ES2218840T3 - Composicion azasteroide para ael tratamiento de la alopecia, el hirsutismo femenino y la seborrea. - Google Patents

Composicion azasteroide para ael tratamiento de la alopecia, el hirsutismo femenino y la seborrea.

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ES2218840T3
ES2218840T3 ES98933945T ES98933945T ES2218840T3 ES 2218840 T3 ES2218840 T3 ES 2218840T3 ES 98933945 T ES98933945 T ES 98933945T ES 98933945 T ES98933945 T ES 98933945T ES 2218840 T3 ES2218840 T3 ES 2218840T3
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Takakazu Sankyo Company Limited HAMADA
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Abstract

Un compuesto representado por la siguiente fórmula descrita (I) es un ingrediente activo de una nueva composición que tiene una acción reparadora para la alopecia, el hirsutismo femenino o la seborrea o que tiene una acción preventiva contra la metástasis ósea producida por cáncer de próstata.

Description

Composición azasteroide para el tratamiento de la alopecia, el hirsutismo femenino y la seborrea.
Campo técnico
La presente invención describe la utilización de la N-[1-metil-1-(4-metoxifenil)etil]-3-oxo-4-aza-5\alpha-androst-1-en-17\beta-carboxamida para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea.
Precedentes de la técnica
La excesiva estimulación de las hormonas andrógenas como la dihidrotestosterona (DHT) causa una alopecia dependiente de andrógenos (calvicie estándar masculina), acné vulgaris, seborrea, hirsutismo femenino, hipertrofia prostática benigna y cáncer de próstata.
Las hormonas esteroides anti-androgénicas (por ejemplo, el estrógeno, hormona femenina) son compuestos que resultaron ser capaces de tratar estos síntomas causados por una excesiva estimulación de hormonas andrógenas. Sin embargo, tienden a producir actividades no deseables, como por ejemplo la feminización, debido a que ellas mismas tienen actividad hormonal.
Por otro lado, también se han desarrollado las hormonas no asteroideas anti-andrógenas. En lugar de ser libres desde el punto de vista de la acción hormonal, compiten con los andrógenos naturales por el receptor y por consiguiente tienen actividades no deseadas tales como la feminización de un feto masculino en el útero o de un hombre, o la iniciación de un mecanismo de retroalimentación tal como la excesiva estimulación de los testículos.
Debido a que la 5\alpha-reductasa actúa en la testosterona para formar la dihidrotestosterona (DHT), si se puede inhibir la actividad de la 5\alpha-reductasa se puede esperar que el tratamiento de los síntomas debido a una excesiva estimulación de las hormonas andrógenas no produzca dichos efectos secundarios.
La 5\alpha-reductasa humana incluye dos isoenzimas. Se ha dilucidado que la 5\alpha-reductasa de tipo I existe en las glándulas sebáceas de la cara y la piel, y que la 5\alpha-reductasa de tipo II se distribuye en la próstata.
Se esperaba que la fuerte inhibición de la 5\alpha-reductasa de tipo I que se encuentra en el folículo del pelo aliviara la calvicie estándar masculina. Los efectos del MK386, un inhibidor selectivo de la 5\alpha-reductasa de tipo I, se evaluaron utilizando un mono que era un modelo animal de la calvicie estándar masculina. Por consiguiente, el nivel de DHT en la sangre mostró una disminución de un 30 a un 40%, aunque tal eficacia del MK 386 no fue reconocida (J. Invest. Dermatol., 104, 658(1995)).
1
La administración de Finasteride, que es un inhibidor selectivo de la 5\alpha-reductasa de tipo II al modelo animal a una dosis de 1 mg/kg disminuyó el nivel de DHT en sangre por un 60 a un 70%, no obstante se reconoció inesperadamente que era efectivo en el tratamiento de la calvicie (J. Clin. Endocrinol. Metabol., 79, 991(1994)).
De hecho, los efectos del Finasteride en la calvicie humana han sido reconocidos por un análisis clínico. La inhibición de un factor que participa en la reducción del tamaño de los folículos del pelo resulta en tales efectos y se presume que depende del nivel de DHT en sangre. Además, se ha encontrado como resultado de los recientes análisis clínicos que la elevada disminución del nivel de DHT en sangre depende principalmente de la fuerza de inhibición con la 5\alpha-reductasa de tipo II, y que los mejores resultados se pueden obtener al utilizar un inhibidor de la 5\alpha-reductasa de tipo I en combinación con la 5\alpha-reductasa de tipo II (J. Clin. Endocrinol. Metabol., 81, 2942-2947(1996)).
También en el tratamiento del hirsutismo femenino o seborrea, un compuesto que tenga actividad inhibidora contra la 5\alpha-reductasa de tipo I y contra la 5\alpha-reductasa de tipo II se considera que pueda ser superior, como remedio, a un compuesto que tenga tan solo actividad inhibidora contra la 5\alphareductasa de tipo II. Con motivo de encontrar un medicamento mas efectivo para la alopecia, el hirsutismo femenino o seborrea, se ha requerido un compuesto que inhiba la 5\alphareductasa de tipo II mas fuertemente que el Finasteride y al mismo tiempo inhiba fuertemente la 5\alphareductasa de tipo I.
La JP 8073492 da a conocer un número de compuestos esteroides que tienen efectos inhibidores de la 5\alphareductasa de la testosterona y son útiles para el tratamiento de enfermedades causadas por acciones andrógenas, tales como la calvicie, hipertricosis o cáncer de próstata.
Divulgación de la invención
Los presentes inventores llevaron a cabo una investigación extensiva durante muchos años en la síntesis de derivados que tenían actividad inhibidora contra la 5\alpha-reductasa de la testosterona y la actividad farmacológica de los derivados. Como resultado, se ha encontrado que algunos compuestos que tienen una estructura específica inhiben fuertemente la 5\alpha-reductasa de tipo II y además inhiben fuertemente la 5\alpha-reductasa de tipo I, y por consiguiente exhiben una fuerte disminución de la actividad del nivel de DHT en sangre que no ha sido descrita hasta el momento entre los conocidos inhibidores selectivos de 5\alpha-reductasa de tipo II, y que han sido útiles en el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea o en la prevención de la metástasis de hueso causada por cáncer de próstata.
La presente invención proporciona una utilización del dicho compuesto para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea.
La novedosa utilización de la presente invención es la utilización de un compuesto representado por la fórmula (I) o una sal aceptable farmacéuticamente o otro derivado de esto para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea, es decir la N-[1-metil-1-(4-metoxifenil)etil]-3-oxo-4-aza-5\alpha-androst-1-en-17-\beta-carboxamida.
2
dónde R^{1} representa H y R^{2} representa un grupo para-metoxi.
El término alopecia significa calvicie estándar masculina y alopecia principal femenina.
Ya que el compuesto (I) puede formar una sal, el término "sales aceptables farmaceúticamente" significa que las sales del compuesto (I) de la presente invención que pueden ser convertidas a sales de las mismas, ejemplos de tales sales preferiblemente incluyen sales de metales alcalinos tales como una sal sódica, una sal potásica y una sal lítica, sales de metales alcalino-térreos tales como una sal de calcio y una sal de magnesio, y sales metálicas tales como una sal de aluminio, una sal de hierro y una sal de zinc.
Cuando el compuesto (I) de la presente invención se deja permanecer en la atmósfera, puede absorber agua directamente o bien formar un hidrato. Tal sustancia se incluye también en la presente invención.
El compuesto (I) de la presente invención se puede preparar por el proceso que se muestra a continuación.
Proceso A
3
(donde R^{1} y R^{2} son tal y como se describen anteriormente)
En el Proceso A, un compuesto (I) se prepara por condensación de un derivado de ácido carboxílico con un derivado de amina.
En el paso A1, un compuesto (I) se prepara utilizando un compuesto (II) o un derivado reactivo del mismo y un compuesto (III). Este paso se lleva a cabo de acuerdo al método convencional utilizado en síntesis de péptidos, por ejemplo, un proceso azida, un proceso de éster activo, un proceso de una mezcla de anhídrido de ácido o un proceso de condensación.
De entre estos procesos, el proceso azida comprende el tratamiento de un compuesto azida con un compuesto amina (III). El compuesto azida se prepara por la reacción de ácido nitroso con una hidrazina de un aminoácido, que se obtiene por reacción del compuesto (II) o un éster del mismo con hidrazina a aproximadamente temperatura ambiente en un disolvente inerte (por ejemplo dimetilformamida).
Ejemplos del compuesto de ácido nitroso utilizados en este documento incluyen los nitritos metálicos alcalinos tales como el nitrito de sodio y nitritos de alquilo tal como el nitrito de isoamilo.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente en un disolvente inerte y ejemplos del disolvente utilizados en este documento incluyen amidas tales como la dimetilformamida y dimetilacetamida, sulfóxidos tales como el dimetilsulfóxido y pirrolidonas tales como la N-metilpirrolidona. La reacción de dos pasos de este proceso se lleva a cabo normalmente en un solo recipiente. La temperatura de reacción varía de -50ºC a 0ºC en el primer paso, mientras que varía de -10ºC a 10ºC en el segundo paso. El tiempo requerido para la reacción varía de 5 minutos a 1 hora en el primer paso, mientras que varía de 10 horas a 5 días en el segundo paso.
El proceso de éster activo se lleva a cabo por reacción del compuesto (II) con un agente esterificante activo para formar el éster activo del compuesto (II) y entonces por reacción del compuesto resultante con el compuesto amina (III).
Ambas reacciones se llevan a cabo preferiblemente en un disolvente inerte y ejemplos del disolvente utilizados en este documento incluyen hidrocarburos halogenados tales como cloruro de metileno y cloroformo, éteres tales como el éter y tetrahidrofurano, amidas tales como la dimetilformamida y dimetilacetamida y nitrilos tales como el acetonitrilo.
Ejemplos del agente esterificante utilizado en este documento incluyen los compuestos N-hidroxi tales como la N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida y compuestos disulfuro tales como el disulfuro de dipiridilo. La esterificación se lleva a cabo apropiadamente en presencia de un agente de condensación tal como la diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol o trifenilfosfina.
La temperatura de reacción varía de -10ºC a 100ºC en la esterificación, mientras que es a temperatura ambiente en la reacción del compuesto de éster activo con la amina (III). El tiempo necesario para la reacción varía de 30 minutos a 80 horas en cada una de las reacciones.
En la reacción del éster activo con una amina, se puede añadir 4-dimetilaminopiridina o una parecida.
El proceso de mezcla de anhídrido de ácido se lleva a cabo por reacción de un anhídrido de ácido mixto de un compuesto (II) con una amina.
Le reacción para preparar el anhídrido de ácido mixto se lleva a cabo por reacción del compuesto (II) con un agente dando lugar a un anhídrido de ácido mixto. Ejemplos de tales agentes incluyen un carbonato halogenado de alquilo de bajo peso molecular (C_{1}-C_{4}) tales como el clorocarbonato de etilo o el clorocarbonato de isobutilo, un haluro de alcanoilo de bajo peso molecular tal como el cloruro de pivaloilo, un ácido de alquilo de bajo peso molecular o diaril-cianofosfórico tal como el ácido dietilcianofosfórico o el ácido de difenilcianofosfórico, o un haluro de sulfonilo tal como el cloruro de 2,4,6-triisopropilbencensulfonilo, el cloruro de paratoluensulfonilo o el cloruro de metansul-
fonilo.
La reacción se lleva a cabo apropiadamente en presencia de una amina orgánica tal como la trimetilamina o la N-metilmorfolina a -10ºC hasta 50ºC. El tiempo necesario para la reacción varía de 30 minutos a 20 horas.
La reacción de un anhídrido de ácido mixto y una amina (III) se lleva a cabo apropiadamente en un disolvente inerte (por ejemplo, el hidrocarburo halogenado anteriormente ilustrado, amida o éter) en presencia de la amina orgánica anteriormente ilustrada. La temperatura de reacción varía de 0ºC a 80ºC y el tiempo necesario para la reacción varía de 1 hora a 48 horas.
Alternativamente, el proceso A se lleva a cabo en la mezcla de un compuesto (II), un compuesto (III) y un agente formando el correspondiente anhídrido de ácido mixto sin aislamiento del anhídrido del ácido mixto.
El proceso de condensación se lleva a cabo directamente por reacción del compuesto (II) con la amina (III) en presencia de un agente de condensación tal como la diciclohexilcarbodiimida, carbonil diimidazol, 1-metil-2-cloro-piridinio iodo-trietilamina. Esta reacción se lleva cabo bajo condiciones similares a aquellas utilizadas en la reacción anteriormente descrita para la preparación de un éster activo.
Cuando R^{1} o R^{2} contiene un grupo hidroxilo protegido, el grupo protegido se puede eliminar de acuerdo al método convencional.
El compuesto de partida (II) o un éster activo del mismo es un compuesto conocido o preparado por un procedimiento familiar a aquellos experimentados en la técnica (por ejemplo, J. Med. Chem., 27, 1690(1984); J. Med. Chem., 29, 2298(1986)].
El compuesto (III) es un compuesto conocido o preparado por un experimentado en la técnica (por ejemplo,
Synthesis, 593(1976);
J. Org. Chem., 36, 305(1971);
Angew. Chem., 82, 138(1970);
Synthesis, 24(1978);
Synthetic Commun., 18, 777(1988);
Synthetic Commun., 18, 783(1988);
Organic Reaction, 3, 337(1946);
Org. Synthesis, 51, 48(1971);
Tetrahedron, 30, 2151(1974);
J. Org. Chem. 37, 188(1972)]. Por ejemplo, H_{2}N-C(Me)(Me)-Ph(R^{1})(R^{2}), el cual es un compuesto de partida de la presente invención que puede ser preparado tal como se muestra en el siguiente esquema de reacción:
4
(donde,
R^{1} y R^{2} son tal y como se describen anteriormente.
Me representa un grupo metilo y Ph representa un grupo fenilo) por reacción de Grignard, reacción de substitución de un grupo hidroxilo con un grupo azida y más tarde la reducción del grupo azida en un proceso parecido al descrito en Synthesis, 24(1978).
El compuesto (I) se administra oralmente en forma de pastillas, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes o parecidos y localmente en forma de una solución de etanol, espuma limpiadora, gel de piel, loción de piel, gel de champú, champú cremoso o parecidos.
Las formulaciones farmacéuticas orales se prepararon por procedimientos familiares a aquellos experimentados en la técnica utilizando excipientes (ejemplos incluyen excipientes orgánicos, tales como derivados de azúcares tales como la lactosa, sucrosa, glucosa, manitol y sorbitol; derivados de almidón, tales como el almidón de maíz, almidón de patata, \alpha-almidón, dextrina y almidón de carboximetilo; derivados de celulosa tales como la celulosa cristalina, celulosa de hidroxipropilo poco substituida, celulosa de hidroxipropilmetilo, celulosa de carboximetilo, celulosa de carboximetil de sodio y calcio internamente entrecruzada con celulosa de carboximetilo; goma árabe, dextrano; y pululano; y excipientes inorgánicos, como por ejemplo derivados de silicatos tales como el anhídrido de ácido de silicio luminoso, silicato de aluminio sintético y metasilicato de aluminato de magnesio, fosfatos tales como el fosfato de calcio; carbonatos tales como el carbonato de calcio y sulfatos tales como el sulfato de calcio), lubricantes (ejemplos incluyen el ácido esteárico, sales de metal del ácido esteárico tales como el estereato de calcio y el estereato de magnesio; talco; sílice coloidal; ceras tales como la cera de abejas, esperma de ballena; ácido bórico; ácido adípico; sulfatos tales como el sulfato de sodio; glicol; ácido fumárico; benzoato de sodio; DL leucina; sales sódicas de ácidos alifáticos; sulfatos de laurilo tales como el sulfato de lauril sódico y el sulfato de lauril de magnesio; ácidos de silicio tales como el anhídrido de ácido de silicio y el hidrato de silicio; y los derivados de almidón ilustrados anteriormente), aglutinantes (ejemplos incluyen la pirrolidona de polivinilo, Macrogol y compuestos similares a los excipientes ilustrados anteriormente), desintegrantes (ejemplos incluyen compuestos parecidos a los excipientes ilustrados anteriormente y almidones químicamente modificados y celulosas tales como la carmelosa cruzada sódica, almidón de carboximetilo sódico y polivinilpirrolidona entrecruzada), estabilizantes (ejemplos incluyen paraoxibenzoatos tales como el paraben de metilo; y paraben de propilo, alcoholes tales como el clorobutano, alcohol benzílico y alcohol de feniletilo; cloruro de benzalconio; derivados de fenol tales como el fenol y el cresol; timerosal; ácido de dehidroacético, y ácido sórbico), dulcificantes (ejemplos incluyen los edulcorantes normalmente utilizados, acidificantes y aromatizantes) y/o diluyentes.
Las formulaciones locales farmacéuticas se preparan por adición de un compuesto ilustrado a una base, bien conocido para aquellos experimentados en la técnica; por ejemplo, agentes de suspensión (ejemplos incluyen goma arábica, adragante, celulosa de metilo, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa de hidroxietilo, celulosa de hidroxipropilo, alginato de sodio y bentonito), agentes de emulsión (ejemplos incluyen trietanolamina, sulfato de lauril sódico, sesquiolato de sorbitano, polisorbato 80 y ácido esteárico polioxil 40), agentes humidificantes (ejemplos incluyen el sorbitol, etilenglicol, propilenglicol, butilenglicol y glicerina), conservantes (ejemplos incluyen el paraoxibenzoato de metilo, paraoxibenzoato de etilo, paraoxibenzoato de propilo y paraoxibenzoato de butilo) o disolventes (ejemplos incluyen agua; alcoholes tales como el etanol, alcohol de isopropilo, propilenglicol, cetanol y alcohol de isostearilo; hidrocarburos tales como grases y aceites naturales, ceras y parafinas líquidas; ácidos alifáticos tales como el ácido esteárico, ácido isosteárico, ácido oleico y ácido linoleico y ésteres tales como el miristato de isopropilo) o una mezcla de los mismos.
La cantidad del compuesto (I) para ser administrado oralmente o localmente variará dependiendo de la condición, edad o parecido del paciente. Es deseable administrar en una dosis de 0.001 mg/kg en peso (preferiblemente 0.01 mg/kg en peso) como límite inferior y 10 mg/kg en peso (preferiblemente 0.5 mg/kg en peso) como límite superior y administrar en una dosis única o en varias dosis distribuidas en un día.
El mejor modo para llevar a cabo la invención
La presente invención será a continuación descrita más específicamente por ensayos, ejemplos de referencia y ejemplos de preparación.
Ejemplo de ensayo 1
Método para la determinación de la actividad de inhibición contra cada una de las 5\alpha-reductasas humanas de tipo I y tipo II (1) Preparación de las 5\alpha-reductasas recombinadas en humanos de tipo I y tipo II a) Clonando 2 cDNAs de 5\alpha-reductasas recombinadas en humanos de tipo I y tipo II
Para clonar las regiones completamente traducidas de las 5\alpha-reductasas humanas de tipo I y tipo II por un método de reacción en cadena polimerasa (PCR), se prepararon los iniciadores de secuencia ID Nº 1,2,3 y 4 utilizando un sintetizador Oligo 1000 DNA (producto de BECKMAN Co., Ltd.) en base a las secuencias de base de las 5\alpha-reductasas humanas de tipo I y tipo II descritas en informes ya publicados (Stefan. A, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3640-3644(1990), Stefan. A, y col., Nature, 354, 159-161(1991)).
Iniciador de sentido de tipo I: 5'-CCAGCCCTGGCGATGGCAAC-3' (secuencia ID No. 1)
Iniciador complementario de tipo I: 5'-CAGAGCTTGAAATTCTGACCTGTTA-3' (secuencia ID. No. 2)
Iniciador de sentido de tipo II: 5'-ACGGCGCGATGCAGGTTCAGTG-3' (secuencia ID. No. 3)
Iniciador complementario de tipo II: 5'-AGCATTGTGGGAGCTCTGCTCCT-3' (secuencia ID. No. 4)
Como plantilla para el método PCR, se utilizó hígado humano QUICK-Clone™cDNA y próstata humana QUICK-Clone™cDNA (productos de Laboratorios CLONTECH, Inc.).
El PCR se llevó a cabo utilizando 1 \muL de cDNA, 5 \muL de un tampón PCR ligado, 1 \muL de una solución de mezcla de 10mM dNTP, 1 \muL de cada uno de los iniciadores de sentido y su complementario anteriormente descritos a una concentración de 20 \muL, 1 \muL de 5 unidades/mL de polimerasa TaKaRa Taq y 40 \muL de agua destilada para dar un volumen de reacción de 50 \muL. Para el PCR, se repitió 25 veces un ciclo de reacciones a 94ºC durante 20 segundos, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto, seguido por almacenamiento a 4ºC. Cuando una porción de aproximadamente 5 \muL de la mezcla de reacción de PCR se sometió a electrocromatografía con gel de agarosa al 0.8%, se encontraron dos bandas (tipo I: 1021 bp, tipo II: 812 bp) correspondientes a las bandas esperadas descritas anteriormente en la literatura. La porción remanente de la mezcla de reacción PCR se purificó por consiguiente por electrocromatografía con gel de acrilamida al 5%. El fragmento de cDNA así purificado se subclonó utilizando un Kit de Clonning™ TA (producto de la corporación Invitrogen). Se confirmó como resultado de los análisis de la completa secuencia de base de cada uno de los cDNAs subclonados de tipo I y tipo II por el método del terminador de tinte que tuvieron las mismas secuencias como aquellas descritas en la literatura. Los cDNAs de tipo I y tipo II cuyas secuencias de bases habían sido confirmadas se insertaron en un vector de expresión, permitiendo la expresión y así permitiendo su uso.
b) Preparación de los plásmidos de expresión humanos de tipo I y tipo II
La cepa de Esterichia coli DH5 (supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1) (adquirida de: Toyobo Co., Ltd.) se transformó utilizando pME18sH5R1 o pME18sH5R2, que es, el plásmido de expresión humano de tipo I y tipo II, por el método descrito en el documento adjuntado al Kit Cloning™ TA. Aproximadamente 10 mL de la solución de cultivo primaria de la cepa recombinante se implantó en 50 mL de un medio 2xLB (20 g de Bacto-Triptona (producto de Labs. DIFCO), 10 g de Extracto de Levadura Bacto (producto de Labs. DIFCO), 10 g de cloruro de sodio y 2 g de glucosa / 1L) conteniendo 50 mg/mL de ampicilina (producto de GIBCO BRL) seguido por incubación a 37ºC durante aproximadamente 40 horas. La solución de cultivo se sometió a centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se recogieron las células. De las células resultantes, se prepararon pME18sH5R1 o pME18sH5R2 utilizando un Kit Maxi de plásmido QIAGEN (producto de Qiagen Inc.).
c) Expresión y preparación de proteínas humanas de tipo I y tipo II
Se introdujeron a células 2x 10^{6}/0.5 mL de COS1, de 10 a 20 \mug de pME18sH5R1 o pME18sH5R2 por el método de electroporación (Gene Pulser™ producto de laboratorios Bio-Rad), 960 \muF, 200 \omega, 300 V). Después de la introducción de la mezcla se incubó durante aproximadamente 48 horas y se recogieron las células. Las células se homogeneizaron (1000 rpm, 30 segundos) por POLYTRON (producto de KINEMATICA GmbH) en una solución tampón (solución tampón 20 mM de fosfato de potasio, pH 7.4, 10% glicerol, 0.33 M de sucrosa, 50 \muM de fosfato de dinucleótido de adenina nicotinamida en su forma reducida (NADPH) y 0.001% de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)) en un baño de hielo, seguido por centrifugación (10000 x g, 1 hora). El precipitado se suspendió de nuevo en una solución tampón y la suspensión resultante se almacenó a -80ºC. La suspensión se utilizó como 5\alpha-reductasa humana de tipo I o tipo II.
(2) Medida del contenido de proteína
El contenido de proteína se midió por el método Bradford (Ensayo de proteína Bio-Rad de Bio-Rad) utilizando gamma-globulina bovina (fracción de bovina cohn II, producto Sigma) como producto estándar.
(3) Determinación de la actividad 5\alpha-reductasa
La actividad de 5\alpha-reductasa se determinó utilizando la proporción de la conversión de ^{14}C testosterona (producto de Amersham) respecto de la ^{14}C 5\alpha-dihidrotestosterona como índice. El compuesto se disolvió con dimetilsulfóxido (DMSO). A cada uno de los dos tubos de ensayo, se vertió una porción de 5 \mul de la solución resultante, mientras que 5 \mul de DMSO se vertieron a un tubo de ensayo adicional como grupo de control. A cada uno de los tubos de ensayo se añadió 0.5 mL de una solución tampón de reacción enzimática que contenía de 10 a 25 \mug de la 5\alpha-reductasa humana de tipo I o tipo II (tipo I; una solución tampón de fosfato de calcio 40 mM (pH 7.5) que contenía 1\muM
de ^{14}C testosterona, 1 mM de ditiotreitol y 0.5 mM de NADPH, tipo II; una solución tampón de tris-citrato 100 mM (pH 5.5) que contenía 1 \muM de ^{14}C testosterona, 1 mM de ditiotreitol y 1 mM NADPH), seguido por incubación a 37ºC durante 15 minutos. Después de la incubación, se añadió 2 mL de acetato de etilo (conteniendo testosterona, 5\alpha-dihydrotestosterona y androstenediona, cada uno 10 \mug) y la mezcla resultante se agitó suficientemente, por lo cual la reacción enzimática se acabó y los compuestos esteroideos se extrajeron en la capa de acetato de etilo. La fase de acetato de etilo se separó entonces de la fase acuosa por centrifugación (3000 rpm durante 5 minutos). La fase de acetato de etilo se transfirió a otro tubo de ensayo, seguido por evaporación a sequedad bajo una corriente de nitrógeno. La pared del tubo de ensayo se lavó con 0.8 mL de dietil éter, por lo cual los compuestos esteroideos se lavaron con agua al final del tubo de ensayo. Después de la evaporación a sequedad de nuevo, el compuesto esteroideo se disolvió en 40 \mul de acetato de etilo y la solución resultante se cubrió en una lámina de capa fina (lámina de silica LK6DF, producto de Whatman). La lámina de capa fina se evolucionó con una mezcla 1:1 de acetato de etilo y ciclohexano, para separar cada fracción que contenía un compuesto esteroideo. La radioactividad de cada fracción se determinó por un analizador de bioimagen (producto de Fuji Film Co., Ltd.). La actividad de inhibición contra la reductasa se indicó por el 50% de concentración de inhibición
(IC_{50}).
El valor IC_{50} se calculó como sigue: Cogiendo la proporción de conversión del grupo de control como el 100%, se calculó la proporción de inhibición de la actividad de la reductasa (100 - (la proporción de conversión sobre la adición del compuesto de ensayo + la proporción de la conversión del grupo de control) x 100) (%). Se llevó a cabo una fila de dilución del compuesto y la proporción de inhibición de cada concentración se calculó por el método descrito anteriormente. Utilizando la concentración de dilución a la que la proporción de inhibición baja en un rango de aproximadamente 20% a aproximadamente un 80% y colocando el valor del logaritmo de la concentración del compuesto de ensayo como X y la proporción de inhibición como Y, se calculó la recta de regresión por el método de mínimos cuadrados. De los resultados de la recta de regresión, se calculó la concentración del compuesto requerido para dar una proporción de inhibición del 50% y se designó como IC_{50}.
La IC_{50} del tipo I se muestra en la Tabla 1, mientras que la de tipo II se muestra en la Tabla 2.
TABLA 1 Tipo I
Compuesto IC_{50}
Compuesto I 4.9 x 10^{-8} M
Finasteride 7.0 x 10^{-7} M
TABLA 2 Tipo II
Compuesto I IC_{50}
Compuesto I 3.2 x 10^{-9} M
Finasteride 1.5 x 10^{-8} M
Ejemplo de ensayo 2
Efectos para disminuir el nivel de dihidrosterona en sangre humana
A un cuerpo humano, se administró oralmente de 1 a 10 mg/cuerpo de compuesto I o 5 mg/cuerpo de Finasteride y se midieron los niveles de dihidrotestosterona (DHT) y testosterona (T) en sangre. Se calcularon sus proporciones (DHT/T) antes de la administración (pre) y después de la entrada del tiempo (10 y 18 horas), de las que se calcularon (DHT/T)/(DHT/T)pre. Los resultados se muestran en la Tabla 3 (n = 4 to 6).
TABLA 3
Después de 10 hours Después de 18 hours
Compuesto I (1 mg) 0.518 0.525
Compuesto I (5 mg) 0.411 0.376
Compuesto I (10 mg) 0.279 0.284
Finasteride (5 mg) 0.553 0.461
Ejemplo de ensayo 3
Ensayo utilizando células papilla pili de humanos
Papilla pili es una masa de células que existen en un pequeño número en los folículos del pelo. Actualmente, se piensa que es una célula raíz para formar la base para el crecimiento del pelo. Esta célula presenta actividad 5\alpha-reductasa. Por consiguiente es posible llevar a cabo un ensayo de un inhibidor de 5\alpha-reductasa al utilizar un sistema de cultivo de esta célula. El aislamiento y incubación de células de papilla pili se lleva a cabo mediante el método de Messenger, A. G. (El cultivo de las células Papilla dermales de los folículos de pelo humanos, Br. J. Dermatol., 110, 685-989(1984)) o Itami, S. y col., ("Actividad 5\alpha-reductasa en un cultivo de células de papilla de la dermis humana de la barba comparadas con los fibroblastos dermales reticulares", J. Invest. Dermatol., 94, 150-152(1990)). Se utilizaron las células papilla de la barba y sus raíces del pelo en la región occipital de la cabeza de dos individuos para el ensayo. Todos los ensayos se llevaron a cabo bajo condiciones convergentes después de que estas células se subcultivaran sobre 4 a 6 generaciones. Las células que han convergido se lavan dos veces con una solución salina de fosfatos tamponada (PBS), exfoliadas por un "rubber policeman",( instrumento usualmente varilla de goma con punta de acero, para remover partículas sólidas de un contenedor de vidrio), y luego recogiéndolas en un tubo de centrifuga. Las células se sometieron a centrifugación a 4ºC a 1500 rpm durante 10 minutos. El aglomerado resultante se suspendió en una solución tampón (una solución tampón (pH 7.5) de cloruro de tris-hidrógeno 20 mM conteniendo 250 mM de sucrosa, 1 mM de cloruro de magnesio y 2 mM de cloruro de calcio) y se pasó una aguja 25G a través de éste 10 veces. La suspensión se homogeneiza entonces utilizando un homogeneizador de vidrio de Teflón para obtener una solución de células desestabilizadas. Para poder identificar la localización de la 5\alpha-reductasa en la célula, la solución resultante de las células desestabilizadas se sometió a centrifugación bajo 800 xg durante 10 minutos, por lo cual se obtiene una fracción en crudo del núcleo. El sobrenadante se centrifuga bajo 10000 g durante 15 minutos, por lo cual se obtiene una fracción de mitocondrias. El sobrenadante se centrifuga de nuevo a 100000 xg durante 60 minutos, por lo cual se obtiene una fracción de microsoma y una fracción de citosol. La porción de precipitado de cada uno de ellos se lava dos veces, seguido por re-suspensión.
Bajo condiciones de incubación convencionales, se añadió 50 \mul de la solución de células desestabilizadas a citrato de sodio 100 mM (pH 5.5) o cloruro de tris-hidrógeno 100 mM (pH 7.5) que contenía 50 nM [^{3}H]-testosterona y 1 mM de NADPH para dar una solución 100 \mul. A cada tubo, se añadió la solución de células desestabilizadas en una cantidad de 50 a 100 mg en términos de contenido de proteína. La reacción se lleva a cabo a 37ºC durante 30 minutos. Durante la incubación, la reacción procede en proporción respecto del tiempo. Para encontrar el pH óptimo para la reacción, se utilizó una solución tampón de citrato a pH 4.5 a 6.5, mientras que se utilizó una solución tampón de cloruro de tris-hidrógeno a pH 7.0 a 9.0. El contenido de proteína se midió por el método de Lowry, y col. ("Medida de Proteína con el reactivo de folin fenol", J. Biol. Chem. 193, 265-275(1951).
Después de la finalización de la incubación, se puso punto y final a la reacción por la adición de 4 veces la cantidad de cloroformo-metanol (2/1: V/V) que contenía 110 mg de cada uno de los esteroides portadores. El esteroide extraído se analiza por cromatografía en capa fina de acuerdo con el método de Gomez y col. ("Metabolismo In Vitro de la Testosterona-4-^{14}C y de la D-androsteno-3,17-diona-4-^{14}C en piel humana", Biochem., 7, 24-32(1968)). La pureza de cada esteroide se confirmó por el método de recristalización. La actividad de 5\alpha-reductasa se indica por la cantidad de dihidrotestosterona formada. La acción inhibidora del enzima se indica como tanto por ciento de inhibición (100-(proporción de la conversión sobre la adición del compuesto de ensayo \div proporción de la conversión del grupo de control)x100)(%), situando la proporción de conversión del grupo de control al 100%.
Se encontró que el compuesto de fórmula (I) exhibía una actividad de inhibición de 5\alpha-reductasa elevada.
Ejemplo de ensayo 4
Prevención de la pérdida de pelo y el efecto tricogeneo en el macaco de cola de tocón (1)
El macaco de cola de tocón sufre una alopecia que se asemeja a la alopecia estándar masculina. La alopecia del macaco de cola de tocón empieza justo después de la pubertad (aproximadamente 4 años de edad). La alopecia ataca a casi todos los machos y las hembras de los macacos de cola de tocón y depende del nivel de andrógenos. El macaco de cola de tocón es por consiguiente un modelo de animal útil de la alopecia estándar masculina.
Los macacos de cola de tocón machos (de 3 a 16 años de edad) se clasifican en grupos, cada uno consistente de 3 a 6 animales. El cuero cabelludo del macaco de cola de tocón está claramente en la región frontal y la región occipital y una de estas regiones se etiqueta, por ejemplo, con tinta china. El pelo en la región marcada se afeita. Se prepara una solución o polvo de un compuesto de ensayo a varias dosis en varias combinaciones y estas muestras se aplican o bien uniformemente a la región de la cual el pelo ha sido afeitado, o bien oralmente administradas. A un animal de control, se administra la misma cantidad de un disolvente (por ejemplo dimetilsulfóxido), crema (administración subcutánea) o placebo (administración oral). El pelo de la región marcada se afeita a intervalos de 4 a 6 semanas y la cantidad de pelo afeitada se pesa. La administración se continúa durante 6 semanas durante 2 años. El Finasteride es un inhibidor de la 5\alpha-reductasa y se conoce que previene la alopecia del animal anteriormente descrito. El Finasteride (administración oral) se facilita para el ensayo como comparación.
El cuero cabelludo (4 mm de profundidad), como un espécimen de biopsia, se elimina al principio y final del ensayo. La presencia o ausencia de alopecia se juzga por el análisis de la actividad de la 5\alphareductasa y la inspección del tejido del cuero cabelludo reseco.
Se encontró que el compuesto de fórmula (I) era efectivo para la alopecia.
Ejemplo de ensayo 5
Prevención de la pérdida de pelo y el efecto tricogeno en el macaco de cola de tocón (2)
Los macacos de cola de tocón machos y hembras (de 3 a 16 años de edad) se dividen en grupos, cada uno compuesto de 3 a 6 animales. Se prepara una solución o polvo del compuesto de ensayo a varias dosis y en varias combinaciones y uniformemente aplicada al cuero cabelludo de la región frontal, o se administra oralmente una vez al día. Se continúa la administración durante 6 semanas a 2 años. A un animal de control, se le administra la misma cantidad de un disolvente (por ejemplo dimetilsulfóxido), crema (administración subcutánea) o placebo (administración oral). La condición del pelo de la región frontal se observa a intervalos de 1 mes y los efectos del compuesto de ensayo se evalúan del tamaño del diámetro del pelo, densidad, y región tricogenea y tiempo. Al mismo tiempo, se coge una foto de los macacos de cola de tocón y se juzga el efecto en el conjunto de las fotos. Se elimina una porción de la piel (un círculo de 4 mm de diámetro) de la región frontal de la cabeza como un espécimen de biopsia en el inicio del ensayo y en el Mes 3 y Mes 6 después del inicio y se estudian los efectos en las etapas de crecimiento de la raíz del pelo por un análisis histológico.
Se encontró que el compuesto de fórmula (I) era efectivo para la alopecia.
Ejemplo de ensayo 6
Ensayo utilizando una rata peluda
Una rata peluda es un animal modelo dependiente de andrógeno que muestra una debilidad anormal de proliferación y secreción de las células de la glándula sebácea de la raíz del pelo. Sus raíces del pelo en la etapa juvenil (aproximadamente 4 años de edad) están principalmente formadas en la etapa de crecimiento. Después de la madurez sexual (aproximadamente 8 semanas), las raíces del pelo en la etapa de relajación incrementan. Por consiguiente se usa como un animal modelo para investigar la influencia del crecimiento del pelo.
Las ratas peludas (macho, de 2 a 12 semanas de edad) se dividen en grupos, cada grupo consistiendo de 5 a 6 ratas. Una solución de polvo del compuesto de ensayo se prepara a varias dosis y en varias combinaciones y uniformemente aplicada a la piel de la región dorsal, o se administra oralmente una vez al día. La administración se continúa de 4 a 8 semanas. A los animales del grupo de control, se administra la misma cantidad de un disolvente (por ejemplo, dimetilsulfóxido), crema (administración subcutánea) o placebo (administración oral). En el siguiente día después de la finalización de la administración, se decapitaron. Se eliminó el tejido de la piel (círculo de 4 mm de diámetro) de la región dorsal. Los efectos en la glándula sebácea y en la etapa de crecimiento del pelo de la raíz del pelo se estudian por un análisis histológico.
Se encontró que el compuesto de fórmula (I) era efectivo para la seborrea y la alopecia.
Así como los ensayos anteriormente descritos, el crecimiento del pelo puede ser evaluado de acuerdo con el método descrito en la literatura (B de Brouwer y col., Br. J. Dermatol., 137, 699-702(1997)) utilizando un ratón desnudo.
N-[1-Metil-1-(4-metoxifenil)etil]-3-oxo-4-aza-5\alpha-androst-1-en-17\beta-carboxamida
A 30 mL de tolueno anhidro, se añadieron sucesivamente 1,0 g de ácido 3-oxo-4-aza-5\alpha-androst-1-en-17\beta-carboxílico, 1,6 g de trifenilfosfina y 1,4 g de 2,2'-dipiridil disulfuro. La mezcla resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se sometió a cromatografía en columna en 35 g de gel de sílice, eluyendo con acetona-cloruro de metileno (1:9 a 1:1), para dar 1,11 g del compuesto de 2-piridiltioester. A 30 mL de cloruro de metileno anhidro, se añadieron sucesivamente 5,0 g de compuesto de 2-piridiltioéster y 5,0 g de 1-(4-metoxifenil)-1-metiletilamina y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Después de la dilución con 100 mL de cloruro de metileno, la mezcla se lavó sucesivamente con ácido clorhídrico 1N, agua, una solución acuosa de bicarbonato de sodio y sal saturada, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en columna en 15 g de gel de sílice eluyendo con acetona-cloruro de metileno (1:9 a 1:1) para dar 5,2 g del compuesto del título.
Espectro de RMN (CDCl_{3}) \delta ppm: 0,68(3H,s), 0,98(3H,s), 0,90-2,20(16H,m), 1,70(3H,s), 1,72(3H,s), 3,35(1H,t,
J=9Hz), 3,80(3H,s), 5,48(1H,br.), 5,76(1H,br.), 5,83(1H,d,J=10Hz), 6,82(1H,d,J=10Hz), 6,88(2H,d,J=9Hz), 7,32(2H,
d,J=9Hz).
Espectro de IR v_{max} cm^{-1} (KBR): 2969, 2938, 1672, 1599, 1514, 1455, 1248, 1181, 1035, 825.
Preparación de ejemplo 1
Comprimidos (5-mg comprimido)
Componente Formulación básica (mg/comprimido)
Compuesto 5,00
Celulosa de hidroxipropilmetilo 15,00
Almidón de carboximetil de sodio 9,50
Celulosa cristalina 30,50
Carmelosa entrecruzada de sodio 20,00
Lactosa (después del filtrado) 38,75
Sesquióxido de hierro amarillo 0,05
Estereato de magnesio (después del filtrado) 1,20
Comprimidos 120,00
Preparación del ejemplo 2
Solución del alcohol
Compuesto 15,0 (wt.%)
Agua 45
Etanol 40
Preparación del ejemplo 3
Espuma limpiadora
Compuesto 10,00 (wt.%)
Agua 70,439
Manzanilla 0,01
Gel de Aloe vera 0,01
Alantonia 0,001
Trietiletanolamina 0,02
METOCEL (METOCEL™ 40-100 (Dow)) 1,50
Glicerina 3,00
Sulfato de lauralil sódico 15,00
Aceite de Vitamina A 0,01
Aceite de Vitamina E 0,01
Preparación del ejemplo 4
Espuma limpiadora
Compuesto 5,0 (wt.%)
Cera de abejas sintética 14,0
Propionato de miristilo PPG_{2} 5,0
Alcohol de lanolino 0,5
Aceite mineral 36,0
Paraben de propilo 0,15
Borax 1,0
Agua 38,35
PPG: polietilen glicol polipropilen glicol
Preparación del ejemplo 5
Gel de piel
Compuesto 2,00 (wt.%)
Propionato del éter de miristilo PPG_{2} 45,0
Éter de cetilo PPG_{10} 5,0
Triglicérido C_{18}-C_{36} 4,0
Miristato de Miristilo 3,0
Tribehenato de glicerilo 2,0
Ciclometicona 34,00
Polietileno 5,00
Preparación del ejemplo 6
Loción de piel
Compuesto 1,0 (wt.%)
Fosfato de dietanol amina oleth 3 1,0
Cera emulsionada 2,0
Ácido alifático de cera C_{18}-C_{36} 1,0
Propionato de miristilo PPG_{2} 5,0
Glicerina 3,0
Trietanolamina 0,5
Agua 86,5
Preparación del ejemplo 7
Gel de Champú
Compuesto 2,0 (wt.%)
Sulfato de lauril de isopropanolamina 81,5
Dietanol amida del ácido alifático de aceite de coco 8,0
Éster de gliceril de la cera C_{18}-C_{36} 4,5
Fosfato PPG_{5} ceteth-10 4,0
Preparación del ejemplo 8
Champú de crema
Compuesto 0,1 (wt.%)
Sulfato de lauril de sodio 65,0
Tribebenato de glicerilo 2,0
Colágeno hidrolizado 1,0
Dietanolamida del ácido Laurico 5,0
Agua 26,9
Aplicabilidad industrial
El Finasteride es un compuesto que se ha vendido en el mercado Europeo como un medicamento para la hipertrofia prostática benigna y se encuentra ahora en las pruebas clínicas como un medicamento para la alopecia.
El compuesto (I) utilizado en la presente invención tiene una acción inhibidora mas fuerte contra el isoenzima tipo II que el Finasteride. También tiene una fuerte inhibición contra el isoenzima de tipo I. Tiene una acción de disminución de la DHT en sangre más fuerte que el Finasteride y tiene así menor toxicidad lo que es útil como ingrediente activo para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea.
Texto de lista de secuencia
[Listado de secuencia ID. No. 1]
Descripción de la secuencia sintetizada: un iniciador designado en base a la secuencia de cDNA codificada de la 5\alpha-reductasa de tipo I.
[Listado de secuencia ID No. 2]
Descripción de la secuencia sintetizada: un iniciador designado en base a la secuencia de cDNA codificada de la 5\alpha-reductasa de tipo I.
[Listado de secuencia ID No. 3]
Descripción de la secuencia sintetizada: un iniciador designado en base a la secuencia de cDNA codificada de la 5\alpha-reductasa de tipo II.
[Listado de secuencia ID No. 4]
Descripción de la secuencia sintetizada: un iniciador designado en base a la secuencia de cDNA codificada de la 5\alpha-reductasa de tipo II.
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Compañía Sankyo, Limitada
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino y seborrea
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 98062SY
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP HEI 9-203136
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997-07-29
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador designado basado en la secuencia de cDNA codificada en la 5 alfa-reductasa de tipo I
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagccctgg cgatggcaac 
\hfill
20 
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<210> 2
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador designado basado en la secuencia de cDNA codificada en la 5 alfa-reductasa de tipo I
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<400> 2
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cagagcttga aattctgacc tgtta 
\hfill
25 
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<210> 3
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador designado basado en la secuencia de cDNA codificada en la 5 alfa-reductasa de tipo II
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acggcgcgat gcaggttcag tg 
\hfill
22 
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<210> 4
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador designado basado en la secuencia de cDNA codificada en la 5 alfa-reductasa de tipo II
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcattgtgg gagctctgct cct 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (4)

1. La utilización de la N-[1-metil-1-(4-metoxifenil)etil]-3-oxo-4-aza-5\alpha-androst-1-en-17\beta-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable o otro derivado del mismo para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia, hirsutismo femenino o seborrea.
2. La utilización para la preparación de una composición para el tratamiento de la alopecia de acuerdo con la reivindicación 1.
3. La utilización para la preparación de una composición para el tratamiento del hirsutismo femenino de acuerdo con la reivindicación 1.
4. La utilización para la preparación de una composición para el tratamiento de la seborrea de acuerdo con la reivindicación 1.
ES98933945T 1997-07-29 1998-07-27 Composicion azasteroide para ael tratamiento de la alopecia, el hirsutismo femenino y la seborrea. Expired - Lifetime ES2218840T3 (es)

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