WO1999006050A1

WO1999006050A1 - Agent reparateur contre la calvitie et autres maladies

Info

Publication number: WO1999006050A1
Application number: PCT/JP1998/003337
Authority: WO
Inventors: Koichi Kojima; Takakazu Hamada; Shiroh Yosioka
Original assignee: Sankyo Company, Limited
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1998-07-27
Publication date: 1999-02-11
Also published as: DE69822636T2; ATE262337T1; CN1129433C; CN1271285A; US6380179B1; NZ502537A; PL338414A1; EP0998930B1; BR9811293A; RU2193887C2; ES2218840T3; NO20000469D0; PT998930E; TR200000263T2; IL134199A0; EP0998930A1; HK1027290A1; DK0998930T3; HUP0003159A3; NO20000469L

Description

明細書

脱毛症等治療剤 [技術分野]

本発明は、脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の優れた治療効果あるいは前立腺癌の骨転移の優れた予防効果を有する新規な組成物に関する。

[背景技術]

ジヒドロテストステロン（D H T ) などの男性ホルモンの過剰刺激により、ァンドロデン依存性脱毛症（男性禿頭症など）、尋常性座瘡、脂漏、女性多毛症、前立腺肥大症及び前立腺癌が引き起こされる。

このような男性ホルモンの過剰刺激による症状を治す化合物としては、まずステロイド系抗男性ホルモン剤（例えば、女性ホルモン、エストロジェン）が発見された。しかし、これらはそれ自体がホルモン活性を有しているので、好ましくない作用、例えば女性化作用を有する。

一方、非ステロイド系抗男性ホルモン剤も開発されている。これらの化合物はホルモン作用はないものの、天然男性ホルモンと受容体で競合するので、女性体内の男子胎児または男性を女性化する作用、あるいは睾丸を過剰刺激するフィ一ドバック機構を開始する等の好ましくない作用を有する。

そこで、 5 α還元酵素がテストステロンに作用してジヒドロテストステロン（D Η Τ ) が生成されることに鑑み、この酵素を阻害すれば上記副作用を伴わず、男性ホルモンの過剰刺激による症状を治すことが期待できる。

さて、かかる人の 5 α還元酵素には 2つのアイソザィムがある。タイプ 1酵素は顔および皮膚の皮脂腺に存在し、タイプ 2酵素は前立腺に分布していることが分かっている。

タイプ 1酵素は毛包に存在するので、その酵素を強く阻害すれば男性禿頭症が改善されると期待された。しかしながら男性禿頭症のモデル動物であるサルを用いてタイプ 1酵素選択的阻害剤である MK 3 8 6の効果を評価したが、血中の D H T濃度は 3 0 — 4 0 %減少していたものの有効性が認められなかった（ J. Invest. Dermatol. , 104, 658 (1995) )。

一方、タイプ 2酵素選択的阻害剤であるフィナステリドは、同モデルにおける 1 m g / k g用量で血中の D H T濃度は 6 0— 7 0 %減少し、予想に反し、有効性が認められた（J. Clin. Endocrinol. etabol. , 79, 991 (1994) )。

実際、フィナステリドは臨床試験で人禿頭症に対する効果が確認されている。そのメカニズムは毛包の縮小に関与している因子を阻害した結果であり、これは血中の D H T濃度に依存していると考えられている。更に、最近の臨床試験の結果では血中の D Η Τを低下させる作用の強さは主としてタイプ 2酵素の阻害作用の強さによるが、タイプ 1酵素の阻害作用を併有していた方がさらに良いことが判ってきた（J. Clin. Endocrinol. Metabol. , 81, 2942-2947 (1996) )。

同様に、女性多毛症、脂漏症の治療の場合も、タイプ 2酵素の阻害作用だけでなくタイプ 1酵素の阻害作用も併有する化合物の方が優れた治療薬になると考えられる。したがって、より有効な脱毛症、女性多毛症、脂漏症の治療薬の探索をするために、フィナステリドより更に強くタイプ 2酵素を阻害し、かつタイプ 1 酵素をも強く阻害する化合物が必要とされている。

また、前立腺にはタイプ 2酵素が分布しており、強いタイプ 2酵素阻害作用を持つ化合物は前立腺癌の治療に有効であるが、前立腺癌の発達及び骨への転移の過程では、タイプ 1酵素が活性な酵素形であることも最近わかってきた（特開平 8— 2 7 7 2 2 0号公報）。よって、上記のような両タイプ阻害型化合物は、これらの予防及び治療にも効果が期待される。

なお、本発明の化合物（ I ) は強い前立腺酵素の阻害活性を持つことが発表されている（特開平 5— 3 2 6 9 3号公報）。しかしながら前立腺酵素の阻害活性からはタイプ 2酵素の阻害作用は予想できるが、前立腺にはタイプ 1酵素は分布していないのでタイプ 1酵素の阻害活性は予想することはできない。

[発明の開示]

本発明者等は、テストステロン 5 _α還元酵素阻害活性を有する誘導体の合成とその薬理活性について永年に亘り鋭意研究を行なった結果、特異な構造を有する化合物が 5 α還元酵素のタイプ 2酵素を強く阻害し、その上タイプ 1酵素をも強く阻害するので、既知のタイプ 2選択的 5 _α還元酵素阻害剤では得られなかった強い血中 D H T低下作用を示すこと、また脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の優れた治療効果、あるいは前立腺癌の骨転移の優れた予防効果を有することを新たに見出し、本発明を完成した。

本発明の目的は、脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の優れた治療効果あるいは前立腺癌の骨転移の優れた予防効果を有する新規な組成物を提供することであり、本発明の他の目的は、脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移の予防のための組成物を製造するために上記化合物を使用することにある。

また、本発明の更に他の目的は、上記化合物の薬理的な有効量を温血動物に投与する脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療方法又は前立腺癌の骨転移の予防方法を提供することである。

本発明の新規な脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物は、下記一般式（ I ) で表わされる化合物、その薬理上許容される塩又はその他の誘導体を有効成分として含有し、好適には、 N— [ 1 —メチル _ 1 — ( 4ーメトキシフエニル）ェチル] — 3—ォキソ— 4— ァザー 5 α —アンドロストー 1 一ェン— 1 7 ;3—カルボキサミドを有効成分として含有している。

又、本発明の新規な使用方法は、下記一般式（ I ) で表わされる化合物、その薬理上許容される塩又はその他の誘導体を脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移の予防のための組成物を製造するために使用することであり、好適には、 N— [ 1—メチル一 1 一（4 —メトキシフエニル）ェチル] — 3—ォキソ一 4 —ァザ一 5 ひ一アンドロスト一 1 一ェンー 1 7 )3—カルボキサミドを上記の組成物を製造するために使用することである。

(式中、 R ¹ 及び R ² は、同一又は異なって、水素原子、水酸基又低級アルコキシ基を示す。）

上記一般式（ I ) において、

「低級アルコキシ基」とは、例えば、メトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、ィソプロボキシ、 n —ブトキシ、イソブトキシ、 s —ブトキシ、 t ert—ブトキシ、 n —ペントキシ、イソペントキシ、 2—メチルブトキシ、ネオペントキシ、 n— へキシノレオキシ、 4 —メチルペントキシ、 3 —メチノレペントキシ、 2 —メチルぺントキシ、 3 ， 3 —ジメチルブトキシ、 2 , 2—ジメチルブトキシ、 1 , 1 ージメチルブトキシ、 1 , 2—ジメチルブトキシ、 1 , 3—ジメチルブトキシ、 2 ， 3 —ジメチルブトキシのような炭素数 1乃至 6個の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基を示し、好適には炭素数 1乃至 4個の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基であり、更に好適には、メトキシ基である。

「脱毛症」とは、男性禿頭症及び女性の頭部の脱毛症を意味する。 W

「その薬理上許容される塩」とは、本発明の化合物（ I ) は、塩にすることができるので、その塩をいい、そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、力リウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩等の金属塩を挙げることができる。

又、本発明の化合物（ I ) は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があり、そのような物も本発明に包含される。

本願発明の化合物（ I ) は、次に示す方法によって製造することができる。

[A法]

(III)

(上記式中、 R ¹ 及び R ² は、前述したものと同意義を示す。）

A法は、カルボン酸とアミンを縮合させ、目的化合物（ I ) を製造する方法である。

第 A 1工程は化合物（II)又はその反応性誘導体と化合物（III) を用いて化合物 ( I ) を製造する工程で、ペプチド合成法における常法、例えばアジド法、活性エステル法、混合酸無水物法又は縮合法によって行われる。

上記方法において、アジド法は、化合物（II)又はそのエステル体をヒドラジンと、不活性溶剤（例えば、ジメチルホルムアミド）中、室温付近で反応させることによって製造されるアミノ酸ヒドラジドを亜硝酸化合物と反応させ、アジド化合物に変換した後、ァミン化合物（III) と処理することにより行われる。使用される亜硝酸化合物としては、例えば亜硝酸ナトリウムのようなアル力リ金属亜硝酸塩又は亜硝酸ィソアミルのような亜硝酸アルキルをあげることができる。

反応は、好適には不活性溶剤中で行われ、使用される溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミドのようなアミド類、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類、 N—メチルピロリドンのようなピロリドン類をあげることができる。又、本方法の 2つの工程は、通常 1つの反応液中で行われ、反応温度は、前段が一 5 0 °C乃至 0 °Cであり、後段が— 1 0 °C乃至 1 0 °Cであり又、反応に要する時間は、前段が 5分間乃至 1時間であり、後段が 1 0時間乃至 5 日間である。

活性エステル法は、化合物（Π )を活性エステル化剤と反応させ、活性エステルを製造した後、ァミン化合物（I I I ) と反応させることによって行われる。

両反応は、好適には、不活性溶剤中で行われ、使用される溶剤としては、例えば、メチレンクロリド、クロ口ホルムのようなハロゲン化炭化水素類、エーテル、テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミドのようなアミド類、ァセトニトリルのような二トリル類をあげることができる。

使用される活性エステル化剤としては、例えば、 N—ヒドロキシサクシンイミド、 1 ーヒドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒドロキシ一 5 —ノルボルネンー 2 , 3—ジカルボキシイミドのような N—ヒドロキシ化合物又はジピリジルジスルフィドのようなジスルフィド化合物をあげることができ、活性エステル化反応は、ジシクロへキシルカルポジイミド、カルボニルジイミダゾールまたはトリフェニルホスフィンのような縮合剤の存在下に好適に行われる。

反応温度は、活性エステル化反応では、 — 1 0 °C乃至 1 0 o °cであり、活性ェステル化合物とァミン（I I I ) との反応では室温付近であり、反応に要する時間は両反応ともに 3 0分乃至 8 0時間である。活性ェステルとァミンの反応では、 4ージメチルァミノピリジン等を加えることも出来る。

混合酸無水物法は、化合物（I I)の混合酸無水物を製造した後、ァミンと反応させることにより行われる。

混合酸無水物を製造する反応は、不活性溶剤（例えば、前記のハロゲン化炭化水素類、アミド類、エーテル類）中、混合酸無水物化剤、例えば、クロル炭酸ェチル、クロル炭酸イソブチルのようなハロゲン化炭酸低級（C i 一 C ₄ ) アルキル、ピバロイルクロリドのような低級アルカノィルハライド、ジェチルシアノリン酸、ジフエ二ルシアノリン酸のような低級アルキル若しくはジァリールシアノリン酸又は 2 ， 4 , 6 — トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド，ノラトノレエンスルホユルクロリド、メタンスノレホニノレクロリドのようなノヽロゲンィ匕スルホニル類等と化合物（Π)を反応させることにより達成される。

反応は、好適には、トリェチルァミン、 N _ メチルモルホリンのような有機ァミンの存在下に行われ、反応温度は、一 1 0 t乃至 5 0 Cであり、反応に要する時間は 3 0分間乃至 2 0時間である。

混合酸無水物とァミン（I I I) の反応は、好適には不活性溶剤（例えば、前記のハロゲン化炭化水素、アミド類、エーテル類）中、前記の有機ァミンの存在下に行われ、反応温度は 0 °C乃至 8 ◦ °Cであり、反応に要する時間は 1時間乃至 4 8 時間である。

また、本反応は、混合酸無水物を単離することなく化合物（11)、化合物（I II) 及び混合酸無水物化剤の共存下にも行われる。

縮合法は、化合物（I I)とァミン（I I I ) をジシクロへキシルカルポジイミド、力ノレボニノレジイミジゾーノレ、 1 ーメチノレー 2—クロ口一ピリジニゥムョージドートリェチルァミンのような縮合剤の存在下、直接反応することによって行われる。本反応は前記の活性エステルを製造する反応と同様に行われる。

R ¹ 、 R ² に保護された水酸基が存在する場合には、常法に従って保護基を除去することができる。

なお、原料化合物（ I I ) 又はその活性エステル体は、公知であるか公知の方法に従って製造される

[例えば、 J. Med, Chem. , 27, 1690(1984)； J. Med. Chem. , 29, 2298(1986) ]。又、化合物（ I I I ) は、公知であるか公知の方法（例えば、

Synthesis, 593 (】976) ;

J. Org. Chem. , 36, 305(1971)；

Angew. Chem. , 82, 138(1970)；

Synthesis, 24(1978)；

Synthetic Co画 n. , 18, 777( 1988)；

Snythetic Commun. , 18, 783(1988)；

Organic Reaction, 3, 337(1946)；

Org. Synthesis, 51, 48(1971)；

Tetrahedron, 30， 2151 (1974)；

J. Org. Chem.， 37, 188 (1972) ]

に従って製造され、例えば、本願発明の原料化合物である、

一般式 H N - C ( e ) (M e ) — P h ( R ¹ ) ( R ² ) を有する化合物は、

NH,

(上記式中、

R ¹ R² は、前記と同意義を示し、

M eは、メチル基を、 P hは、フエ二ル基を示す。）上式のように、グリ二ヤール反応、水酸基のアジド化反応、及び還元反応により、シンセシス（S yn t hes i s ) 、第 2 4頁（ 1 9 7 8年）に記載の方法に準じて製造される。

本発明の化合物（ I ) の投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等による経口投与及びエタノール溶液、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、スキンジエル、スキンローション、シャンブージエル、クリームシャンプー等による局所投与を挙げることができる。

経口投与における製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニット、ソルビットのような糖誘導体：トウモロコシデンプン、ノレイショデンプン、 α 澱粉、デキストリン、カルボキシメチルデンプンのような澱粉誘導体；結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カノレボキシメチルセノレロース、カノレボキシメチルセノレロースカノレシゥム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリゥムのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤：及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸カルシウムのような憐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤 (例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイ蠟のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム； D Lロイシン；脂肪酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシゥムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。 )、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、前記賦形剤と同様の化合物、及び、クロスカルメロースナトリウム. カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン 'セル口一ス類を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラォキシ安息香酸エステル類；ク口ロブタノール、ベンジルアルコール、フエニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニゥム；フエノール、クレゾールのようなフユノ一ル類；チメ口サール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。

局所投与における製剤は、懸濁化剤（例えば、アラビアゴム、トラガント、メチルセノレロース、カルボキシメチノレセルロースナトリウム、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ベントナイトを挙げることができる。）、乳化剤（例えば、トリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、セスキォレイン酸ソルビタン、ポリソルベート 8 0、ステアリン酸ポリオキシル 4 0を挙げることができる。）、湿潤剤（例えば、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを挙げることができる。）、保存剤（例えば、パラォキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル、パラォキシ安息香酸ブチルを挙げることができる。）、溶剤（例えば、水：エタノール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコーノレ、セタノ一ル、イソステアリノレアノレコ一ノレのようなアルコール類；天然油脂、ロウ類、流動パラフィンのような炭化水素類；ステアリン酸、イソステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸のような脂肪酸類：ミリスチン酸イソプロピルのようなエステル類を挙げることができる。）等の当業界でよく知られた様々な基剤又はそれらの混合基剤に、例示した化合物等を添加することにより製造される。

経口投与及び局所投与における化合物（ I ) の使用量は、症状、年齢等により異なるが、例えば、 1 回当り、下限として、 0 . 0 0 1 m g/kg 体重（好ましくは、 0. 0 1 mg/kg 体重）、上限として、 1 0 mg/kg 体重（好ましくは、 0. 5 mg/k 体重）を 1 日当り 1乃至数回症状に応じて投与することが望ましい。

[発明を実施するための最良の形態]

以下に、試験例、参考例及び製剤例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。

[試験例 1 ]

5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2阻害活性試験法

( 1 ) 組換えヒト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の作製

a ) ヒト 5 ひ還元酵素タイプ 1およびタイプ 2 cDNAのクローニング

ヒト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の全翻訳領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 法によりクローニングするために、既報（Stefan. A et al： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3640-3644(1990)、 Stefan. A et al: Nature, 354, 159- 161(1991) 参照）のヒト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の塩基配列を基に、配列番号 1 、 2および 3、 4に示すプライマーをオリゴ 1000DNA シンセサイザ一（Oligo 1000 DNA synthesizer ：ベックマン社製（BECKMAN Co. , Lfd. ) ) を用いて合成した。タイプ 1 センス . プライマ一： 5' -CCAGCCCTGGCGATGGCAAC- 3' (配列番号 1 ) タイプ 1 アンチセンス · プライマー： 5' CAGAGCTTGAAATTCTGACCTGTTA- 3' (酉己歹 ij 番号 2)

タイプ 2 センス . プライマー： 5' - ACGGCGCGATGCAGGTTCAGTG- 3' (配列番号 3 ) タイプ 2 アンチセンス · プライマ一： 5' - AGCATTGTGGGAGCTCTGCTCCT-3' (配列番号 4)

PCR 法の铸型としては Human Liver QUICK-Clone™ cDNA および Human Prost ate QUICK-Clone™ cDNA (クロンテック社製： CL0NTECH し aboratories, Inc.

) を用いた。 cDNA を 1 μ ΐ 、付属の PCR 緩衝液を 5 μ ΐ 、 10 mM dNTP 混合液を 1 μ ΐ 、上記センスおょぴアンチセンス · プライマ一各 20μΜ を 1 μ 1 、 Ta KaRa Taq polymerase 5 単位/ ml を 1 μ ΐ 、蒸留水を 40 μ 1 用レ、、反応用量を 50 μ 1 として、 PCR を行った。 PCR の条件は 94°C、 20 秒間、 55°C、 1 分間、 72 °C、 1 分間の反応を 25 回繰り返し行い、最後に 4 °Cで保存した。 PCR 反応液約 5 μ 1 について 0.8 %ァガロースゲル電気泳動を行ったところ、上記文献から予測される大きさ（タイプ 1 ： 1021bp、タイプ 2 _: 812bp ) に相当するバンドが確認されたので、残りの PCR 反応液について 5 <½ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分離精製した。精製した cDNA 断片を TA Cloning™ Kit( インビトロジェン社製： Invitrogen Corporation) を用いてサブクローニングした。サブクローニングしたタイプ 1およびタイプ 2 cDNA について、全塩基配列の解析をダイターミネータ一（dye terminator)法で行い、既報の配列と同じであることを確認した。塩基配列を確認したタイプ 1およびタイプ 2 cDNA は発現べクタ一に組み込んで発現させ使用した。

b ) ヒトタイプ 1およびタイプ 2発現プラスミドの調製

大腸菌 DH5 株（supE44, hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl) (購入先：東洋紡績株式会社）をヒトタイプ 1 またはタイプ 2発現プラスミド、 p E18sH5Rl または pME18sH5R2、を用いて TA Cloning™ Kit 添付文書の方法で形質転換した。形質転換株の一次培養液約 ΙΟμ Ι を 50/ig/mlのアンピシリン（ギブコ社製： GIBC0 BRL ) を含む 2 Xし B 培地（20g Bacto-Tr yptone ( ディフコ社製： DIFC0 Labs. ), 10g Bacto- Yeast Extract (ディフコ社製： DIFC0 Labs. ) , 10g 塩化ナトリウム， 2g グルコース /1 し） 50ml に植菌し、 37 で約 40 時間培養した。培養液を遠心分離（5000rpm 、 10 分間）し、菌体を回収した。回収した菌体から QIAGEN Plasmid Maxi Kit (キアジユン社製： QIAGEN Inc. )を用いて、 _PME18sH5Rl または pME18sH5R2を調製した。

c ) ヒトタイプ 1およびタイプ 2蛋白質の発現と調製

10乃至 20 μ g の pME18sH5Rl または _PME18sH5R2を 2 X 10⁶個 /0.5 ml の COS- 1 細胞に、エレクトロポレーシヨン法（Gene Pulser™ ：バイオ ' ラッド社製 (Bio-Rad Laboratories) , 960 μ F 、 200 Ω、 300 V ) により導入した。導入後、約 48時間培養し細胞を回収した。回収した細胞は氷冷下のバッファー（20 mM リン酸カリウム緩衝液、 pH 7.4、 10% グリセロール、 0.33M ショ糖、 50μΜ ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドフォスフエ一ト還元体（NADPH) 、 0.001 % フェニルメチルスノレホニルフノレオリド（PMSF) ) 中でポリトロン（ P0LYTR0N、 KINEMATICA GmbH ) でホモゲナイズ（1000 rpni、 30秒間）し、遠心分離（10000 X g、 1 時間）後、沈渣を再び、ノッファーに懸濁し、 - 80 Cに保存した。これを、ヒト 5 α還元酵素タイプ 1またはタイプ 2 として使用した。

(2) 蛋白質量の測定

蛋白質量は Bradford 法（Bio - Rad, Bio-Rad Protein Assay) にて測定した。標準品としてゥシガンマグロブリン（Sigma, bovine cohn fraction II) を使用した。

(3) 5 α還元酵素活性の測定

5 α還元酵素活性は ^{1 4} Cテストステロン（Amersham) から ^{1 4} C 5 ひジヒドロテストステロンへの変換率を指標として測定した。化合物はジメチルスルホキシド（DMS0) を用いて溶解および希釈し、試験管当り 5 μ 1 分注した。なお、対照群には DMS0のみを 5 μ 1 分注した。これにリコンビナントヒト 5 α還元酵素タイプ 1またはタイプ 2を 10〜25μ g 含む酵素反応緩衝液（タイプ 1 ; 1μΜ^{1 4} 。テストステロン、 ImMジチオスレイト一ル及び 0.5mM NADPHを含む 40mMリン酸力リウム緩衝液（pH 7.5) 、タイプ 2 ； 1μΜ ^{1 4} 〇テストステロン、 ImMジチォスレイト一ル及び ImM NADPHを含む 100mM トリスークェン酸緩衝液（pH 5.5) ) 0.5ml を加え、 37°Cで 15分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、酢酸ェチル 2 ml (テストステロン、 5 α—ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン各々 10μ₈ 含む）を加えてよく攪拌し、酵素反応を停止するとともにステロイド化合物を酢酸ェチル相に抽出した。その後、遠心分離（3000rpm, 5分間）し酢酸ェチル相と水相を分離し、酢酸ェチル相を別の試験管に移し窒素ガス噴霧下で蒸発乾固した。試験管壁をジェチルェ—テル 0.8ml で洗浄しステロイド化合物を試験管底に洗い落とし、再び蒸発乾固後、酢酸ェチル 40μ1 中にステロイド化合物を溶解し、薄層クロマトプレート（Whatman, LK6DF silica plate ) にスポットした。薄層ク口マトプレートを酢酸ェチル：シクロへキサン（ 1 ： 1 ) 混合液にて 2度展開し、各ステロイド分画を分離した。薄層クロマトプレート上に分離された各ステロイド分画の放射活性はバイオイメージアナライザー（富士写真フィルム（株））を用いて測定した。なお、酵素阻害作用は 5 0 %阻害濃度

( I C ₅。）で示した。

I C ₅。値の算出は以下のように行った。まず対照群の変換率を 100 %とし、酵素活性抑制率（100 — （検体添加時の変換率 ÷対照群の変換率） X100 ) (%) を求めた。化合物の希釈列を作成し、各濃度における抑制率を上記の方法により計算した。抑制率が、約 2 0 <½から約 8 0 %の範囲となった希釈濃度を用いて、化合物の濃度の 1 o g値を Xとし、抑制率を Yとして最小二乗法により回帰曲線を計算した。得られた回帰曲線から、 5 0 °/。抑制率となる化合物濃度を算出し、

I C ₅。値とした。

表 1にタイプ 1の I C₅。値を、表 2にタイプ 2の I C ₅。値を示す。

[表 1 ] (タイプ 1 ) 化合物 I C 化合物 I 4. 9 X 1 0 " ⁸ M

フィナステリド 7. 0 X 1 0 - ⁷M [表 2] (タイプ 2) 化合物 I C 化合物 I 3. 2 X

フィナステリド 1. 5 x 1 0 M

[試験例 2 ]

ヒトにおける血中ジヒドロテストステロン低下作用

ヒ卜に 1乃至 1 0 mg/body の化合物 I 又は 5 mg/body のフィナステリドを経口投与し、血中のジヒドロテストステロン（DHT) 濃度及びテストステロン（T) 濃度を測定した。投与前（pre) 及び経過時間後のそれらの比（DHT/T) を計算し、 (DHT7T)バ DHTVT)preを求め、表 3に示した。（人数 _n = 4〜 6)

[表 3 ]

0時間後 1 8時間後化合物 I (lmg) 0.518 0.525

化合物 I (5mg) 0.411 0.376

化合物 I (10mg) 0.279 0.284

フィナステリド（5rag) 0.553 0.461 [試験例 3 ]

ヒト毛乳頭細胞を用いた試験

毛乳頭は毛包の中の小数の細胞塊であり、現在、毛の成長の基部を形成する幹細胞と考えられている。この細胞は 5 α還元酵素活性を持つことが示されている。そこでこの細胞の培養系を用いて 5 α還元酵素阻害剤の試験を行なうことが可能である。毛乳頭細胞の単離及び培養は Messenger, A. G. (The Culture of Dermal Papilla Cells From Human Hair Follicles, Br. J. Dermatol. , 110:685-989, 1984) と Itami, S. ら (5a— Reductase Activity In Cultured human Dermal Papilla Cells From Beard Compared With Reticular Dermal Fibroblasts, J. Invest. Dermatol. , 94: 150-152, 1990) の方法に従い行なう。髭毛乳頭細胞と二人の後頭部毛根を実験に使用する。すべての実験は 4から 6代のサブカルチヤ一後、コンフルェン卜の状態で行なう。コンフルェン卜になった細胞はリン酸緩衝食塩水 (PBS) にて二回洗浄後、ラバ一ポリスマンで剥離し、遠心チューブに回収する。細胞は 4 °Cにて 1500 rpm、 1 0分間遠心分離する。ペレツトを緩衝液（ 250 mMショ糖， 1 mM 塩化マグネシウム及び 2 mM 塩化カルシウムを含む 20 mM トリス塩酸緩衝液（pH 7.5)) に懸濁し、 25G の針を 1 0回通過させる。さらに、テフロン一ガラスホモゲナイザーを用いてホモゲナイズし、これを細胞破砕液とする。 5 α還元酵素の細胞内局在を調べるために、細胞破砕液を 800 Xg にて 1 0分間遠心分離し、粗核分画を得る。上清は 10，000Xg にて 1 5分間遠心分離し、ミトコンドリア分画を得る。この上清をさらに 100， OOOXgにて 6 0分間遠心分離し、ミクロソーム分画とサイトゾ一ル分圃を得る。それぞれの沈渣部分は 2回洗浄した後、再懸濁する。

通常のィンキュベ一ション条件は 50 nM [³H]—テストステロン及び 1 mM NADPH を含む 100 mM クェン酸ナトリウム（pH 5.5)又は 100 mM トリス—塩酸（pH 7. δ) に 50 ml の細胞破砕液を加えて、 100 ml とする。各チューブには蛋白質量で 50 〜100 mg相当の細胞破砕液を加える。反応は 37 Cにて 30分間行なう。インキュベーションの間、反応は時間に比例して進行する。反応至適 pHの検討には、 pH 4.5 から 6.5 はクェン酸緩衝液を、 pH 7.0から 9.0 はトリスー塩酸緩衝液を用いる。蛋白質量の測定は Lowry らの方法（Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. , 193:265 - 275， 1951) により行なう。

インキュべ一シヨン終了後、キャリア一ステロイドをそれぞれ 110 mg 含んだ 4倍量のクロ口ホルム一メタノール（2/l:V/V ) を加えて反応を停止させる。抽出したステロイ it Gomez らの方法 (In Vitro Metabolism Of Testosterone-4-¹⁴C and D - androstene 3, 17 - dione - 4- "C In Human Skin, Biochem. , 7:24-32, 1968) に従い薄層クロマトグラフィ一にて解析する。それぞれのステロイドの純度は再結晶法にて確認する。 5 _α還元酵素活性は生成されたジヒドロテストステロンで示す。なお、酵素阻害作用は対照群の変換率を 100 %とし、阻害率（100 — （検体添加時の変換率 ÷対照群の変換率） X 100 ) (%) として示す。

化合物（ I ) は良好な 5 _α還元酵素阻害作用を示す。

[試験例 4 ]

ベニガオザル抜け毛予防と発毛促進作用（ D

ベニガオザルはヒ卜の男性型脱毛症に似たパターンで禿頭症になる。この禿頭のプロセスは思春期直後に始まる（年齢約 4才）。これは雌雄両性のベニガオザルのほとんど 1 0 0 %に起こり、しかもアンドロゲン依存性である。従って、ヒトの男性型脱毛症の有用な動物モデルである。

雄のベニガオザル（年齢 3— 1 6才）を一群 3— 6匹ずつにわける。頭皮の前頭部と後頭部のうち、一つの領域の境界を明確に定めて、例えば入れ墨でマークし、マークした領域の毛髪を剃り落とす。実験薬剤は各種の用量と各種の組み合わせにより溶液又は粉末を調製し、 1 日 1回又は 2回、剃り落とした領域に均等に塗布又は経口投与する。対照動物には同量の溶媒（例えばジメチルスルホキシドなど）又はクリーム（皮膚投与）或はプラセボ（経口投与）を投与する。このマークした領域は 4一 6週間毎に剃り落とし、剃った毛髪の重量を計量する。投与期間は 6週間乃至 2年間である。フィナステリドは 5 _α—レダクタ一ゼ阻害剤であり、この動物の禿頭を防止することで知られている。フィナステリド（経口）を対照薬として実験に使用する。

頭皮の生検材料（4 m mのパンチ）は治療開始時と終了時に採取する。標本により 5 _α _レダクターゼ活性を分析し、組織検査を行なって脱毛症の有無を判定する。

化合物（ I ) は脱毛症に対して有効である。

[試験例 5 ]

ベニガオザル抜け毛予防と発毛促進作用（ 2 )

雌雄のベニガオザル（年齢 3— 1 6才）を一群 3 - 6匹ずつにわける。実験薬剤は各種の用量と各種の組み合わせにより溶液または粉末を調製し、 1 日 1回前頭部皮膚に塗布又は経口投与する。投与期間は 6週間乃至 2年間である。対照群の動物には同量の溶媒（例えばジメチルスルホキシドなど）またはクリーム（皮膚投与）或いはプラセボ（経口投与）を投与する。 1 ヶ月毎に前頭部の毛の状態を観察し、毛の太さ、密度、発毛領域、発毛時期から実験薬剤の効果についての評価すると同時に写真を撮影し写真による全体的な判定も行なう。実験開始前、 3ヶ月目及び 6ヶ月目の時点で前頭部皮膚の一部をバイォプシ一により採取（直径 4 m mの円形）し、組織学的検索により毛根部の発育ステージに対する効果について検討する。

化合物（ I ) は脱毛症に対して有効である。

[試験例 6 ]

ファジーラットを用いた試験

ファジーラットはアンドロゲン依存性で毛根部皮脂腺細胞の増殖および分泌能が異常に亢進するモデル動物である。また幼若期（4週齢前後）の毛根は成長期が主体であるが、性成熟後（ 8週齢前後）には休止期の毛根が増加する。このため毛の発育に及ぼす影響について検討するためのモデル動物として用いられている。

ファジーラット（雄、 3— 1 2週齢）を一群 5から 6匹ずつに分ける。実験薬剤は各種の用量と各種の組み合わせにより溶液又は粉末を調製し、 1 日 1回背部皮膚に塗布又は経口投与する。投与期間は 4乃至 8週間である。対照群の動物には同量の溶媒（例えばジメチルスルホキシドなど）又はクリーム（皮膚投与）或いはプラセボ（経口投与）を投与する。投与終了翌日に断頭屠殺後、背部皮膚組織を採取（直径 4 mmの円形）し、組織学的検索により皮脂腺及び毛根部発育ステ一ジに対する効果について検討する。

化合物（ I ) は脂漏症及び脱毛症に対して有効である。なお、上記試験例の他に、文献（B de Brouwer et al, Br. J. Dermatol. , 137, 699- 702 (1997))記載の方法に従って、ヌードマウスを用いて育毛を評価することもできる。

[参考例 1 ]

- [ 1 —メチル一 1 一（ 4ーメトキシフエ二ル) ェチル] — 3—ォ_キソー 4 —ァザ一 5 α—アンドロスト— 1 一ェン— 1 7 /3—カルボキサミド

乾燥したトルエン 3 0 ml に 3—ォキソ一 4一ァザー 5 α—アンドロストー 1 一ェン— 1 7 ;3—カルボン酸 l.Og 、トリフエニルホスフィン 1.6g及ぴ 2 , 2 ' ージピリジルジスルフィド 1.4g を順次加え、室温で一夜撹拌放置した。反応液をそのまま 3 5 gのシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィ一に付し、ァセトン一塩化メチレン（ 1 ： 9力ら 1 ： 1 ) で溶出して 2—ピリジルチオエステル体 l. llg を得た。乾燥した塩化メチレン 3 0 ml に同様に合成した 2—ピリジルチォエステル体 5.0g 及び 1 — ( 4ーメトキシフエ二ル） — 1 —メチルェチルァミン 5.0_gを順次加え、室温で 3 日間撹拌放置した。反応液を塩化メチレン 100ml で希釈して、 1 N—塩酸、水、重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシゥムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣を 1 5 gのシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィ一に付し、アセトン—塩化メチレン（ 1 ： 9から 1 ： 1 ) で溶出して、目的化合物 5.2gを得た。

NMRスペクトル（CDCl₃) 5ppm ： 0.68 (3H s) , 0.98 (3H, s) , 0.90 - 2.20 ( 16H, m) , 1.70(3H, s), 1.72(3H, s), 3.35 ( 1H, t, J=9Hz) , 3.80(3H, s), 5.48 ( 1H br. ) , 5.76 (1H, br. ), 5.83(1H, d, J=10Hz), 6.82 ( 1H, d， J= 10Hz) , 6.88(2H, d, J=9Hz), 7.32 (2H, d, J=9Hz)

I Rスぺクトル v cm—¹ (KBr) ： 2969, 2938, 1672, 1599, 1514, 1455, 1248, 1181, 1035, 825

[製剤例 1 ]

錠剤

、 5 mg飽) ロロ名基本処方（mg/錠）参考例 1の化合物 5

ヒドロキシプロピルメチノレセノレ口一ス 15

カルボキシメチルスタ一チナトリウム 9.5

結晶セルロース 30.5

クロス力ノレメロースナトリゥム 20

乳糖（篩過） 38.75

黄色三二酸化鉄 0.05

ステアリン酸マグネシウム（篩過） 1.2

錠剤 120.0 [製剤例 2 ]

アルコール溶液

参考例 1 の化合物 1 5. 0 (重量％) 水 4 5

エタノーノレ 4 0

[製剤例 3]

クレンジングフォーム

参考例 1 の化合物 1 0. 0 0 (重量％) 水 7 0. 4 3 9

カモミール 0. 0 1

アロエベラシェノレ 0. 0 1

アラントイン 0. 0 0 1

トリエタノールアミン 0. 0 2

メトセル（METH0CEい ^M 40-100(Dow)) 1. 5 0

グリセリン 3. 0 0

ラウリル硫酸ナトリウム 1 5. 0 0

ビタミン Aオイル 0. 0 1

ビタミン Eオイル 0. 0 1

[製剤例 4]

クレンジングクリーム

参考例 1の化合物 5 · 0 (重量％) 合成ミツロウ 1 4. 0

P P G - ミリスチルプロピオネート 5. 0

ラノリンアルコール 0. 5

ミネラルオイル 3 6. 0

プロピルパラベン 0. 1 5

ホウ砂 1 . 0

水 3 8. 3 5

P P G ：ポリエチレングリコ一ルポリプロピレングリコール

[製剤例 5]

スキンジエル

参考例 1 の化合物 2. 0 0 (重量％)

P P G . ミリスチルエーテルプロピオネート 4 5. 0 0

P P G . セチノレエーテノレ 5. 0 0 c i _s— c ₃₆ トリグリセリド 4. 0 0 ミリスチルミリステート 3. 0 0 グリセリノレトリベべネート 2. 0 0 シクロメチコン 3 4. 0 0 ポリエチレン 5. 0 0 [製剤例 6 ]

スキン口一、ンョン参考例 1 の化合物 1 . 0 (重量％) ジエタノールアミンォレス 3 リン酸 1 . 0

孔ィヒワックス 2 . 0

C , 一ヮックス脂肪酸 1 . 0

P P G , ミリスチルプロピオネート 5 . 0 グリセリン 3 . 0

トリエタノールアミン 0 . 5 水 8 6 . 5

[製剤例 7 ]

シャンプ一ジェル

参考例 1 の化合物 2 . 0 (重量％) ィソプロパノ一ルァミンラウリル硫酸 8 1 . 5 ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 8 . 0 c _ε— C ₃ . ワックス酸グリセリルエステル 4 . 5

P P G ₅ セテス 1 0 リン酸 4 . 0

[製剤例 8 ]

クリ一ムシャンプ一 _ 参考例 1 の化合物 0 . 1 (重量％) ラウリル硫酸ナトリウム 6 5 . 0 グリセリノレトリベべネート 2 . 0 ヒドロライズドコラーゲン 1 . 0 ラウリン酸ジエタノールァミド 5 . 0 [産業上の利用可能性]

フィナステリドは良性前立腺肥大症の治療薬として欧米で発売され、現在脱毛症治療薬として臨床試験が実施されている化合物である。

本発明の化合物（ I ) 及び関連化合物は、フィナステリドより強いタイプ 2ァイソザィム阻害作用を持ち、加えて、タイプ 1アイソザィム阻害作用も強い。そのためフィナステリドより遥かに強力な血中の D H T低下作用を有し、且つ、毒性も少ないので、脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物、あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物として有用である。

[配列表フリ一テキスト]

[配列番号 1 ]

合成配列の説明： 5 α還元酵素タイプ 1 をコードする c DN Α配列に基づいて設計されたプライマー

[配列番号 2 ]

合成配列の説明： 5 α還元酵素タイプ 1 をコードする c D Ν Α配列に基づいて設計されたプライマー

[配列番号 3]

合成配列の説明： 5 _α還元酵素タイプ 2をコードする c D N A配列に基づいて設計されたプライマー

[配列番号 4 ]

合成配列の説明： 5 ひ還元酵素タイプ 2をコードする c DN A配列に基づいて設計されたプライマ一

Claims

請求の範囲

1. 下記一般式（ I ) で表わされる化合物、その薬理上許容される塩又はその他の誘導体を有効成分として含有する脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物、あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物。

(式中、 R ¹ 及び R ² は、同一又は異なって、水素原子、水酸基又は低級ァルコキシ基を示す。）

2. N - [ 1 一メチル一 1 — (4ーメトキシフエニル）ェチル] 一 3—ォキソ一 4一ァザー 5 α—アンドロスト一 1 一ェン— 1 7 —カルボキサミドを有効成分として含有する脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物、あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物。

3. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物。

4. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脱毛症の治療のための組成物。

5. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の女性多毛症の治療のための組成物。

6. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脂漏症の治療のための組成物。

7. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の前立腺癌の骨転移予防のための組成物。

8. 脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物を製造するための、下記一般式（ I ) で表わされる化合物、その薬理上許容される塩又はその他の誘導体の使用。

9. 脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物を製造するための、 N— [ 1 ーメチルー 1 一（ 4ーメトキシフエニル）ェチル] 一 3—ォキソ一 4ーァザ— 5 ct—アンドロスト一 1 一ェンー 1 7 )3—カルボキサミドの使用。

1 0. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脱毛症、女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物を製造するための使用。

1 1 . 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脱毛症の治療のための組成物を製造するための使用。

1 2. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の女性多毛症の治療のための組成物を製造するための使用。

1 3. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脂漏症の治療のための組成物を製造するための使用。

1 4. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の前立腺癌の骨転移予防のための組成物を製造するための使用。