ES2247158T3

ES2247158T3 - Nuevos derivados de al coumarina y sales de los mismos, procedimiento para su preparacion y su uso en el campo farmaceutico.

Info

Publication number: ES2247158T3
Application number: ES01962875T
Authority: ES
Inventors: Marco Prosdocimi; Giampaolo Menon; Giovanni Monastra; Enrico Galbiati; Mario Finesso
Original assignee: Bausch and Lomb Inc
Current assignee: Bausch and Lomb Inc
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-26
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2021-07-26
Also published as: EP1307438B1; ITPD20000193A0; AU8395901A; WO2002010148A1; DE60113278D1; JP2004505072A; CA2417788A1; US20040023893A1; AU2001283959B2; AU2001283959B8; IT1317356B1; EP1307438A1; ITPD20000193A1; DE60113278T2

Abstract

Nuevos derivados de cumarina y sales de los mismos, procedimiento para su preparación y su uso en el campo farmacéutico. La presente invención se refiere a nuevos derivados de cumarina, a las sales de dichos compuestos, particularmente aquellas obtenidas con bases o ácidos aceptables farmacéuticamente y a los procedimientos para la preparación de las mismas. Los nuevos derivados de cumarina y las sales de acuerdo con la presente invención tienen propiedades farmacológicas interesantes y por lo tanto pueden usarse para mejorar el tratamiento de patologías importantes tales como isquemia periférica e isquemia de órganos, alteraciones eléctricas del miocardio y otros órganos que se producen por la liberación de moléculas proinflamatorias (TNF, IL-1, NO, etc.), vasculopatías cerebrales y periféricas, afecciones de tipo anginoso, hipercolesterolemia, infecciones sistémicas tal como sepsis, patologías alérgicas tales como asma, rinitis, eczema, dermatitis, tales como antitrombóticos y antihipertensivos. La presente invención también incluye preparaciones que contienen uno o más de dichos derivados o sus sales en forma de cápsulas, comprimidos, soluciones inyectables, vaporizadores y sistemas de liberación controlada, cremas, geles y sistemas transdérmicos.

Description

Nuevos derivados de cumarina y sales de los mismos, procedimiento para su preparación y su uso en el campo farmacéutico.

La presente invención se refiere a nuevos derivados de cumarina, a las sales de dichos compuestos, particularmente aquellas obtenidas con bases o ácidos aceptables farmacéuticamente y a los procedimientos para la preparación de las mismas.

Los nuevos derivados de cumarina y las sales de acuerdo con la presente invención tienen propiedades farmacológicas interesantes y por lo tanto pueden usarse para mejorar el tratamiento de patologías importantes tales como isquemia periférica e isquemia de órganos, alteraciones eléctricas del miocardio y otros órganos que se producen por la liberación de moléculas proinflamatorias (TNF, IL-1, NO, etc.), vasculopatías cerebrales y periféricas, afecciones de tipo anginoso, hipercolesterolemia, infecciones sistémicas tal como sepsis, patologías alérgicas tales como asma, rinitis, eczema, dermatitis, tales como antitrombóticos y antihipertensivos. La presente invención también incluye preparaciones que contienen uno o más de dichos derivados o sus sales en forma de cápsulas, comprimidos, soluciones inyectables, vaporizadores y sistemas de liberación controlada, cremas, geles y sistemas trans-
dérmicos.

Antecedentes de la invención

Las cumarinas incluyen una larga clase de sustancias fenólicas que se encuentran en plantas y están constituidas por un anillo benceno y un anillo \alpha-pirona fusionados juntos. Hasta la fecha, se han identificados 1300 cumarinas, principalmente como metabolitos de plantas verdes, hongos y bacterias.

El Cloricromeno (nombre comercial Proendotel) pertenece a una familia de cumarinas y se prepara mediante el procedimiento descrito en las patentes de EEUU Nº 4.296.039 y 4.452.811.

Además de sus conocidas propiedades de vasodilatador coronario y antiarrítmico (Pat. de EEUU Nº 4.349.566) y propiedades de antiagregante plaquetario (Pat. de EEUU Nº 4.362.741), se ha visto que el cloricromeno es capaz de inhibir muchas de las funciones celulares de los leucocitos polimorfonucleares (Bertocchi y col.: Arch. Pharmacol. 1989, 339, 697-703; Gresele y col.: Biochem. Pharmacol. 1993, 45, 123-130) y puede tener efectos positivos en la interacción bioquímica entre diferentes especies de células, en particular entre plaquetas y leucocitos polimorfonucleares (Zatta y col.: Eur. J. Pharmacol. 1991, 198, 97-100), que se sabe son relevantes en los estados trombóticos e isquémicos.

El cloricromeno también tiene un efecto que se ha documentado en modelos de isquemia y reperfusión en varios órganos, en los que también están involucradas citoquinas de tipo inflamatorio, tal como TNF (Squadrito y col.: Life Sciences 1993, 53, 341-355), y su actividad se conoce también en el tratamiento de patologías ligadas a procesos de vasodilatación y de daño tisular caracterizadas por un aumento en la producción de óxido de nitrógeno (patente del Solicitante Nº IT 1265665), tales como, por ejemplo inflamación pulmonar, edema, eritema, dermatitis, soriasis, úlceras de la piel, artritis, artritis reumatoide y otras afecciones autoinmunes, shock hipotensivo, shock séptico, shock hipovolémico, vasculitis tales como inflamaciones consecuentes en la tromboflebitis, colitis ulcerosa.

Descripción detallada de la invención

En vista de estas propiedades conocidas del Cloricromeno y dado que se sabe que las citoquinas son potentes agentes proinflamatorios, se prepararon y probaron una serie de compuestos para estudiar su actividad in vitro e in vivo en la síntesis de citoquinas tal como TNF, como así también para estudiar su acción en otros fenómenos celulares, tales como la agregación plaquetaria y la producción de radicales libres, como también su acción en modelos de inflamación in vivo. Entre los fármacos usados actualmente en los procesos antiinflamatorios, los compuestos no esteroides se conocen por su pobre o nula capacidad de inhibir la liberación de citoquinas inflamatorias, las que son, por el contrario, inhibidas por los compuestos de tipo esteroide. Mientras que estos compuestos tienen varias actividades tóxicas, la disponibilidad de productos no esteroides específicamente activos en la síntesis de citoquinas es particularmente útil en el desarrollo de terapias novedosas.

Los resultados experimentales obtenidos demostraron que los compuestos que son objeto de la presente invención tienen actividades que son mejores y diferentes que aquellas del cloricromeno. En particular, se observó que algunos compuestos tienen acciones más potentes que el cloricromeno en la síntesis de TNF, una citoquina inflamatoria conocida y no son activos en el proceso de agregación plaquetaria y en la liberación de radicales libres.

Esta selectividad de acción incrementada hace que los compuestos de la presente invención sean ventajosos terapéuticamente.

Además, la caracterización in vivo indicó que los compuestos de la invención tienen menor toxicidad que el cloricromeno, como lo demuestra el hecho de que sólo se observan efectos tóxicos o letales en dosificaciones altas.

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Por lo tanto, debido a la estricta relación entre los compuestos libres y las sales de la presente invención, siempre que sea factible, todo lo indicado de ahora en adelante con respecto a las sustancias libres también será cierto para sus sales.

Los compuestos de la presente invención son los siguientes:

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Éstos fueron probados en varios modelos in vivo e in vitro:

- inhibición de la liberación de TNF tras la estimulación con LPS in vitro

- inhibición de la liberación de TNF e IL-1\beta tras la estimulación con LPS in vivo

- reducción de la inflamación en edema de pata de rata inducido con carragenina

- inhibición de la liberación de nitrito-nitrato en plasma de rata

- inhibición de la formación de aniones superóxido inducido por f-MLP en sangre entera humana

- inhibición de la agregación plaquetaria en sangre entera humana

- toxicidad aguda posterior a una única administración intravenosa

- mutagénesis (prueba Mini-Ames)

Prueba 1

Inhibición de la liberación de TNF tras la estimulación con LPS in vitro

Se agregó el compuesto en prueba al medio de cultivo en una línea de macrófago murino (J774) o a sangre entera anticoagulada con heparina. Posteriormente las células se estimularon con lipopolisacárido bacteriano. Tras la incubación a 37ºC durante un tiempo adecuado, se eliminó el sobrenadante del cultivo y se lo incubó con una línea de fibroblastos murinos (L929), sensibles a TNF. La cantidad de TNF liberado tras la estimulación con LPS se mide comparando la mortalidad de las células L929 con las de los controles. La Tabla 1 describe la concentración (\pm error estándar) para un único compuesto capaz de inhibir la mortalidad de fibroblastos (L929) al 50%.

TABLA 1

Compuesto	J774 CI_{50}(mcM)	Sangre humana CI_{50} (mcM)
201006 (Proendotel®)	57,9 \pm 20	78,6 \pm 10
201261	25,4	9
201273	27,5 \pm 5,3	40,4 \pm 13,5
201326	10,5 \pm 3,0	23 \pm 2,0

Prueba 2

Inhibición de la liberación de TNF e IL-1\beta tras la estimulación con LPS in vivo

Se inyectaron ratas concientes con una dosis de LPS, la que es capaz de estimular la liberación de TNF e IL-1\beta, habiendo previamente recibido una administración intravenosa (15 minutos antes) del compuesto en prueba a una dosis de 0,5 mg/Kg o 2 mg/Kg. Se midieron los niveles de TNF e IL-1\beta por el método ELISA en muestras de sangre tomadas 75 minutos y 120 minutos después del LPS respectivamente.

La Tabla 2 a continuación informa el porcentaje de inhibición de cada producto comparado con los controles tratados con solución salina.

TABLA 2

Compuesto	Dosis de 0,5 mg/Kg	Dosis de 2 mg/Kg
	% de inhibición	% de inhibición	% de inhibición	% de inhibición
	de TNF	de IL-1\beta	de TNF	de IL-1\beta
201006 (Proendotel)	9	45	30	28
201273	72	67	84	39
201326	85	40	77	62

Prueba 3

Reducción de la inflamación en edema de pata de rata inducido con carragenina

Se usó un modelo de inflamación aguda inducido por la inyección intraplantar de 1,5 mg de carragenina en la pata de la rata. La administración de los compuestos (2 mg/Kg) fue por vía intravenosa 5 minutos antes de la inducción del edema: 3 horas antes los animales se sacrificaron y se pesaron sus patas como índice de inflamación. Los animales control recibieron solución salina en vez de los compuestos en prueba. El peso de las patas de los animales control se tomó como 100% en el índice de inflamación.

Los resultados se muestran en la Tabla 3

TABLA 3

Compuesto	% versus controles
201006 (Proendotel®)	79
201261	86
201273	67
201326	58
Indometacina	57
Metilprednisolona	56
Solución salina	100

Prueba 4

Inhibición de la liberación de nitrito-nitrato en plasma de rata

Se midió la liberación de nitrito-nitrato con el reactivo Griess en muestras de sangre tomadas 8 horas después de la administración intravenosa de LPS (0,1 mg/Kg).

Los animales fueron tratados con los compuestos por vía oral (25 mg/Kg) 30 minutos antes y 3 horas después de LPS. Los animales control recibieron solución salina en lugar de los compuestos en prueba y los valores para la liberación de nitrito-nitrato se tomaron como 100%. Los resultados se informan en la Tabla 4.

TABLA 4

Compuesto	% versus controles
201006 (Proendotel)	99
201261	98
201273	76
201326	62
Betametasona	20
Solución salina	100

Prueba 5

Inhibición de la formación de aniones superóxido inducido por f-MLP en sangre entera humana

Se incubaron muestras de sangre entera diluida con PBS Citocromo C durante 20 minutos a 37ºC con los compuestos en prueba o solución salina antes de agregar el agente quimiotáctico f-MLP (0,1 mcM/l) en presencia de citocalasina B. Tras 20 minutos de activación con este agente, las muestras se centrifugaron y se tomaron lecturas de los sobrenadantes con un espectrofotómetro para evaluar la disminución de Citocromo C. La Tabla 5 muestra las concentraciones que son eficaces para inhibir la pérdida de Citocromo C al 50%.

TABLA 5

Compuesto	CI_{50} mcM/l
201006 (Proendotel®)	52
201261	100
201273	>100
201326	>100
SOD (unidades/ml)	0,5

Prueba 6

Inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno en sangre entera humana

La agregación se analizó contando las plaquetas no agregadas con un contador celular 5 minutos después de agregar colágeno (1 mcg/ml). En estas condiciones de trabajo, el colágeno induce la agregación plaquetaria de más del 80%. Los compuestos en prueba o la solución salina como control se incubaron previamente durante 1 minuto antes del agregado de colágeno.

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TABLA 6

Compuesto	CI_{50} mcM/l
PG12	0,05
201006 (Proendotel)	35,0
201261	>100
201273	>100
201326	78

Prueba 7

Toxicidad posterior a una única administración intravenosa

Se usaron ratones machos CD-1 para evaluar la dosis máxima no letal (MNLD -dosis mayor con la que no se observan casos de mortalidad) y la dosis máxima tolerada (MTD - dosis con la que no se observan signos marcados o evidentes de toxicidad o comportamiento alterado). Los resultados se muestran en la Tabla 7.

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TABLA 7

Compuesto	DMT (mg/Kg)	DMNL (mg/Kg)
201006 (Proendotel)	6,25	12,5
201261	50	200
201273	25	100
201326	6,25	50

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Prueba 8

Mutagénesis (prueba Mini-Ames)

La prueba Mini-Ames es una versión de la prueba Ames tradicional que incluye la incubación de células bacterianas en placas de 35 mm en lugar de placas de 100 m y que requiere una cantidad menor de producto mientras se mantiene la fiabilidad del resultado.

La prueba se lleva a cabo en 2 cepas de Salmonella typhimurium que necesitan histidina (TA 98 y TA 100) y en dos cepas de Escherichia coli que necesitan triptofano (WP2 pKM101 y WP2 uvrA pKM1091).

Se expusieron las células bacterianas a diferentes concentraciones de los compuestos en prueba en presencia y en ausencia de una preparación microsomal de enzimas hepáticas para poner en evidencia cualquier posible actividad de los metabolitos.

La actividad mutagénica se determinó como la capacidad del compuesto en prueba para inducir un incremento significativo en el número de clones mutantes comparado con aquellos desarrollados espontáneamente en los cultivos con el vehículo control.

Los compuestos probados mostraron ser no mutagénicos.

Los compuestos de la invención pueden prepararse por procedimientos conocidos (condensación y rearreglo de Claisen, condensación de Pechmann, síntesis de Williamson, esterificación de Fischer). Las cumarinas se sintetizan por condensación entre una resorcina y un \beta-cetoéster. Pueden ser alquiladas sustituyendo los hidrógenos aromáticos al reaccionar con formaldehído y una amina. Alternativamente, es posible alquilar el oxhidrilo libre con un alilo y realizar una transposición térmica en el anillo aromático, o el oxhidrilo puede ser alquilado con un agente alquilante o con un espaciador (un dihaluro de alquilo o un haluro de alquilo sustituido con un anillo epoxi, un éster, una amina) que pueden posteriormente alquilarse.

El producto sintetizado puede experimentar hidrogenación para reducir el doble enlace entre las posiciones 3 y 4, o el oxígeno en posición 2 puede ser sustituido por reacción con el reactivo de Lawesson.

A continuación se describen algunos ejemplos de la preparación de derivados de cumarina de acuerdo con la presente invención:

Ejemplo 1 Preparación del compuesto FID 201261

Se forma una sal con diez gramos de 3-dietilaminoetil-4-metil-7-hidroxi-cumarina (0,0363 mol PM 275,35) y KOH en etanol (1:1 mol/mol), el solvente se evapora y el residuo se vuelve a disolver en 2-butanona con 6,0 g de epibromhidrina (0,044 mol PM 136,98) a reflujo durante 12 horas. La sal de KBr se filtra y se evapora el solvente. Se vuelve a disolver el residuo en acetato de etilo y se lava con NaOH 1N. Se seca y concentra la solución orgánica y se precipita con n-hexano, posteriormente se la seca bajo vacío. Se vuelve a disolver el residuo en agua, con agregado de 10,8 g de L-cisteína (0,0891 mol PM 121,16), se ajusta el pH hasta 9 y se deja reaccionar la mezcla bajo agitación a 37ºC. Doce horas más tarde, se purifica por cromatografía en gel de sílice con cloruro de metileno - metanol - amoníaco 30% en un gradiente de entre 80-15-2 y 60-30-7.

Las fracciones limpias se concentran, se disuelven nuevamente en etanol saturado con HCl bajo agitación durante una hora, se evaporan y liofilizan (rendimiento 6,1 g PM 553,55)

Ejemplo 2 Preparación del compuesto FID 201273

Se forma una sal con cinco gramos de 3-dietilaminoetil-4-metil-7-hidroxi-cumarina (0,0182 mol PM 275,35) y KOH en etanol (1:1 mol/mol), el solvente se evapora y el residuo se vuelve a disolver en 2-butanona con 9,1 g de epoxihexano (0,091 mol PM 100,16) a reflujo durante 48 horas. La sal de KBr se filtra y se evapora el solvente. Se vuelve a disolver el residuo en acetato de etilo y se lava con NaOH 1N, se concentra y purifica por cromatografía en gel de sílice con un eluente de cloruro de metileno - metanol - amoníaco 30%, en un gradiente de entre 98-2-0,2 y 90-5-0,4.

Las fracciones limpias se concentran, se disuelven nuevamente en acetato de etilo y se tratan con HCl en etanol hasta que el indicador rojo Congo vira su color, se concentra y cristaliza desde acetona-hexano 2:1 (rendimiento 3,1 g PM 411,97).

Ejemplo 3 Preparación del compuesto FID 201310

Se suspenden diez gramos de lactosa (0,0278 mol PM 360,32) en 51 g de anhídrido acético (0,5 mol PM 102,09) y se agregan gota a gota a 100 ml de anhídrido de piridina. Se deja reaccionar la mezcla durante la noche, luego se evapora y purifica por cromatografía en gel de sílice eluyendo con tolueno-acetona 4:1. Las fracciones puras se evaporan y la peracetil-lactosa resultante se seca en vacío, se suspende en 120 ml de N,N-dimetilformamida anhidra, se le agregan 5,7 g de carbonato de amonio (0,059 mol PM 96,09) y se deja reaccionar bajo agitación durante 24 horas, posteriormente se evapora y purifica en gel de sílice eluyendo con tolueno-acetona 9:1.

Las fracciones puras se evaporan y la hidroxiperacetil-lactosa resultante se seca en vacío, se disuelve en 250 ml de cloruro de metileno anhidro con 9,3 ml de tricloroacetonitrilo (0,0642 mol PM 144,4) y se trata con 0,5 g de hidruro de sodio (0,0214 mol PM 24), agitando durante 3 horas. La mezcla se concentra y purifica en gel de sílice eluyendo en un gradiente de tolueno-acetona de entre 9:1 y 7:3. Las fracciones puras se evaporan, el tricloroacetamidato de paracetil-lactosa se seca en vacío y se deja reaccionar con 3,0 g de 3-dietilaminoetil-4-metil-7-hidroxi-cumarina en 100 ml de cloruro de metileno anhidro, en presencia de tamices moleculares activados. Se agregan 3,2 g de trifluoro-etileterato de boro (0,0109 mol PM 295,68) y se deja reaccionar la mezcla durante 2 horas, luego se filtra, se lava con NaOH 1N, se seca, concentra y purifica por cromatografía en gel de sílice con un eluente de cloruro de metileno-metanol-amoníaco, 30%, a un gradiente de entre 90-5-0,4 y 80-20-0,4.

Las fracciones limpias se concentran, hidrolizan en 100 ml de NaOH 1N /tert-butanol 1:1 y se neutralizan con HCl. Se ajusta el pH hasta 8 con amoníaco y se extrae la mezcla con cloroformo/n-butanol 1:1.

Se evapora el solvente y se liofiliza el residuo (rendimiento 3,2 g PM 599,64).

Ejemplo 4 Preparación del compuesto FID 201326

5,6 g de 3-dietilaminoetil-4-metil-7-hidroxi-8-cloro-cumarina (0,018 mol PM 309,8) se someten a reflujo en tolueno con 9,1 g de 1,2-epoxihexano en presencia de 2 g de alúmina básica súper 1 durante 24 horas. Se filtra y elimina el material sólido, lavando con NaOH 1N. La mezcla se concentra y purifica por cromatografía en gel de sílice con un eluente de cloruro de metileno-metanol-amoníaco, 30%, en un gradiente de entre 98-2-0,2 y 90-5-0,4.

Las fracciones limpias se concentran, se disuelven nuevamente en acetato de etilo y se tratan con HCl en etanol hasta que el indicador rojo Congo vira su color, se filtra y cristaliza desde acetona (rendimiento 1,6 g PM 446,42).

Ejemplo 5 Preparación del compuesto FID 201359

Se forma una sal con diez gramos de 3-dietilaminoetil-4-metil-7-hidroxi-cumarina (0,0363 mol PM 275,35) y KOH en etanol (1:1 mol/mol). El solvente se evapora y el residuo se pone a reflujo con 2-butanona con 6,0 g de epibromhidrina (0,044 mol PM 136,98) durante 12 horas. La sal de KBr se filtra y se evapora el solvente. Se vuelve a disolver el residuo en acetato de etilo y se lava con NaOH 1N, se seca, se concentra, se precipita con n-hexano y se seca bajo vacío. Se vuelve a disolver el residuo en agua, con agregado de 14,5 g de N-acetil L-cisteína (0,0891 mol PM 163,19), se ajusta el pH hasta 9 y se deja reaccionar la mezcla bajo agitación a 37ºC. Doce horas más tarde, se liofiliza y purifica por cromatografía en gel de sílice con cloruro de metileno -metanol - amoníaco 30%, 80-25-5.

Las fracciones limpias se concentran y liofilizan desde HCl (rendimiento 10,0 g PM 531,07)

Ejemplo 6 Preparación de FID 201264

Se forma una sal con 30,3 g de 3-dietilaminoetil-4-fenil-7-hidroxi-cumarina (0,0802 mol PM 337,86) (preparado como se describe en el documento GB 1.013.053, ejemplo 1) y KOH en etanol (1:1 mol/mol); se evapora el solvente, se vuelve a disolver el residuo en 150 ml de DMSO y se agregan 26,5 g de 1-bromopropanol-2 (0,1605 mol, PM 165,07). Luego de 10 días en agitación a 50ºC, se agregan 300 ml de tolueno y 150 ml de agua. La fase orgánica se lava con NaOH 1 M, se concentra a sequedad bajo vacío. Se purifica el residuo por cromatografía en gel de sílice con eluente CH_{2}Cl_{2}-CH_{3}OH - amoníaco 30%, en un gradiente de entre 98-2-0,2 y 90-5-0,4. Las fracciones limpias se concentran a sequedad, se vuelve a disolver en acetato de etilo y se trata con HCl en etanol hasta que el indicador rojo Congo vira de color, posteriormente se concentra y liofiliza (rendimiento 13,5 g, PM 431,96).

Todos los productos fueron caracterizados y sus estructuras confirmadas por NMR y FT-IR.

Claims

1. Un derivado de cumarina seleccionado del grupo constituido por:

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y las sales de los mismos son ácidos o bases farmacéuticamente aceptables.

2. Composiciones farmacéuticas que contienen un derivado de cumarina como se reivindica en la reivindicación 1, en la forma de cápsulas, comprimidos, soluciones inyectables, vaporizadores, sistemas de liberación controlada, cremas, geles y sistemas transdérmicos.

3. Composiciones farmacéuticas como las reivindicadas en la reivindicación 2, para el tratamiento de patologías vasculares (incluyendo aquellas debidas a la liberación de moléculas pro inflamatorias), patologías dermatológicas y alérgicas, de hipercolesterolemia e infecciones sistémicas.

4. Composiciones farmacéuticas como las reivindicados en las reivindicaciones 2 y 3, para el tratamiento de vasculopatías periféricas, afecciones de tipo angina y vasculopatías cerebrales, isquemia periférica e isquemia de órganos.

5. Composiciones farmacéuticas como las reivindicadas en las reivindicaciones 2 y 3, para el tratamiento de trombosis e hipertensión.