ES2243994T3

ES2243994T3 - Procedimiento para la inactivacion virica de proteinas de la sangre liofilizadas.

Info

Publication number: ES2243994T3
Application number: ES97921280T
Authority: ES
Inventors: Prabir Bhattacharya; Toshiharu Motokubota
Original assignee: Probitas Pharma Inc
Current assignee: Probitas Pharma Inc
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-04-17
Also published as: DE69733664D1; EP0954326B1; CA2252374C; ATE298582T1; DE69733664T3; WO1997039761A1; US6566504B2; JP2000509374A; EP0954326A1; CA2252374A1; US20010047085A1; ES2243994T5; DE69733664T2; EP0954326A4; EP0954326B2

Abstract

SE PRESENTA UN PROCESO PARA LA INACTIVACION VIRAL DE PROTEINAS LIOFILIZADAS DE LA SANGRE, PARTICULARMENTE DEL FACTOR VIII, MEDIANTE CALOR, QUE COMPRENDE LA FORMACION DE UN COMPLEJO ESTABLE ENTRE LA PROTEINA DE LA SANGRE Y UNA CICLODEXTRINA EN UNA SOLUCION ACUOSA. LA SOLUCION SE LIOFILIZA ENTONCES Y SE RECUPERA EL COMPLEJO DE PROTEINA/CICLODEXTRINA DE LA SANGRE. LA PROTEINA/CICLODEXTRINA LIOFILIZADAS DE LA SANGRE SE CALIENTAN ENTONCES, POR EJEMPLO HASTA 80 C DURANTE 72 HORAS, PARA INACTIVAR CUALQUIER VIRUS PRESENTE. EL MATERIAL PUEDE RECONSTITUIRSE ENTONCES ANTES DE SU ADMINISTRACION A UN PACIENTE.

Description

Procedimiento para la inactivación vírica de proteínas de la sangre liofilizadas.

Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere a la inactivación de contaminantes víricos de preparados farmacéuticos. De manera más específica, la presente invención está dirigida a un proceso para la inactivación de contaminantes víricos de proteínas de la sangre liofilizadas, particularmente factor VIII, por la acción del calor.

Antecedentes de la invención

La utilización terapéutica primaria del factor VIII ha sido su administración intravenosa a pacientes de hemofilia A. En casos graves, se requieren concentraciones relativamente elevadas de factor VIII. Estas elevadas concentraciones se obtienen por purificación y concentración de factor VIII. El factor VIII se encuentra a disposición comercialmente en forma de polvo seco, estéril, liofilizado, que es reconstituido con agua destilada estéril o con una solución salina fisiológica estéril para infusión en un paciente de hemofilia A.

En la técnica conocida se describen varios métodos referentes al factor VIII. El documento WO-A-9 526 750 da a conocer formulaciones que comprenden el factor de coagulación VIII o IX para administración subcutánea, intramuscular o intradérmica, de forma que aditivos de ciclodextrinas incrementan la biodisponibilidad del factor VIII (ver página 8, líneas 19-28). Además, dichas formulaciones se encuentran en forma liofilizada y son reconstituidas con una solución acuosa (ver página 11, segundo párrafo). No obstante, no se hace mención en el documento WO-A-9 526 750 de un complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina que es calentado, como mínimo, a 60ºC.

El documento WO-A 9 003 784 da a conocer complejos de ciclodextrina-péptido, incluyendo factores VIII y IX (ver resumen página 21, líneas 15-25, página 27, líneas 4-7). No obstante, el documento WO-A-9 003 784 no indica nada sobre una etapa de calentamiento de dicho complejo de ciclodextrina-péptido a un mínimo de 60ºC.

La patente US-A-5 334 382 da a conocer compuestos de proteínas liofilizados, incluyendo sustancias de proteínas biológicamente activas combinadas con ciclodextrina (ver abstracto, columna 3, líneas 26-37, columna 4, línea 51 pasando a columna 5, líneas 1-37).

La patente US-A-5 304 546 se refiere a complejos de ciclodextrina con compuestos lipofílicos, en los que la presencia de compuestos biológicos, tales como sangre, huevo y leche son también contemplados (ver abstracto, columna 1, líneas 8-18).

El documento WO-A-9 309 790 da a conocer la combinación de derivados poliiónicos de ciclodextrina con un factor de crecimiento (ver abstracto, página 12, líneas 10-27, página 22, línea 30 con página 31, líneas 1-8). Ninguna referencia se hace en el documento WO-A-9 309 790 al calentamiento de un complejo liofilizado de una proteína y ciclodextrina.

El documento EP-A-614 666 da a conocer complejos de polipéptidos liofilizados con ciclodextrina a utilizar en soluciones parenterales (ver abstracto, página 3, líneas 9-12, reivindicaciones 1-13).

El documento WO-A-820 387 da a conocer un método de inactivación de virus en compuestos que contienen factores coagulantes de la sangre VII, IX y X por calentamiento de los compuestos en estado seco (ver abstracto, página 15, líneas 9-24, página 17, líneas 6-14). Además, en la página 6, líneas 11-15 se menciona la presencia de estabilizantes, tales como monosacáridos reductores, oligosacáridos y alcoholes de azúcar.

La publicación Pharmaceutical Research, 9(2), 1992, pp. 266-270, M.E. Ressing y otros, llega al resultado que la hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPbetaCD) es el estabilizante más efectivo del anticuerpo monoclonal liofilizado (MN12). Ressing y otros hacen referencia a la estabilidad de tortas de MN12 liofilizadas que contienen HPbetaCD, con respecto a alteraciones de carga inducidas por calor y pérdida de capacidad de unión a antígenos, con lo que los correspondientes preparados de MN12 son tratados a una temperatura de 56ºC. Ressing y otros no mencionan otras gamas de temperatura.

El problema que subyace en estos compuestos es que cualesquiera contaminantes víricos del factor VIII deben ser inactivados antes de que el preparado del factor VIII pueda ser utilizado clínicamente, evitando, de esta manera, la propagación de HIV, hepatitis, etc. Existen una serie de enfoques diferentes para inactivar virus en el factor VIII. Un enfoque consiste en calentar el producto liofilizado a un mínimo de 60ºC durante un mínimo de 10 horas. Habitualmente, los productos liofilizados son calentados a 60ºC o, incluso, a 80ºC durante 72 horas.

Se ha descubierto que un producto de factor VIII tratado térmicamente, liofilizado, requiere más tiempo de lo deseado en ser reconstituido, y, adicionalmente, el producto de factor VIII puede perder una parte sustancial de su actividad durante el proceso de liofilización y calentamiento. De acuerdo con ello, el calentamiento del factor VIII liofilizado durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, 80ºC durante 72 horas, para conseguir la inactivación vírica, no es un enfoque preferente.

Características de la invención

La presente invención da a conocer un procedimiento para la estabilización de proteínas de la sangre liofilizadas, particularmente factor VIII liofilizado, durante la inactivación vírica por la acción del calor. El proceso comprende el disponer una solución acuosa de proteína de la sangre. Se añade ciclodextrina a una solución en una cantidad suficiente para formar un complejo, como mínimo, con una parte de la proteína de la sangre y preferentemente la totalidad de la misma. La solución es liofilizada a continuación para conseguir un complejo seco de proteína de la sangre/ciclodextrina.

El complejo liofilizado de proteína de la sangre/ciclodextrina es calentado a continuación a una temperatura mínima de 60ºC, durante un tiempo suficiente para inactivar cualquier contaminante vírico y, más preferentemente, a un mínimo de unos 80ºC durante un tiempo mínimo de unas 10 horas y, preferentemente, un mínimo de 72 horas. El complejo víricamente inactivado de proteína de la sangre/ciclodextrina puede ser reconstituido posteriormente para conseguir una solución de la proteína de la sangre administrable a un paciente.

Se ha descubierto que la estabilización de una proteína de la sangre con ciclodextrina antes de liofilización resulta en una notable reducción de la desnaturalización de la proteína durante la inactivación vírica por acción de calor, en seco. De forma adicional, el tiempo de reconstitución para la proteína de la sangre liofilizada, estabilizada de acuerdo con la práctica de la presente invención, se reduce sustancialmente, con una reducción correspondiente de precipitados insolubles.

Los objetivos de la presente invención se consiguen mediante las reivindicaciones que se adjuntan.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor haciendo referencia a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y dibujos, en los que:

las figuras 1A-1C muestran, respectivamente, \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, y \gamma-ciclodextrina;

la figura 2 es un gráfico de barras, que indica la actividad residual del factor VIII como función de la concentración de hidroxi propil \beta-ciclodextrina; y

la figura 3 es un gráfico de barras que indica la actividad residual del factor VIII como función de la concentración de ciclodextrina.

Descripción detallada

La presente invención está dirigida a un procedimiento que incorpora la utilización de diferentes ciclodextrinas para estabilizar proteínas liofilizadas, durante la inactivación vírica por calor en seco, y para ayudar a reconstituir estas proteínas después de la inactivación vírica. Entre las proteínas de la sangre con las que se puede utilizar el presente proceso se incluyen albúmina, Factor II, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y X_{a}, fibrinógeno, antitrombina III, transferrina, haptoglobina, gama globulinas, fibronectina, proteína C, proteína S y trom-
bina.

Las ciclodextrinas son un grupo de oligosacáridos homólogos, que son obtenidos a partir del almidón por la acción de enzimas procedentes de Bacillus macerans. Son moléculas cíclicas que contienen seis o más unidades \alpha-D-glucopiranosa ligadas entre sí en las posiciones 1, 4, tal como en la amilosa. Esta estructura cíclica puede ser indicada también como toro.

Las ciclodextrinas útiles en la práctica de la presente invención son las \alpha-, \beta- y \gamma-ciclodextrinas, que están compuestas, respectivamente, de seis, siete y ocho unidades de \alpha-D-glucopiranosa, así como derivados, tales como hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.

Las figuras 1a, 1b y 1c muestran la estructura de tres de las ciclodextrinas más habituales. La \alpha-ciclodextrina tiene seis unidades de glucopiranosa, la \beta-ciclodextrina tiene siete unidades de glucopiranosa, y la \gamma-ciclodextrina tiene ocho unidades de glucopiranosa. Se incluyen mezclas de estos materiales en el término "ciclodextrina" que se utiliza en esta descripción.

La ciclodextrina puede ser añadida a una solución acuosa, que contiene la proteína de la sangre antes de liofilización en cualquier punto adecuado del proceso de purificación. Preferentemente, la ciclodextrina es añadida a una solución acuosa de la proteína de la sangre después de que se han completado todas las etapas de purificación. Esto se lleva a cabo para impedir que la ciclodextrina forme un complejo con impurezas, haciendo más difícil la eliminación de las impurezas.

La ciclodextrina se añade en una cantidad suficiente para asegurar la formación de un complejo con todas las proteínas de la sangre deseadas. Es adecuada para la mayor parte de aplicaciones una cantidad de ciclodextrina que proporcione una solución acuosa con una concentración de ciclodextrina mínima de 0,1%, preferentemente de
aproximadamente 0,8% a aproximadamente 5% en peso/volumen (peso/volumen), y, más preferentemente, 3% peso/volumen aproximadamente.

Se ha descubierto que la presencia de ciclodextrina durante inactivación vírica por acción del calor de la proteína de la sangre liofilizada reduce sustancialmente la desnaturalización de la proteína de la sangre. La actividad residual de la proteína de la sangre, después de la inactivación vírica por calor, en seco, a 80ºC durante 72 horas y reconstitución es, como mínimo, de 90% y, preferentemente, como mínimo de 95%, e incluso de modo más preferente, como mínimo, de 98% aproximadamente de la actividad de la proteína de la sangre antes de inactivación vírica.

También se ha descubierto que el tiempo de reconstitución se reduce sustancialmente por la presencia de ciclodextrina durante la liofilización y la activación por calor, en seco.

Ejemplo 1 Proceso general para la preparación de Factor VIII

En una realización a título de ejemplo, el material inicial para el liofilizado de factor VIII es plasma, congelado a una temperatura aproximada de -20ºC. El plasma es descongelado a una temperatura de 0º a 5ºC, durante cuyo tiempo se forma un precipitado (crioprecipitado) que se retira por centrifugación y se recupera para purificación y concentración adicionales.

El crioprecipitado es suspendido en agua destilada heparinizada (250 unidades de heparina o menos por mL) y es mezclada a 25 \pm 10ºC hasta que queda bien suspendida y el pH de la solución se ajusta a 7,0 \pm 1,0 con HCl diluido. El volumen de agua destilada de heparinizado utilizada es de 6 \pm 4 litros por kilo de crioprecipitado.

A continuación, se añadió PEG a la solución hasta una concentración final de 3 \pm 2% y se mezcló a 25 \pm 10ºC. El pH de la suspensión se ajustó a continuación de 6,5 \pm 1,0 con ácido acético diluido. La suspensión se mezcló a una temperatura de 25 \pm 10ºC durante un tiempo no inferior a 15 minutos. El precipitado formado se retiró por centrifugación.

El sobrenadante recuperado de la centrifugación fue filtrado para eliminar cualesquiera partículas sólidas, formando, de esta manera, una solución filtrada de factor VIII. Se añadieron Tri(n-butyl) fosfato (TNBP) y Polisorbato 80 a la solución de factor VIII filtrada hasta una concentración final de 0,30 \pm 0,02% TNBP volumen/peso y 1,00 \pm 0,05% de polisorbato 80 peso/peso. El pH de la mezcla fue ajustado a 6,5 \pm 1,0 con ácido acético diluido e hidróxido sódico. El producto fue transferido, a continuación, a un área de control vírico siguiendo 1 hora de incubación a 27ºC \pm 3ºC. La suspensión fue mezclada a 27ºC \pm 3ºC durante un tiempo no inferior a 6 horas y no superior a 12 horas para formar una solución de disolvente detergente (SD) de factor VIII.

La solución SD de factor VIII fue cargada en una columna cromatográfica de intercambio aniónico QAE-55OC con un tampón de unión que comprendía NaCl 0,35 M e histidina 0,025 M con un pH de 6,8. La columna fue lavada con un tampón de lavado que comprendía NaCl 0,35 M e histidina 0,025 M, con un pH de 6,8 y, a continuación, se lavó nuevamente con un tampón de lavado, comprendiendo CaCl_{2} a 0,1 M e histidina 0,025 M a un pH de 6,8. El factor VIII fue eluido con un tampón de elución, comprendiendo CaCl_{2} 0,2 M e histidina 0,025 M, con un pH de 6,8. El factor VIII fue entonces purificado adicionalmente, utilizando glicina y NaCl para precipitar el factor VIII. Se añadió la glicina al eluído hasta una concentración final de 2 M y, a continuación, se añadió NaCl hasta una concentración final de 1,6 M. La mezcla fue incubada a continuación durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada y el factor VIII precipitado fue recuperado. El precipitado de complejo de factor VIII fue reconstituido en una solución de arginina 0,1 M e histidina 0,025 M, con un pH de 7,3. Esta solución se indica también como "masa purificada". La actividad del factor VIII en la solución fue medida, y esta solución fue utilizada, a continuación, para otros pro-
cesos.

Ejemplo 2

En este ejemplo, una solución estéril de masa de factor VIII, según el Ejemplo 1, con la actividad específica de 370 unidades por miligramo, fue llenada en viales con diferentes aditivos y, a continuación, fue liofilizada. El producto liofilizado de factor VIII fue sometido, a continuación, a secado-calentamiento (DH) (80ºC durante 72 horas). Los preparados finales fueron reconstituidos con agua para inyección. El tiempo de reconstitución y la actividad residual del factor VIII se midieron durante un ensayo de coagulación de una etapa. Los resultados de las pruebas, que se indican en la siguiente tabla 1, muestran que el factor VIII que fue liofilizado a partir de la solución que comprendía 3% de ciclodextrina (hidroxipropil-\beta-ciclodextrina) era más estable que el factor VIII preparado utilizando diferentes cantidades de otros materiales, tales como albúmina, Tween 80®, PEG, glicina, citrato sódico, dextrina e histi-
dina.

TABLA I Rastreo de aditivo para factor VIII altamente purificado

Aditivo	F.VIII: U/ml	Tiempo de reconstitución
	antes de DH	después de DH	(seg.) después de DH
Sin aditivo	77,5 (100%)	45,1 (58%)	20
0,1% Tween 80®	71,8 ('')	18,4 (26%)	12
0,1% PEG	83,2 ('')	13,8 (17%)	>10 min
0,2M glicina	78,8 ('')	42,1 (53%)	15
0,2M Na citrato	92,8 ('')	26,1 (28%)	60
3% ciclodextrina	75,8 ('')	74,5 (98%)	<10
3% dextrina	79,2 ('')	43,1 (54%)	22
0,1M histidina	70,9 ('')	51,0 (72%)	10

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Ejemplo 3

En un experimento similar, se prepararon soluciones de control y de prueba utilizando 0,5% de albúmina y 3% de ciclodextrina como aditivos. Las soluciones fueron liofilizadas, y las muestras liofilizadas fueron sometidas a continuación a secado térmico a 80ºC durante 72 horas. Los resultados de la prueba se muestran en la siguiente tabla II. Se muestra que el factor VIII asociado con ciclodextrina al 3% era sustancialmente más estable cuando se calentaba en seco que con el factor VIII estabilizado con 0,5% de albúmina solamente.

TABLA II Actividad del producto en la etapa de calentamiento en seco

Aditivo	Calentamiento en seco (80ºC, 72 horas)	F.VIII:C. U/ml (%)
Sin aditivo	antes DH	132 (100)
	después DH	86 (65)
0,5%-albúmina	antes DH	128 (100)
	después DH	98 (77)
3%-ciclodextrina (HPB)	antes DH	127 (100)
	después DH	114 (90)

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Ejemplo 4

En otra prueba, la concentración óptima de ciclodextrina utilizada para estabilizar el factor VIII fue estudiada midiendo la actividad residual del factor VIII como función de la concentración de la ciclodextrina utilizada en la solución antes de liofilización y calentamiento en seco. Los resultados, que se indican en la figura 2, muestran que, para la concentración de 0,2% de ciclodextrina, la actividad residual del factor VIII era aproximadamente del 62%; para una concentración de 3% de ciclodextrina, la actividad de factor VIII era aproximadamente de 98-99%, mientras que para una concentración de 5% de ciclodextrina, la actividad residual descendió aproximadamente a 88%-
90%.

Ejemplo 5

En otra prueba el factor VIII fue estabilizado con tres ciclodextrinas distintas, a saber, hidroxipropil-\beta-ciclodextrina al 3%, metiléter-\beta-ciclodextrina al 3%, y \gamma-ciclodextrina al 3%. Los resultados de esta prueba se indican en la siguiente tabla III, mostrando que cada una de las tres diferentes ciclodextrinas utilizadas era eficaz en la estabilización del factor VIII.

TABLA III

Aditivo	Calentamiento en seco (80ºC, 72 horas)	F.VIII:C U/ml (%)
3% hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (HPB)	antes DH	58 (100)
	después DH	52 (90)
3% metil éteres-\beta-ciclodextrina	antes DH	68 (100)
	después DH	69 (101)
3% \gamma-ciclodextrina	antes DH	54 (100)
	después DH	61 (113)

Las descripciones anteriores de realizaciones de procesos a título de ejemplo para la preparación de productos de Factor VIII estabilizados tienen objetivo ilustrativo. El ámbito de la invención es el que se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Procedimiento para la inactivación de contaminantes víricos de proteínas, que comprende las siguientes etapas:

(a) disponer una solución acuosa de proteína;

(b) añadir a la solución una ciclodextrina en una cantidad suficiente para formar un complejo estable con la proteína;

(c) liofilizar la solución de la etapa (b) y recuperar el complejo de proteína liofilizada/ciclodextrina; y

(d) calentar el complejo de proteína liofilizada/ciclodextrina a un mínimo de 60ºC durante un tiempo suficiente para inactivar cualesquiera virus presentes en el complejo de proteína/ciclodextrina.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la ciclodextrina es seleccionada del grupo que consiste en \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina y \gamma-ciclodextrina, y mezclas de las mismas.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la ciclodextrina es añadida en una cantidad suficiente para conseguir una concentración de ciclodextrina mínima de 0,1% (peso/volumen).

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina recuperado en la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de unos 60ºC, durante un tiempo mínimo de 10 horas.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina recuperado en la etapa (c) es calentado a una temperatura, como mínimo, de unos 80ºC durante un mínimo de 72 horas.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa que reconstituye el complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que se añade ciclodextrina a la solución de la etapa (a) hasta una concentración comprendida aproximadamente entre 0,8% y 5% (peso/volumen).

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la ciclodextrina es añadida a la solución de la etapa (a) a una concentración aproximada de 3% (peso/volumen).

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proteína es seleccionada del grupo que consiste en albúmina, Factor II, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y X_{a}, fibrinógeno, antitrombina III, transferina, haptoglobina, gama globulinas, fibronectina, proteína C, proteína S, trombina y inhibidor de C1.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que la proteína es Factor VIII.

11. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que la actividad residual de la proteína después de liofilización, calentamiento y reconstución es, como mínimo, de 90% de la actividad de la proteína antes de liofilización.

12. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que la actividad residual de la proteína después de liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo, aproximadamente 95% de la actividad de la proteína antes de liofilización.

13. Procedimiento para la inactivación vírica de contaminantes del factor VIII, que comprende las siguientes etapas:

(a) disponer una solución acuosa de Factor VIII;

(b) añadir a la solución una ciclodextrina seleccionada del grupo que consiste en \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina y \gamma-ciclodextrina, de manera que la solución tiene una concentración de ciclodextrina comprendida aproximadamente de 0,1% a 3% (peso/volumen) para formar de esta manera un complejo Factor VIII/ciclodextrina;

(c) liofilizar la solución de la etapa (b) y recuperar el complejo liofilizado de Factor VIII/ciclodextrina; y

(d) calentar el complejo liofilizado de Factor VIII/ciclodextrina a un mínimo de 60ºC durante un tiempo suficiente para inactivar cualesquiera virus presentes en el complejo de Factor VIII/ciclodextrina.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el complejo de Factor VIII/ciclodextrina liofilizado recuperado de la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de unos 60ºC durante un mínimo de unas 10 horas.

15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el complejo de Factor VIII/ciclodextrina liofilizado recuperado en la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de unos 80ºC durante un mínimo de unas 72 horas.

16. Procedimiento, según la reivindicación 13, que comprende además la etapa de reconstituir el complejo liofilizado de Factor VIII/ciclodextrina.

17. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que se añade ciclodextrina a la solución de la etapa (a) a una concentración aproximadamente comprendida entre 0,8% y 5% (peso/volumen).

18. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que la ciclodextrina se añade a la solución de la etapa (a) en una concentración aproximada de 3% (peso/volumen).

19. Procedimiento, según la reivindicación 16, en el que la actividad residual del factor VIII después de liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo, 90% aproximadamente de la actividad de Factor VIII antes de la liofilización.

20. Procedimiento, según la reivindicación 16, en el que la actividad residual del Factor VIII después de liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo, 95% de la actividad del Factor VIII antes de la liofilización.