hmot. spek. MlT = 604 (FAB).

Sůl hydrochloridu byla připravena rozpuštěním sloučeniny z příkladu 9 v dichlormethanu, který byl nasycen chlorovodíkem. Po zkoncentrování ve vakuu bylo získáno sloučenina z příkladu 9 jako HC1 sůl.

t.t. = 166,5 °,C.

[a]_D ²⁵ = +70,8° (9,9 mg/2 ml MeOH).

-41 CZ 292791 B6

Příklad 9A & 9B

(-)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok B (3,38 g) je ponecháno reagovat s 2,20 g sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI) stejným způsobem jako je popsán v příkladě 5 9. Získá se 3,58 g sloučeniny z příkladu 9A.

HC1 sůl sloučeniny z příkladu 9A je připravena rozpouštěním této sloučeniny v CH2CI2. Pak se k roztoku přidá 6M HC1 (g) v CH₂C1. Pak se roztok zkoncentruje ve vakuu a poskytne sůl.

t.t. = 129 °C, [a]_D ²⁵ = -72,3° (3,32 mg/2 ml MeOH).

Racemát sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok A (PVIIIA), je ponechán reagovat se sloučeninou z preparativního příkladu 1 (PI) stejným způsobem jako je popsán v příkladu 9. Získá se sloučenina z příkladu 9B.

t.t. = 145,0 °C.

Příklad 10

-42CZ 292791 B6

Krok A

1,33 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok B se nechá reagovat sl,37g l-N-t-butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové kyseliny způsobem, který je popsán pro 5 příklad 6, krok A. Získá se 2,78 g produktu (XA).

Hmot. spek. NH⁺ = 694,0 (FAB) [a]_D ²⁵ = +34,1° (5,45 mg/2 ml MeOH).

Krok B

2,78 g produktu z kroku A (XA) se ponechá reagovat způsobem, který je popsaný v příklad 8, krok B. Získá se 1,72 g produktu (XB).

t.t. = 104,1 °C. hmot. spek. MFf = 594 [a]_D ²⁵ = +53,4° (11,42 mg/2 ml MeOH).

-43CZ 292791 B6

Krok C:

1,58 g produktu z kroku B (XB) reaguje s 6 ml (CH₃)₃SiNCO způsobem, který je popsán pro příklad 6, krok C. Získá se 1,40 g požadované sloučeniny (X).

t.t. = 140 °C

Hmot. spek. NH⁺ = 637 [a]_D ²⁵ = +49,1° (4,24 mg/2ml MeOH).

Rekrystalizací z acetonu se získá požadovaná látka jako pevná látka, t.t. = 214,5 až 215,9 °C.

Příklady 10A & 10B

(-)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok B, je převeden na požadovanou sloučeninu (příklad 10A) v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 10, kroky A-C. Získá se sloučenina, příklad 10A.

t.t. = 152 °C, hmot. spek. ΜΗ* = 637 [a]_D ²⁵ = -62,5° (1,12 mg/2ml MeOH).

Racemická sloučenina z preparativního příkladu 8, krok A, je převedena na požadovanou sloučeninu (příklad 9B) v podstatě stejným způsobem, který je popřán pro příklad 10, kroky A-C. Získá se sloučenina, příklad 10B.

t.t.= 111,2 °C.

-44CZ 292791 B6

Příklad 11

XI

Požadovaná sloučenina (XI) je připravena z racemické sloučeniny z preparativního příkladu 9, krok F v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 2.

’H NMR (CDC1₃, 400 MHz), 8,44 (d, 1H), 8,14 (d, 2H), 7,58 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,14 (m, 3H),

5,32 (s, 1H), 4,65-4,57 (m, 1H), 3,68 (s, 2H), 3,65-3,39 (m, 4H), 2,91-2,87 (m, 1H), 2,69-2,63 (m, 1H), 2,45-2,33 (m, 4H).

ΜΙΓ = 605

Příklad 11A& 11B

Z R(+)- nebo S(-)- enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 9, krok g, je připraven R(+)-enantiomer (příklad 11A) a S(-)-enantiomer (příklad 11B) v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 2.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer, příklad 11 A:

t.t. = 167,0 až 167,8 °C, [a]_D ²⁵ = +32,6° (c = 1, MeOH).

’H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,44 (d, 1H), 8,14 (d, 2H), 7,58 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,14 (m, 3H),

5,32 (s, 1H), 4,65-4,57 (m, 1H), 3,68 (s, 2H), 3,65-3,39 (m, 4H), 2,91-2,87 (m, 1H), 2,69-2,63 (m, 1H), 2,45-2,33 (m, 4H).

MH⁺ = 605.

-45CZ 292791 B6

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer, příklad 11B [a]_D ²⁵ = -38,2° (14,67 mg/2 ml MeOH).

’H NMR (CDCI3,400 MHz): 8,44 (d, 1H), 8,14 (d, 2H), 7,58 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,14 (m, 3H),

5,32 (s, 1H), 4,64-4,57 (m, 1H), 3,67 (s, 2H), 3,70-3,34 (m, 4H), 2,95-2,87 (m, 1H), 2,69-2,63 (m, 1H), 2,45-2,31 (m, 4H).

ΜΗ* = 605.

Příklad 12

Požadovaná sloučenina z příkladu 12 (XII) je připravena z racemické sloučeniny z preparativního příkladu 9, krok F v podstatě stejným způsobem, který je opsaný pro příklad 8, krok A-C. Sloučenina XII je racemát.

Příklad 12A & 12B

Sloučenina z příkladu 12 je racemická směs. Chromatografie 2,45 g sloučeniny z příkladu 12 za použití kolony Chiralpack AD, 20% iPrOH/hexan + 0,2% diethylamin jako mobilní fáze při nízké průtokové rychlosti lOOml/min, poskytne 0,970 g (+}-enantiomeru (příklad 12B) a 0,982 g (-)-enantiomeru (příklad 12A)

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer, příklad 12A.

[a]_D ²⁵ = -31,2° (c = 0,453, MeOH).

-46CZ 292791 B6 ’HNMR (CDC1₃, 200 MHz), 8,43 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,48 (d, 1H), 7,14 (m, 1H), 5,32 (s, 1H),

4.5- 4,75 (m, 1H), 4,4 (s, 2H), 3,9 (d, 2H), 3,2-3,7 (m, 5H), 2,52-3,05 (m, 4H), 1,85-2,5 (m, 6H),

1.5- 1,85 (m, 4H), 1,0-1,4 (m, 1H).

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer, příklad 12B.

[a]_D ²⁵ = +29,8° (c = 0,414, MeOH) ’HNMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,43 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,48 (d, 1H), 7,14 (d, 1H). 5,32 (s, 1H),

4.5- 4,75 (m, 1H), 4,4 (s, 2H), 3,9 (d, 2H), 3,2-3,7 (m, 5H), 2,52-3,05 (m, 4H), 1,85-2,5 (m, 6H),

1.5- 1,85 (m, 4H), 1,0-1,4 (m, 1H).

Příklad 13

XIII

Krok A:

1,35 g (-)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 10, krok B (PCB) je ponecháno reagovat s 1,4 g l-N-t-butoxykarbonylpiperidin-4-octové kyseliny v podstatě stejným způsobem, který je popsaný pro příklad 6, krok A. Získá se 2,0 g produktu (XIIIA).

Hmot. spek. MH⁺ = 694 (FAB) částečně ’HNMR (CDC1₃,300 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,05 (m, 1H), 1,45 (s,9H).

-47CZ 292791 B6

Krok B:

1,95 g produktu z kroku A (XIIIA) je ponecháno reagovat způsobem, který je popsaný pro příklad 8, krok B. Získá se 1,63 g produktu XIIIB).

Hmot. spek. ΜΙΓ = 594 (FAB) částečně *HNMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,03 (m, 1H), 4,64 (d, 1H), 3,90 (m, 2H).

Krok C:

(-)-isomer

ΧΠΙΒ XIII

1,6 g produktu z kroku B (XIIIB) je ponecháno reagovat s 1,3 ml (CH₃)₃SiNCO stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 6, krok C. Získá se 1,27 g produktu (XIII).

Hmot. spek. MFT = 637 (FABS) částečně *H NMR (CDC1₃, 400 MHz). 8,38 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,04 (m, 1H), 4,60 (d, 1H),4,41 (s,2H).

[a]_D ²⁵ = -33,1° (c = 0,58, EtOH).

-48CZ 292791 B6

Příklad 13A& 13B

(+)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 10, krok B, (2,1 g), je převedeno na požadovanou sloučeninu stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 10, krok A-C. Získá se sloučenina, příklad 13A.

Hmot. spek. MFF = 637 (FABS), [a]_D ²⁵ = +32,4° (c = 0,57, EtOH) částečně *H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,39 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,04 (m, 1H), 4,60 (d, 1H), 4,41 (s, 2H), částečné *H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,42 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,29 (m, 1H), 5,85 (s, 2H), 4,20 (d, 1H).

Racemická sloučenina z preparativního příkladu 10, krok A, je převedena na racemickou sloučeninu, přiklad 13B, analogickým způsobem.

částečné *H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1), 7,59 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,40 (m, 1H), 4,60 (d,lH), 4,41 (s,2H).

částečné ‘HNMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,42 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,29 (d, 1H), 5,85 (s, 2H), 4,20 (d, 1H).

Příklad 14

Br

XIV

-49CZ 292791 B6

2,6 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 10, krok B, je ponecháno reagovat s 1,68 g sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI), analogickým způsobem jako je popsaný pro příklad 9. Získá se 2,10 g, požadované sloučeniny (XIV).

Hmot. spek. MbT = 604 (FAB), [a]_D ²⁵ = +34,1° (10,98 mg/2 ml EtOH) částečně ’H NMR (CDClj, 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 8,15 (d, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,15 (d, 2H), 7,03 (d, 1H), 4,57 (d, 1H).

HC1 sůl sloučeniny z příkladu 14 se připraví rozpuštěním 700 mg sloučeniny (XIV) ve 4 ml CH2CI2. Přidají se 4 ml Et₂O, ochladí na 0 °C a pomalu (po kapkách se přidá 1 ml HC1 (g) v dioxanu. Přidají se 2 ml Et₂O a reakční směs se míchá při 0 °C 7 minut. Pak se zředí 30 ml Et₂O, pevný produkt se spojí na filtru a promyje 30 ml Et₂O. Pevný produkt se suší ve vakuu a získá se 0,836 g HC1 soli sloučeniny z příkladu 14.

[a]_D ²⁵ = +64,8° (9,94 mg/2 ml Et/OH).

Příklad 14A & 14B

Příklad 14A Příklad 14B

0,6 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparativního příkladu 10, krok B, je ponecháno reagovat s 0,39 g sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PÍ), analogickým způsobem jako je popsaný pro příklad 9. Získá se 0,705 g požadované sloučeniny.

Hmot. spek. MFT = 604 (FABS), [a]_D ²⁵ = -41,8° (EtOH) částečné 'HNMRÍCDCh, 300 MHz): 8,38 (s, 1H), 8,15 (d, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,15 (d, 2H), 7,03 (d, 1H), 4,57 (d, 1H).

HC1 sůl sloučeniny z příkladu 14A se připraví stejným způsobem, který je popsaný pro příkladu 14.

[a]_D ²⁵ =-63,2° (EtOH).

Racemická sloučenina z preparativního příkladu 10, Krok A, je převedena na racemickou sloučeninu z příkladu 14B stejným způsobem jako je popsán pro příkladu 9.

částečné 'H NM (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 8,15 (d, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,15 (d, 2H), 7,03 (d, 1H), 4,57 (d, 1H).

-50CZ 292791 B6 částečné 'H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,77 (d, 2H), 8,47 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,74 (d, 2H), 7,43 (m, 1H), 7,27 (d, 1H), 4,35 (d, 1H).

Příklad 15

Sloučenina z preparativního příkladu 4 reaguje stejnými způsoby, které jsou popsány pro příklad 8, krok A-C. Získá se požadovaná sloučenina (XV), která je racemát.

Hmot. spek. MlT = 635 (FAB) částečně *H NMR (CDC1₃): 8,45 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 4,45 (s, 1H).

Příklad 16A & 16B

R(+)-enantiomer nebo S-(-)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 11 je převeden stejným způsobem, kteiý je popsán pro příklad 2. Získá se R-(+)-enantiomer, příklad 16A a S-(-)-enantiomer, příklad 16B, požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer:

¹³C NMR (CDC1₃): 166,5(C), 154,8(C), 146,6(CH), 140,8(CH), 140,4(C), 138,5(CH), 138(CH), 136,3(C), 134,6(C), 133,8(C), 133,6(C), 132,0(CH), 130,0(CH), 126,3(CH), 126,3(CH), 125,8(CH), 119,6(C), 78,4(CH), 51,1(CH₂), 50,6(CH₂), 45,4(CH₂), 41,5(CH₂), 38,0(CH₂), 30,l(CH₂), 30,0 (CH₂).

-51 CZ 292791 B6 [a]_D ²⁵ = +30,7° (10,35 mg/2 ml MeOH).

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer:

¹³C NMR (CDC1₃): 166,5(C), 154,8(C), 146,6(CH), 140,8(CH), 140,4(C), 138,5(CH), 138,5(CH), 136,3(C), 134,6(C), 133,8(C), 133,6(C), 132,0(CH), 130,0(CH), 126,3(CH), 126,3(CH), 125,8(CH), 119,6(C), 78,4 (CH), 51,1(CH₂), 50,6 (CH₂).

[a]_D ²⁵ = -30,9° (9,70 mg/2 ml MeOH).

Příklad 17

Příklad 17A (+)-enantiomer nebo (-)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 11 se zpracovává stejným způsobem, který je popsán pro příklad 1, kroky A-C. Získá se R-(+)-enantiomer, příklad 17 a S-(-)-enantiomer, příklad 17A, požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer.

¹³C NMR (CDClj): 169,3 (C), 157,5 (C), 155,0 (C), 146,6(CH). 140,8(CH), 140,4(C), 136,3(C), 134,8(C), 133,7(C), 132,0(CH), 130,0(CH), 125,8(CH), 119,6(C), 79,5(CH), 51,4(CH₂), 50,9(CH₂), 45,2(CH₂), 43,9(CH₂), 43,9(CH₂), 38,8(CH₂), 32,5(CH₂), 31,5(CH₂), 31,5(CH₂), 30,l(CH₂), 30,0(CH₂).

[a]_D ²⁵ = +28,7° (10,1 mg/2 ml MeOH).

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer:

¹³C NMR (CDC1₃): 169,3(C), 157,6(C), 155,0(C), 146,6(CH), 140,8(CH), 140,4(C), 136,3(C), 134,8(C), 133,7(C), 132,0(CH), 130,0(CH), 125,8(CH), 119,6(C), 78,5(CH), 51,4(CH₂), 50,9(CH₂), 45,2(CH₂), 43,9(CH₂), 43,9(CH₂), 38,8(CH₂), 32,5(CH₂), 31,5(CH₂), 31,5(CH₂), 30,l(CH₂), 30,0 (CH₂).

[a]_D ²⁵ = -28,5° (10,1 mg/2 ml MeOH).

-52CZ 292791 B6

Příklad 18

nh₂

XVIII

Krok A:

PV11B XVniA

9,90 g (18,9 mmol) produktu z preparativního příkladu 7, krok B (PVIIB) , se rozpustí ve 150 ml CH2CI2 a 200 ml CH₃CN a zahřeje se na 60 °C. Přidá se 2,77 g (20,8 mmol) N-chlorsuccinimidu a zahřívá se k refluxu po dobu 3 hodin. Reakce se monitoruje TLC (30% EtOAc/voda). Přidá se dalších 2,35 g (10,4 mmol) N-chlorsuccinimidu a zahřívá se k refluxu dalších 45 minut. Reakční 10 směs se ochladí na teplotu místnosti a extrahuje se IN NaOH a CH2CI2. CH2CI2 vrstva se suší

MgSO₄, filtruje se a čistí flash chromatografií (1200 ml silikagelu s normální fází, eluce 30% EtOAc/voda). Získá se 6,24 g požadovaného produktu (XVIIIA).

t.t. = 193 až 195,4 °C.

-53CZ 292791 B6

Ke 160 ml koncentrované HC1 se při -10 °C přidá 2,07 g (30,1 mmol) NaNO₂ a míchá se 10 minut. Přidá se 5,18 g (10,1 mmol) produktu z kroku A (XVIILA). Reakční směs se ohřeje z -10 °C na 0 °C během 2 hodin. Pak se reakční směs ochladí na -10 °C a přidá se 100 ml H₃PO₂ a reakční směs se ponechá stát přes noc. Reakční směs se pak nalije na drcený led a zalkalizuje se 50% NaOH, extrahuje se CH₂C1₂. Organická vrstva se suší MgSO₄, zfiltruje a zkoncentruje do sucha. Čistí se flash chromatografíí (600 ml silikagelu s normální fází, eluce 20% EtOAc/hexan). Získá se 3,98 g produktu (XVIIIB).

Hmot. spek. MH^4- = 495.

Krok C:

3,9 g produktu z kroku B (XVIIIB) se rozpustí ve 100 ml koncentrované HC1 a zahřívá se k refluxu přes noc. Reakční směs se ochladí, zalkalizuje 50% NaOH a výsledná směs se extrahuje CH₂C1₂. CH₂C1₂ vrstva se suší MgSO₄, za vakua se odpaří rozpouštědlo a produkt se usuší. Získá se 3,09 g požadovaného produktu (XVIIIC).

Hmot. spek. MH* = 423.

KrokD:

XVIIIC XV11ID

Za použití způsobu, který je podobný způsobu, který je popsán v preparativním příkladě 6, se získá 1,73 g požadovaného produktu (XVUID).

t.t. =169,8 až 170,1 °C, [a]_D ²⁵ = +48,2° (c=l, MeOH), MH* = 425.

-54CZ 292791 B6

Krok E:

Za použití způsobu, který je podobný způsobu, který je popsán v příkladu 4, se z výchozí látky, produktu z kroku DD (XVIII).

t.t. = 152,3 až 153,3 °C, [a]_D ²⁵ = +53,0° (c=l, MeOH), ΜΙΓ = 593.

Příklad 19

Krok A:

15,0 (44,4 mmol) produktu z preparativního příkladu 9, krok B se ponechá reagovat s 6,52 g (48,9 mmol) N-chlorsuccinimidu způsobem, který je podobný tomu, který je popsaný v příkladu 18, krok A. Extrahuje se, jak je popsáno a získá se 16,56 g požadovaného produktu (XIXA).

t.t. = 234,7 až 235,0 °C, MtT = 370.

KrokB:

16,95 g (45,6 mmol) produktu z kroku A (XIXA) se ponechá reagovat způsobem popsaným v příkladu 18, krok B a získá se 13,07 g požadovaného produktu (XIXB).

t.t. = 191,7 až 192,1 °C. MH⁺ = 356.

-55CZ 292791 B6

Krok C:

10,0 g (28,0 mmol) produktu z kroku B (XIXB) se ponechá reagovat s NaBFLi způsobem, který je popsaný v preparativním příkladě 9, krok B. Získá se požadovaný produkt (XIXC), který se použije v následujícím kroku bez dalšího čištění.

Krok D:

XIXC

10,0 g (27,9 mmol) produktu z kroku C (XIXC) se rozpustí pod dusíkem v 200 ml CH₂C1₂ za míchání a při teplotě místnosti. Reakční směs se ochladí na 0 °C a přidá se 2,63 g triethylaminu a 4,80 g (41,9 mmol) methansulfonylchloridu. K výslednému roztoku se při 0 °C přidá roztok 16,84 g (19,6 mmol) piperazinu a 100 ml THF a dále se bez prodlení přidá 100 ml DMF. Míchá se při teplotě místnosti přes noc. Odpaří se rozpouštědlo a výsledný zbytek se extrahuje s CH₂C1₂ a nasyceným roztokem NaHCO₃. CH₂C1₂ vrstva se suší MgSO₄, filtruje se a koncentruje, aby se získal surový produkt. Chromatografie surového produktu (1200 ml silikagelu, eluce 5% MeOH (nasycený NH₃)/CH₂C1₂) se získá racemická směs. Racemická sloučenina se dělí chirální chromatografíí na koloně Chiralpack AD (5 cm x 50 cm) eluce 30% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu.

Hmot. spek. MH = 426. Požadovaný izomer je (+)-enantiomer.

KrokE:

2,0 (4,7 mmol) produktu z kroku D se míchá v 40 ml DMF pod dusíkem, směs se ochladí na 0 °C a přidá se 0,615 g (6,1 mmol) N-methylmorfolinu, 1,1668 g (6,1 mmol) DEC, 0,8225 g (6,1 mmol) N-methylmorfolinu, 1,1168 g (6,1 mmol) DEC, 0,8225 g (6,1 mmol) HOBT a 1,6042 g (6,1 mmol) produktu z preparativního příkladu 1 (PI). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Odpaří se rozpouštědlo a výsledný zbytek se extrahuje CH₂C1₂, který se promyje vodou, nasyceným NaHCO₃, 10% NaH₂PO₄ a solankou. Oddělí se CH₂C1₂ vrstva, suší se MgSO₄, zfiltruje se a zkoncentruje do sucha. Odparek se čistí flash chromatografíí (400 ml silikagelu, eluce 5% MeOH/NH₃-CH₂Cl₂).

-56CZ 292791 B6

Získá se 2,43 g požadovaného produktu (XIX).

t.t. = 145,3 až 146,1 °C, [a]_D ²⁵ = +33,6° (c = 1, MeOH), MlT = 561.

Příklad 20

Krok A:

200 mg výchozí kyanosloučeniny se zahřívá v 17 g kyseliny polyfosforečné při teplotě 190 až 200 °C 45 minut. Výsledná směs se nalije na led, přidá se 30% HC1 a míchá se 30 minut. Reakční směs se extrahuje CH₂C1₂, promyje solankou a suší Na₂SO₄. Extrakt se zfiltruje a zkoncentruje. Čistí se preparační TLC (eluce EtOAc/hexan) a získá se 21 mg požadované sloučeniny (XXA) (také se získá 59 mg 10-chlorproduktu).

KrokB:

Způsobem, kteiý je popsaný v preparativním příkladě 9, krok E, se ponechá reagovat 1,75 g (5,425 mmol) produktu z kroku A (XXA) s NaBFL» a získá se požadovaný produkt (XXB).

-57CZ 292791 B6

Krok C:

XXB

Látka získaná v kroku B (XXB) se při teplotě místnosti rozpustí v 50 ml CH2CI2, přidá se 3,95 ml (5,425 mmol) SOC1₂ a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Za vakua se odstraní přebytek SOCI2 a rozpouštědlo. Odparek se rozpustí v CH2CI2, promyje nasyceným roztokem NaHCO₃ a solankou. Suší se Na₂SO₄, zfiltruje se a zkoncentruje. K vzniklé látce se přidá 25 ml THF a 2,33 g (27,125 mmol) piperazinu a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se CH₂C1₂. Promyje se nasyceným roztokem NaHCO₃ a solankou. Suší se Na₂SO4, zfiltruje se a zkoncentruje. Výsledná látka se čistí chirální chromatografií za použití kolony Chiralpack AD, eluce 20% iPrOH/hexan s 0,2% diethylaminu.

Hmot, spek.: MH⁺ = 392.

Požadovaný izomer je (+) - enantiomer.

Krok D:

770 mg (1,960 mmol) produktu z kroku C se smíchá s 323 μΐ (2,548 mmol) N-methylmorfolinu, 344 mg (2,548 mmol) HOBT, 487 mg (2,548 mmol) DEC, 390 mg (2,548 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI) a 8 ml DMF. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se EtOAc, promyje se nasyceným roztokem NaHCO₃, vodou a solankou. Suší se Na₂SO4. Produkt se čistí flash chromatografií na silikagelu, eluce EtOAc až gradient 10, 12% (10% NH₄OH/MeOH/EtOAc). Dále se čistí preparativní TLC (silikagel 1000μ) a získá se 750 mg požadované sloučeniny (XX).

[a]_D ²⁵ = +23,3° (c = 0,332, MeOH).

Příklad 21

XXI racemát

-58CZ 292791 B6

Krok A

10,0 g (29,6 mmol) produktu z preparativního příkladu 9, krok B, se rozpustí v 150 ml CH₂C1₂ a 200 ml CH₃CN při teplotě místnosti. Směs se zahřeje na 60 °C, přidá se 10,45 g (32,6 mmol) l-fluor-4-hydroxy-l,4-diazoniabicyklo[2,2,2]oktan bistetrafluoroboritanu a zahřívá se k refluxu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, extrahuje se CH₂C1₂ a 1 N NaOH. CH₂C1₂ vrstva se suší MgSO₄, zfiltruje se a zkoncentruje do sucha. Výsledná látka se čistí flash chromatografií za použití 1400 ml silikagelu s normální fází, eluce 10% EtOAc-CH₂Cl₂ + 2 kapky NH₄OH. Získá se 2,00 g produktu (XXIA).

t.t. = 103,2 až 103,5 °C, MH⁺ = 355.

Krok B:

Způsob, který je popsaný v preparativním příkladě 9, krok D, se ponechá reagovat 1,80 g (5,1 mmol) produktu z kroku A (XXIA). Surový produkt se čistí flash chromatografií za použití 200 ml silikagelu s normální fází, eluce 20% EtOAc/hexan.

Hmot. spek. MH⁺ = 339.

Krok C:

Způsob, který je popsaný v preparativním příkladě 9, krok E, se ponechá reagovat 0,47 g (1,4 mmol) produktu z kroku B s NaBH₄. Získá požadovaný produkt (XXIC).

Hmot, spekt.: ΜΗ⁴ = 342.

-59CZ 292791 B6

Krok D:

0,37 g (1,1 mmol) produkt z kroku C (XXIC) se rozpustí v 20 ml toluenu pod dusíkovou atmosférou a ochladí se z teploty místnosti na 0 °C. Přidá se 0,3855 g (3,2 mmol) SOCI2 a míchá se při teplotě místnosti, pak se přidá 10 ml CHCI3 a míchá se 3 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří a výsledná látka se extrahuje 1 N NaO CH2CI2. CH₂C1₂ vrstva se suší MgSO₄, zfiltruje se a zkoncentruje do sucha. Výsledná látka se rozpustí v 10 ml THF v atmosféře dusíku při dá se 0,455 g (5,4 mmol) piperazinu, 10 ml THF a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Znovu se zopakuje 10 extrakce a získá se požadovaný produkt.

Hmot, spek.: MH⁺ = 410.

Krok E:

0,44 g (1,1 mmol) produktu z kroku D se ponechá reagovat s N-methylmorfoline, N-oxidem kyseliny 4-pyridyloctové, DEC a HOBT v DMF způsobem, který je popsaný v příkladu 5. Odpaří se rozpouštědlo a výsledná látka se extrahuje CH₂C12-voda, nasyceným roztokem NaHCO₃, 10% NaH₂PO₄ a solankou. CH₂C1₂ vrstva se suší MgSO₄, filtruje se a koncentruje do 20 sucha. Výsledná látka se čistí flash chromatografíí na 150 ml silikagelu s normální fází, eluce 5% MeOH/NH3-CH₂Cl₂. Získá se 0,41 g požadované sloučeniny (XXI).

t.t. = 155,0 až 155,6 °C.

Hmot, spek.: MlT = 545.

-60CZ 292791 B6

Následující sloučeniny se připraví z odpovídajících výchozích sloučenin a způsoby, které jsou popsány výše:

-61CZ 292791 B6

Stanovení

1. In vitro stanovení enzymů: Inhibice famesylproteintransferázy a geranylgerinyl protein transferázy.

Jak famesylprotein transferáza (FPT), tak geranylgeranyl protein transferáza (GGPT) byly částečně čištěny z krysího mozku za pomoci frakcionace síranem amonným a následnou aniontově výměnnou chromatografíí na Q-Sepharose (Pharmacia lne.), jak je popsána Yokoymou a kol. (Yokoyama a kol., (1991). A problém geranylgeranyltransferase from bovine braine Inplications for protein prenylation specifícity, Proč. Nati. Acad. Sci USA 88 5302-5306. Lidská famesyl protein transferáza byla také vyznačena v E. coli za použití cDNA klonů, které kódovaly jak, a tak b subjednotky. Tyto použité metody byly podobné metodám, které byly publikovány (C. Omer a kol., (1993), Charakterization of recombinant human famesyl protein transferase. Cloning expresiion, famesyl diphosphate binding, and fúnctional homology with yeast prenylprotein transferases, Biochemistry 32:5167-5176). Lidská famesyl protein transferáza byla částečně čištěna z rozpustné proteinové frakce E. Coli, jak bylo popsáno výše. Tricyklické inhibitory famesyl protein transferázy, které jsou zde popsané, inhibují jak lidský, tak kiysí enzym s podobnou účinností. Byly připraveny dvě formy val^,2-Ha-Ras proteinu jako substráty

-62CZ 292791 B6 pro tyto enzymy. Tyto formy se liší ve svých karboxyterminálních sekvencích. Jedna forma je ukončena cystein-valin-leucin-serin sekvencí (Ras-CVLS) a druhá sekvencí cystein-valinleucin-leucin (Ras-CVLL). Ras-CVLS je substrát pro farnesy protein transferázu, zatímco RasCVLL je substrát pro geranylgeranyl protein transferázu I. cDNA, které kódují tyto proteiny, byly konstruovány tak, že tyto proteiny obsahují amino-terminální extenzi 6-histidinových zbytků. Oba proteiny byly vyznačeny v Escherichia coli a čištěny za použití afinitní chromatografie s chetáty kovu. Radioznačené isoprenyl pyrofosfátové substráty. [³H]famesylpyrofosfát a [³H]geranylgeranylpyrofosfát byly získány od DuPont/New Englad Nuclar.

Několik metod pro měření aktivity famesyl protein transferázy je popsáno v (Reiss a kol. 1990, Cell 62: 81 Schaber a kol., 1990. J. Bio. Chem. 265: 14701. Manne a kol., 1990, PNAS 87: 7541 a Parbacid a Manne 19993. US patent č. 5 185 428). Aktivita byla stanovována měřením přenosu [³H]famesyly z [³H]famesylpyrofosfátu na Ras-CVLS za podmínek, které jsou podobné podmínkám, které jsou popsané v Reiss a kol., 1990 (CE11 62:81). Reakční směs obsahovala 40 mM Hepes. Ph 7,5 20 mM chloridu hořečnatého. 5 mM dithiothreitolu, 0,25 μΜ [³H]famesylpyrofosfátu, 10 ml famesyl protein transferázy, která byla čištěna přes Q-Sepharose. Dále obsahovala indikovanou koncentraci tricyklické sloučeniny nebo dimethylsulfoxid jako slepý pokus s nosičem (5% DMSO konečného) a 5 mM Ras-CVLS v celkovém objemu 100 ml. Reakce byla ponechána probíhat při teplotě místnosti 30 minut a pak byla zastavena 0,5 ml 4% dodecylsíranu sodného (SDS), pak se přidalo 0,5 ml chladné 30% TCA. Vzorky byly ponechány stát v ledu 45 minut a sraženina Ras-proteinu byla pak spojena na gF/C filtračním papíru za použití Brandelova sběrače buněk. Povlaky na filtru byly promyty pouze 6% TCA, 2% SDS a radioaktivita byla měřena ve Wallec 1204 Betaplate BS kapalném scintilačním počítadle. Procenta inhibice byla vypočtena relativně k DMSO jako slepému pokusu s nosičem.

Stanovení geranylgeranyl protein transferázy I bylo identické ke stanovení famesyl protein transferázy, které je popsané výše, se dvěma výjimkami:

Famesylproteinpyrofosfát jako donor isoprenoidu byl nahrazen [³H]geranylgeranylpyrofosfátem a Ras-CVLL byl akceptor proteinu. Toto stanovení je podobné stanovení, které je popsané Casey a kol. (P.J. Casey a kol. (1991), Enzymatic modification of proteins with a geranylgeranyl isoprenodi. Proč. Nati. Aca. Sci. USA 88: 8631-8635.

2. Stanovení založené na buňkách: Přechodná vyznačení val¹²-Ha-Ras-CVLS a val^I2-HaRas-CVLL v COS v buňkách z opičích ledvin: Vliv inhibitorů fanesyl protein transferázy na průběh množství Ras a chorobný růst buněk indukovaných transformujícím se Ras.

Buňky v opičích ledvinách byly přeneseny elektroporací s epizomem pSV-Sport (Gibco/BRL), který obsahuje cDNA štěp, který je kódovaný buď Ras-CVLS nebo Ras-CVLL. To vede k přechodnému přeznačení Ras substrátu pro famesyl protein transferázu nebo geranylgeranyl protein transferázu I (viz výše).

Po elektroporací byly buňky rozprostřeny do misek s šesti otvory s tkáňovou kulturou, které obsahovaly 1,5 ml Dulbecco modifikované Eaglovy kultivační půdy (GIBCO lne.), která byla opatřena 10% zárodečným telecím sérem a odpovídajícími inhibitory famesyl protein transferázy. Po 24 hodinách byla kultivační půda odstraněna a čerstvá kultivační půda, která obsahovala odpovídající látky byla znovu přidána.

hodin po elektroporací byly buňky zkoumány pod mikroskopem, aby byl monitorován chorobný růst buněk indukovaný transformujícím se Ras. Buňky, které se vyznačují transformujícím se Ras, jsou okrouhlejší, refraktivní a přerůstají monovrstvu, která vypadá jako transformovaný fenotyp. Buňky byly pak fotografovány, promyty dvakrát 1 ml chladného fyziologického roztoku, kteiý byl pufrován fosforečnanem (PBS), a byly odstraněny z misky seškrabáním do 1 ml pufru, který obsahoval 25 mM Tris, pH 8.0, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluoridu, 50 mM leupeptinu a 0,1 mM pepstatinu.

-63CZ 292791 B6

Buňky' byly štěpeny na homogenizát a buněčná tkáň byla odstraněna centrifugací při 2000 x g po dobu 10 minut.

Buněčný protein byl srážen přídavkem ledem chlazené kyseliny trifluoroctové a znovu rozpuštěn v 100 ml SDS-pufr pro elektroforézu. Vzorky (5-10 ml) byly naneseny na 14% polyakrylamidové minigely (Novex, lne.) a elektroforéza probíhala až do té doby, kdy se pás barviva přiblížil ke dnu gelu. Proteiny dělené na gelu byly elektronaneseny na nitrocelulosové membrány pro imunodetekci.

Membrány byly vyvíjeny přes noc při 4 °C v PBS, který obsahoval 2,5% sušeného mléka a 0,5 Tween-20 a pak byly inkubovány sRas specifickou monoklonální protilátkou, Y13-259 (M.E. Furth a kol., (1982): Monoclonal Antibodies to the p21 produkts of transformint gene ofHarvey murine sarcome virus and of the cellular ras gene family, J. Virol. 43: 294-304), v PBS, který obsahoval 1% zárodečného telecího séra pro dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po promytí byly membrány inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti s sekundární protilátkou králičí anti-rat IgG při zředění 1:5000, která je konjugována s křenovou peroxidásou. Inkubace probíhala v PBS který obsahoval 1% zárodečného telecího séra. Přítomnost zreagovaného a nezreagovaného Ras-CVLS nebo Ras-CVLL byly detekovány za použití kolorimetrického peroxidásového činidla (4-chlomaftol), jak je popsané výrobcem (Bio-Rad).

3. Stanovení buněčného povlaku

Normální lidské fibroblasty byly rozprostřeny v 3,5 cm miskách při hustotě 5 x 10⁴ buněk/misku v 2 ml růstové kultivační půdy. Byly inkubovány 3 až 5 dní až se dosáhlo sbíhání. Kultivační půda byla odsáta z každé misky a na vršek fibrolastové monovrstvy při hustotě 2 x 10³ buněk na misku v 2 ml růstové kultivační půdy, byl umístěn indikátor rakovinných buněk T24-BAG4, lidské buňky z karcinomu močového měchýře, který se vyznačuje aktivovaným H-ras genem. Vzorek byl ponechán přes noc. Sloučeninou indukovaná inhibice kolonie byla stanovena přídavkem postupně zřeďované sloučeniny přímo do kultivační půdy 24 hodin po umístění nádorových buněk. Buňky byly inkubovány dalších 14 dní, aby se kolonie vytvořila. Stanovení byla ukončena vymácháním monovrstev dvakrát ve fyziologickém roztoku, který byl pufrován fosforečnanem (PBS). Monovrstvy byly fixovány 1% roztokem glutaraldehydu v PBS. Pak byly nádorové buňky zviditelněny obarvením X-Gal (J. Price a kol., Lineage analysis in vertebrate nervous systém by retrovirus-mediated gene transfer, Proč. Nati. Acad. Sci. 84,156-160 (1987)). Při stanovení inhibice kolonie byly sloučeniny hodnoceny na základě dvou IC50 hodnot: koncentrace látky nutná k zabránění růstu 50% množství nádorových buněk (tIC₅₀) koncentrace látky nutná k snížení hustoty buněk, které obsahují buněčný povlak o 50% (mIC₅₀). Obě IC₅₀ hodnoty byly získány určením hustoty nádorových buněk a mrtvých buněk vizuálním pozorováním pod mikroskopem. Terapeutický index sloučeniny byl kvantitativně vyjádřen jako poměr IC₅o/tIC₅o, s hodnotami většími než je hodnota cílové specifikace nádoru.

Další stanovením byly prováděny následující v podstatě stejným způsobem jako je popsán výše, pouze s náhradou indikačních nádorových buněčných řad na místo T24-GAB buněk. Stanovení byla vedena s použitím DLD-l-BAG lidských nádorových buněk tračníku, označující se jako K-rasgen nebo SW620-BAG lidskými nádorovými buňkami tračníku vyznačujícími se aktivovaným K-ras genem. Při použití jiných nádorových buněčných řad, které jsou v tomto oboru známy, může být aktivita sloučenin z tohoto vynálezu demonstrována proti jiným typům rakovinných buněk (takových jaké jsou vyjmenovány zde na straně 15 a 16).

4. Jemné agarové stanovené

Na podkladu závislý růst je charakteristika tumorigenních buněčných řad. Lidské nádorové buňky byly suspendovány v růstové kultivační půdě, která obsahovala 0,3% agarosy a indikovanou koncentraci inhibitoru famesyl transferázy. Roztokem je převrstvena kultivační půda zahuštěná 0,6% agarosy a která obsahuje tutéž koncentraci inhibitoru famesyl transferázy jako

-64CZ 292791 B6 vrchní vrstva. Pak byla vrchní vrstva zahuštěna, plácky byly inkubovány 10 až 16 dní při 37 °C pod atmosférou 5% CO₂, aby se kolonie rozrostla. Po inkubaci jsou kolonie obarveny převrstvením agaru roztokem MTT (3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromidu (thiazolylová modř) (1 mg/ml v PBS). Kolonie byly spočteny a hodnoty IC₅₀ určeny.

Inhibice růstu lidských nádorových buněk jemným agarosovým stanovením.

Jemné agarové stanoveno bylo provádění se sloučeninou vzorku 10 a následujícími nádorovými buněčnými řadami: K ras NIH 3T3 H ras NIH 3T3, HTB 177 (NSCLC) K ras mutace, HTB 173 (NCIH146) (SCCLC) ras mutac. neurčena, A549 (plíce) Kras mutace, HTB 175 (SCLC) rak mutace neurčena, HTB 119 (NCI H69) (SCLC), HTB 183 (NCI H661) (NSCLC) ras mutace neurčena, HPAF II (pancreas) Kras mutace, MCF-7 (prs) ras mutace neurčena, HBL 100 (prs) ras mutace neurčena, Du4475 (prs) ras mutace neurčena, MDA MB 468 (prs) ras mutace neurčena, DU 145 (prostata) ras mutace neurčena, MDA MB453 (prs), BT474 (prs), PC3 (prostata), DLD 1 (tračník) K ras mutace a AsPc-1 (pancreas) K ras mutace. Ras mutace byla určena ELISA (oncogene Science). IC₅o (μΜ) pro každou buněčnou řadu byl v rozsahu 0,04 až 3,0.

Jemné agarové stanovení bylo prováděno se sloučeninou vzorku 18 a následujícími buněčnými řadami: K ras NIH 373, H ras NIH 3T3, HBT 177 (NSCLC) K ras mutace, A549 (plíce) K ras mutace a HTB 175 (SCLC) ras mutace neurčena. Ras mutace byla určována ELISA (Oncogene Science). IC₅₀ (μΜ) pro každou buněčnou řadu bylo v rozmezí 0,175 až 0,8.

Výsledky:

1. Enzymologie

Data demonstrující, že sloučeniny z tohoto vynálezu jsou inhibitory Ras-CLVS famesylace částečně čištěnou famesyl protein transferázou z krysího mozku (FPT). Data také ukazují, že tyto sloučeniny je možné považovat za velmi účinné (IC₅o«O,l μΜ) inhibitory Ras-CVLS famesylace částečně čištěným krysím Mozkem FPT.

Data také demonstrují, že sloučeniny z tohoto vynálezu jsou horší inhibitory geranylgeranyl protein transferázy (GGP), stanoveno za použití Ras-CVLL jako akceptoru isoprenoidu. Tato selektivita je důležitá pro terapeutický účinek sloučenin použitých ve způsobem z tohoto vynálezu. Roste možnost, že sloučeniny budou míst vlastnosti jako selektivní inhibitory růstu proti buňkám transformovaným Ras.

2. Stanovení COS buněk založených na buňkách

Analýza Ras proteinu vyznačeného v COS buňkách, které jsou transformované Ras a následující působení tricyklických inhibitorů famesy protein transferázy indikuje, že tyto látky inhibují vývoj Ras-CVLS, což vede k akumulaci nezreagovaného Ras (viz Tabulka 3). Sloučenina z příkladu 2, například, inhibuje vývoj Ras-CVLS s IC₅₀ při koncentracích až do 33 μΜ.

Tyto výsledky poskytují důkaz pro specifickou inhibici famesyl protein transferázy, ale ne geranylgeranyl transferázy I sloučeninami z tohoto vynálezu v neporušených buňkách. Také indikují množství, že tyto látky přicházejí v úvahu k blokování buněčných transformací aktivovanými Ras onkogeny.

3. Stanovení buněčného povlaku založené na buňkách

Tricyklické inhibitory famesyl protein transferázy z tohoto vynálezu také inhibují růst nádorových buněk transformovaných Ras ve stanovení povlaku bez vykázání cytotoxické aktivity proti normální monovrstvě.

-65CZ 292791 B6

In vivo anti-tumor studie

Nádorové buňky (od 5x 10⁵ do 8 x 10⁶) DLD-1 (lidské nádorové buňky tračníku), ATCC CCL 221) byly naočkovány podkožně do slabin 5-6 týdenních od athymických nu/nu myší (samic). Zvířata, která nesla nádor, byla vybrána a randomizována, když byl nádor potvrzen. Zvířata byla léčena pouze nosičem (beta-cyklodextrin pro i.p. nebo kukuřičný olej pro p.o.) nebo nosičem se sloučeninou z tohoto vynálezu čtyřikrát denně (QID) po 7 dní v týdnu 4 týdny. Procenta inhibice růstu nádoru byla určena relativně k působení nosiče měřeními nádoru.

Průměrná % inhibice nádoru pro každou sloučeninu z příkladů 1,2,4, 5, 6, 7, 7A, 8B, 9,10,11 A, 11B, 12B, 13, 14A, 16B a 18 byla v rozmezí od 7 do 50% pro dávku 10 mg/kg p.o. a v rozmezí do 35,4 do 83 pro dávku 50 mg/kg p.o.

Pro přípravu farmaceutických prostředků ze sloučenin z tohoto vynálezu se používají inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou buď tuhé nebo kapalné. Pevná forma prostředků zahrnuje prášky, tablety, disperzibilní granule, kapsle, oplatky a čípky. Prášky a tablety obsahují od 5 do 70% aktivní složky. Vhodné tuhé nosiče, které jsou v tomto oboru známy, jsou např. uhličitan hořečnatý, stearan hořečnatý, talek, cukr, laktóza. Tablety, prášky, oplatky a kapsle se používají jako pevné dávkovači formy vhodné pro orální podávání.

Pro přípravu čípků se používá nízko tající vosk, stejně jako směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo. Tyto složky se nejprve taví, pak se v nich za míchání homogenně disperguje aktivní složka. Roztavená homogenní směs se pak nalije do forem běžné velikosti a zde se nechá ztuhnout.

Kapalné formy prostředků zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad uveďme vodu nebo roztoky voda-propylenglykol pro parenterální injekce.

Kapalné formy prostředků zahrnují také roztoky pro intranasální podávání.

Aerosolové prostředky vhodné pro inhalaci zahrnují roztoky nebo tuhou složku ve formě prášku, které jsou v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem jako je inertní stlačený plyn.

Dále jsou zde zahrnuty tuhé formy prostředků, které se krátce před použitím převádějí na kapalnou formu prostředků pro orální nebo parenterální podávání. Takové kapalné formy zahrnují roztoky suspenze a emulze.

Sloučeniny z tohoto vynálezu jsou také aplikovány transdermálně. Transdermální prostředky jsou ve formě krémů, mlék, aerosolů a/nebo emulzí. Lze je transdermálně aplikovat z matrice nebo z typu zásobníku, který je běžný v tomto oboru pro dané účely.

S výhodou jsou sloučeniny podávány orálně.

S výhodou je farmaceutický prostředek v jednotkové dávkové formě. V takové formě, že prostředek je rozdělen na jednotkové dávky, které obsahují dostačující množství aktivní složky, tj. účinné množství, kterým se dosáhne požadovaného účelu.

Množství aktivní sloučeniny v jednotkové dávce prostředku může být různé neboje nastaveno od 0,1 mg do 1000 mg, výhodněji od 1 mg do 300 mg, podle aplikace.

Aktuální dávka je různá v závislosti na požadavcích pacienta a na vážnosti stavu, který je léčen. Určení správné dávky pro určitou situaci je odborníkovi v tomto oboru zřejmé. Obecně se léčení začíná s menšími dávkami, které jsou menší než optimální dávka sloučeniny. Potom se dávka

-66CZ 292791 B6 zvyšuje po malých přírůstcích až do optimálního účinku za daných okolností. Výhodně je celková denní dávka rozdělena a podávána po částech během dne, je-li potřeba.

Množství a frekvence podávání sloučenin z tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelných solí je regulováno podle úvahy ošetřujícího lékaře vzhledem k takovým faktorům, jako je věk, kondice a velikost pacienta stejně jako vážnost symptomů, které jsou léčeny. Typický doporučený dávkový režim je orální podávání od 10 mg do 2000mg/den, s výhodou od 10 do lOOOmg/den ve dvou nebo čtyřech dávkách, aby se zablokoval růst nádoru. Sloučeniny jsou netoxické, jestliže se podávají v tomto rozmezí dávek.

Následující příklady farmaceutických dávkových forem, které obsahují sloučeninu z tohoto vynálezu. Rozsah vynálezu zahrnuje aspekt farmaceutický prostředek, který není vymezen poskytnutými příklady.

Farmaceutické dávkové formy - příklady

Příklad A

Tablety

č. Složky mg/tablety mg/tableta

1.	aktivní složka	100	500
2.	laktózaUSP	122	113
3.	kukuřičný škrob, potrav, kvalita jako 10% pasta v čištěné vodě	30	40
4.	kukuřičný škrob potrav, kvalita	45	40
5.	stearan hořečnatý	3	7

Celkově 300 700

Způsob přípravy

Složky číslo 1 a 2 se mísí ve vhodném mísiči 10 až 15 minut. Složkou č. 3 se směs granuluje. Vlhké granule se rozdrtí přes hrubé česle (např. 1/4, 0,63 cm), je-li potřeba. Vlhké granule se suší. Sušené granule se třídí, jestliže je potřeba, a mísí se složkou č. 4. Mísí se 10 až 15 minut. Přidá se složka č. 5 a mísí se 1 až 3 minuty. Směs se stlačí na vhodnou velikost a zpracuje ve vhodném tabletovacím stroji.

Příklad B

Kapsle

č.	Složky	mg/tablety	mg/tableta
1.	aktivní sloučenina	100	500
2.	laktóza USP	106	123
3.	kukuřičný škrob potrav, kvalita	40	60
4.	stearan hořečnatý NF	7	7
	Celkově	253	700

Způsob přípravy

Složky č. 1, 2 a 3 se mísí ve vhodném mísiči 10 až 15 minut. Přidá se složka č. 4 a mísí se 1 až 3 minuty. Směs se naplní do vhodných dvoudílných tvrdých želatinových kapslí na vhodném stroji na výrobu kapslí.

-67CZ 292791 B6

Protože tento vynález byl popsán ve shodě se specifickými složeními, které jsou uvedené výše, odborníkovi je zřejmé množství alternativ, modifikací a variací. Všechny takové alternativy, modifikace a variace jsou uvažovány, že spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Tabulka 1 - inhibice FPT

Vzorek FPT IC₅₀(mM)Vzorek FPTIC₅₀(mM)

1 4	< 0,034 0,046	2 16A	0,010 0,016 0,026
16B	0,038	11B	0,032 >0,095
15	0,023 0,022	7	0,012
8	0,021	11A	0,0018
5	0,0023	12B	0,0021 0,0025
9	0,0013	10	0,0019
7B	<0,003	8B	0,013
14A	0,0026	14	0,062
13A	0,078	13	0,005
5A	>0,099	7A	>0,1
8A	>0,094	10A	>0,094
9A	>0,088	6	0,0031
11	0,002	5B	0,003
12A	>0,094	13B	0,005
14B	0,005	5.HC1 sůl	0,0038
14A.HC1 sůl	<0,0031	9B	0,003
10B	0,003	17	0,043
17A	0,048	18	0,0031
19	<0,0038	20	0,0062
21	0,0084

-68CZ 292791 B6

Tabulka 2

Srovnání FPT inhibice a GCPT inhibice

Vzorek Inhibice enzymu FPT ICspinM Inhibice enzymu GCPT IC_Sq mM

2	0,0010 0,016	>300
4	0,046	>35.7
5B	0,003	>300
16A	0,032 0,026	>38
16B	0,038 0,023	>76
7	0,012	>300
11A	0,0018 0,0021	>66
9	0,0013	>59
5	0,023	>66
14A	0,0026	>62
13	0,005	>63
7B	<0,003	>66
8B	0,013	>60
18	0,0031	>50
20	0,0062	>38

-69CZ 292791 B6

Tabulka 3

Aktivita v COS buňkách

Vzorek	Inhibice vývoje Ras IC50(gM)	Vzorek	Inhibice vývoje Ras ΙΟ50(μΜ)
8	<0,25	2	0,25
1,5	0,60	16A	0,5
7	0,125	11	<0,025
10	<0,025	10A	2,0
12B	<0,025	12A	0,95
11A	<0,025	11B	2,25
5	0,098	14A.HCI	0,015
13	0,420	9	0,010
7B	0,025	8B	0,280
9A	0,85	5.HCI	0,010
5A	5,0 1,0	14A	0,480
14	>1,0	13A	>1,0
7A	>1,0	8A	>1,0
17	0,350	17A	0,500
14B	0,045	6	0,040
18	0,025	19	0,045
20	0,030	21	0,42

-70CZ 292791 B6

Tabulka 4

Inhibice růstu nádorových buněk

Stanovení buněčného povlaku

Vzorek	Nádor (T-24) IC50(gM)	Nádor (DLD-1) IC5o (μΜ)	Nádor (SW620) ΙΟ50(μΜ)	Normální IC50 (μΜ)
1	<1,6	-	-	>25
4	3,1	-	-	>25
7	<1,6	<1,6	6.25	>25
5B	<1,6	3,1	10	>25
13B	<1,6	3,1	>3,1	25
11B	<1,6	8	18	>25
9A	<1,6	12,5	12,5	18
10A	<1,6	2,0	1,6	8
5	<1,6	3,1	6,25	>25
14A	<1,6	6,25	12,5	>25
13A	3,1	6,25	6,25	>25
7B	<1,6	1,6	3,1	>25
8A	<1,6	<1,6	3,1	>25
2	<1,6	6,25	6,25	>25
16B	<1,6	6,25	25	>25
8	<1,6	3,1	3,1	>25
15	3,1	6,25	>6,25	>25
11A	<1,6	<1,6	>6,25	>25
9	<1,6	<1,6	6,25	>25
10	<1,6	<1,6	3,1	>25
12A	<1,6	2,0	4	>25
5A	12,5	12,5	>25	>25
14	<1,6	6,25	>12,5	>25
13	<1,6	3,1	>1,6	>25
8B	<1,6	<1,6	3,1	>25
17	1,6	6,25	25	>25
17A	3,1	4	18	>25
10B	<1,6	1,6	1,6	>25
12B	<1,6	3,1	6,25	>25
7A	<1,6	1,6	3,1	>25
6	<1,6	4,0	6,24	—
19	<1,6	<1,6	6,25	>25

Průmyslová využitelnost:

Sloučeniny z tohoto vynálezu se používají v farmaceutických prostředcích pro léčbu proliferativních chorob a nádorových onemocnění.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát tricyklického amidu, který je vybraný ze skupiny, která se skládá z:

   -72CZ 292791 B6 (-) - enantioiner

   -73CZ 292791 B6

   -74CZ 292791 B6 nebo farmaceuticky přijatelných solí těchto sloučenin.
2. 2. Deriváty tricyklického amidu podle nároku 1, který je vybraný ze skupiny,která se skládá z:

   -75CZ 292791 B6

   -76CZ 292791 B6 (-) - enantiomer

   -77f (xci-o) nh₂

   Br

   -78CZ 292791 B6
3. 3. Derivát tricyklického amidu podle nároku 1, který je vybraný ze skupiny, která se skládá z:

   (-) - enantiomer

   -79CZ 292791 B6
4. 4. Derivát tricyklického amidu podle nároku 1, který je vybraný ze skupiny, která se skládá z:

   -80CZ 292791 B6 (+)-enantiomer (+) - enantiomer (+) - enantiomer (+)-enantiomer

   -81 CZ 292791 B6
5. 5. Derivát tricyklického amidu podle nároku 1, který je vybraný ze skupiny, která se skládá z:
6. 6. Derivát tricyklického amidu podle nároku 5, který má strukturní vzorec:

   -82CZ 292791 B6
7. 7. Derivát tricyklického amidu podle nároku 5, který má strukturní vzorec:

   (+) - enanliomer
8. 8. Derivát tricyklického amidu podle nároku 5, který má strukturní vzorec:

   5
9. 9. Derivát tricyklického amidu podle nároku 1, který má strukturní vzorec:
10. 10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství derivátu tricyklického amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
11. 11. Použití derivátu tricyklického amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro inhibici famesyl protein transferá2y.
12. 12. Použití derivátu tricyklického amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva 15 pro léčení rakoviny pankreatu, rakoviny plic, myeloidní leukémie, thyroidní rakoviny folikula, myelodysplastického syndromu, epidermálního karcinomu, nádoru močového měchýře, rakoviny tračníku, rakoviny prsu nebo rakoviny prostaty.

    -83CZ 292791 B6
13. 13. Použití derivátu tricyklického amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro inhibici abnormálního růstu buněk,

    5
14. 14. Použití tricyklcikého amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro inhibici abnormálního růstu buněk, kde inhibované buňky jsou nádorové buňky, které se vyznačují aktivovanými Ras onkogeny.
15. 15. Použití derivátu tricyklického amidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva ío pro inhibici abnormálního růstu buněk, přičemž inhibované buňky jsou buňky, kde Ras protein je aktivován jako výsledek onkogenní mutace v jiných genech než je Ras gen.
16. 16. Použití derivátu tricyklického amidu podle nároku 8, pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny pankreatu, rakoviny plic, myeloidní leukémie, thyroidní rakoviny folikula, myelodysplastického

    15 syndromu, epidermální karcinomu, karcinomu močového měchýře, rakoviny tračníku, rakoviny prsu nebo rakoviny prostaty.