PT1121114E - Utilização de análogos gaba para a produção de um medicamento para o tratamento da mania e da doença bipolar - Google Patents

Description

ΡΕ1120114 1 DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR ESTADOS QUE RESPONDEM AO ESTROGÉNIO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com composições e métodos para tratar estados que respondem ao estrogénio. As composições e métodos utilizam compostos agonistas/anta-gonistas de estrogénio. Em ambos homens e mulheres pós-menopáusicas, o cancro do cólon é tratado com as composições e os métodos da presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nas mulheres pré-menopaúsicas, o 17p-estradiol produzido pelos ovários é o estrogénio circulante principal. As concentrações de estradiol no soro são baixas em raparigas pré-adolescentes e aumentam na menarca. Nas mulheres, variam desde cerca de 100 pg por mililitro (367 pmol por litro) na fase folicular até cerca de 600 pg por mililitro (2200 pmol por litro) na altura da ovulação. Podem aumentar até aproximadamente 20 000 pg por mililitro (70 000 pmol por litro) durante a gravidez. Após a menopausa, as concentrações de estradiol no soro caiem para valores semelhantes ou inferiores aos dos homens de idade semelhante (5 a 20 pg por mililitro [18 a 74 pmol por 2 ΡΕ1120114 litro]) (Yen, S.S.C. and Jaffe, R.B., eds. Reproductive Endocrinology: Physiology, Pathophysiology and Clinicai Management, 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders, (1991)).

Os estrogénios esteróides são formados em último lugar a partir quer de androstenediona ou de testosterona como percursores imediatos. A reacção envolve aromatização de um anel A, e é catalizada em três passos por um complexo da enzima monooxigenase (aromatase) que utiliza NADPH e oxigénio molecular como co-substratos, (Miller, W.L., Endocr. Rev., 9:295-318 (1988)). No primeiro passo da reacção, C 19 (o grupo metilo angular residente no C 10 do precursor de androgénio) é hidroxilado. Uma segunda hidroxilação resulta na eliminação do grupo hidroximetilo recentemente formado C 19, e uma hidroxilação final em C 2 resulta na formação de um intermediário instável que se re-arranja para formar o anel A fenólico. A totalidade da reacção consome três moléculas de NADPH. A actividade da aromatase reside numa glicopro-teina de transmembrana (P45o,arom) que é homóloga à família do citocromo P450 de monooxigenases (Nebert, D.W. and Gonzalez, F.J., Annu. Rev. Biochem. 56:945-993, (1987); Corbin, C.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8948-8952, (1988)); também essencial é uma flavoproteína ubíqua, NADPH-cictocromo Ρ450 reductase. Ambas as proteínas estão localizadas no retículo endoplásmico das células granulosas ováricas, células testiculares Sertoli e Leydig, adipó-citos, sinctiotrofoblastos placentais, o blastócisto de 3 ΡΕ1120114 pré-implantação, e varias regiões do cérebro, incluindo o hipotálamo.

Os ovários são a principal fonte de estrogénio nas mulheres pré-menopaúsicas. 0 principal produto de segregação é o estradiol, sintetizado por células granulosas a partir dos precursores androgénicos providenciados por células teçais. 0 estradiol segregado é oxidado reversivelmente a estrona, e ambos estes estrogénios podem ser convertidos em estriol. Estas transformações ocorrem principalmente no fígado, onde a interconversão entre estrona e estradiol é catalizada pela 17-hidroxiesteróide desidrogenase.

Nos homens e nas mulheres pós-menopáusicas, a principal fonte de estrogénio é o tecido adiposo. Neste e noutros tecidos periféricos, a estrona é sintetizada a partir de desidroepiandrosterona, que é segregada pelo córtex adrénico. Assim, é regulada a contribuição de estrogénios do tecido adiposo, em parte pela disponibilidade de precursores androgénicos (Mendelson, C.R. and Simpson, E.R., Mol. Cell Endocrinol., 52:169-176, (1987)). 0 cancro do intestino grosso é a segunda, apenas superado pelo cancro do pulmão, causa de morte por cancro nos Estados Unidos. Ocorreram aproximadamente 133 500 novos casos em 1996, resultando em 54 900 mortes. A taxa de incidência deste estado maligno extremamente comum não mudou substancialmente durante os últimos 40 anos, embora, 4 ΡΕ1120114 a taxa de mortalidade tenha decrescido em anos recentes, particularmente em fêmeas. 0 cancro colo-rectal ocorre geralmente em indivíduos de 50 anos de idade ou mais velhos.

Crê-se que a maioria dos cancros colo-rectais, independentemente da etiologia, surgem a partir de pólipos adenomatosos. Um pólipo é uma protuberância grosseiramente visível da superfície mucosa e poderá ser classificado patologicamente como um hamartoma não neoplástico (pólipo juvenil), uma proliferação da mucosa hiperplástica (pólipo hiperplástico), ou um pólipo adenomatoso. Só os adenomas são claramente pré-malignos, e apenas uma minoria de tais lesões se desenvolvem alguma vez em cancro. Os estudos de rastreio da população e colecções de autópsias revelaram que os pólipos adenomatosos poderão ser encontrados nos cólons de cerca de 30 porcento das pessoas de meia-idade ou idosas. Baseado nesta prevalência e no conhecimento da incidência de cancros colo-rectais, parece que menos que 1 porcento dos pólipos se torna alguma vez maligno. A maior parte dos pólipos não produzem sintomas e permanecem clinicamente indetectáveis. SO sangue oculto nas fezes poderá ser encontrado em menos de 5 porcento dos sujeitos com tais lesões.

Foi descrito um número de alterações moleculares no ADN obtido a partir dos pólipos adenomatosos, lesões displásticas, e pólipos contendo focos microscópicos de células tumorais (carcinoma in situ), que se pensa 5 ΡΕ1120114 representarem um processo de passos múltiplos na evolução da mucosa colónica normal para carcinoma invasivo potencialmente letal. Estes passos de desenvolvimento para carcinogénese incluem mutações pontuais no K-ras proto-oncogene; hipometilação de ADN, conduzindo a activação de gene; perda de ADN ("perda alélica") no local de um gene supressor de tumor [o gene coli poliposis adenomatoso (APC)] localizado no braço extenso do cromossoma 5 (5q21); perda alélica no local de um gene supressor de tumor localizado no cromossoma 18q [o chamado gene eliminado no cancro colo-rectal(DCC)]; e perda alélica no cromossoma 17p, associado a mutações no gene supressor de tumor p53. Assim, o padrão proliferativo alterado da mucosa colónica, que resulta na progressão para um pólipo e seguidamente para o carcinoma, poderá envolver a activação mutacional de um oncogene seguido por e acoplado com uma perda de genes que normalmente suprime a génese tumoral. Enquanto o presente modelo inclui cinco de tais alterações moleculares, outros estão provavelmente envolvidos no processo carcinogénico. Permanece incerto quais as aberrações genéticas que ocorrem sempre numa ordem definida. Baseado neste modelo, contudo, crê-se que a neoplasia se desenvolve apenas naqueles pólipos nos quais ocorrem todos estes eventos mutacionais. (Mayer, R. j., Gastrointestinal Tract Câncer, Chapter 92, in Harrison's Principies of Internai Medicine, 14th ed., 1998).

Foram avaliados vários materiais que ocorrem naturalmente e sintéticos administrados oralmente como 6 ΡΕ1120114 possíveis inibidores do cancro do cólon. A classe mais efectiva destes agentes quimiopreventivos é a aspirina e outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides, que se crê suprimirem a proliferação celular por inibição da síntese de prostaglandina. Estudos caso de controlo indicaram que a utilização regular da aspirina reduz o risco de adenomas e carcinomas colónicos bem como da morte por cancro do intestino grosso; este efeito de inibição na carcinogénese colónica parece aumentar com a duração da utilização do fármaco. Enquanto que as vitaminas antioxi-dantes tais como ácido ascórbico, tocoferois, e β-caroteno estão presentes nas dietas ricas em frutas e vegetais, que têm sido associadas a baixas taxas de cancro colo-rectal, descobriu-se serem ineficazes num ensaio aleatório prospec-tivamente como um meio de reduzir a incidência de adenomas subsequentes em sujeitos que sofreram a remoção de um adenoma colónico. A terapia de substituição de estrogénio foi associada em estudos prospectivos de grupos a uma redução no risco de cancro colo-rectal nas mulheres, presumivelmente por um efeito na síntese e composição do ácido biliar. Por outro lado a inexplicável redução na mortalidade por cancro colo-rectal nas mulheres poderá ser um resultado da vasta utilização da substituição de estrogénio em indivíduos pós-menopáusicos. (Mayer, R. J., Gastrointestinal Tract Câncer, Chapter 92, in Harrison's Principies of Internai Medicine, 14th ed., 1998). A menopausa ocorre naturalmente numa idade média de 50 a 51 anos nos Estados Unidos da América. Com o 7 ΡΕ1120114 envelhecimento dos ovários, a resposta a gonadotropinas pituitárias (hormona foliculo-estimulante [FSH] e hormona luteinizante [LH]) decresce, resultando inicialmente em fases foliculares mais curtas (portanto, ciclos menstruais mais curtos), menos ovulações, decréscimo da produção de progesterona, e maior irregularidade nos ciclos. Eventualmente, o foliculo cai para responder e não produz estrogénio. A fase transicional, durante a qual uma mulher abandona o estágio reprodutivo, começa antes da menopausa. É denominada climatérico ou perimenopausa, embora muitas pessoas se refiram a ela como menopausa. A menopausa prematura refere-se à deficiência ovárica de causa desconhecida que ocorre antes dos 40 anos. Poderá estar associada a fumar, viver a altitude elevada, ou estatuto nutricional pobre. A menopausa artificial poderá resultar de ooforectomia, quimioterapia, radiação da pélvis, ou de qualquer processo que reduza o fornecimento de sangue ovárico.

Os sintomas do climatérico variam desde a não existência a graves. Afrontamentos (intermitências) e exsudação secundária até instabilidade vasomotora afectam 75 % das mulheres. A maioria tem afrontamentos durante mais de 1 ano, e 25 a 50% até durante mais de 5 anos. A mulher sente-se com calor ou quente e pode transpirar, por vezes profusamente. A pele, especialmente da cabeça e do pescoço, torna-se vermelha e quente. O afrontamento, que poderá durar desde pelo menos 30 sec. a 5 min., poderá ser seguido 8 ΡΕ1120114 por arrepios. Os sintomas vasomotores do afrontamento coincidem com o início de pulsos LH, mas cada incremento no LH não está associado a um afrontamento, sugerindo que o controlo hipotalâmico dos impulsos LH é independente do dos afrontamentos. Esta independência é confirmada pela ocorrência de afrontamentos nas mulheres que tinham tido deficiência pituitária e não segregam LH e/ou FSH.

Podem ocorrer sintomas emocionais e psicológicos incluindo fadiga, irritabilidade, insónia, incapacidade de concentração, depressão, perda de memória, dor de cabeça, ansiedade, e nervosismo e timidez. Transtornos do sono por afrontamentos recorrentes contribuem para a fadiga e a irritabilidade. Poderão também ocorrer tonturas intermitentes, parestesias, palpitações, e taquicardia. São também comuns, náusea, constipação, diarreia, artralgia, mialgia, mãos e pés frios, e ganho de peso. A grande redução de estrogénio conduz a variações profundas no tracto genital inferior; e.g., a mucosa vaginal e a pele vulvar tornam-se mais finas, a flora bacteriana normal altera-se, e o tamanho dos lábios menores, clítoris, útero, e ovários decresce. A inflamação da mucosa vaginal (vaginite atrófica) pode causar que a mucosa tenha uma aparência de morango e pode conduzir a frequência e urgência urinária, secagem vaginal, e dispareunia. As mulheres tendem a perder a tonalidade do músculo pélvico e a desenvolver incontinência urinária, cistite, e vaginite. 9 ΡΕ1120114

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é um gráfico log-linear da competição da ligação de PPTN e 17p-estradiol ao receptor de estrogénio humano. 0 eixo dos X representa a percentagem de estrogénio radiomarcado ligado ao receptor. 0 eixo dos Y representa a concentração molar do ligando adicionado. Os valores são média ± DMP.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com composições farmacêuticas úteis para o tratamento de estados que respondem ao estrogénio. As composições são compreendidas de um agonista/antagonista de estrogénio e um veiculo, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Estas composições são efectiva no tratamento de cancro do cólon. A presente invenção providencia a utilização de agonistas/antagonistas de estrogénio da presente invenção para o fabrico de um medicamento para tratar o cancro do cólon. Esta indicação é também tratada pelo mediamento enquanto se reduz substancialmente a responsabilidade concomitante de efeitos adversos associados à administração de estrogénio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com composições 10 ΡΕ1120114 e métodos para o tratamento de estados que respondem a estrogénio. A menos que seja indicado o contrário os termos seguintes têm os significados como definido abaixo: "Tratamento" como usado aqui inclui tratamento preventivo (e.g., profiláctico) e paliativo e "tratar" como usado aqui refere-se ao acto de providenciar tratamento preventivo e/ou paliativo.

Um "sujeito" é um animal incluindo a espécie humana que é tratável com as composições, métodos e kits (conjuntos) da presente invenção. O termo "sujeito" ou "sujeitos" é entendido referir-se a ambos os géneros, masculino e feminino a menos que seja indicado especifi-camente um género. "Estados que respondem ao estrogénio" incluem aqueles estados causados por deficiência de estrogénio ou aqueles que são tratados com suplemento ou substituição de estrogénio. Estas condições incluem cancro do cólon. "Efeitos adversos associados a estrogénio" incluem brandura dos seios, cancro da mama, distensão abdominal, cefaleia, coagulação sanguínea aumentada e sangramento menstrual nas mulheres. A terapia de estrogénio sem oposição aumenta o risco de carcinoma do endométrio. As mulheres em terapia de estrogénio de longa duração poderão ter um risco aumentado que não é revertido por progestina concorrente (N, Engl, J, Med. 332: 1589, (1995)). No homem, 11 ΡΕ1120114 os efeitos adversos de estrogénio incluem coagulação sanguínea aumentada, ginecomastia, feminização e libido diminuída. 0 termo "mulher pós-menopáusica" é definido para incluir não só as mulheres de idade avançada que passaram pela menopausa, mas também as mulheres que foram histerectomizadas ou que por alguma outra razão possuem a produção de estrogénio suprimida, tal como aquelas que sofreram administração de corticoesteróides de longa duração, sofrem de síndrome de Cushions ou que possuem disgénese das gónadas. "Cancro da mama" é definido como uma proliferação maligna de células epiteliais que revestem os duetos ou lóbulos da mama.

Um "agonista/antagonista de estrogénio" é um composto que afecta algum dos mesmos receptores que o estrogénio, mas não necessariamente todos, e em alguns casos, antagoniza ou bloqueia o estrogénio. É também conhecido como um "modulador receptor de estrogénio selectivo" (SERM). Os agonistas/antagonistas de estrogénio poderão também ser referidos como anti-estrogénios embora possuam alguma actividade estrogénica a alguns receptores de estrogénio. Os agonistas/antagonistas de estrogénio não são portanto os que são comummente referidos como "anti-estrogénios puros". Os anti-estrogénios que podem também actuar como agonistas são referidos como anti-estrogénios 12 ΡΕ1120114

Tipo I. Os anti-estrogénios Tipo I activam o receptor de estrogénio para se ligar fortemente ao núcleo durante um periodo prolongado mas com reduzida recuperação do receptor (Clark, et ai., Steroids 22:707, 1 (973); Capony, et al., Mol Cell Endocrinol, 3:233, (1975)).

Os métodos referidos acima para tratar os estados que respondem ao estrogénio referem-se geralmente a beneficios/ou sobrevivência a longo prazo. Os benefícios clínicos poderão ser observáveis dentro de poucas semanas, por exemplo 2-3 semanas, contudo, isto não implica que os sujeitos não beneficiem do tratamento antes da real observação clinica. É preferido, contudo que a administração seja efectuada com duração longa; isto é mais longa que 16 semanas, e preferencialmente mais longa que 6 meses. Não estando limitado a qualquer teoria única, crê-se que os agonistas/antagonistas de estrogénio da presente invenção e as composições contendo aqueles agonistas/antagonistas de estrogénio tratam estados que respondem ao estrogénio tais como cancro do cólon devido à actividade no receptor de estrogénio. Os agonistas/antagonistas de estrogénio da presente invenção exercem um efeito estrogénico positivo em animais no tratamento de cancro do cólon. Os efeitos são atingidos sem a responsabilidade concomitante dos efeitos adversos associados à administração de estrogénio devido aos efeitos anti-estrogénio dos agonistas/antagonistas de estrogénio noutros tecidos tais como o tecido da mama. 13 ΡΕ1120114

Por halogeno é entendido cloro, bromo, iodo, ou fluoro ou por halogéneo é entendido cloro, bromo, iodo ou flúor.

Por alquilo é entendido um hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada. Ilustrações de tais grupos alquilo (assumindo que o comprimento designado contém o exemplo particular) são metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, butilo terciário, pentilo, isopentilo, hexilo e iso-hexilo.

Por alcoxi é entendido um alquilo saturado de cadeia linear ou ramificada ligado através de um oxi. Ilustrações de tais grupos alcoxi (assumindo que o comprimento designado contém o exemplo particular) são metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, butoxi terciário, pentoxi, isopentoxi, hexoxi e isohexoxi. 0 sinal parentético negativo ou positivo utilizado aqui na nomenclatura denota que a direcção do plano polarizado da luz é rodado pelo estereoisómero particular. 0 composto utilizado na presente invenção é revelado na Patente dos Estados Unidos da América 5 552 412.

Num aspecto da invenção, é providenciada a utilização de: 14 ΡΕ1120114 (-) —cís-6-fenil—5-[4—(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetra-hidronaftaleno-2-ol; ou um seu isómero óptico ou geométrico; ou um seu sal de adição de ácido ou éster, farmacologicamente aceitável, não tóxico, no fabrico de uma composição para tratar o cancro do cólon.

Preferencialmente, a utilização é de (-)-cis-6-fenil-5- [4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5, 6,7, 8-tetra-hidro-naftalen-2-ol na forma do sal D-tartarato. 0 perito químico comum irá reconhecer que certos compostos desta invenção irão conter um ou mais átomos que poderão estar numa configuração estereoquimica, tautomé-rica, ou geométrica particular, dando origem a estereoisó-meros, tautómeros e isómeros configuracionais. Todos esses isómeros e suas misturas estão incluídos nesta invenção. Os hidratos dos compostos desta invenção estão também incluídos . É também parte da presente invenção administrar mais que um agonista/antagonista de estrogénio. Adicionalmente, um agonista/antagonista de estrogénio ou combinações de agonistas/antagonistas de estrogénio pode ser administradas em combinação com outros compostos terapeuticamente activos, particularmente compostos que são utilizados para tratar artrite reumatóide, cancro do cólon ou cataratas. Os diferentes compostos podem ser administrados na mesma forma 15 ΡΕ1120114 de dosagem ou em formas de dosagem diferentes ao mesmo tempo ou a tempos diferentes. O assunto da invenção inclui também compostos marcados isotopicamente, que são idênticos àqueles enumerados na Fórmula (IA), excepto pelo facto que um ou mais átomos são substituídos por um átomo possuindo uma massa atómica ou um número de massa diferente da massa atómica ou número de massa encontrado usualmente na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 1SN, 180, 170, 31P, 32P, 35P, 35S, 18F e 38C1 res- pectivamente. Os compostos da presente invenção, seus pró-fármacos, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos compostos ou dos referidos pró-fármacos que contêm os isótopos mencionados anteriormente e/ou outros isótopos de outros átomos estão no objectivo desta invenção. Certos compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo aqueles nos quais são incorporados tais isótopos radioactivos como He C, são uteis em ensaios de distribuição em tecidos de fármaco e/ou substrato. Os isótopos trítio, i.e., 3H, e carbono 14, i.e., 14C, são particularmente preferidos devido à sua fácil preparação e detecta-bilidade. Adicionalmente, a substituição com isótopos mais pesados como o deutério i.e., 2H, pode aportar certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo tempo de meia-vida in vivo aumentando ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, 16 ΡΕ1120114 poderão ser preferidos em alguns casos. Os compostos marcados isotopicamente de Fórmula (IA) desta invenção e seus pró-fármacos podem geralmente ser preparados levando a cabo os procedimentos descritos e/ou exemplificados na Patente dos Estados Unidos da América 5 552 412 e por substituição de um reagente marcado isotopicamente prontamente disponível por um reagente não marcado isotopicamente .

Os químicos farmacêuticos irão facilmente reconhecer que os compostos activos fisiologicamente que possuem grupos hidroxilo acessíveis são frequentemente administrados na forma de ésteres farmaceuticamente aceitáveis. A literatura respeitante a tais compostos, tais como estradiol, providencia um grande número de exemplos de tais ésteres. Os compostos desta invenção não são excepção neste respeito, e podem ser efectivamente administrados como um éster, formado nos grupos hidroxi, tal como um perito em química farmacêutica esperaria. Crê-se que tais ésteres são quebrados metabolicamente no organismo, originando o composto com um grupo hidroxi livre. É possível, como há muito conhecido na química farmacêutica, ajustar a taxa ou a duração da acção do composto través de adequadas escolhas de grupos éster.

Certos grupos éster são preferidos como constituintes dos compostos desta invenção. Os compostos de fórmula (IA) poderão conter grupos éster em várias posições como definido aqui atrás, onde estes grupos são repre- 17 ΡΕ1120114 sentados como -COORg, Rg é C1-C14 alquilo, C1-C3 cloroal-quilo, C1-C3 fluoroalquilo, C5-C7 cicloalquilo, fenilo, ou fenil mono- ou di-substituído com C1-C4 alquilo, C1-C4 alcoxi, hidroxi, nitro, cloro, fluoro ou tri(cloro ou fluoro)metilo.

Os sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção poderão ser formados a partir do próprio composto, ou de qualquer dos seus ésteres, e incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis que são frequentemente utilizados na quimica farmacêutica. Por exemplo, os sais podem ser formados com ácidos inorgânicos ou orgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácidos sulfónicos incluindo tais agentes como ácidos naftalenossulfónico, metanossulfónico e toluenossulfónico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido pirossulfúrico, ácido metafosfórico, ácido succínico, ácido fórmico, ácido ftálico, ácido láctico e semelhantes, mais preferível com ácido clorídrico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido maleico, ácido acético, e ácido propiónico.

Os compostos desta invenção, como discutido atrás, podem ser administrados na forma de sais de adição de ácido. Os sais são convenientemente formados, como é usual na química orgânica, por reacção de um composto desta invenção com um ácido adequado, tal como foi descrito atrás. Os sais são formados rapidamente com rendimentos elevados a temperaturas moderadas, e frequentemente são 18 ΡΕ1120114 preparados por simples isolamento do composto a partir de uma lavagem acidica adequada como o passo final da sintese. 0 ácido formador de sal é dissolvido num solvente orgânico adequado, ou solvente orgânico aquoso, tal como um alcanol, cetona ou éster. Por outro lado, se um composto desta invenção é desejado na forma de base livre, é isolado por um passo de lavagem final básico, de acordo com a prática usual. Uma técnica preferida para preparar cloridratos é dissolver a base livre num solvente adequado e secar a solução cuidadosamente, como sobre crivos moleculares, antes de borbulhar cloreto de hidrogénio gasoso através deste. Um sal preferido da presente invenção é o sal D-(-)-tartarato. A dose de um composto desta invenção a ser administrada a um ser humano é bastante vastamente variável e sujeita ao julgamento do médico assistente. Deverá ser notado que poderá ser necessário ajustar a dose de um composto quando é administrado na forma de um sal, tal como um laureato, cuja unidade formadora de sal tem um peso molecular apreciável. 0 intervalo geral das taxas de administração efectivas dos compostos é desde cerca de 0,001 mg/dia até cerca de 100 mg/dia. Um intervalo de taxa preferido é desde cerca de 0,01 mg/dia a 10 mg/dia. Claro que, é frequentemente prático administrar a dose diária de composto em porções, a várias horas do dia. Todavia, em qualquer caso dado, a quantidade de composto administrado irá depender de tais factores como a solubilidade do componente activo, a formulação utilizada e a via de administração. 19 ΡΕ1120114 A via de administração dos compostos desta invenção não é critica. Os compostos são conhecidos ser absorvidos a partir do tracto alimentar, e assim é usualmente preferido administrar um composto oralmente por razões de conveniência. No entanto, os compostos poderão igualmente efectivamente ser administrados percutaneamente, ou como supositórios para absorção pelo recto, se desejado num dado caso. Poderão ser usados todos os tipos usuais de composições, incluindo comprimidos, comprimidos mastigáveis, cápsulas, soluções, soluções parentéricas, trociscos, supositórios e suspensões. As composições são formuladas para conter uma dose diária, ou uma fracção conveniente da dose diária, numa unidade de dosagem, que poderá ser um comprimido único ou uma cápsula ou um volume conveniente de um liquido.

Em geral, todas as composições são preparadas de acordo com métodos usuais em química farmacêutica e por aqueles procedimentos descritos e/ou exemplificados na Patente dos Estados Unidos da América 5 552 412.

As cápsulas são preparadas por mistura do composto com um diluente adequado e enchendo a quantidade adequada da mistura em cápsulas. Os diluentes usuais incluem substâncias em pó inertes tais como amido de muitos tipos diferentes, celulose em pó, especialmente celulose cristalina e microcristalina, açúcares tais como frutose, manitol e sacarose, farinha em grão e pós comestíveis semelhantes. 20 ΡΕ1120114

Os comprimidos são preparados por compressão directa, por granulação húmida, ou por granulação seca. As suas formulações usualmente incorporam diluentes, aglome-rantes, lubrificantes e desintegrantes bem como o composto. Os diluentes típicos incluem, por exemplo, vários tipos de amido, lactose, manitol, caulino, fosfato ou sulfato de cálcio, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e açúcar em pó. Os derivados de celulose em pó são também úteis. Os aglomerantes de comprimidos típicos são substâncias tais como amido, gelatina e açúcares tais como lactose, frutose, glucose e semelhantes. As gomas naturais e sintéticas são também convenientes, incluindo acácia, algi-natos, metilcelulose, polivinilpirrolidina e semelhantes. Polietilenoglicol, etilcelulose e ceras podem também servir como aglomerantes.

Na formulação de um comprimido poderá ser necessário um lubrificante para prevenir o comprimido e punções de se colarem na matriz. O lubrificante é escolhido de tais sólidos escorregadios como talco, esterato de magnésio e cálcio, ácido esteárico e óleos vegetais hidrogenados.

Os desintegrantes de comprimidos são substâncias que facilitam a desintegração de um comprimido para libertar um composto quando o comprimido se torna húmido, incluem amidos, argilas, celuloses, alginas e gomas, mais particularmente, amido de milho e batata, metilcelulose, agar, bentonite, celulose da madeira, esponjas naturais em 21 ΡΕ1120114 pó, resinas de permuta catiónica, ácido alginico, goma de guaré, polpa de citrinos e carboximetilcelulose, por exemplo, poderá ser usado também laurilsulfato de sódio.

Os comprimidos são frequentemente revestidos com açúcar como aromatizante e selante, ou com agentes protec-tores formadores de filme para modificar as propriedades de dissolução do comprimido. Os compostos poderão também ser formulados como comprimidos mastigáveis, utilizando grandes quantidades de substâncias agradáveis ao paladar tais como manitol na formulação, como está agora bem estabelecido na técnica.

Quando é desejado administrar um composto como um supositório, poderão ser usadas as bases típicas. A manteiga de cacau é uma base tradicional de supositório, que poderá ser modificada por adição de ceras para elevar levemente o seu ponto de fusão. As bases de supositório miscíveis com água compreendem, particularmente, polietile-noglicóis de vários pesos moleculares são usadas em larga escala. 0 efeito dos compostos poderá ser retardado ou prolongado por formulação adequada. Por exemplo, poderá ser preparada uma pastilha lentamente solúvel do composto e incorporada num comprimido ou cápsula. A técnica poderá ser melhorada fazendo pastilhas de várias taxas de dissolução diferentes e enchendo as cápsulas com uma mistura das pastilhas. Os comprimidos ou cápsulas podem ser revestidos 22 ΡΕ1120114 com um filme que resista à dissolução durante um período de tempo previsível. Mesmo as preparações parentéricas poderão ser feitas de longa actuação, por dissolução ou suspensão do composto em veículos oleosos ou emulsionados que permitem a sua dispersão apenas lentamente no soro.

Como usado aqui, o termo "quantidade efectiva" significa uma quantidade de composto dos métodos da presente invenção que é capaz de tratar os sintomas dos estados patológicos descritos. A dose específica de um composto administrado de acordo com esta invenção irá, claro, ser determinada pelas circunstâncias particulares envolvendo o caso incluindo, por exemplo, o composto administrado, a via de administração, o estado de existência do sujeito, e a gravidade do estado patológico sendo tratado.

As composições farmacêuticas tópicas e cosméticas da presente invenção podem ser feitas numa vasta variedade de tipos de produto. Estes incluem, mas não estão limitados a loções, cremes, óleos de praia, géis, batons, aerossóis, unguentos, pastas, mousses e cosméticos. Estes tipos de produto poderão compreender vários tipos de sistemas de transporte, mas não estão limitados a soluções, emulsões, géis e sólidos. As composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção formuladas como soluções incluem tipicamente um solvente aquoso ou orgânico farmaceuticamente aceitável. Os termos "solvente aquoso farmaceuticamente aceitável" e " solvente orgânico farma-ceuticamente aceitável" referem-se a um solvente que é 23 ΡΕ1120114 capaz de ter dissolvido nele o agonista/antagonista de estrogénio, e possui propriedades de segurança aceitáveis (e.g., caracteristicas de irritação e sensibilização). Estas soluções contêm desde cerca de 0,00001 % a cerca de 20 %, mais preferencialmente desde cerca de 0,001 % a cerca de 10 % do agonista/antagonista de estrogénio, e desde cerca de 80 % a cerca de 99, 999 %, mais preferencialmente desde cerca de 90 % a cerca de 99,9 % de um solvente aquoso ou orgânico aceitável. Se as composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção são formuladas como um aerossol e aplicadas na pele com um pulverizador, é adicionado um propulsor à composição da solução. Exemplos de propulsores úteis aqui incluem, mas não estão limitados a, hidrocarbonetos de baixo peso molecular, clorados, fluorados ou clorofluorados. Uma revelação mais completa de propulsores úteis aqui pode ser encontrada em Sagarin, Cosmetics Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 2, pp. 443-465 (1972). As composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção compreendem adicionalmente desde cerca de 2 % a cerca de 50 % de um emoliente farmacêutica e cosmeticamente aceitável tópico. Como usado aqui, "emolientes" refere-se a materiais usados na prevenção ou no alivio de secura, bem como na protecção da pele. É conhecida uma vasta variedade de emolientes adequados e poderão ser usados aqui. Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 32-43 (1972), contém numerosos exemplos de materiais adequados. Exemplos de classes de emolientes úteis incluem os seguintes: 24 ΡΕ1120114 1. Óleos e ceras de hidrocarboneto. Exemplos incluem óleo mineral, vaselina, parafina, ceresina, ozocerite, cera microcristalina, polietileno, e per-hidroesqualeno. 2. Óleo de silicone, tal como dimetilpolisiloxanos, metil-fenilpolisiloxanos, co-polímeros de silicone glicol solúveis em água e solúveis em álcool. 3. Ésteres triglicéridos, por exemplo óleos e gorduras vegetais e animais. Exemplos incluem óleo de ricino, óleo cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de milho, azeite, óleo de figado de bacalhau, óleo de amêndoa, óleo de abacate, óleo de palma, óleo de sésamo, e óleo de soja. 4. Ésteres acetoglicéridos, tais como monoglicéridos acetilados. 5. Glicéridos etoxilados, tais como monoestearato de glicerilo etoxilado. 6. Ésteres alquilicos de ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono. Os ésteres metilicos, isopropilicos, e butilicos de ácidos gordos são particularmente úteis aqui. Exemplos de outros ésteres alquilicos úteis incluem laurato de hexilo, laurato de iso-hexilo, palmitato de iso-hexilo, palmitato de isopropilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, estearato de hexadecilo, estearato de decilo, e estearato de isopropilo, adipato de diisopropilo, adipato de diiso-hexilo, adipato de di-hexildecilo, sebacato de 25 ΡΕ1120114 diisopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo, e lactato de cetilo. 7. Ésteres alcenílicos de ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono. Exemplos incluem miristato de oleílo, estearato de oleílo, e oleato de oleílo. 8. Ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono. Exemplos adequados incluem ácidos pelargónico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, isoesteárico, hidroxies-teárico, oleico, linoleico, ricinoleico, araquídico, bénico, e erúcico. 9. Álcoois gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono. Álcoois laurílico, miristílico, cetílico, hexadecílico, estearílico, isostearílico, hidroxiestearílico, oleilico, ricinoleilico, benílico, e erucílico, bem como 2-octildo-decanol, são exemplos de álcoois gordos satisfatórios. 10. Éteres de álcoois gordos. Álcoois gordos etoxilados de 10 a 20 átomos de carbono incluem os álcoois laurílico, cetílico, estearílico, isoestearílico, oelílico, e colesterol tendo anexados a eles de 1 a 50 grupos óxido de etileno ou 1 a 50 grupos óxido de propileno. 11. Ésteres de éter tais como ésteres de ácido gordo de álcoois gordos etoxilados. 12. Lanolina e derivados. Lanolina, óleo de lanolina, cera 26 ΡΕ1120114 de lanolina, álcoois de lanolina, ácidos gordos de lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada, álcoois de lanolina etoxilada, colesterol etoxilado, álcoois de lanolina propoxilada, lanolina acetilada, álcoois de lanolina acetilada, linoleato de álcoois de lanolina, recinoleato de álcoois de lanolina, recinoleato de álcoois de acetato de lanolina, ésteres de acetato de álcoois etoxilados, hidrogenólise de lanolina, lanolina hidrogenada etoxilada, lanolina de sorbitol etoxilado, e bases de absorção de lanolina liquida e semi-sólida são ilustrativos de emolientes derivados de lanolina. 13. Álcoois poli-hídricos e derivados poliéter. Propileno-glicol, dipropilenoglicol, polipropilenoglicóis 2000 e 4000, polioxietileno polioxipropilenoglicóis, polioxipro-pileno-polioxietilenoglicóis, glicerol, sorbitol, sorbitol etoxilado, hidroxipropilsorbitol, polietilenoglicóis 200-6000, metoxipolietilenoglicóis 350, 550, 750, 2000 e 5000, poli[óxido de etileno] homopolimeros (100 000-5 000 000), polialquilenoglicóis e derivados, hexilenoglicol (2-metil-2, 4-pentanodiol), 1,3-butilenoglicol, 1, 2, 6-hexanotriol, eto-hexadiol USP (2-etil, 3-hexanodiol), glicol C15-C18 vicinal, e derivados de polioxipropileno de trimetilol-propano são exemplos deste tipo de materiais. 14. Ésteres de álcool poli-hidrico. Ésteres de ácido mono-e di-gordo etilenoglicol, ésteres de ácido dietilenoglicol, mono- e di-ésteres de ácido gordo de polietilenoglicol (200-6000), mono- e di-ésteres de ácido gordo de propile- 27 ΡΕ1120114 noglicol, monooleato de polipropilenoglicol 2000, monoes-tearato de polipropilenoglicol 2000, monoestearato etoxi-lado de propilenoglicol, mono- e di-ésteres de ácido gordo de glicerilo, poli-ésteres de ácido gordo de poliglicerol, monoestearato de glicerilo etoxilado, monoestearato de 1,3-butilenoglicol, diestearato de 1,3-butilenoglicol, éster de ácido gordo polioxietileno poliol, ésteres de ácido gordo de sorbitano, e ésteres de ácido gordo polioxietileno sorbitano são ésteres de álcool poli-hídrico satisfatórios para utilizar aqui. 15. Ésteres de ceras tais como cera de abelhas, esperma-cete, miristato de miristilo e estearato de estearilo. 16. Derivados de cera de abelha, e.çr., polioxietileno-sorbitol cera de abelha Esses são produtos da reacção da cera de abelhas com sorbitol etoxilado de teor de óxido de etileno variado, formando uma mistura de éter-ésteres. 17. Ceras vegetais incluindo ceras de carnaúba e malei-teira. 18. Fosfolipidos, tais como lecitina e derivados. 19. Esteróis. Colesterol e ésteres de ácido gordo de colesterol são seus exemplos. 20. Amidas tais como amidas de ácido gordo, amidas de ácido gordo etoxilado e alcanolamidas de ácido gordo sólido. 28 ΡΕ1120114

Emolientes particularmente úteis que providenciam condicionamento da pele são glicerol, hexanotriol, butano-triol, ácido láctico e seus sais, ureia, ácido carboxilico pirrolidona e seus sais, aminoácidos, guanidina, diglicerol e triglicerol. Uma loção pode ser feita a partir de uma solução sistema de transporte. As loções compreendem tipicamente desde cerca de 0,00001 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 0,001 % a cerca de 10 %, do agonista/antagonista de estrogénio anti-rugas; desde cerca de 1 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 5 % a cerca de 10 %, de um emoliente; e desde cerca de 50 % a cerca de 90 %, preferencialmente desde cerca de 60 % a cerca de 80 %, água. Outro tipo de produto que poderá ser formulado a partir de uma solução sistema de transporte é um creme. Um creme da presente invenção compreende desde cerca de 0,00001 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 0,001 % a cerca de 10 %, do agonista/antagonista de estrogénio; desde cerca de 5 % a cerca de 50 o °r preferencialmente desde cerca de 10 % a cerca de 20 o °r de um emoliente, e desde cerca de 45 % a cerca de 85 o 0/ preferencialmente desde cerca de 50 % a cerca de 75 o °r água. Ainda outro tipo de produto que poderá ser formulado a partir de uma solução sistema de transporte é um unguento. Um unguento poderá compreender uma base única de óleos animais ou vegetais ou hidrocarbonetos semi-sólidos (oleaginoso). Os unguentos poderão também compreender bases de absorção de unguento que absorvam água para formar emulsões. Os veículos de unguentos poderão também ser solúveis 29 ΡΕ1120114 em água. Um unguento poderá também compreender desde cerca de 2 % a cerca de 10 % de um emoliente mais desde cerca de 0,1 % a cerca de 2 % de um agente espessante. Exemplos de agentes espessantes adequados incluem: derivativos de celulose (e.g., metilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose), polímeros sintéticos de peso molecular elevado (e.g., polímero carboxivinílico e álcool polivinílico), hidrocolóides de plantas (e.g., goma Karaya e goma adragante), espessantes de argilas (e.g., silicato de alumínio e magnésio co-loidal e bentonite), e polímeros carboxivinílicos (CARBO-POLS®; comercializado por B. F. Goodrich Company, tais polímeros estão descritos em detalhe na Patente dos Estados Unidos da América No. 2 798 053, Brown, concedida em Jul. 2, 1975). Uma revelação mais completa de agentes espessantes úteis aqui pode ser encontrada em Segarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp.72-73 (1972). Se o veículo for formulado como uma emulsão, desde cerca de 1 % a cerca de 10 %, preferencialmente desde cerca de 2 % a cerca de 5 %, do sistema transportador compreende um emulsionante. Os emulsionantes poderão ser não iónicos, aniónicos ou catiónicos. Emulsionantes adequados são revelados em, por exemplo,

McCutcheon's Deterqents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986). Os emulsionantes preferidos são aniónicos ou não iónicos, embora possam também ser usados outros tipos.

As loções e cremes podem ser formulados como emulsões e como soluções. Tipicamente tais loções compre- 30 ΡΕ1120114 endem desde cerca de 0,00001 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 0,0001 % a cerca de 10 %, de agonista/antagonista de estrogénio; desde cerca de 1 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 5 % a cerca de 10 %, de um emoliente; desde cerca de 25 % a cerca de 75 %, preferencialmente desde cerca de 45 % a cerca de 95 %, água; e desde cerca de 0,1 % a cerca de 10 %, preferencialmente desde cerca de 0,5 % a cerca de 5 %, de um emulsionante. Tais cremes compreenderão tipicamente desde cerca de 0,00001 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 0,0001 % a cerca de 10 %, de agonista/antagonista de estrogénio; desde cerca de 1 % a cerca de 20 %, preferencialmente desde cerca de 5 % a cerca de 10 %, de um emoliente; desde cerca de 20 % a cerca de 80 %, preferencialmente desde cerca de 30 % a cerca de 70 %, água; e desde cerca de 1 % a cerca de 10 %, preferencialmente desde cerca de 2 % a cerca de 5 %, de um emulsionante.

As preparações de cuidado da pele de emulsão única, tais como loções e cremes, do tipo óleo-em-água e do tipo água-em-óleo são bem conhecidas nas técnicas cosméticas e são úteis na presente invenção. As composições de emulsões de fase múltipla, tais como o tipo água-em-óleo-em-água são também úteis na presente invenção. Em geral, tais emulsões únicas ou de fase múltipla contêm água, emolientes e emulsionantes como componentes essenciais. Emulsões triplas sistemas de transporte que compreendem uma composição de emulsão fluida óleo-em-água-em-silicone são também úteis na presente invenção. 31 ΡΕ1120114

Outra emulsão sistema de transporte útil nas composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção é um sistema transportador de microemulsão. Um tal sistema compreende preferencialmente desde cerca de 9 % a cerca de 15 % de esqualano; desde cerca de 25 % a cerca de 40 % de óleo de silicone; desde cerca de 8 % a cerca de 20 % de um álcool gordo; desde cerca de 15 % a cerca de 30 % de ácido mono-gordo de polioxietileno sorbitano (disponível comercialmente sob a marca registada Tweens) ou outros não iónicos; e desde cerca de 7 % a cerca de 20 % de água. Este sistema transportador é combinado com desde cerca de 0, 00001 % até cerca de 10 % de agonista/antagonista de estrogénio.

Se as composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção forem formuladas como um gel ou um baton cosmético, é adicionada uma quantidade apropriada de um agente espessante, como revelado anterior-mente, a uma formulação de creme ou loção. As composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção poderão também ser formuladas como produtos de maquilhagem tais como bases. As bases são baseadas em solução ou loção com quantidades apropriadas de espessantes, pigmentos e fragrância. As composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção poderão conter, adicionalmente aos componentes mencionados anteriormente, uma vasta variedade adicional de materiais solúveis em água e/ou materiais solúveis em óleo usados convencionalmente em 32 ΡΕ1120114 composições tópicas, nos seus níveis estabelecidos. Nas composições desta invenção poderão também estar presentes vários materiais solúveis em água. Estes incluem humi-dificantes, tais como glicerol, sorbitol, propilenoglicol, glucose alcoxilada e hexanotriol, etilcelulose, álcool polivinílico, carboximetilcelulose, gomas vegetais e argilas tais como VEEGUM® (silicato de alumínio e magnésio, R. T. Vanderbilt, inc.); proteínas e polipéptidos, conservantes tais como os ésteres metílico, etílico, propílico e butílico do ácido hidroxibenzóico (Parabéns® - Mallinckrodt Chemical Corporation), edta, ureias metilisotiazolinona e imidazolidinilo (Germall 115® - Sutton Laboratories); e um agente alcalino tal como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio para neutralizar, se desejado, parte dos ácidos gordos ou espessante que poderá estar presente. Adicionalmente, as composições tópicas aqui podem conter adjuvantes cosméticos convencionais, tais como corantes, opacificantes (e.g., dióxido de titânio), pigmentos e perfumes. As composições farmacêuticas e cosméticas tópicas da presente invenção poderão também incluir uma quantidade segura e efectiva de um agente intensificador de penetração. Uma quantidade preferida de um agente intensificador de penetração é desde cerca de 1 % a cerca de 5 % da composição. Outros produtos aditivos de cuidado da pele convencionais poderão também ser incluídos nas composições da presente invenção. Por exemplo, podem ser usados cola-génio, ácido hialurónico, elastina, hidrolisatos, óleo de onagra, óleo de jojoba, factor de crescimento epidérmico, saponinas de soja, mucopolissacáridos, e suas misturas. 33 ΡΕ1120114 Várias vitaminas poderão também ser incluídas nas composições da presente invenção. Por exemplo, poderão ser usados Vitamina A, e seus derivados, Vitamina B2, biotina, pantoténico, Vitamina D, e suas misturas.

Os veículos e formulações "cosmeticamente aceitáveis" referem-se a veículos e formulações que podem ser utilizados sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida, e semelhantes.

Baseado numa leitura da presente descrição e reivindicações, certas modificações às composições e aos métodos aqui descritos serão aparentes aos peritos comuns na técnica. As reivindicações anexadas a aqui pretendem abranger estas modificações.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Ligação ao Receptor de Estrogénio. A afinidade da ligação do estrogénio e agonis-ta/antagonista de estrogénio foi medida através do protocolo seguinte:

Clonagem cDNA de ERg humana: A região de codificação ERa humana foi clonada por RT-PCR a partir da célula do cancro da mama humano mRNA usando o Expand™ High Fidelity PCR System de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN). Os 34 ΡΕ1120114 produtos PCR foram clonados num pCR2.1 TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciado. A região de codificação de cada receptor foi sub-clonada no vector pcDNA3 de expressão mamífera (Invitrogen, Carlsbad, CA) .

Expressão de células mamíferas. As proteínas receptoras foram sobreexpressas em células 293T. Estas células, derivadas de células HEK293 (ATCC, Manassas, VA), foram planeadas para expressar estavelmente o antigénio T grande e podem portanto replicar plasmídeos contendo uma origem SV40 de replicação para números de cópia elevados. As células 293T foram transfectadas com quer hERa-pcDNA3 ou hERP~pcDNA3 utilizando lipofectamina como descrito pelo fabricante (Gibco/BRL, Bethesda, MD). As células foram colhidas em salina tamponada com fosfato (PBS) com EDTA 0,5 mM a 48 h após a transfectação. Os granulados de célula foram lavados uma vez com PBS/EDTA. Os lisatos de célula inteira foram preparados por homogeneização em tampão TEG (Tris 50 mM pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 50 mM, glicerol a 10%, DTT5 mM, aprotinina 5 g/ml, leupeptina 10 g/ml, Pefabloc 0,1 mg/ml) usando um homogeneizador Dounce. Os extractos foram centrifugados a 100 000 x g durante 2 h a 4 °C e os sobrenadantes foram recolhidos. As concentrações de proteína total foram determinadas usando o reagente BioRad (BioRad, Hercules, CA).

Ensaio de competição de ligação. Foi medida a capacidade de vários compostos para inibir a ligação de [3H]-estradiol por um ensaio de competição de ligação 35 ΡΕ1120114 utilizando carvão revestido com dextrano como foi descrito (Leake RE, Habib F 1987 Steroid hormone receptors: assay and characterization. In: B. Green e R.E. Leake (eds). Steroid Hormones a Practical Approach. IRL Press Ltd, Oxford, 67-92) . Os extractos de células 293T expressos quer em hERa ou hERP foram incubados na presença de concentrações crescentes de competidor e de uma concentração fixa de [3H]-estradiol (141 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) em TrisHCl 50 mM pH 7,4, EDTAl,5 mM, NaCl 50 mM, glicerol a 10%, DTT5 mM, β-lactoglobulina 0,5 mg/ml num volume final de 0,2 ml. Todos os competidores foram dissolvidos em dimetilsulfóxido. A concentração final de receptor foi 50 pM com [3H]-estradiol 0,5 nM. Após 16 h a 4°C, foi adicionado carvão revestido com dextrano (20 μΐ) . Após 15 min. à temperatura ambiente o carvão foi removido por centrifugação e o ligando radioactivo presente no sobrenadante foi medido por contagem de cintilação. Todos os reagentes foram obtidos a partir da Sigma (St. Louis, MO) a menos que seja indicado o contrário. A afinidade de ligação de (-)-cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetra-hidro-naftaleno-2-ol(PPTN) e 17p-estradiol foi medida usando o receptor de estrogénio humano recombinante (ER). A Figura 1 mostra os resultados de uma experiência de ligação na qual se descobriu que a ligação de PPTN é semelhante à do 17p-estradiol. 36 ΡΕ1120114

Exemplo 4: Formação de Óxido Nítrico por Células Endote-liais de Cultura A formação de NO é avaliada por determinação de GMP cíclico intracelular em células endoteliais de cultura, enquanto que a libertação de NO a partir destas células é medida pelo efeito estimulador do NO na actividade da guanililciclase solúvel (Luckhoff, et al., Br j Pharmacol, 95:189, (1988); Wiemer, et al., Hypertension, 18:558, (1991); Linz, et al., J Mol Cell Cardiol, 24:909, (1992)). A aorta bovina ou porcina é obtida e as células endoteliais são isoladas por digestão com dispase. As células são semeadas em placas de 6 ou 24 poços e crescem até à confluência. Meio de Eagle modificado por Dulbecco/meio de Ham F-12 contendo 20 % de soro fetal de vitelo é suplementado com penicilina (10 U/ml), estreptomicina (10 mg/ml), L-glutamato (1 mM/1), glutationa (5 mg/ml), e ácido L(+)ascórbico (5 mg/ml). São usadas culturas primárias de células endoteliais. Após a remoção do meio de cultura por aspiração, a monocamada é lavada duas vezes com 2 ml de solução de Tyrode - HEPES (37°C) . Em seguida, as células são pré-incubadas durante 15 min. a 37°C com 3-isobutil-l-metil-xantina (IBMX), (10“4 M) . Após este tempo, são adicionados os compostos ou os solventes. Após períodos pré-determinados, o meio de incubação é rapidamente removido. As células são então imediatamente extraídas com 0,6 ml de 37 ΡΕ1120114 ácido tricloroacético a 6% e recolhidas com uma escova de raspagem de borracha. A suspensão de células é sujeita a ultra-sons durante 10 sec. antes de ser centrifugada durante 5 min. a 4 OOOg. Os sobrenadantes são extraídos com quarto volumes de éter dietílico saturado com água, e as amostras congeladas (-20°C) até à análise. Os teores de proteína das amostras são medidos de acordo com Lowry, et al. (J Biol Chem, 193:265, (1951)). O GMP cíclico pode ser determinado em amostras acetiladas por vários métodos (Heath et al., Which Cyclic GMP Assay?, in Moncada, S., et al., (eds) The Biology of Nitric Oxide: 2 Enzymoloqy, Biochemistry and Immunology. Portland Press, London, pp 98, 1992), e.g., utilizando um ensaio imunológico radioactivo disponível comercialmente (New England Nuclear). O teor de GMP cíclico é expresso como picomoles de GMP por miligrama de proteína. A libertação de NO a partir de células endo-teliais é testada em base do efeito estimulador de NO na actividade da guanililciclase solúvel (purificada a partir de pulmão bovino) (Gerzer, et al., Eur j Biochem 116:479, (1981)). A actividade da enzima é determinada em termos da formaçao de [ P]GMP cíclico a partir de a-[ P]GTP. As reacções são levadas a cabo numa mistura reaccional contendo trietanolamina HC1 30 mM (pH 7,4), glutationa reduzidal mM, MgCl2 4 mM, cGMP 1 mM e g-globulina bovina 0,1 mg/ml (volume total de 0,18 ml) a 37°C na presença de a- [32P] GTP (0,03 mM; 0,2 mCi) e guanililciclase solúvel (4 mg) . As amostras de dez ml são rapidamente transferidas 38 ΡΕ1120114 para a mistura reaccional. A formação enzimática de cGMP é deixada prosseguir durante 60 sec e seguidamente parada pela adição de 450 ml de acetato de zinco (120 mM) e 500 ml de carbonato de sódio (120 mM) . Uma inibição completa da formação de cGMP pode ser conseguida por pré-incubação de monocamadas durante 30 min. com o inibidor estereo-especifico de NO-sintase, NG-nitro-L-arginina.

As curvas tempo-resposta e curvas dose-resposta são obtidas após adição de agonistas/antagonistas de estrogénio da presente invenção. Os dados são reportados como valores médios ± DMP de cGMP (pmol/mg de proteína) ou actividade da guanililciclase (nmol/mg/min).

Lisboa, 10 de Janeiro de 2007

Claims (2)

1. ΡΕ1120114 1 REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de (-)-cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetra-hidronaftaleno-2-ol; ou um seu isómero óptico ou geométrico; ou um seu sal de adição de ácido ou éster farmaceuticamente aceitável, não tóxico, no fabrico de uma composição para tratar o cancro do cólon.
2. 2. A utilização da reivindicação 1, em que o composto é (-)-cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetra-hidronaftaleno-2-ol na forma de um sal D-tartarato. Lisboa, 10 de Janeiro de 2007