ES2231725T3 - 3,5-diamino-1,2,4-triazoles como agentes inhibidores de cinasas. - Google Patents

3,5-diamino-1,2,4-triazoles como agentes inhibidores de cinasas.

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ES2231725T3
ES2231725T3 ES02771564T ES02771564T ES2231725T3 ES 2231725 T3 ES2231725 T3 ES 2231725T3 ES 02771564 T ES02771564 T ES 02771564T ES 02771564 T ES02771564 T ES 02771564T ES 2231725 T3 ES2231725 T3 ES 2231725T3
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disease
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Orlin Petrov
Karl-Heinz Thierauch
Gerhard Siemeister
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Abstract

Compuestos de la fórmula general I R1 representa un heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo, y R2 representa un arilo o heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo, así como sus isómeros y sales.

Description

3,5-Diamino-1,2,4-triazoles como agentes inhibidores de cinasas.
El presente invento se refiere a 3,5-diamino-1,2,4-triazoles como agentes inhibidores de cinasas, a su preparación, así como a su utilización como medicamento para el tratamiento de diferentes enfermedades.
La inhibición de la angiogénesis es una posible modalidad de tratamiento para enfermedades tumorales. En este contexto, el abastecimiento de un tumor que está creciendo se empeora por una inhibición del crecimiento concomitante uniforme del sistema vascular sanguíneo. Esto conduce por lo menos a un crecimiento decelerado, a la estabilización del estado existente o, con frecuencia, a una regresión. Como importantes emisores de señales se han reconocido para el crecimiento vascular los factores de crecimiento VEGF (de vascular endothelial growth factor = factor de crecimiento endotelial vascular) y para la estabilización vascular el PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) y el Tie2. Las respectivas carencias de genes (gen-knock-out) de los factores de crecimiento y sus receptores condujeron a un fenotipo vascular letal en el estadio embrionario. Los tumores son caracterizados por un crecimiento celular acelerado en comparación con un tejido normal. La inhibición del crecimiento y la apoptosis siguiente de células tumorales constituyen un principio de muchos agentes citostáticos y medicamentos citotóxicos con indicaciones en tumores. Mediante el conocimiento profundizado, que se ha elaborado en la biología acerca de los mecanismos de la proliferación, se ha conseguido identificar esenciales reguladores del ciclo celular, que son activados al efectuarse la división celular. Son muy importantes los cometidos de las CDK's (cell cycle dependent kinases = cinasas dependientes del ciclo celular), que funcionan como sitios de conmutación centrales (primordiales) en las diferentes fases de la división celular. Si se consigue vincular la inhibición de la transmisión de señales, que es necesaria para una formación ordenada de vasos sanguíneos, con la inhibición del ciclo celular, que es una premisa tanto para un tumor como también para las células de paredes de vasos sanguíneos, entonces aparece una inhibición del crecimiento del tumor, que va esencialmente más lejos que si se inhibiría sólo uno de los dos procesos.
Ya es conocido que los 1,2,4-triazoles se emplean como agentes inhibidores de la deshidrogenasa de monofosfato de inosina (IMPDH) y por consiguiente encuentran utilización como agentes supresores de inmunidad, agentes anticancerosos, compuestos anti-hiperproliferativos vasculares, agentes inhibidores de inflamaciones, compuestos anti-micóticos, anti-psoriásicos y anti-víricos (documento de solicitud de patente internacional WO 00/25780).
Sin embargo, no es conocido su efecto como agentes inhibidores de las cinasas.
A causa de las interesantes propiedades de esta clase de compuestos, sigue existiendo todavía una gran necesidad de compuestos que sean más selectivos y en particular más eficaces para el tratamiento de diferentes enfermedades.
Se encontró, por fin, que los compuestos de la fórmula general I
1
en la que
R^{1}
representa un heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo, y
R^{2}
representa un arilo o heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo,
\quad
así como sus isómeros y sales,
poseen, por un lado, una alta potencia en la transmisión de señales para procesos relevantes en la angiogénesis, mediante bloqueo de las cinasas de tirosina de receptores e influyen, por otro lado, sobre la proliferación celular mediante una inhibición de las cinasas de ciclos celulares de serina / treonina.
Como consecuencia de ello, los compuestos conformes al invento se pueden utilizar para el tratamiento de las más diferentes enfermedades de tumescencia (tumorales) con inclusión de enfermedades proliferativas hemangiogenéticas. Entre éstas se cuentan por ejemplo cánceres, tales como tumores sólidos y leucemia, enfermedades autoinmunitarias tales como psoriasis, alopecia y esclerosis múltiple, alopecia y mucositis que han sido inducidas por agentes quimioterapéuticos, enfermedades cardiovasculares, tales como estenosis, arteriosclerosis y reestenosis, enfermedades infecciosas tales como p.ej. las provocadas por parásitos unicelulares, tales como tripanosomas, toxoplasmas o plasmodios, o por hongos, enfermedades nefrológicas, tales como p.ej. glomerulonefritis, enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, demencia causada por SIDA y la enfermedad de Alzheimer, enfermedades neurodegenerativas agudas, tales como isquemias del cerebro y traumas neuronales, infecciones víricas, tales como p.ej. infecciones de citomegalia, herpes, hepatitis B y C y enfermedades causadas por HIV (virus de la inmunodeficiencia humana).
Como especialmente valiosos se han mostrado los compuestos de la fórmula general I, en la que
R^{1}
representa el grupo
2
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X en el anillo representa un átomo de nitrógeno, y
R^{3}
representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{10}, halógeno-alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno-alcoxi C_{1}-C_{10}, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi o el grupo -NR^{4}R^{5},
R^{2}
representa el grupo
3
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, nitro, ciano, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{10}, halógeno-alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno-alcoxi C_{1}-C_{10}, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, alquil C_{1}-C_{10}-carbonilo, alcoxi C_{1}-C_{10}-carbonilo o el grupo -NR^{4}R^{5}, así como sus isómeros y sales.
Por un alquilo se ha de entender en cada caso un radical alquilo lineal o ramificado, tal como por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo, terc.-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo, siendo preferidos los radicales alquilo C_{1-6}.
Por un alcoxi se ha de entender en cada caso un radical alcoxi lineal o ramificado, tal como por ejemplo metiloxi, etiloxi, propiloxi, isopropiloxi, butiloxi, isobutiloxi, sec.-butiloxi, terc.-butiloxi, pentiloxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi o deciloxi, siendo preferidos los radicales alcoxi C_{1-6}.
Por un halógeno ha de entenderse en cada caso fluoro, cloro, bromo o yodo.
El radical arilo tiene en cada caso 6 - 12 átomos de carbono, tal como por ejemplo naftilo, bifenilo y en particular fenilo.
El radical heteroarilo puede estar en cada caso condensado con benzo. Por ejemplo, se han de mencionar como radicales heteroaromáticos con un anillo de 5 miembros: tiofeno, furano, oxazol, tiazol, imidazol y derivados con benzo de éstos, y como radicales heteroaromáticos con anillo de 6 miembros: piridina, pirimidina, triazina, quinolina, isoquinolina y derivados con benzo de éstos.
Si está contenida una función de carácter ácido, como sales son apropiadas las sales fisiológicamente tolerables de bases orgánicas e inorgánicas, tales como por ejemplo las sales bien solubles de metales alcalinos y alcalino-térreos, así como las de N-metil-glucamina, dimetil-glucamina, etil-glucamina, lisina, 1,6-hexano-diamina, etanolamina, glucosamina, sarcosina, serinol, tris-hidroxi-metil-amino-metano, amino-propanodiol, la base de Sovak y 1-amino-2,3,4-butano-triol.
Si está contenida una función de carácter básico, son apropiadas las sales fisiológicamente tolerables de ácidos orgánicos e inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido tartárico, etc.
Como especialmente eficaces se han manifestado los compuestos de la fórmula general I, en la que
R^{1}
representa el grupo
4
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X en el anillo representa un átomo de nitrógeno, y
R^{3}
representa hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{6},
R^{2}
representa el grupo
5
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o halógeno-alquilo C_{1}-C_{6}, así como sus isómeros y sales.
Como muy especialmente eficaces se han manifestado los compuestos de la fórmula general I, en la que
R^{1}
representa el grupo
6
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{4}
independientemente uno de otro, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X representa un átomo de nitrógeno,
X^{5} hasta X^{7}
representan el grupo CR^{3},
R^{3}
representa hidrógeno, metoxi, bromo, cloro o metilo,
R^{2}
representa el grupo
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, metilo o trifluorometilo, así como sus isómeros y sales.
Preparación de los compuestos conformes al invento
Los siguientes Ejemplos explican la preparación de los compuestos conformes al invento, sin limitar el alcance de los compuestos reivindicados a estos ejemplos.
Los compuestos conformes al invento se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la bibliografía, de acuerdo con la siguiente reacción (p.ej.: J. Heterocyclic Chem., 19, 1205 (1982) y J. Heterocyclic Chem., 24, 275 (1987)):
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Una hetarilamina se puede hacer reaccionar en el seno de un apropiado disolvente, tal como p.ej. etanol, isopropanol, dioxano o acetonitrilo, con el ciano-carboximidato de difenilo comercial a una temperatura comprendida entre 20ºC y la temperatura de ebullición del disolvente. La N-ciano-O-fenil-isourea obtenida se hace reaccionar en el seno de un apropiado disolvente, tal como p.ej. metanol, con una hidrazina correspondientemente sustituida, a una temperatura comprendida entre 20ºC y la temperatura de ebullición del disolvente para formar los derivados de 3,5-diamino-1,2,4-triazol conformes al invento.
Si es que no se describe la preparación de los compuestos de partida, entonces es que éstos son conocidos o se pueden preparar de una manera análoga a la de compuestos conocidos o a procedimientos aquí descritos. También es posible llevar a cabo todas las reacciones aquí descritas en reacciones paralelas o mediante técnicas de trabajo combinatorias. Las mezclas de isómeros se pueden separar de acuerdo con métodos usuales, tales como por ejemplo cristalización, cromatografía o formación de sales, en los enantiómeros o bien isómeros E/Z.
La preparación de las sales se efectúa de un modo usual, mezclando una solución del compuesto de la fórmula I con la cantidad equivalente o con un exceso de una base o de un ácido, que eventualmente está en la forma de una solución, y separando el precipitado o tratando la solución de un modo usual.
Ejemplo 1 5-Amino-1-(2-piridinil)-3-(3-piridinilamino)-1H-1,2,4-triazol
527 mg de N^{1}-ciano-N^{2}-(3-piridil)-O-fenil-isourea se disuelven en 10 ml de metanol, se mezclan con 295 mg de 2-hidrazino-piridina y se calientan a reflujo durante 10 horas. Después del enfriamiento, el precipitado se filtra con succión, se lava con metanol y se seca. Se obtienen 362 mg (63,5% del rendimiento teórico) de 5-amino-1-(2-piridinil)-3-(3-piridinilamino)-1H-1,2,4-triazol con el punto de fusión de 256ºC.
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 5-Amino-1-(2-piridinil)-3-(2-piridinilamino)-1H-1,2,4-triazol
97 mg de N^{1}-ciano-N^{2}-(2-piridil)-O-fenil-isourea se disuelven en 2 ml de metanol, se mezclan con 51 mg de 2-hidrazino-piridina y se calientan a reflujo durante 24 horas. Después del enfriamiento, el precipitado se filtra con succión, se lava con metanol y se seca. Se obtienen 15 mg (14,7% del rendimiento teórico) de 5-amino-1-(2-piridinil)-3-(2-piridinilamino)-1H-1,2,4-triazol con el punto de fusión de 332ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de los compuestos de partida 1)
\;
N^{1}-Ciano-N^{2}-(2-piridil)-O-fenil-isourea
443 mg de 2-amino-piridina y 953 mg de ciano-carboximidato de metilo se agitan a 60ºC durante 5 horas en el seno de 9,5 ml de 1,4-dioxano. El disolvente se separa por destilación y el residuo se purifica por cromatografía en columna a través de gel de sílice con mezclas de cloruro de metileno y etanol (desde 100:0 hasta 95:5). Se obtienen 555 mg de un producto con el punto de fusión de 105ºC.
2)
\;
N^{1}-Ciano-N^{2}-(3-piridil)-O-fenil-isourea
443 mg de 3-amino-piridina y 953 mg de ciano-carboximidato de metilo se agitan a la temperatura ambiente durante 24 horas en el seno de 9,5 ml de isopropanol. El precipitado se filtra con succión, se lava con isopropanol y se seca. Se obtienen 527 mg de N^{1}-ciano-N^{2}-(2-piridil)-O-fenil-isourea con el punto de fusión de 146ºC.
Por un modo de procedimiento análogo se preparan también los siguientes compuestos:
11
12
13
14
Los compuestos conformes al invento inhiben en lo esencial a las cinasas dependientes de ciclinas, sobre lo que se basa también su efecto por ejemplo contra cánceres, tales como tumores sólidos y leucemia, enfermedades autoinmunitarias tales como psoriasis, alopecia y esclerosis múltiple, alopecia y mucositis que han sido inducidas por agentes quimioterapéuticos, enfermedades cardiovasculares, tales como estenosis, arteriosclerosis y reestenosis, enfermedades infecciosas, tales como p.ej. las provocadas por parásitos unicelulares, tales como tripanosomas, toxoplasmas o plasmodios, o por hongos, enfermedades nefrológicas, tales como p.ej. glomerulonefritis, enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, demencia causada por SIDA y la enfermedad de Alzheimer, enfermedades neurodegenerativas agudas, tales como isquemias del cerebro y traumas neurológicos, infecciones víricas, tales como p.ej. infecciones de citomegalia, herpes, hepatitis B y C y enfermedades causadas por HIV.
El ciclo de división celular de eucariotas asegura la duplicación del genoma y su distribución a las células hijas, recorriendo éste una sucesión coordinada y regulada de sucesos. El ciclo celular se subdivide en cuatro fases consecutivas: La fase G1 representa el período de tiempo que transcurre antes de la replicación del ADN, en el que la célula crece y es accesible para estímulos externos. En la fase S la célula replica su ADN, y en la fase G2 se prepara para la entrada en la mitosis. En la mitosis (fase M) el ADN replicado se separa y la división celular se completa.
Las cinasas dependientes de ciclinas (CDK's) que son una familia de cinasas de Ser/Thr, cuyos miembros necesitan la fijación de una ciclina (Cyc) como subunidad reguladora para su activación, impulsan a la célula a través del ciclo celular. Diversos pares de CDK/Cyc, son activos en las diferentes fases del ciclo celular. Pares de CDK/Cyc importantes para la función fundamental del ciclo celular, son por ejemplo los de CDK4(6)/CycD, CDK2/CycE, CDK2/CycA, CDK1/CycA y CDK1/CycB. Algunos miembros de la familia de enzimas CDK tienen una función reguladora, influyendo ellos sobre la actividad de las CDK's de ciclo celular antes mencionadas, mientras que con otros miembros de la familia de las enzimas CDK no se pudo coordinar todavía ninguna función determinada. Una de éstas, la CDK5, se distingue por el hecho de que posee una subunidad reguladora (p35) atípica, que se diferencia de las ciclinas, y su actividad en el cerebro es máxima.
La entrada en el ciclo celular y el atravesamiento del "punto de restricción", que marca la independencia de una célula con respecto de otras señales del crecimiento para la terminación de la iniciada división celular, se controlan por medio de la actividad de los complejos CDK4(6)/CycD y CDK2/CycE. El substrato esencial de estos complejos de CDK es la proteína del retinoblastoma (Rb), que es el producto del gen supresor de tumores del retinoblastoma. La Rb es una proteína co-represora de la transcripción. Junto con otros mecanismos todavía ampliamente no comprendidos, la Rb fija y desactiva a factores de transcripción del tipo E2F, y forma complejos represores de la transcripción con desacetilasas de histonas (HDAC) (Zhang H.S. y colaboradores (2000). Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF and Rb-hSWI/SNF [La salida desde las fases G1 y S del ciclo celular es regulada por complejos represores que contienen HDAC-Rb-hSWI/SNF y Rb-hSWI/SNF]. Cell 101, 79-89). Mediante la fosforilación de la Rb por las CDK's se ponen en libertad factores de transcripción E2F fijados, y conducen a una activación de la transcripción de genes, cuyos productos se necesitan para la síntesis de ADN y la progresión a través de la fase S. Adicionalmente, la fosforilación de la Rb produce la disolución de los complejos de Rb y HDAC, con lo que se activan otros genes. La fosforilación de Rb por las CDK's ha de ser equiparada con el atravesamiento del "punto de restricción". Para la progresión a través de la fase S y su terminación se necesita la actividad de los complejos de CDK2/CycE y CDK2/CycA, p.ej. la actividad de los factores de transcripción del tipo E2F se desconecta mediante fosforilación por el CDK2/CycA, tan pronto como las células han entrado en la fase S. Después de una replicación completa del ADN, la CDK1 controla en el complejo con CycA o CycB la entrada y el atravesamiento de las fases G2 y M (Figura 1).
De modo correspondiente a la extraordinaria importancia del ciclo de división celular, el atravesamiento del ciclo se regula y controla de una manera estricta. Las enzimas, que son necesarias para la progresión a través del ciclo, deben ser activadas en el momento correcto, y también deben ser desconectadas de nuevo tan pronto como se haya pasado por la correspondiente fase. Los correspondientes puntos de control ("Check-points") detienen la progresión a través del ciclo celular, en el caso de que se detecten daños para los ADN, o la replicación del ADN, o no está todavía terminada la formación del aparato del huso.
La actividad de las CDK's se controla directamente por diferentes mecanismos, tales como los de síntesis y degradación de las ciclinas, de formación de complejos de las CDK's con las correspondientes ciclinas, de fosforilación y desfosforilación de radicales Thr y Tyr reguladores, y la fijación de proteínas inhibidoras naturales. Mientras que la cantidad de proteínas de las CDK's en una célula en proliferación es relativamente constante, oscila la cantidad de las ciclinas individuales con el atravesamiento del ciclo. Así, por ejemplo, la expresión de CycD durante la fase G1 temprana es estimulada por factores de crecimiento, y la expresión de CycE se induce, después de haber atravesado el "punto de restricción", por la activación de los factores de transcripción del tipo del E2F. Las ciclinas propiamente dichas son descompuestas mediante una proteolisis mediada por ubiquitina. Las fosforilaciones activadoras y desactivadoras regulan la actividad de las CDK's, por ejemplo fosforilan a cinasas activadoras de CDK's (CAK's) la Thr160/161 a la CDK1, al contrario de lo cual la familia de las cinasas Wee1/Myt1 desactivan a la CDK1 por fosforilación de Thr14 y Tyr15. Estas fosforilaciones desactivadoras pueden ser suprimidas de nuevo por fosfatasas de cdc25. Es muy importante la regulación de la actividad de los complejos de CDK/Cyc por dos familias de proteínas inhibidoras de CDK's (CKI's) naturales, es decir los productos proteínicos de la familia de genes p21 (p21, p27, p57) y de la familia de genes p16 (p15, p16, p18, p19). Ciertos miembros de la familia p21 se fijan a complejos con ciclinas de las CDK's 1,2,4,6, pero solamente inhiben a complejos que contienen la CDK1 o CDK2. Los miembros de la familia p16 son agentes inhibidores específicos de los complejos con CDK4 y CDK6.
Por encima de esta regulación directa compleja de la actividad de las CDK's está situado el plano de la regulación de los puntos de control. Los puntos de control permiten que la célula vigile el transcurso ordenado de las fases individuales durante el ciclo celular. Los puntos de control más importantes están situados en la transición de G1 a S y de G2 a M. El punto de control de G1 asegura que la célula no comience ninguna síntesis de ADN en el caso de que no haya sido correspondientemente alimentada, de que interactúe correctamente con otras células o con el substrato, y su ADN esté intacto. El punto de control G2/M asegura la replicación completa del ADN y la formación del huso mitótico, antes de que la célula entre en la mitosis. El punto de control de G1 es activado por el producto génico del gen supresor de tumores p53. La p53 es activada después de la detección de alteraciones en el metabolismo o de la integridad genómica de la célula, y puede provocar o bien una detención de la progresión del ciclo celular o una apoptosis. En tal caso, la activación de la transcripción de la expresión de la proteína inhibidora de CDK p21 por la p53 desempeña un cometido decisivo. Un segundo ramal del punto de control de G1 comprende la activación de las cinasas ATM y Chk1 después de un deterioro del ADN por luz ultravioleta (UV) o por radiación ionizante, y finalmente la fosforilación y la subsiguiente descomposición proteolítica de la fosfatasa cdc25A (Mailand N. y colaboradores (2000). Rapid destruction of human cdc25A in response to DNA damage [Rápida destrucción de la cdc25A humana como respuesta a un daño del ADN]. Science 288, 1425-1429). A partir de esto resulta una detención del ciclo celular, puesto que no se suprime la fosforilación inhibidora de las CDK's. Después de una activación del punto de control de G2/M por daño para el ADN, ambos mecanismos participan de manera similar en detener la progresión a través del ciclo celular.
La pérdida de la regulación del ciclo celular y la pérdida de la función de los puntos de control son características de células tumorales. El camino de las señales de CDK-Rb está afectado por mutaciones en más del 90% de las células tumorales humanas. Estas mutaciones, que conducen a la fosforilación desactivadora de la RB, incluyen la sobreexpresión de las ciclinas D y E mediante una amplificación génica o translocaciones cromosomales, mutaciones o deleciones desactivadoras de agentes inhibidores de las CDK's del tipo de la p16, así como una descomposición proteínica aumentada (de p27) o disminuida (de CycD). El segundo grupo de genes, que están afectados por mutaciones en células tumorales, codifica componentes del punto de control. Así, la p53, que es esencial para los puntos de control de G1 y G2/M, es el gen mutado con la máxima frecuencia en tumores humanos (aproximadamente en un 50%). En células tumorales, que expresan sin mutación la p53, se desactiva con frecuencia por causa de una degradación proteínica fuertemente aumentada. De manera similar, están afectados por mutaciones los genes de otras proteínas necesarias para la función de los puntos de control, por ejemplo por ATM (mutaciones desactivadoras) o fosfatasas de cdc25 (sobre-expresión).
Ciertos datos experimentales convincentes apuntan a que los complejos de CDK2/Cyc ocupan una posición decisiva durante la progresión del ciclo celular: (1) Tanto ciertas formas negativas dominantes de la CDK2 como la represión de la transcripción de la expresión de la CDK2 por oligo-nucleótidos antisentido producen una detención de la progresión del ciclo celular. (2) La desactivación del gen de CycA en ratones es letal. (3) La perturbación de la función del complejo de CDK2/CycA en células mediante péptidos permeables para las células, condujo a la apoptosis selectiva para células tumorales (Chen Y.N.P. y colaboradores (1999). Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists [Aniquilación selectiva de células transformadas por agentes antagonistas de la cinasa 2 dependiente de ciclina/ ciclina]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4325-4329).
Las modificaciones del control del ciclo celular desempeñan un cierto cometido no solamente en enfermedades cancerosas. El ciclo celular es activado por una serie de virus, tanto transformadores como no transformadores, con el fin de hacer posible la reproducción de los virus en la célula anfitriona. La entrada errónea en el ciclo celular de células normalmente post-mitóticas se pone en conexión con diferentes enfermedades neurodegenerativas.
Los mecanismos de la regulación del ciclo celular, sus modificaciones en enfermedades y un gran número de puntos de partida para el desarrollo de agentes inhibidores de la progresión del ciclo celular y especialmente de las CDK's, ya se describieron detalladamente de modo colectivo en varias publicaciones (Sielecki T.M. y colaboradores (2000). Cyclin-dependent kinase inhibitors: useful targets in cell cycle regulation [Agentes inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas: dianas útiles en la regulación del ciclo celular]. J. Med. Chem. 43, 1-18; Fry D.W. & Garret M.D. (2000). Inhibitors of cyclin-dependent kinases as therapeutic agents for the treatment of cancer [Agentes inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer]. Curr. Opin. Oncol. Endo. Metab. Invest. Drugs 2, 40-59; Rosiania G.R. & Chang Y.T. (2000). Targeting hyperproliferative disorders with cyclin dependent kinase inhibitors [Dirección hacia trastornos hiperproliferativos con agentes inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas]. Exp. Opin. Ther. Patents 10, 215-230; Meijer L. y colaboradores (1999). Properties and potential applications of chemical inhibitors of cyclin-dependent kinases [Propiedades y aplicaciones potenciales de agentes inhibidores químicos de cinasas dependientes de ciclinas]. Pharmacol. Ther. 82, 279-284; Senderowicz A.M. & Sausville E.A. (2000). Preclinical and clinical development of cyclin-dependent kinase modulators [Desarrollos preclínicos y clínicos de agentes moduladores de cinasas dependientes de ciclinas]. J. Natl. Cancer Inst. 92, 376-387).
Para la utilización de los compuestos conformes al invento como medicamentos, éstos se llevan a la forma de una formulación farmacéutica, que junto a la sustancia activa contiene materiales de vehículo farmacéuticos inertes orgánicos o inorgánicos, que son apropiados para la aplicación por vía enteral o parenteral, tales como por ejemplo agua, gelatina, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales, poli-(alquilen-glicoles), etc. Las formulaciones farmacéuticas se pueden presentar en una forma sólida, por ejemplo como tabletas, grageas, supositorios, cápsulas, o en una forma líquida, por ejemplo como soluciones, suspensiones o emulsiones. Eventualmente, contienen además de ello sustancias coadyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizadores, humectantes o emulsionantes; sales para la modificación de la presión osmótica o tampones.
Estas formulaciones farmacéuticas son asimismo objeto del presente invento.
Para la administración por vía parenteral son apropiadas en particular soluciones o suspensiones inyectables, más en particular soluciones acuosas de los compuestos activos en un aceite de ricino poli(hidroxi-etoxilado).
Como sistemas de vehículo se pueden utilizar también sustancias coadyuvantes activas interfacialmente, tales como sales de los ácidos biliares o fosfolípidos animales o vegetales, pero también mezclas de ellos, así como liposomas o sus constituyentes.
Para la administración por vía oral se adecuan en particular tabletas, grageas o cápsulas con talco y/o vehículos o aglutinantes de hidrocarburos, tales como por ejemplo lactosa, o bien almidón de maíz o de patata. La administración puede efectuarse también en forma líquida, tal como por ejemplo la de un zumo, al que eventualmente se ha añadido una sustancia edulcorante.
Las administraciones por vías enterales, parenterales y orales son asimismo objeto del presente invento.
La dosificación de las sustancias activas puede variar dependiendo de las vías de administración, la edad y el peso del paciente, el tipo y la gravedad de la enfermedad que se ha de tratar, y factores similares. La dosis diaria es de 0,5-1.000 mg, preferiblemente de 50-200 mg, pudiéndose administrar la dosis como una dosis individual a administrar en una sola vez o de modo subdividido en 2 o más dosis diarias.
Es asimismo objeto del presente invento la utilización de los compuestos de la fórmula general I para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cardio-vasculares, alopecia y mucositis que han sido inducidas por agentes quimioterapéuticos, enfermedades infecciosas, enfermedades nefrológicas, enfermedades neurodegenerativas crónicas y agudas, e infecciones víricas, habiendo de entenderse por cánceres tumores sólidos y leucemia, por enfermedades autoinmunitarias psoriasis, alopecia y esclerosis múltiple, por enfermedades cardiovasculares estenosis, arteriosclerosis y reestenosis, por enfermedades infecciosas las enfermedades provocadas por parásitos unicelulares, por enfermedades nefrológicas la glomerulonefritis, por enfermedades neurodegenerativas crónicas la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, la demencia causada por SIDA y la enfermedad de Alzheimer, por enfermedades neurodegenerativas agudas isquemias del cerebro y traumas neurológicos, y por infecciones víricas infecciones de citomegalia, herpes, hepatitis B o C, y enfermedades causadas por HIV.
Son asimismo objeto del presente invento los medicamentos para el tratamiento de las enfermedades antes señaladas, que contienen por lo menos un compuesto de acuerdo con la fórmula general I, así como medicamentos con sustancias de formulación y de vehículo apropiadas.
Los compuestos de la fórmula general I conformes al invento son, entre otras cosas, sobresalientes agentes inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas, tales como CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8 y CDK9, así como de la cinasa de sintasa de glicógeno (GSK-3\beta de Glykogen Synthase Kinase).
Los siguientes Ejemplos de aplicación describen el efecto biológico de los compuestos conformes al invento, sin limitar el invento a estos Ejemplos.
\newpage
Ejemplo de aplicación 1
Ensayo de la cinasa CDK2/CycE
Las proteínas recombinantes de fusión de GST con CDK2 y CycE, purificadas a partir de células de insectos infectadas con baculovirus (Sf9), fueron obtenidas a partir del Dr. Dieter Marmé, Klinik für Tumorbiologie Freiburg] Clínica de Biología Tumoral Freiburg. La histona IIIS, que se utilizó como substrato de cinasas, se adquirió de la entidad Sigma.
El complejo de CDK2/CycE (50 ng/punto de medición) se incubó durante 15 min a 22ºC en presencia de diferentes concentraciones de las sustancias de ensayo (0 \muM, así como dentro del intervalo de 0,01 - 100 \muM) en un tampón de ensayo [50 mM de Tris/HCl de pH 8,0, 10 mM de MgCl_{2}, 0,1 mM de orto-vanadato de Na, 1,0 mM de ditiotreitol, 0,5 \muM de trisfosfato de adenosina (ATP), 10 \mug/punto de medición de histona IIIS, 0,2 \muCi/punto de medición de ^{33}P-gamma ATP, 0,05% de NP40, 12,5% de dimetil-sulfóxido]. La reacción se detuvo por adición de una solución de EDTA (250 mM, pH 8,0, 14 \mul/punto de medición).
De cada una de las tandas de reacción, se aplicaron 10 \mul sobre tiras de filtro P30 (de la entidad Wallac) y el ^{33}P-ATP no incorporado se eliminó lavando las tiras de filtro tres veces, cada vez durante 10 min, en ácido fosfórico al 0,5%. Después de haber secado las tiras de filtro durante 1 hora a 70ºC, estas tiras de filtro se cubrieron con tiras con agente escintilador (MeltiLex® A, de la entidad Wallac) y quemaron durante 1 hora a 90ºC. La cantidad de ^{33}P incorporado (fosforilación del substrato) se determinó por medición de la escintilación en un aparato de medición de la radiación gamma (Wallac).
Ejemplo de aplicación 2
Ensayo de KDR (VEGFR II) y Tie2
En una placa de microtitulación que termina en forma puntiaguda (¡sin fijación de proteínas!) se mezclan las soluciones en el siguiente orden de sucesión:
10 \mul de una mezcla de substratos
10 \mul de una dilución de una sustancia inhibidora
10 \mul de una solución de enzima.
Se mezcla a fondo y se incuba durante 10 min a la temperatura ambiente. Después de ello se añaden 10 \mul de la solución de detención, se mezclan y se transfieren 10 \mul de la solución a un filtro de fosfocelulosa P 81. Se lava múltiples veces en ácido fosfórico 0,1 M. El papel de filtro se seca, se cubre con Meltilex y se mide en el aparato Microbeta. Los valores de IC50 se determinan a partir de la concentración de agente inhibidor, que es necesaria para inhibir la incorporación de fosfato al 50% de la incorporación no inhibida, después de haber restado el valor en vacío (reacción detenida por EDTA).
Soluciones utilizadas para el ensayo Soluciones patrones (partes alícuotas congeladas a -70ºC)
A: 3 mM de ATP en agua de pH 7,0 (-70ºC)
B: \gamma-^{33}P-ATP 1 mCi/100 \mul
C: poli-(Glu_{4}Tyr) 10 mg/ml en agua
Disolvente para diluciones
Disolvente para el substrato: 10 mM de DTT, 10 mM de MnCl_{2}, 100 mM de MgCl_{2} (el DTT se oxida fácilmente, hay que congelar a -80ºC). Antes del ensayo hay que diluir a 1:10 con H_{2}O.
Disolvente para la enzima: 120 mM de TrisCl de pH 7,5; 10 \muM de Na_{3}VO_{4}
Soluciones de trabajo
Por cada 125 tandas se necesitan las siguientes cantidades:
Mezcla de substrato:
Volumen de 10 \mul de solución patrón A de ATP + 25 \muCi de \gamma^{33}P-ATP (aproximadamente 2,5 \mul de la solución patrón B) + 30 \mul de la solución patrón de poli- (Glu_{4}Tyr) C + 1,21 ml de un disolvente para el substrato.
Solución de sustancia inhibidora:
Las sustancias correspondientemente a las diluciones, como testigo 3% de DMSO en un disolvente para substrato.
Solución de enzima:
11,25 \mug de solución patrón de enzima (KDR y cinasa de FLT-1 y Tie2) se diluyen a 4ºC en 1,25 ml de disolvente para enzima (¡otras cantidades en el caso de actividad distinta!).
Solución de detención: 250 mM de EDTA de pH 7,0
Solución de lavado: ácido fosfórico al 0,5%.
Los resultados de los Ejemplos de aplicación 1 y 2 se exponen en la siguiente Tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\newpage
Ejemplo de aplicación 3
Ensayo de proliferación
Células tumorales humanas MCF7 cultivadas se sembraron en placas en una densidad de 5.000 células/punto de medición en una placa de multititulación de 96 pocillos en 200 \mul del correspondiente medio de crecimiento. Después de 24 horas, las células de una placa (placa de punto cero) se tiñeron con violeta cristal (véase más adelante), mientras que el medio de las otras placas se reemplazó por un medio de cultivo de nueva aportación (200 \mul), al que se habían añadido las sustancias de ensayo en diferentes concentraciones (0 \muM, así como en el intervalo de 0,01-30 \muM; la concentración final del disolvente dimetil-sulfóxido fue de 0,5%). Las células se incubaron durante 4 días en presencia de las sustancias de ensayo. La proliferación celular se determinó por tinción de las células con violeta cristal: Las células se fijaron por adición de 20 \mul/punto de medición de una solución al 11% de glutaraldehído durante 15 min a la temperatura ambiente. Después de haber lavado tres veces con agua las células fijadas, las placas se secaron a la temperatura ambiente. Las células se tiñeron por adición de 100 \mul/punto de medición de una solución al 0,1% de violeta cristal (pH ajustado a pH 3 por adición de ácido acético). Después de haber lavado tres veces con agua las células teñidas, las placas se secaron a la temperatura ambiente. El colorante se disolvió por adición de 100 \mul/punto de medición de una solución al 10% de ácido acético. La extinción se determinó por fotometría a una longitud de onda de 595 nm. La modificación porcentual del crecimiento celular se calculó mediante normalización de los valores de medición a los valores de la extinción de la placa de punto cero (= 0%) y se calculó la extinción de las células no tratadas (0 \muM) (= 100%).
Los resultados se exponen en la siguiente Tabla:
Ejemplo Nº MCF-7
IC 50 [\muM]
1 1,5
3 >10
4 6
5 2
6 4
9 >10
10 4
13 0,7
15 1,1
17 1,5

Claims (10)

1. Compuestos de la fórmula general I
16
R^{1}
representa un heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo, y
R^{2}
representa un arilo o heteroarilo mono- o bi-cíclico que eventualmente puede estar sustituido una vez o múltiples veces, de igual o diferente modo,
\quad
así como sus isómeros y sales.
2. Compuestos de la fórmula general I de acuerdo con la reivindicación 1, en la que
R^{1}
representa el grupo
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X en el anillo representa un átomo de nitrógeno, y
R^{3}
representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{10}, halógeno-alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno-alcoxi C_{1}-C_{10}, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi o el grupo -NR^{4}R^{5},
R^{2}
representa el grupo
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, nitro, ciano, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{10}, halógeno-alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno-alcoxi C_{1}-C_{10}, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, alquil C_{1}-C_{10}-carbonilo, alcoxi C_{1}-C_{10}-carbonilo o el grupo -NR^{4}R^{5}, así como sus isómeros y sales.
3. Compuestos de la fórmula general I de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en la que
R^{1}
representa el grupo
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X en el anillo representa un átomo de nitrógeno, y
R^{3}
representa hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{6},
R^{2}
representa el grupo
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, alquilo C_{1}- C_{6} o halógeno-alquilo C_{1}-C_{6}, así como sus isómeros y sales.
4. Compuestos de la fórmula general I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en la que
R^{1}
representa el grupo
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en el que
X^{1} hasta X^{4}
independientemente uno de otro, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{3}, realizándose que por lo menos un X representa un átomo de nitrógeno,
X^{5} hasta X^{7}
representan el grupo CR^{3},
R^{3}
representa hidrógeno, metoxi, bromo, cloro o metilo,
R^{2}
representa el grupo
22
\quad
en el que
Y^{1} hasta Y^{7}
independientemente unos de otros, representan un átomo de nitrógeno o el grupo CR^{6}, y
R^{6}
representa hidrógeno, metilo o trifluorometilo, así como sus isómeros y sales.
5. Utilización de los compuestos de la fórmula general I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, alopecia y mucositis que han sido inducidas por agentes quimioterapéuticos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades nefrológicas, enfermedades neurodegenerativas crónicas y agudas e infecciones víricas.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque por cánceres se entienden tumores sólidos y leucemia, por enfermedades autoinmunitarias se entienden psoriasis, alopecia y esclerosis múltiple, por enfermedades cardiovasculares se entienden estenosis, arteriosclerosis y reestenosis, por enfermedades infecciosas se entienden enfermedades provocadas por parásitos unicelulares, por enfermedades nefrológicas se entienden glomerulonefritis, por enfermedades neuro-degenerativas crónicas se entienden la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, demencia causada por SIDA y la enfermedad de Alzheimer, por enfermedades neurodegenerativas agudas se entienden isquemias del cerebro y traumas neurológicos, y por infecciones víricas se entienden infecciones de citomegalia, herpes, hepatitis B y C y enfermedades causadas por HIV.
7. Medicamento, que contiene por lo menos un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4.
8. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 7 para el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades nefrológicas, enfermedades neuro-degenerativas e infecciones víricas.
9. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque por cánceres se entienden tumores y leucemia, por enfermedades autoinmunitarias se entienden psoriasis, alopecia y esclerosis múltiple, por enfermedades cardiovasculares se entienden estenosis, arteriosclerosis y reestenosis, por enfermedades infecciosas se entienden enfermedades provocadas por parásitos unicelulares, por enfermedades nefrológicas se entiende la glomerulonefritis, por enfermedades neurodegenerativas crónicas se entienden la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, demencia causada por SIDA y la enfermedad de Alzheimer, por enfermedades neurodegenerativas agudas se entienden isquemias del cerebro y traumas neurológicos, y por infecciones víricas se entienden infecciones de citomegalia, herpes, hepatitis B y C y enfermedades causadas por HIV.
10. Compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 4 y medicamentos de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9 con apropiadas sustancias de formulación y de vehículo.
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