ES2216143T3 - Uso de hemicelulosa en alimentos con bajo contenido calorico. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA QUE LOS ANIMALES MONOGASTRICOS MEJOREN LA EFICACIA CON LA QUE APROVECHAN LAS RACIONES DIETETICAS DE BAJO CONTENIDO CALORICO. LA ADICION DE UN ENZIMA DE UNA HEMICELULASA, COMO LA MANANASA, A LAS RACIONES DIETETICAS QUE NO TIENEN UN SUPLEMENTO DE GRASA CONCENTRADA O QUE CONTIENEN GRASA REDUCIDA MEJORA LA EFICACIA CON LA QUE LOS ANIMALES MONOGASTRICOS APROVECHAN LAS RACIONES.

Description

Uso de hemicelulosa en alimentos con bajo contenido calórico.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con una composición de alimento que comprenda una harina de semilla leguminosa; (b) aminoácidos esenciales y (c) una enzima de hemicelulosa, en donde la composición de alimento tiene una cantidad de grasa concentrada añadida menor del 2%, y un contenido total de energía que se puede metabolizar de menos de 3086 Kcla/Kilogramo por usarse en métodos para alimentar animales monogástricos, y más particularmente, a composiciones alimenticias que emplean uno o más hemicelulosas, tal como la mananasa, la cual disminuye el alimento para ganar, o incrementar la ganancia de peso de animales que se alimentaron con una dieta baja en calorías que contiene la enzima.

2. Antecedentes

La población mundial sigue creciendo, pero la tierra para la producción de alimentos es finita. J.E. Cohen, Discover 17:42-47 (1996). Con el objetivo de mantenerse al día con la demanda creciente de alimentos, se necesitarán mejoras en la uso de fuentes de alimentos para mantener los estándares de vida actuales. Un planteamiento para la eficiencia mejorada ha sido mejorar la digestión de alimentos mediante la inclusión de enzimas. Chesson, A., Enzimas complementarias para mejorar la uso de dietas de cerdos y aves de corral, págs. 71-89, en Haresign, W. y D.J.A. Cole (eds.), Recent Advances in Animal Nutrition -1987, Butterworths, Londres. La digestión auxiliada de manera enzimática no solamente produce más carne por libra de alimento, sino que también reduce el volumen de estiércol y el costo de eliminación.

Se han reconocido claramente cuatro tipos de enzimas en el mercado por su valor en los alimentos de animales. En las dietas que contienen trigo, centeno o triticalo, se ha mostrado que la enzima xilanasa (endo-1,4-\beta-D-xilanohidrolasa, E.C. 3.2.1.8) es beneficiosa. Petterson y colaboradores, British Journal of Nutrition 62:139-149, (1989). El trigo, el centeno y el triticalo híbrido de trigo/centeno contienen grandes cantidades de arabinoxilano de polisacárido sin almidón en la pared celular del endosperma. Los animales monogástricos no digieren el arabinoxilano, pero la xilanasa microbiana lo hiroliza.

Un segundo ejemplo de una enzima con uso difundido en los alimentos, es la \beta-glacanasa [celulosa, endo-1,4-\beta-D-glucan 4-glucanohidrolasa E.C. 3.2.1.4; o endo-1,3- (1,3 ; 1,4)-\beta -D- glucan 3(4)-glucanohidrolasa E.C. 3.2.1.6] de la cual se ha mostrado que es especialmente beneficiosa en dietas que contienen cebada y avena. Rotter y colaboradores, Nutrition Reports Internacional 39:107-120 (1989). Además de interferir con la digestión, el glucano provoca un estiércol húmedo y pegajoso que induce ampollas de pechuga en las aves de corral. En la práctica, la xilanasa y la \beta-glucanasa se aplican juntas ya que tanto el arabinoxilano como el glucano están presentes en los granos de cereal. Petterson y colaboradores, Animal Production 51:210-20 (1990).

El uso de enzimas que separan el fósforo a partir de un ácido fítrico (hexacisfosfato de mio-inositol) es un tercer ejemplo de la uso beneficiosa de las enzimas en el alimento de animales. Simons y colaboradores, British Journal of Nutrition, 64:525-540 (1990). En los animales monogástricos, no se libera el fosfato a partir del ácido fítico durante la digestión, sino que se libera en el estiércol a través de la acción microbiana. El ácido fítico tiene un contenido significativo en los alimentos típicos. El escape de fosfato llega a ser un problema durante la eliminación del estiércol porque provoca la eutrofización de los ríos, lagos o bahías cercanas. La incorporación de la fitasa disminuye el contenido de fosfato en el estiércol y disminuye de manera significativa la necesidad de añadir sales de fosfato a las dietas.

La mananasa es otra enzima que ha ganado uso comercial en las dietas que se basan en maíz y en frijol de soya. El alimento disminuido para la ganancia, o la ganancia de peso incrementado, de los animales monogástricos que se alimentan con una dieta que contiene mananasa, fue inesperado en una dieta que se basa en maíz. Hasta el descubrimiento de que la endo-1,4-\beta-mananasa bacteriana (E.C. 3.2.1.78, también conocida como manan endo-1,4- \beta-manosidasa, ver McCleary, B.V., \beta-D-Mananasa, Methods in Enzymology 160:596-609, (1988) aumenta la eficiencia del alimento en dietas de maíz-frijol de soya, las enzimas no se usaban frecuentemente en los alimentos de aves de corral o de cerdos que se criaban con dietas de maíz-soya. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,429,828, la cual se incorpora a la presente como referencia, enseña un método para mejorar la eficiencia de energía de alimentos de animal que contienen hemicelulosa, mediante la adición hemicelulosa, especialmente mananasa, a la dieta.

Fue inesperado el efecto positivo de la adición de la endo-1,4-\beta-D-mananasa en la eficiencia de la alimentación en una dieta que se basa en maíz. En la cebada o la avena que contiene glucano enlazado-mezclado, o trigo, centeno y triticalos que contienen arabinoxilano, el polímero antinutritivo representa un gran porcentaje del endosperma de la semilla. En contraste, existe solamente un contenido muy pequeño de polímeros que se basan en la 1,4-\beta-D-manan en las dietas comunes que se basan en maíz. La fuente principal de galactomanan en una dieta común que se basa en maíz, es la harina de frijol de soya (que se añade principalmente como una fuente de proteína). Basados en el análisis completo de azúcar y en el porcentaje de polisacáridos sin almidón, la harina de frijol de soya podría contener el orden de 1.3 por ciento de manan. De esta manera, una dieta con el 30 por ciento de harina de frijol de soya, tendría solo aproximadamente 0.4 por ciento de polímero de manan. La energía agregada que se derivaría de una digestión completa de este pequeño porcentaje de la dieta, no podría explicar el gran mejoramiento que se ve en la conversión del alimento y la ganancia de peso.

En muchas áreas del mundo, se utilizan raciones de dieta que contienen un bajo contenido de energía que se puede metabolizar. Las raciones de dieta en estos países no se suplementan con grasa. Como consecuencia, existe una necesidad de incrementar la eficiencia de energía para la uso de las dietas bajas en grasa. En los países en desarrollo o desarrollados, se están eliminando la grasa concentrada complementaria de la dieta, por razones de salud. Además, existe un número sorprendente de problemas asociados con la adición de grasa concentrada a las raciones de dieta, para incrementar el contenido de energía que se puede metabolizar (ME, por sus siglas en inglés) del alimento (Rouse, R.H., Calidad de Grasa, el confuso mundo de las grasas de alimento, págs. 55-63 en: Proceedings of the 1994 Maryland Nutrition Conference, marzo 24-25, Baltimore, MD, University of Maryland Feed Industry Council, Collage Park, MD).

Se sabe que la oxidación de los ácidos grasos no saturados en la grasa, lleva a la formación de peróxidos y de radicales libres. Esto a su vez lleva a la oxidación de los nutrientes y las vitaminas del alimento. También hay evidencia disponible que indica que las dietas elevadas en grasa pueden llevar a falla ventricular y/o problemas de ascitis en pollos tiernos (Mulins, T.M. y W.W. Taylor, Efectos de una dieta elevada en grasa en el crecimiento, hipertrofia ventricular derecha, falla ventricular derecha, y formación de ascitis en pollos tiernos, Resumen 25, p 11, Southern Poultry Science Society, 16^{th} Annual Meeting, Enero 16-17, 1995, Atlanta, Georgia). Algunas fuentes de grasa de alimento para animales incluye grasa de desperdicio de restaurante, la cual se ha hidrogenado de manera parcial para crear ácidos grasos no naturales con enlaces dobles trans, que pueden interferir con la fertilidad, el metabolismo de los ácidos grasos y el valor de energía del alimento (Rouse, supra). Otra cuestión es la presencia de ácidos grasos libres en las grasas comerciales que pueden tener efectos adversos en la producción, y pueden tener un efecto antimicrobiano en el intestino de pollo (Rouse, supra). Las grasas mezcladas también están contaminadas frecuentemente con PCBs, residuos de pesticida, metales pesados, y gosipol a partir del extracto de jabón de aceite de semilla de algodón (Rouse, supra). Los gerentes de molinos de alimentos tienen que vigilar todos estos aspectos. Es bien sabido que la grasa inferida (y los materiales disueltos en ella, como el PCB), pueden incorporarse directamente dentro de la grasa del animal que la consume, y que ésta puede presentar riesgos importantes de salud. Además, la grasa en las raciones de los animales puede influir el sabor de la carne. Por ejemplo, más de 1 por ciento de aceite de pescado en las dietas de los pollos provocará un olor distintivo de tipo-pescado en la carne o los huevos (Lesson, S., y J.D. Summers, Capítulo 2: Evaluación del ingrediente en la fórmula de dieta, en Comercial Poultry Nutrition, University Books, Guelph, Ontario, 1991). El efecto del alto contenido de grasa (especialmente grasa animal) en el sabor del producto, es otro aspecto al que algunos productores han empezado a prestar atención. Es de interés general la capacidad para evitar el uso de grasa y todavía obtener la misma productividad.

Existe una necesidad continua por una eficiencia más elevada en la producción de alimentos y la urgencia para proporcionar soluciones solamente se incrementará con el tiempo. No siempre es posible o deseable el uso de dietas de energía elevada, las cuales incluyen diferentes porcentajes de grasa para promover el crecimiento eficiente del animal, debido al costo elevado de la grasa o de los aceites vegetales, o a las cantidades limitadas de grasa animal disponible en algunas de las partes más altamente pobladas del mundo (por ejemplo, en India o China). Existe una ineficacia básica en el uso de la grasa disponible en el alimento. Por ejemplo, en las industrias química y del jabón, la grasa podría tener más valor. Finalmente, existe un número de aspectos y problemas de salud asociados con la incorporación de grasas concentradas exógenas en las dietas de animales. Estos aspectos son una indicación adicional de que se necesita urgentemente una dieta de alimento de animal de grasa reducida, caloría reducida que mantenga una eficiencia elevada de alimentación.

Existe por lo tanto una necesidad por un método que incremente la eficiencia con la que los animales monogástricos utilicen las raciones de alimento que contenga un contenido bajo de energía que se pueda metabolizar. De igual manera, existe una necesidad por una ración de alimento que los animales monogástricos puedan utilizar de manera eficiente, sin la adición de grasa.

Sumario de la invención

De conformidad con lo anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición alimenticia para su uso en un método para incrementar la eficiencia con la que los animales monogástricos utilizan las raciones de alimento que contienen un contenido bajo de energía que se puede metabolizar.

Es otro objetivo de esta invención proporcionar una composición alimenticia para su uso en un método para incrementar la eficiencia con la que los animales monogástricos utilizan las raciones de alimento que no contienen grasa concentrada agregada.

Estos y otros objetivos se consiguen, de conformidad con una realización de la presente invención mediante el suministro de una composición de alimento que comprende (a) una harina de semilla leguminosa; (b) aminoácidos esenciales y (c) una enzima de hemicelulosa, en donde la composición de alimento tiene una cantidad de grasa concentrada añadida menor al 2%, y un contenido total de energía que se puede metabolizar, de menos de 3086 Kcal/Kilogramo.

Otra realización de la invención es una composición de alimento que comprende (a) una harina de frijol de soya; (b) aminoácidos esenciales y (c) una enzima de hemicelulosa, en donde la composición de alimento tiene un contenido total de energía que se puede metabolizar, de menos de 3086 Kcal/Kilogramo.

Otra realización de la invención es una composición e alimento que comprende (a) una harina de frijol de soya; (b) aminoácidos esenciales y (c) una mananasa, tal como la endo-1,4-\beta-D-mananasa, en donde la composición de alimento tiene una cantidad de grasa concentrada añadida menor al 2%, y un contenido total de energía que se puede metabolizar, de menos de 3086Kcal/Kilogramo.

Todavía otra realización de la invención, es una composición de alimento que comprende (a) una harina de frijol de soya; (b) aminoácidos esenciales y (c) una mananasa, tal como la endo-1,4-\beta-D-mananasa, en donde la composición de alimento tiene una cantidad de grasa concentrada añadida menor al 2%, y un contenido total de energía que se puede metabolizar, de menos de 3086 Kcal/Kilogramo y no contiene esencialmente grasa concentrada agregada.

Otra realización de la invención es una composición de alimento que comprende (a) una harina de frijol de soya; (b) aminoácidos esenciales y (c) una mananasa, tal como la endo- 1,4-\beta-D-mananasa, en donde la composición de alimento tienen un contenido total de energía que se puede metabolizar, de menos de 3086 Kcal/Kilogramo y que contiene menos del 2 por ciento de grasa concentrada agregada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un Diagrama de Flujo de Bomba - Cabeza Doble - para la aplicación de la endo-1,4-\beta-mananasa de Molino de Alimento, de conformidad con la presente invención.

La Figura 2 muestra un ejemplo de la Aplicación Exitosa de la Enzima en un Molino de Alimento que produce hasta 50 toneladas de Alimento en forma de Píldoras por Hora, de conformidad con la presente invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En la presente invención se puede utilizar cualquier hemicelulosa, incluyendo cualquier mananasa, y más específicamente la endo-1,4-\beta-D-mananasa, la cual es efectiva para disminuir el alimento a ganancia, o la ganancia de peso incrementado, de un animal que consume una dieta baja en grasas. Como un ejemplo, una fuente preferida de enzima es la endo-1,4-\beta-mananasa del Bacillus lentus (ATCC 5045) (Fodge y Anderson, supra; Fodge, Anderson, y Pettey, supra), fabricada como un producto con el nombre de fábrica Hemicell ®.

Cuando se valora el valor agregado de la enzima, frecuentemente se usa un sistema "Punto", el cual es la suma de los puntos de "peso" (P_{w}) y los puntos de "conversión de alimento, FC" (P_{pc}). La conversión de alimento se calcula por medio de dividir el peso del alimento consumido, por el peso vivo. Se definen los dos tipos de puntos como sigue:

P_{w} = (Peso_{PRUEBA}- Peso_{CONTROL}) \ / \ 0.06 \ Libras \ (a \ los \ 45 \ \text{días})

P_{pc} = (FC_{CONTROL} - FC_{PRUEBA}) \ / \ 0.01

En la mayoría de las pruebas científicas que se condujeron en los Estados Unidos de Norteamérica, se observaron mejorías de apenas 5 a 8 puntos (ver Tabla 2) en los pollos, y se observaron resultados comparables tanto con pavos, como con cerdos (no se muestran los datos). Sin embargo, ocasionalmente, se observó un mejoramiento dramático sobre la aplicación de la endo-1,4-\beta-D-mananasa (Rue, J.R., H.R. Zhang, Z.C. Liang, T. Li y F.R. Meng, Aplicación de la endo-1,4-\beta-D-mananasa en la Industria Alimenticia, Zhongguo Siliao (China Feed) 24:19-21, 1995).

Uno de los inventores condujo experimentos en cuatro lugares diferentes en China. Promediando los resultados de las cuatro pruebas, hubo un mejoramiento de 24.6 puntos después del uso de la endo-1,4-\beta-D-mananasa. En la Tabla 1 se resumen los datos de Rue y colaboradores. Se examinaron las diferencias entre las dietas que se usaron. Basados en las diferencias, comenzamos algunas pruebas científicas controladas de manera cuidadosa, para investigar la causa del mayor impacto de la \beta-mananasa. El resultado inesperado fue que el contenido de grasa, y/o el contenido de kilocalorías de la ración, fue la clave para aumentar el efecto de la endo-1,4-\beta-D-mananasa, como se describe más adelante.

TABLA 1 El efecto de la endo-1,4-\beta-D-mananasa en Pruebas de Corral de Pollos Tiernos en China (Rue, R. J. y colaboradores, 1995)

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Se ajusta la concentración de mananasa a 1000 MU/litro, como se determinó mediante un ensayo de reducción de azúcar. También se puede determinar la concentración de la enzima, por ejemplo, con un ensayo de viscosidad o un ensayo basado en tinta azul. Generalmente, se usa el ensayo de tinta azul como un ensayo rápido para verificar el progreso de las fermentaciones, y el ensayo de reducción de azúcar se usa para ensayos de control de calidad del producto final y muestras de alimento. El producto final tiene un pH ajustado a entre 7,0 y 7,5, y se estabiliza la solución de la enzima contra el crecimiento microbiano secundario mediante la adición de 150 g/litro de cloruro de sodio. De esta forma, la enzima es muy estable y se mantiene a la temperatura ambiente hasta que se usa.

El producto de enzima se aplica de preferencia al alimento de dos maneras. En un primer método, se seca la enzima sobre granos de frijol de soya (malla de 20-80, Archer Daniels Midland), usando un secador de lecho fluidificado Glatt Air a una concentración de enzima de 100 MU por 0,45 kg. De preferencia se mantiene el contenido final de humedad del producto de enzima seco, a menos del 8 por ciento. Se agrega este producto cuando se formula el alimento, y se mezcla a una proporción de una libra de producto seco de endo-1,4-\beta-D-mananasa por 900 kg. de alimento. Generalmente se usa el método del producto seco cuando no se calienta el alimento mezclado a una temperatura elevada (por ejemplo, menos de 16º F) durante el procesamiento para la formación de píldoras. Una tendencia reciente en la fabricación de alimentos, es el uso de temperaturas muy elevadas en los formadores de píldoras de alimento y/o expansores y extrusores de alimento. Por otro lado, en muchos casos se puede rociar el producto líquido de la enzima de endo-1,4-\beta-D-mananasa, sobre píldoras de alimento formadas previamente, a una proporción de 100 Mu/ton. En un lugar en la línea de producción de alimento corriente abajo desde el enfriador de gránulo, de preferencia se esparce el alimento que cae dentro de un flujo de profundidad ancho pero poco profundo, mediante un cono o placa en el tubo o ducto justamente enfrente del área en donde se rocía la enzima. De esta manera, aproximadamente 100 mililitros de endo-1,4-\beta-D-mananasa líquida se diluyen de manera continua con agua usando una bomba de cabeza doble y se rocían a través de una boquilla a una presión moderada en un patrón uniforme sobre la corriente de alimento que cae. De manera alternativa, la enzima diluida se deja caer sobre un disco giratorio, el cual a su vez rocía la enzima sobre una cortina de alimento que pasa alrededor del disco, mediante el conocido método roto-revestidor.

Todavía un tercer método, es rociar la enzima dentro de un dispositivo de mezclado de píldoras, localizado usualmente después de que se ha aplicado algún otro componente de alimento líquido, tal como grasa o vitaminas. La cantidad de humedad que se agrega al alimento en este proceso es insignificante, de manera que la enzima se absorbe inmediatamente y la humedad que se agregó no promueve el crecimiento microbiano ni desgasta la estructura del gránulo. Después de la adición de la enzima, el alimento pasa a través de un mezclador para asegurar que se obtiene la distribución uniforme de la enzima en el alimento. Se prefiere la maquinaria que mantiene una velocidad de flujo uniforme del alimento más allá del rocío.

En un modo más preferido del proceso de rociado, se utiliza ya sea un dispositivo de flujo como la fabrica Milltronics, Arlington, Texas, que proporciona el ajuste de la velocidad de rociado basado en la velocidad de flujo del alimento, o un dispositivo roto-revestidor como la fabrica APEC (Automated Process Equipment Corporation), Lake Odessa, Michigan (Stemler, T., Extendiendo el procesamiento de alimento más allá del molino de gránulo, Feed Management 45:4, 1994). El coeficiente de variación para el nivel de enzima en el alimento, deberá ser de 15 por ciento o menos, en un caso preferido. La aplicación de más de la cantidad objetivo de 100 MU enzima por tonelada de alimento no es perjudicial, sino que probablemente proporciona poco o ningún beneficio. En el Ejemplo 3 más adelante se da una descripción más detallada de un modo preferido de la aplicación de la enzima y de la instalación del equipo para usarse en un molino de granulación de alimento de temperatura elevada.

Se ha conducido un gran número de pruebas de corral de alimentación de animales y pruebas de campo de escala completa con la endo- 1,4-\beta-D-mananasa, como se describió anteriormente. En los casos en donde las pruebas se conducen de manera apropiada con suficientes repeticiones para producir resultados estadísticamente significativos, y en donde la enzima se aplicó de manera uniforme al nivel apropiado, y en donde se evitaron otros escollos comunes, tal como alimentos no uniformes, los datos generalmente apoyan la eficiencia incrementada del alimento con la incorporación de la mananasa en el alimento. En la Tabla 2 se resumen seis experimentos de alimentación de pollos de prueba de corral. También se condujeron los estudios con pavos, y cerdos de diferentes crías, con composiciones de alimentos y ubicaciones geográficas diferentes. Ocasionalmente, las pruebas trabajaron mucho mejor de lo esperado, como en Rue y colaboradores, supra. Prueba en China (Tabla 1). El examen de las diferencias en estas pruebas que fueron extraordinarias, llevó a la invención actual.

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La Tabla 3 compara la composición de una dieta optimizada de pollo tierno de los Estados Unidos de Norteamérica, con las dietas que se usan en el estudio de rue, R.J. y colaboradores (Tabla 1). Las dos dietas estás basadas en maíz-frijol de soya, pero existen algunas diferencias. En las dietas chinas se agregó poca o ninguna grasa, y la ME (energía que se puede metabolizar) promedió aproximadamente 6.3 por ciento más que en las dietas de los Estados Unidos de Norteamérica. Otra observación es que la dieta china usó un 44 por ciento de proteína de harina de frijol de soya (SBM 44), mientras que las dietas de los Estados Unidos de Norteamérica usaron 48 por ciento de proteína de harina de frijol de soya (SBM 48). El porcentaje más elevado de proteína significa que hay menos fibra en la harina que se deriva a partir de hollejos de frijol de soya. Debido a que los hollejos de frijol de soya son ricos en manan (Whistler, R.L. y J. Saarnio, Galactomanan a partir de hollejos de frijol de soya, J. Am. Chem. Soc., 79:6055-6057), el porcentaje que se calculó para la cantidad de galactomanan en las dos formulaciones es en promedio aproximadamente 66 por ciento más para las dietas chinas, aunque en ambos casos es baja. Los niveles de proteína cruda fueron similares, pero el contenido de lisina en las dietas chinas es significativamente mayor, basados en el nivel recomendado por el National Research Council (NRC). La dieta de los Estados Unidos de Norteamérica en la Tabla 3, tendría un total de aproximadamente 4.7 por ciento de lisina ex exceso sobre una base mezclada, pero la dieta china tienen aproximadamente 13.8 por ciento de lisina en exceso, en comparación con la recomendación del Nacional Research Council sobre una base mezclada. Usando los experimentos de prueba de corral de crecimiento de pollo bien diseñados y conducidos cuidadosamente, se valoraron los efectos de la grasa (dietas de energía más elevada, Dieta B) con la endo-1,4-\beta-D-mananasa, manteniendo bajo y constante el contenido de manan. En el Ejemplo 1 más adelante, se describen los detalles del experimento de alimentación.

En la Tabla 4 se resumen las dietas que se usaron en la prueba de alimentación en el Ejemplo 1 (descrito en detalle en el Ejemplo 2). La dieta A tuvo aproximadamente 3 por ciento menos grasa que la dieta B en cada una de las fases de crecimiento (iniciador, criador y terminador), pero la dieta A sería aproximadamente 85 Kcal/Kilogramo más grande que una dieta de pollo tierno chino típico. Se mantuvo igual la cantidad de proteína cruda en las dos dietas y los niveles de proteína de frijol de soya que se agregaron estuvieron muy cercanos. Las cantidades de lisina y de otros aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales estuvieron tan cerca de ser idénticos como fue práctico. La dieta A tuvo más maíz agregado para compensar la eliminación de grasa concentrada. Esto es beneficiosos porque los costos de maíz son significativamente menores que los de la grasa. Se probó cada dieta tanto con, como sin enzima de endo-1,4-\beta-D-mananasa en 8 corrales con 70 aves por corral. Se determinó la prueba a los 45 días.

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En la Tabla 5 se resume el resultado de la prueba. Usando los dos tipos de alimento, hubo un mejoramiento altamente significativo de manera estadística (P < 0.05) después de la inclusión de la enzima de endo- 1,4-\beta-D-mananasa. Sin embargo, el mejoramiento que se vio mediante la inclusión de la 1,4-\beta-D-mananasa en la dieta A, fue más de dos veces mejor que el mejoramiento que se vio en la dieta B después de la adición de la enzima. Cuando se examina la Kcal que se requieren para producir una libra de peso vivo de ave, la Kcal/x 0,45 kg viva disminuyó por 40 en la dieta B, pero disminuyó por 91 en la dieta A. Quizás lo más importante es la comparación entre la dieta B sin la enzima y la dieta A baja en grasa, con la enzima. Las conversiones de alimento y pesos no fueron estadísticamente diferentes al comparar los dos casos, pero la kcal por libra viva disminuyó por 131 en la dieta A más la \beta-mananasa. Estos datos demuestran que es posible eliminar 3 por ciento de grasa de las dietas al reducir el contenido de Kcal por aproximadamente 143 Kcal/kilogramo, sin la degradación del desempeño, si se agrega una endo- 1,4-\beta-D-mananasa efectiva a 100 MU/tonelada, como se definió.

Debido al costo elevado de la grasa concentrada como se usa actualmente en la industria, es muy significativo el beneficio económico al utilizar la dieta A más la enzima. No se anticipó este resultado sorprendente. Se cree que el contenido más elevado de manan en el SBM 44 es una diferencia significativa entre la dieta típica de los Estados Unidos de Norteamérica y la china, la cual provocó que la enzima de mananasa tuviera un impacto mayor en la dieta china. Estos resultados inesperados muestran que la grasa también es de importancia clave y que la endo- 1,4-\beta-D-mananasa, está mejorando actualmente el nivel de energía del alimento, mucho más de lo que se reconocía anteriormente. Con el objetivo de obtener el beneficio completo del incremento de la Kilocaloría después de uso de la mananasa, de preferencia se deberían ajustar los aminoácidos esenciales hacia arriba como corresponde, de manera que no se hagan limitantes.

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El método de mejoramiento de alimento de esta invención no es único para cualquier fuente de la endo-1,4-\beta-D-mananasa. Se pueden identificar fácilmente otras mananasas después de su aislamiento de la naturaleza y su producción mediante la tecnología d ADN convencional o recombinante, bien conocida en la técnica. Se han aislado los genes de codificación de la mananasa, a partir de diferentes fuentes (Luthi, E., N.B. Jasmat, R.A. Grayling, D.R. Love y P.L. Bergquist, Clonación, análisis de secuencia, y expresión en la Escherichia coli de una coficiación de gen para una \beta-mananasa, a partir de la bacteria extremadamente termifílica Caldocellum saccharolyticum, Appl. Environ. Microbiol. 57:694-700, 1991; Akino, T., C. Kato, y K. Horikoshi, Se producen dos \beta-mananasas de Bacillus que tienen terminaciones COOH en Escherichia coli que lleva pMAH5, Appl. Environ. Microbiol. 55:3178-3183, 1989). Además, se pueden mejorar las enzimas para usarse en este método mediante las técnicas que se conocen colectivamente como ingeniería de proteína, bien conocida en la técnica. Se hacen los cambios en la estructura de la proteína a través de mutación. Por ejemplo, se puede mejorar las mananasas en estabilidad a través del cambio de residuos específicos en la secuencia de aminoácido que producen una susceptibilidad oxidativa disminuida, susceptibilidad proteolítica, o de manera alternativa, una estructura más puenteada a temperaturas incrementadas. Se pueden predecir fácilmente estos cambios, después de la determinación de la estructura de cristal tridimensional de la proteína, mediante cristalografía de rayos-x. De manera alternativa, se pueden hacer mejorar mediante mutagénesis dirigida al área, pero aleatoria de la secuencia del gen, seguida por el rastreo de las enzimas mutantes resultantes para las propiedades mejoradas deseadas.

En un modo preferido de la invención, se utiliza una mananasa que tiene estabilidad térmica incrementada que puede soportar el tratamiento de calor por vapor que se envía al alimento durante la granulación, expansión, o extrusión. En este caso, de preferencia se incorpora la enzima directamente en una forma seca con los otros ingredientes del alimento, antes de la granulación. Se puede conseguir la estabilidad térmica incrementada, por ejemplo, mediante una combinación de métodos. Uno es empezar con la enzima que tiene estabilidad térmica inherente, tal como una enzima aislada a partir de un microorganismo termofílico. Sin embargo, la actividad específica deber ser suficiente a los 40ºC como para liberar aproximadamente 100 MU/tonelada, como se describió en este método. Una segunda opción es aumentar la termoestabilidad de una enzima mesofílica a través de la ingeniería de proteína, como se mencionó anteriormente, o mutagénesis dirigida al área de mutación aleatoria y la selección de enzimas con propiedades mejoradas. Todavía una tercera opción es mezclar las enzimas con productos químicos estabilizantes y/o agregar recubrimientos que eviten la penetración del vapor, pero los cuales no interfieran con la solubilización rápida y la actividad en el intestino del animal.

Se sabe que ciertos azúcares como la trealosa (Colaco, C., S. Sen, M. Thangavelu, S. Pinder y B. Roser, Estabilidad extraordinaria de enzimas secadas en trealosa:biología molecular simplificada, Bio/Technology 10:1007-1011, 1992; Roser, B.J., Protección de proteínas y similares, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,891,319), estabilizan las proteínas. También, se sabe que ciertos problemas químicos tales como el 2,3-difosfoglicerato cíclico (Seely, R.J., y D.E. Fahrney, El 2,3-difosfoglicerato cíclico a partir del Metanobacterium termoautotrófico, es el enantiómero D, Current Microbiol. 10:85-88, 1984; Hensel, R. y H.Koning, Termoadaptación de bacterias metanogénicas mediante concentración de ión intracelular, FEMS Microbiol. Lett. 49:75-79,1988) y el di-mio-inositol-1,1'-fosfato (Scholz, S., J. Sonnenbichler, W. Schafer, y R. Hensel, Di-mio-inositor-1-1'-fosfato: un fosfato de inositol nuevo aislado a partir del Pyrococcus woesei, FEBS 306:239-242, 1992) así como altas concentraciones de sal (Breitung, J., R.A. Schmitz, K.O. Stetter y R. K. Thauer, Ciclohidrolasa de N^{5}, N^{10}-metilentetra-hidrometanopterina a partir de la Methanopyrus kandleri extremadamente termofílica: incremento de la eficiencia catalítica y termoestabilidad en la presencia de sales, Arch. Microbiol. 156:517-524, 1991), están involucrados en la estabilización de las proteínas en algunos microorganismos extremadamente termofílicos. De esta manera, se pueden usar las enzimas termofílicas, las mutaciones estabilizantes, los productos químicos estabilizantes, o una combinación de estos factores para preparar mananasas que soporten el calentamiento durante la formación de gránulo de alimento, en un modo preferido de esta invención.

Los microorganismos productores de mananasa se seleccionar fácilmente a partir de la naturaleza, por medio de seleccionar microbios que puedan crecer sobre una goma basada en mananasa, como la única fuerte de carbonato. Se esperaría que cualquier suelo rico en materia orgánica fuera posible fuente de estos microbios. Por ejemplo, se sabe que muchos tipos de hemicelulosa de madera de árbol contienen cantidades significativas de manan (Sjostrom, E., Capítulo 3, Polisacáridos de la Madera, en Wood Chemistry, Fundamentals and Applications, páginas 49-67, Academic Press. Nueva York, 1981). Por lo tanto, es muy probable que los lugares con madera en descomposición sean fuentes ricas de mananasas. También se esperaría que ciertos tipos de lugares agrícolas sean fuentes ricas de microbios que produzcan mananasa. Por ejemplo, los lugares para el cultivo y procesamiento de coco/copra, o el cultivo y procesamiento de otras especies botánicas de las cuales se sabe que son una fuente rica de manan, probablemente tendrán abundantes microbios que degradan mananasa, que produzcan endo-1-\beta-D-mananasas. Ya se han descrito varias fuentes de endo-1-\beta-D-mananasas (McCleary, B.V., \beta-D-Mananasa, Methods in Enzymology 160:596-610, 1988); incluyendo el hongo (Jonson, K.G., \beta-mananasas exocelulares a partir de hongo hemicelulótico, World J. Microbiol. Biotechnol. 6:209-217, 1990; Araujo, A. Y O.P. Ward, Estudios sobre enzimas que degradan galactomanan producidas por el Sporotrichum cellulophilum, J. Industrial Microbiol. 8:229-236, 1991; Kurasakabe, I., G.G., Park, N. Kumita, T. Yasui y K. Murakami, Especificidad de la \beta-mananasa a partir del Penicillium purpurogenum para el glucomanan de Konjac, Agric. Biol.. Chem. 52:519-524, 1988) termofílicos extremos (Luthi y colaboradores, 1991, supra; Bicho, P.A., T.A. Clark, K. Mackie, H.W. Morgan y R.M. Daniel, La caracterización de un endo-1-\beta-D-mananasa termoestable clonada a partir del Caldocellum saccharolyticum, Appl. Microbio. Biotechnol. 36:337-343, 1991), los hipertermófilos (Adams, M.W., y R.M. Kelly, Enzimas a partir de Ambientes Extremos, Chemical & Engineering News, páginas 32-42, 18 de diciembre de 1995), el Streptomyces (Kusakae, I., R. Takahashi, \beta-mananasa de Streptomyces , Methods in enzymology 160: 611-614, 1998; Takahashi, R., I. Kusakabe, H. Kobayashi, K. Murakami, A. Maekawa y T. Suzuli, Purificación y algunas propiedades de la mananasa a partir de la Streptomyces sp., Agric. Biol.. Chem. 48:2189-2195, 1984) y especies de Bacillus (Araujo, a., y O.P. Ward, Hemicelulosa de las especies de Bacillus: estudios comparativos preliminares sobre la producción y propiedades de las mananasas y galactanasas, J. Appl. Bacteriol. 68:253-261, 1990; Akino y colaboradores, 1989, supra; Akino,. , T., N. Nakamura y K. Horikoshi, Caracterización de tres \beta-mananasas de un Bacillus sp. Alcalofílico, Agric. Biol.. Chem. 52:773-779, 1988; Emi y colaboradores, 1972, supra). También están disponibles comercialmente las mananasas del Aspergillus Níger (dos ejemplos son las Enzimas Solvay, Hemicelulosa y Novo Nordisk, Gamanasa ^{MR}.)

Una vez que se ha identificado la población microbiana como una fuente potencial de enzima de mananasa, basados en la capacidad para crecer sobre manan como la única fuente de carbono, se pueden identificar fácilmente los microbios individuales que secretan la mananasa por medio de sobreponer cultivos cultivados en cajas de Petri con manan modificado con tinta azul disuelto en soluciones de agarosa fundida. Desde que la agarosa se solidifica, los microbios que producen mananasa generan zonas claras aparentes provocadas por la difusión rápida de los fragmentos de manan etiquetados por tinta azul. Una vez que se identificaron, se usan los métodos estándares incluyendo el mejoramiento genético (Rowlands, R.T., Mejoramiento industrial de cepa: procedimientos de mutagénesis y clasificación aleatoria, Enzyme Microb. Technol. 6: 3-10, 1984) y la tecnología de fermentación, ambos bien conocidos en la técnica, para producir suficiente enzima para las pruebas. Una vez que se ha identificado la mananasa útil, se usan los mejoramientos de la cepa, los cuales podrían incluir la clonación y la expresión de gen, para mejorar adicionalmente la producción de enzima mediante los métodos de fermentación. En algunos casos, hasta podría ser recomendable clonar el gen de mananasa antes del subcultivo y purificación de las especies microbianas individuales que producen la mananasa. Se puede aislar el ADN directamente de fuentes naturales, clonarse dentro de vectores de expresión en, por ejemplo, E. Coli, seguidos por la clasificación de los clones recombinantes para la producción de la mananasa deseada (Robertson, D.E., E.J. Mathur, R.V. Swanson, B.L. Marrs, y J.M. Short, El descubrimiento de biocatalizadores nuevos a partir de la diversidad microbiana, SIM News, 46:3-8, 1996).

Una fuente alternativa de mananasa útil en esta aplicación, es a partir de una fuente botánica. Debido a que los mananos se usan frecuentemente como polímeros de almacenamiento en las semillas, ciertas semillas en germinación tal como la Mielga (Medicago sativa) o Guar (Cyamopsis tetragonolobus), son buenas fuentes de mañanazas (McCleary, 1988, supra). Se germanarían las semillas, después se procesarían para rendir una fuente concentrada de la enzima. De manera alternativa, se podrían cultivar las semillas completas en germinación dentro de una harina, para uso directo en el alimento. En este caso, las semillas podrían tener dos propósitos en el alimento, primero como una fuente de enzima de mañanaza, y en segundo lugar como una fuente de proteína y carbohidrato. Sin embargo, si las semillas en germinación tienen alguna otra propiedad anti-nutritiva que sea más fuerte que el efecto de la mañanaza, entonces probablemente ese tipo de semilla no sería significativamente útil en este método. También es posible diseñar plantas de manera genética para provocar que se produzca una mañanaza en sus frutos, semillas, tallos u hojas. Como un ejemplo de numerosos ejemplos que se podrían citar, se ha expresado una enzima extraña en la Brassica napus (van Rooijen G.J.H., y M.M. Moloney, Cuerpos grasosos de semilla de planta como portadores para proteínas extrañas, Bio/Technology 13:72-77, 1995), una planta de semilla de aceite comercial que se cultiva a gran escala. La ingeniería genética de planta es todavía otra fuente posible de la enzima de mañanaza bien conocida en la técnica, que se puede usar para la práctica de esta invención.

Todavía otro planteamiento para introducir la mañanaza en alimento en el tracto digestivo, y un modo preferido de esta invención, es modificar genéticamente el animal (es decir, cerdos, pollos o pavos), de manera que se sintetice la endo-1-\beta-D-mananasa en el tracto digestivo. Esto se logra mediante la introducción de un gen de mañanaza con una estructura alterada ta, que esté bajo el control de secuencias reguladoras de genes que codifican para las enzimas que se secretan dentro de diferentes partes del tracto digestivo, se puede dirigir la secreción de mananasa a diferentes lugares para optimizar su impacto. Se ha usado este tipo de tecnología transgénica, por ejemplo, para provocar la producción de proteínas heterólogas dentro de la leche en las glándulas mamarias de animales diseñados (Campbell, A.M., Tecnología transgénicas, Biopharm. 9:28, 1996; Velander, W.H., J.L. Johnson, R.L. Page, C.G. Russel, A. Subramanian, T.D. Wilkins, F.C. Gwazdauskas, C. Pittius, W.N. Drohan, Expresión de nivel elevado de una proteína heteróloga en la leche de cerdos transgénicos usando el ADNc que codifica la proteína humana C, Prc. Natl. Acad. Sci. 89:12003-12007, 1992; Hansson, L., M. Elund, A. Elund, T. Johansson, S.L. Marklund, S. Fromm, M. Stromqvist, Y J. tornell, Expresión y caracterización de la dismutasa de superóxido extracelular humana biológicamente activa en la lecha de ratones transgénicos, J. Biol.. Chem. 269:5358-5363, 1994).

Independientemente del método de fabricación o introducción dentro del trato digestivo, se debe probar la efectividad de cualquier mañanaza individual en este método en pruebas de alimentación de animales. Esta prueba se puede conducir de la mejor manera mediante un protocolo similar a aquel que se describe en detalle en los Ejemplos 1 y 2. De preferencia se debe determinar la cantidad de enzima que se agrega dentro de la prueba, de conformidad con el pH y las temperaturas cono se usan en la presente, aún si estas condiciones no son óptimas para las enzimas que se van a probar. Después, se utilizan 100 MU de enzima por tonelada de alimento.

Para los propósitos de esta invención, se dan las siguientes definiciones con respecto a ciertos aspectos de la tecnología que se usa durante el desarrollo de esta invención. Se considera que el manan es cualquier polímero de carbohidrato que se puede degradar de manera parcial o extensiva mediante la endo-1, 4-\beta-D-mananasa de la enzima. De esta manera, el término manan incluye los polímeros basados en \beta-1, 4-D-manan, tal como el galactomanan que tiene ramificaciones de galactosa enlazada 1,6 (cualquier otro azúcares de ramificación) en la estructura básica del polímero de 1,4-\beta-D-manan, o el glucomanan que tiene algunos residuos de 1,4-\beta-D-glucosa interdispersados en la cadena de polímero principal. Algunos ejemplos prácticos de mananos y sus fuentes, de conformidad con esta definición, incluye la goma de guar (Cyamopsis tetragonolobus), goma de algarroba, palma de tagua (marfil vegetal), manan e copra (palma), manan de salep, mana de café, mana de arveja (Ceratonia siliqua) (Whistler, R.L. y C.L. Samart, Polysaccharide Chemistry, Acedemic press, (1953)), harina de girasol, harina de alfalfa, (Tookey y colaboradores, J. Afr. Foods Chem. 10:131-133, 1962), harina de girasol y harina de dátil (Düsterhöft y colaboradores, J. Science Foor Agr. 59:151-160, 1962). Los galactomananos están esparcidos de manera amplia en la naturaleza., Por ejemplo, los galactomananos están presentes en el endosperma de la mayoría, pero no en todas, las semillas leguminosas (Ehistler y Samr. 1953, supra). Por lo tanto, se pronostica el efecto beneficioso por añadir una mañanaza efectiva con cualquier alimento que contenga una cantidad significativa de cualquier alimento que contenga una cantidad significativa de cualquier harina de semilla leguminosa que sea positiva para el manan del endosperma.

Para los propósitos de esta invención, también se describe la endo-1, 4-\beta-D-mananasa (E.C. 3.2.1.78) mediante otros nombres, tal como endo-1, 4-\beta-D- manosidasa de manan, o simplemente endo-mananasa, mananasa o hemicelulosa. Se define una mañanaza efectiva para las aplicaciones de alimento de animal como una proeparación de enzima (purificada o cruda), con la capacidad de reducir de manera enzimática la viscosidad de la gona de algarroba o soluciones de goma guar, y que sea efectiva para incrementar la conversión de alimentos en pruebas de alimentación controladas de manera científicia, usando dietas basadas en maíz/harina de semilla de leguminosa (por ejemplo, harina de frijol de soya), dietas como las describieron primero Fodge y Anderson (Fodge y Anderson, supra, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,429,828). La harina de frijol de soya es un producto comercial actual que se usa ampliamente y disponible principalmente cono una fuente de proteína en ditas de alimentación animal. La harina de frijol de soya está enriquecida por la proteína a través de la extracción del aceite de frijol de soya y la mayoría del hollejo, y actualmente es la fuente principal de manan en las dietas de alimentación animal altamente optimizadas. La harina de frijol de soya está disponible generalmente en una forma que es 44 por ciento proteína cruda, llamada SMB 44, ó 48 por ciento proteína cruda, llamada SBM 48 para los propósitos de esta invención. En los países en desarrollo, también están disponibles harinas de frijol de soya con contenidos de proteína menores de 44 por ciento.

Se pronostica la interacción positiva del efecto de la mañanas con dietas bajas en energía que se puede metabolizar para el mejoramiento del alimento, con dietas que contienen otras fuentes de manan, particularmente una fuente de manan a partir de otros miembros de la familia de las leguminosas, tales como chícharos, frijoles, lentejas, alfalfa y otros. La familia de plantas leguminosas para los propósitos de esta invención, es el nombre común que se usa para significar la familia Leguminosae o Fabaceae, también conocida comúnmente como la familia impulso de las plantas. Muchos miembros de esta familia, como los frijoles de soya, son ricos en proteína de alta calidad y contienen mana en su endosperma (Whistler y Smart, 1953, supra). Muchos son deseables como componentes de aliemntos y tienen valor mejorado a través de la práctica de esta invención.

Para los propósitos de esta invención, se puede obtener una unidad de endo-1,4-\beta-D-mananasa mediante los métodos de ensayo que se describen en la presente. Una dosis efectiva de mañanaza es equivalente a 100,000,000 unidades (100 MU) por tonelada de alimento. Hemicell® es la marca comercial registrada de una mañanaza efectiva para los propósitos de esta invención, pero se puede utilizar cualquier otra mañanaza efectiva en esta invención.

La energía que se puede metabolizar (ME) es la cantidad de energía (medida en kilocalorías/kilogramo) en el alimento que puede ingerir una animal. La energía que se puede metabolizar para un componente de alimento dado, varía de especie a especie del animal que lo consume. Se ha publicado el contenido aproximado de energía que se puede metabolizar de los ingredientes de alimentos comunes (Dale, N., Tabla de análisis de ingredientes: Edición 1995, Feedstuffs 67:24-39, 1995). Los nutriólogos de animales usan esta información cuando se formulan dietas balanceadas y cuando se vuelven a formular sobre una base de costos menores, ya que el precio y la disponibilidad de los componentes del alimentos varían. Para los propósitos de esta invención, se define la energía que se puede metabolizar de un alimento mediante la suma de la energía que se puede metabolizar (ME) suministrada por cada componente a niveles que se definen en la Tabla de Análisis de Ingredientes de Feedstuffs (Dale, 1995, supra), o versiones actualizadas de esta referencia.

Los requerimientos de aminoácidos esenciales del NRC para los propósitos de esta invención, son como se publicaron en el artículo de referencia de Feedstuffs, tanto para cerdo (Easter, R.A., J. Odle, G.R. Hollis y D.H. Baker, Asignaciones de nutrientes dietéticos para cerdos, Feedstuffs 67:40-46, 1995) y aves de corral (Waldroup, P.W. Asignaciones de nutrientes dietéticos para aves de corral, Feedstuffs 67:69-76, 1995). Se define el requerimiento en esta referencia en términos de la cantidad de aminoácidos requeridos por unidad de contenido de energía que se puede metabolizar de la dieta.

Para los propósitos de esta invención, se define la manipulación transgénica como la causante de la producción de una proteína en un animal a través de la aplicación de ADN recombinante. Se define el ADN recombinante como la manipulación in vitro del ADN, ya sea aislado a partir de fuentes naturales, o sintetizado completamente de manera química, seguido de la introducción dentro de un organismo para el propósito de su expresión subsecuente. Se define la mutación como el cambio de la secuencia de ADN de un gen mediante la mutagénesis, ya sea dirigida al área, dirigida al sitio o aleatoria, para los propósitos de esta invención.

Se mide fácilmente la endo-1.4-\beta-D-mananasa mediante cualquier método conocido; por ejemplo, mediante un ensayo de azúcar de reducción.

En un ensayo de azúcar de reducción ejemplar, se usan los siguientes materiales:

ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNS); Aldrich, > 98 por ciento puro

Fenol - grado de reactivo

Sal de Rochelle (potasio, tartrato de sodio, grado de reactivo

Hidróxido de sodio (NaOH)

Ácido clorhídrico (HCl)

Sulfito de sodio (anhidro)

Goma de algarroba (Sigma Chemicla Co., producto # G0753

Regulador de trishidroximetilamimometano (Tris)

D(+)-manosa, grado de reactivo (Sigma, producto # M-4625)

Tetraciclina-HCL

Baño de agua a 40ºC

Baño de agua hirviendo

Centrifugadora de la parte superior de mesa Sorvall

Microcentrifugadora (por ejemplo, Eppindorph, tubos de plástico de 1.5 mililitros)

Mezcladora de vórtice

Espectrofotómetro (para leer a 50 nm)

Medidor de pH

Tubos de vidrio de 16 x 100 milímetros

Tubos de vidrio de 13 x 100 milímetros

Barras de agitación magnéticas y placa magnética para agitar/calentar

Vasos de laboratorio, matraces volumétricos, botellas de almacenamiento

Balanza analítica

Dispositivo de pipeta variable (1 mililitro) con puntas desechables

Matraces desviados de agitación de 250 mililitros (Bellco)

Agitador de matraz de plataforma (New Brunswick Scientific)

Se puede usar el Reactivo de Ácido Dinitrosalicílico (DNS) como un reactivo. Para hacer 1 litro de una solución de cepa estable, se disuelven en agua los siguientes ingredientes.

NaOH	10 gramos (se agrega primero)
DNS	10 gramos
Fenol	2 gramos
Sal Rochelle	200 gramos

Se madura la solución 1 día antes de usarse y se almacena en la oscuridad. Se debe preparar una solución de trabajo diariamente, mediante la adición de 0.5 gramos/litro de sulfito de sodio anhidro a la solución cepa.

Se puede preparar el Sustrato de Goma de Algarroba (LBG, por sus siglas en inglés) a 5 gramos/litro mediante la adición lenta de goma de algarroba dentro de una solución de agitación rápida de Regulador Tris de 50 mM (pH 7,5) a la temperatura ambiente. Después de que se dispersa bien el polvo, se calienta lentamente la suspensión hasta que hierva y se hierve a fuego lento durante 1 hora con agitación rápida sobre una placa de agitación calentada para obtener un gel muy consistente, bien hidratado. Se debe asegurar que no haya terrones pequeños de gel no hidratado en la solución. Si hay algunos, se tiene que empezar de nuevo usando una adición más lenta de la LBG a la solución de regulador Tris. Se enfría a la temperatura ambiente y se ajusta la solución al volumen final deseado para dar 5 gramos/litro de goma de algarroba. Se agrega la tetraciclina-HCl (30 miligramos(mililitro) a la solución de goma como un preservativo. Se almacena a 4ºC cuando no se usa. Después de almacenar, se agita bien antes de usarse.

Se pueden obtener las Soluciones Estándares y la Curva Estándar mediante la preparación de una serie de soluciones estándares de D-(+)-manosa disueltas en agua en el rango de concentración de 0,1 a 0,5 gramos/litro. Se agregan 0,6 mililitros de cada estándar de manosa (por duplicado o triplicado), con 1,5 mililitros de solución de trabajo de ácido dinitrosalicílico en tubos de vidrio de 13 x 100 milímetros. También se incluye una reacción con alícuotas de 0,6 mililitros de agua como un blanco de reactivo para centrar el espectrofotómetro. Se calienta en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos, se enfría a la temperatura ambiente y se lee la absorbencia a 550 nm. El resultado esperado es una respuesta de dosis lineal entre 0,25 y 1,7 unidades de O.D. [Nota – En los ensayos de enzima (que se describen más adelante), solamente se usan los datos generados en el rango de 0,25 a 1,2 O.D. en los cálculos, ya que debido a la limitación del sustrato, la reacción de la enzima no es lineal más allá de este rango]. Se calcula la inclinación de la curva estándar (O.D. 550/gramos/litro de manosa) a partir de la porción lineal de la curva solamente.

Esta curva estándar variará con el Lote de reactivo de ácido dinitrosalicílito que se obtuvo. Si se anticipan diferentes ensayos, es aconsejable obtener un lote grande de ácido dinotrosalicílico cuando se compra.

En la Figura anexa se muestra una curva estándar típica. La inclinación de esta curva es igual a 4.706 O.D./gramos/
litro de manosa.

Se preparan las muestras mediante la dilución de muestras líquidas a aproximadamente 100,000 U/litro (0.1 MU/litro), en regulador de Tris-HCl de 20 mN (pH 7,5). Para una exactitud mejor, primero se determina la densidad de la solución de enzima, después se usa una balanza analítica para hacer las soluciones por peso, de manera muy exacta. Se extraen las muestras sólidas del alimento de animal, antes del ensayo. Se agregan 10 gramos de portador de enzima sólida a 10 mililitros de agua en un matraz de agitación no desviado de 250 mililitros y se mezcla a 200 rpm a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se transfiere algo de la solución del extracto a un tubo de la centrifugadora Eppindorph y se pasa por centrifugación (10.000 - 12.000 RPM) durante 2 minutos. Se remueve algo del sobrenadante del líquido transparente y se diluye dentro de un regulador de Tris-HCl de 20 mM (pH 7,5) hasta aproximadamente 0.1 MU/litro por ensayo.

En un ensayo de enzima, de preferencia todos los ensayos se hacen por duplicado o triplicado a cada nivel de dilución que se prueba. Se pesan 4 gramos de sustrato da goma de algarroba en tubos de vidrio de 16 x 100 milímetros y se llevan a 40ºC en un baño de agua. [Nota - pesar la solución de goma da algarroba es más exacto por su viscosidad hace difícil pasarla por la pipeta]. Se agregan 0,8 mililitros de solución de enzima, se agita vigorosamente con una mezcladora de vórtice, se vuelve a poner en el baño a 40ºC y se empieza el cronometraje. Se incluye un tubo con agua en lugar de la enzima, como un control para centrar el espectrofotómetro. Se debe mezclar la reacción de enzima aproximadamente cada 5 minutos e inmediatamente antes de tomar las muestras. A los 12, 18 y 24 minutos, se remueven alícuotas de 0,6 mililitros de la reacción y se agregan a 1,5 mililitros de reactivo de trabajo de ácido dinitrosalicílico, en un tubo de vidrio de 13 x 100 milímetros. Inmediatamente se pasa por el vórtice para detener la reacción. Se coloca en un baño de agua hirviendo durante exactamente 5 minutos. Se enfría a la temperatura ambiente, se pasa por centrifugación durante 10 minutos a 2.700 RPM en una centrifugadora de parte superior de mesa y se lee la densidad óptica (O.D., por sus siglas en inglés) del sobranadante, a 550 nm. Usando las lecturas que producen números en el rango lineal del ensayo (entre 0.25 y 1.2 O.D: 550), se calcula proporción de enzima como O.D./minuto.

Una unidad ChemGen para la manasa de Hemicell tiene una definición arbitraria que se definió originalmente a partir del método de viscosidad. Se eligió el tamaño de la unidad, basados en ciertas características de desempeño, y no se puede comparar de manera directa a otros métodos de ensayo sin el factor de conversión. Cuando se correlacionó el método de viscosidad con el método de azúcar de reducción que se describe aquí, 1 Unidad de CG produce 0.574 microgramos de azúcar de reducción/minuto a partir de la goma de algarroba. De esta manera, 1 CG MU produce 0.574 gramos de azúcar de reducción/minuto.

En términos prácticos, se puede realizar el cálculo de la siguiente manera.

\frac{O.D./min. \ (ensayo)}{O.D./g/litro \ de \ manosa \ (Curva \ Estándar)} = g/litro/min. de manosa

\frac{G/Litro/min \ de \ manosa}{0,094914 g/Litro/min./MU/Litro} = MU/Litro (en solución de ensayo)

Para la endo-1,4-\beta-D-mananasa- Líquida:

MU/Litro (en sol. de ensayo) X factor de dilu. = MU/Litro (sol. orig.)

Para la endo-1,4-\beta-D-mananasa-Seca:

MU/Litro (en sol. de ensayo) X factor de dilu. = MU/Litro (extrac. orig.)

MU/Litro (extrac orig.) X 0,1 Litro/0,01 kg = MU/Kg

También se puede obtener la endo-1,4-\beta-D- mañanaza mediante un ensayo de viscosidad.

Este método es un ensayo muy sensible para las actividades de tipo de mañanaza que hidroliza los enlaces manosídicos internos de la goma de algarroba. Se mide la reducción correspondiente en la viscosidad del sustrato, con un viscómetro calibrado y se usa para calcular la unidad de actividad que define CehmGen (Unidad CG). Se usa este ensayo cuando la actividad que se va a medir es baja, o cuando se necesita una exactitud elevada. Sin embargo, el procedimientos toma mucho tiempo.

De preferencia, se usan los siguientes materiales y aparato:

Viscómetro

Se usa un viscómetro tipo Canon-Fenske calibradode tamaño 100. Se suministra un viscómetro adecuado como el Número de Catálogo 2885-100 de Scientific Products, 1210 Waukegan Road, McGaw Park, I11., 60085.

Baño de Agua de Vidrio

Se usa un baño de agua de vidrio a temperatura constante, mantenida a 40ºC +/- 0.1ºC. Se suministra un baño adecuado como el Número de Catálogo W3520-10 de Scientific Products.

Dos cronómetros electrónicos

Medidor de pH

Vasos de laboratorio, matraces volumétricos (1000 mililitros, 500 mililitros)

NaOH, HCl

Glicina (grado de reactivo)

Mezcladora magnética/placa caliente y barras de agitación magnéticas

Pipetas de 10 mililitros, pipetas de 2.0 mililitros

Pipeta de 1,0 mililitro con puntas desechables (por ejemplo, Pipettman, Rainin Instruments)

Pipeta de 1,0 mililitro con puntas desechables (por ejemplo, Pipettman, Rainin Instruments)

Balanza analítica

Tubos de vidrio de 18 x 150 milímetros

Dispositivo de succión (diseñado para usarse con pipetas)

Mezcladora de vórtice de tubo

Papel aluminio

De preferencia, se usan los siguientes reactivos y soluciones en el ensayo de viscosidad:

A. Goma de algarroba (LGB)

Se puede usar la Goma de Algarroba en Polvo suministrada por Sigma Chemical Company. Las gomas de algarroba pierden viscosidad con el tiempo. Para resultados exactos, se debe preparar el sustrato fresco cuando menos una vez al mes. Para un buen sustrato, el T_{s} (ver más adelante) debe ser mayor de 110 segundos.

Se prepara la goma de algarroba a 2 gramos/litro (0,2 por ciento) mediante la adición lenta de la goma da algarroba dentro de un solución de agitación rápida de agua desionizada a la temperatura ambiente. Se agregan 2 gramos de goma de algarroba a aproximadamente 900 mililitros de agua desionizada de manera muy lenta, con agitación rápida sobre una placa de agitación. Después de que se dispersó bien el polvo, se calienta la suspensión lentamente hasta que hierva y se hierve lentamente mezclando rápidamente de manera continua, sobre una placa de agitación calentada durante una hora o más, para obtener un gel muy consistente, bien hidratado. Se debe asegurar que no haya terrones pequeños de gel no hidratado en la solución. Si hay algunos, se tiene que empezar de nuevo usando una adición más lenta de la LBG a la solución de agua se enfría a la temperatura ambiente y se ajusta la solución al volumen final deseado mediante la transferencia cuantitativa a un matraz volumétrico de 1000 mililitros, se diluye hasta el volumen con agua, y se mezcla. Después del almacenamiento, se mezcla bien antes de usarse. El pH del producto final deberá estar cerca de un pH de 6.

B. Regulador de Glicina, 2M (pH 9,0)

Se disuelven 75 gramos de flicina en 450 mililitros de agua desionizada, se agregan NaOH de 5 N con mezclado continuo, hasta que el pH sea de 9,0 +/- 0,05 por unidad, según se determinó mediante un medidor de pH. Se transfiere de manera cuantitativa a un matraz volumétrico de 500 mililitros y se diluye al volumen con agua. Se verifica el pH de 9,0 en la solución final.

C. Preparación de la Muestra

Se prepara una solución de la muestra en agua desionizada, de manera que 0,5 mililitros de la solución final produzcan un cambio en la fluidez relativa (F_{R}), entre 0,035 y 0,045 por minuto bajo las condiciones que se especifican en el Procedimiento más adelante. Esto corresponde a la actividad en el reango de aproximadamente 1850 a 2400 CG U/litro en la muestra. No se garantiza la linealidad del ensayo fuera de este rango de actividad. Para muestras líquidas, se hacen diluciones en agua usando una balanza analítica para medir la enzima y el agua que se agrega, para una mejor exactitud.

Para las muestras que se extraen a partir de sólidos, se pasa por centrifugación o se filtra para remover los sólidos que pudieran obstruir el fino calibre del viscómetro.

Para realizar el procedimiento y el cálculo, se limpia de manera escrupulosa el viscómetro por medio de extraer una gran volumen de solución de detergentes (si es necesario remover residuos adherentes), seguido por agua, a través del instrumento y colocar el viscómetro calibrado previamente en el baño de agua de vidrio a 40ºC en una posición exactamente vertical. Estos pasos son necesarios entre cada medición.

Determinar T_{W}

Se pasan por pipeta 10 mililitros de agua desionizada en el depósito del viscómetro y se permite reposar unos cuantos minutos para equilibrar la temperatura. Se lleva el agua hacia arriba dentro del viscómetro pasando la marca superior. Se permite que fluya de regreso la solución, iniciando un cronómetro cuando el menisco cae pasando la marca superior y detine el cronómetro cuando el menisco cae pasando la segunda marca. Se repite la medición varias veces. Se define el tiempo promedio como el T_{W} (tiempo de efusión para el agua).

Determinar T_{S} y Velocidad de Control

Se colocan 10 mililitros del sustrato de LEG en un tubo de vidrio de 18 x 150 milímetros, se agregan2 mililitros de regulador de glicina de 2,0 M (pH 9,0), se mezcla, se tapa con papel aluminio y se coloca en agua a 40ºC durante unos pocos minutos para calentar. Se agregan 0,5 mililitros de agua, se mezcla rápidamente con una mezcladora vórtice, e inmediatamente se inicia el primer cronómetro. Se pasan por la pipeta 10 mililitros de la solución al depósito del viscómetro, se permite un minuto para equilibrar, después se lleva la solución hacia arriba y se determina el tiempo de efusión con el segundo cronómetro, esto será el T_{S} (registrado en segundos). Cada vez que se determina el T_{S}, se registra el tiempo transcurrido (T_{R}, tiempo de reacción, registrado en minutos digitales) en el primer cronómetro, cuando el menisco cae pasando la marca superior. En el caso ideal, el T_{S} no cambiará, indicando que no hay pérdida de control de la viscosidad. En este caso, el T_{S} para los cálculos, debe ser el promedio de las determinaciones. En algunos casos, sin embargo, existe una velocidad antecedente. Para las velocidades antecedentes, se tratan los valores de efusión del sustrato como valores de T_{T} para el cálculo con los valores de T_{R} correspondientes, para calcular una velocidad antecedente como se describe más adelante. El primer tiempo de efusión que se midió después del inicio, se usa como T_{S} en este caso cálculo de la velocidad antecedente. Algunos lotes de sustrato pueden llegar a contaminarse con pequeñas cantidades de actividad de tipo mañanas. Si se miden más de 500 U/L o si la T_{S} inicial es menor de 100 segundos, es mejor preparar una solución de sustrato nueva.

Proporción de Enzima

Se colocan 10 mililitros del sustrato de goma de algarroba en un tubo de vidrio de 18 x 150 milímetros, se agregan 2 mililitros de regulador de glicina de 2,0 M (pH 9,0), se mezcla y se coloca en el agua a 40ºC durante unos cuantos minutos para calentarse. Se tapa el tubo con papel aluminio para evitar que la evaporación del agua antes de su uso. Se agregan 0.5 mililitros de solución de enzima, se mezcla rápidamente con una mezcladora vórtice, y se inicia de inmediato el primer cronómetro para determinar los valores del T_{R}. Se pasan por pipeta 10 mililitros de la solución al depósito del viscómetro, se permite un minuto para equilibrar, después se lleva la solución hacia arriba. Cuando el menisco pasa la marca superior, se registra el T_{R} en el primer cronómetro y se empieza a determinar el tiempo de efusión con el segundo cronómetro, este será el T_{T}. De inmediato se vuelve a llevar la solución sobre la marca superior para obtener un T_{T} en un segundo T_{R}. Se continúan repitiendo las determinaciones, hasta que ha transcurrido un período de aproximadamente 15 minutos después de la última medición de T_{R}. Se recomiendan cuando menos cuatro puntos de tiempo.

Para realizar el cálculo requerido, se usan los datos para calcular la fluidez relativa (F_{R}) y el tiempo de reacción normalizado (T_{N}), el cual es T_{R} más la mitad del tiempo de efusión correspondiente. Se hacen los cálculos como sigue:

F_{R} = (T_{S} - T_{W}) / (T_{R} - T_{W}),

Y

T_{N} = 0,5 (T\gamma /60 \ s \ /min) + T_{R} = (T\gamma /120) + T_{R}

Se trazaron las fluideces relativas (F_{R}) como la ordenada contra cuatro tiempos de reacción (T_{N}) como la abcisa. Se deberá obtener una línea recta. La inclinación de la línea corresponde al cambio de fluidez relativa por minuto (F_{R}/min.), y es proporcional a la concentración de la enzima. Usar la inclinación a través de una serie de puntos, es un mejor criterio de actividad de enzima que usar un solo valor de fluidez relativa. De manera ideal, el cambio de fluidez relativa debería ser de aproximadamente 0,04/minuto. Si existe una degradación de sustrato antecedente en la reacción, el trazo no será lineal en el parte inicial del trazado. Se usan los datos después de que la línea se hace lineal, para determinar la inclinación. Generalmente usamos el programa de hoja dispersada de Lotus para trazar y calcular los otros cálculos necesarios para obtener las unidades.

CG/Litro = 9.397 x 10^{4} X F_{R} / min. De esta manera, se calcula la concentración original de enzima muestra como:

CG U/L (muestra orig.) = (1CG U/L - Control de Sustrato U/L) X factor de dilución

También se puede ensayar la endo-1,4-\beta-D-mananasa usando un ensayo de tinta azul.

De conformidad con este ensayo, se prepara un sustrato de enzima, de referencia usando el procedimiento (Methods in enzymology 160:538, 1988) que se describe para la producción del RBB (azul brillante de remisol) -xilano que se adaptó APRA unir la tinta azul RBB a la goma de algarroba. Se modificó el procedimiento mediante la adición de goma da algarroba (LGB) al 0.7 por ciento y tinta al 0.07 por ciento dentro de la reacción inicial. También, después de la reacción con RBB en acetato de sodio e hidróxido de sodio, se pasó por diálisis la solución de goma algarroba entintada para remover la sal, antes de la precipitación con etanol. Esto facilitó la resuspensión de la goma después de la precipitación. Se puede precipitar la goma fijada con tinta con un volumen de etanol a la temperatura ambiente, más bien que con dos volúmenes sobre hielo, como se usó en el procedimiento del xilano.

Se disuelven 3,5 gramos de azul brillante de remisol goma de algarroba en un litro de Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5, mediante la adición lenta de polvo seco a un regulador de pH agitado rápidamente. Se calienta con agitación hasta que hierva, después se pone en la autoclave durante 20 minutos a 121ºC y se enfría a la temperatura ambiente. Se pasa por centrifugación para remover el material no disuelto. Se vacía el sobrenadante dentro del tubos adecuados, después se pone nuevamente en la autoclave. La solución es estable durante cuando menos seis meses, si no se introduce contaminación microbiana dentro de la botellas. El blanco de reactivo en el ensayo (ver más adelante) deberá dar una densidad óptica (OD) de menos de 0,15 cuando se lee contra etanol al 70 por ciento. Si la densidad óptica es mayor, se desecha el reactivo de azul brillante de remisol-goma de algarroba.

Protocolo del Ensayo

A. Hacer diluciones apropiadas de las muestras y estándares en agua no clorada Para la curva estándar, se hacen diluciones que tengan aproximadamente 1,5, 2,0 y 2,5 MU/Litro, usando una enzima estándar que se determinó previamente mediante el método de azúcar de reducción. Se deben diluir las muestras de prueba, de manera que la actividad caiga entre el rango de 1,5 a 2,5 MU/Litro. Para mejores resultados, se hacen las diluciones usando matraces volumétricos y una balanza analítica para determinar de manera exacta la cantidad de solución de enzima que se agregó.

B. Se distribuyen 0,54 mililitros de reactivo de azul brillante de remisol-goma de algarroba dentro de tubos de microcentrifugadora de 1,5 mililitros, y se colocan los tubos en una baño de agua a 40º durante cuando menos 10 minutos.

C. Para hincar la reacción, se agregan 20\muL de enzima y se mezcla por medio de pasar por el vórtice. Se incuba mcada muestra durante exactamente 10 minutos. Se deben probar las muestras por duplicado para mejores resultados.

D. Se detiene la reacción mediante la adición de 0,9 mililitros de etanol absoluto (alcohol reactivo) y la mezcla profunda. Se permite que reposen los tubos a la temperatura ambiente durante cuando menos 10 minutos.

E. Se pasan los tubos pro centrifugación a 8.12000 RPM en una centrifugadora, durante tres minutos.

F. Se lee la densidad óptica a 590 nm usando un blanco de reactivo tratado exactamente como las muestras de prueba anteriores, usando 20 \muL de agua en lugar de la enzima, para centrar el espectrofotómetro.

G. Se traza la densidad óptica de 590 nm que se observó para los estándares, contra la actividad en MU/Litro en los estándares diluidos y se determina la inclinación.

Cálculo

La actividad en las muestras (MU/Litro) = OD 590 nm x inclinación x factor de dilución de la muestra.

A continuación se describe adicionalmente la presente invención, por medio de la referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1 Método de Prueba de Corral de Crecimiento de Pollos

Se criaron pollos tiernos comerciales (50/50 machos/hembras Peterson X Arbor Acres) provistos por la ConAgra Hatchery, Hurlock, Maryland, con 70 aves por corral desde el día 1 hasta el día 45, y se enviaron al sitio de prueba en el día de salieron del cascarón. Se vacunaron todos los polluelos y se trataron como normales en el criadero. La densidad fue de 0,076m^{2} por ave, usando corrales de 1,5 x 3,6 m, en tamaño. La construcción fue una estructura de madera/bloque de concreto calentada con la calefacción con aire a presión (más lámparas de calor la primer semana) y luz incandescente. Se verificó la temperatura diariamente y se mantuvo a 32ºC durante los primeros 3 días, después se redujo 17ºC por día, hasta que se alcanzaron 52,2ºC y se mantuvo hasta el final de la prueba. Se mejoró el intercambio de aire mediante ventiladores con un retardo de tiempo que transcurrió en promedio entre 1-4 minutos cada 10 minutos. Se condujo la prueba desde el 31 de octubre de 1995 hasta el 15 de diciembre de 1996 en la costa este de Maryland.

Se prepararon los alimentos usando los requerimientos típicos conocidos en la industria de la avicultura y las especificaciones comerciales. Se mezcló todo el alimento para la pruebas completa y se hizo píldoras a aproximadamente 175ºC. Todo el alimento que se utilizó en el experimento se preparó al mismo tiempo e igualó o excedió los requerimientos nutricionales establecidos por el National Research Council (Nutrient Requirements of Poultry, 9ª. Edición Revisada, EAU; National Research Council, 1994). Se tomó una parta de la mezcla de control para la adición de la enzima por medio de rociarla de manera uniforme con el concentrado líquido. El alimento iniciador para los días 0 a 21 fueron píldoras desmenuzadas. Los alimentos de crecimiento y los terminadores se usaron como píldoras completas.

Inicialmente se atrapan y se pesan veinticinco polluelos. Se determinó el peso medio y se estableció un rango de cinco gramos cerca del medio. Se escogieron de manera aleatoria los polluelos con pesos dentro de este rango y se dividieron en 70 por corral. Se usó un total de 3,840 polluelos machos y hembras (50/50) en el experimento. Se verificaron todos los corrales tres veces al día durante el estudio. De manera más específica, se verificaron la disponibilidad de alimento y agua, el mantenimiento de temperatura, y la condición general de los polluelos y la camada. Durante los primeros siete días del experimento, se reemplazaron los polluelos que murieron, a partir de un grupo de aves que se mantuvieron separadas con sus dietas respectivas y escogidas aleatoriamente.

Los ocho corrales para cada uno de los diferentes tratamientos se pusieron al azar a través de todo el edificio para eliminar cualquier predilección posible provocada por la ubicación física de los corrales en el edificio. Se recolectaron los siguientes datos durante la prueba:

1. Los pesos corporales individuales en el día 21 y el día 45. Eficiencia del alimento en el día 21 y el día 45.

2. Se calculó la eficiencia de la alimentación como la proporción alimento/ganancia. La ganancia fue la suma de los peses del ave viva, así como el peso de cualquier ave muerta en el día en que murió. Se determinó el peso del alimento mediante la adición de cantidades conocidas de alimento a cada corral, y la sustracción del peso de cualquier alimento que no se haya comido, dejado en el corral en el momento de pesar a las aves.

3. El análisis de mortalidad incluyó la mortalidad total, así como el día de la muerte.

4. Se calcularon las desviaciones estándares y los coeficientes de variación para los pesos corporales individuales, en el día 21 y el día 45.

5. Otras observaciones de las aves incluyeron el plumaje y la apariencia física.

6

No hubo diferencias significativas que se hayan observado entre ninguno de los grupos con respecto a la mortalidad, plumaje o apariencia física. En la Tabla 5 anterior se resumen los resultados y en el Ejemplo 6 (Tabla 8), se muestran los detalles de las preparaciones dietéticas. En las Tablas 6 y 7 se dan los detalles de los datos.

7

En las Tablas 6 y 7, se asignan los grupos de tratamiento como sigue:

T1	=	3229 Kcal/Kg, sin enzima
T2	=	3229 Kcal/Kg, más enzima
T3	=	3085 Kcal/Kg, sin enzima
T4	=	3085 Kcal/Kg, más enzima

Ejemplo 2 Detalles de las dietas que se usaron en las pruebas de corral para valorar la interacción de la energía dietética y la mañanaza

La tabla 8 proporciona una descripción detallada de las dietas que se usaron en la prueba de corral que se describe en el Ejemplo 4. Los ingredientes son bien reconocidos por cualquier experto en la técnica de la nutrición animal. La dieta iniciadora se usó en los días 0-21, la dieta de crecimiento, en los días 22-39 y la dieta terminadora, en los días 40-45.

8

Ejemplo 3 Sistema de rociado para la aplicación de la enzima a píldoras de alimento en un molino de alimento de aves de corral

En muchos casos, podría ser preferible rociar la enzima sobre las píldoras de alimento que se formaron previamente, si se usan temperaturas extremas durante la formación de las píldoras. En algunos lugares, se usan tiempo y temperaturas de calentamiento durante la formación de píldoras que esencialmente cocinan el alimento y por lo tanto, desnaturaliza la mayoría de las enzimas efectivas en este método.

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de un sistema de bombeo para recubrir el alimento con la enzima. La bomba es una bomba de diafragma de dos cabezas (Duriron #E2-(16) (07) 115-68A31), que se usa para bombear el agua y la endo-1,4-\beta-D-mananasa en aproximadamente una proporción de 9 a 1 dentro de una salida común. La mezcla fluye más allá de un amortiguador de impulso (Blacoh #A301N) y se usa una válvula de solenoide (Asco #EF8210G87) para evitar el flujo de agua mientras se apaga la bomba. Un medidor de flujo (King Instruments, serie 7511, permite la inspección visual de las velocidades del flujo del líquido y el color de la solución de enzima diluida en agua.

Se usa el interruptor de presión ajustable (Omega #PSW121) para detectar cualesquiera bloqueos de la línea y se apaga de manera automática si se excede el ajuste de la presión. El ajuste que se usa depende de la altura de la salida de la enzima en relación con la bomba, y es generalmente ligeramente mayor que la presión que se crea mediante la altura de la cabeza. Se proporcionan válvulas para permitir el muestreo líquido y la cebación del lado de la endo-1,4-\beta-D-mananasa de la cabeza de la bomba. Se reduce la presión de agua del alojamiento a 15 10,2 kPa, antes de bombear mediante el regulador de presión del agua. Se puede presurizar el tanque o tambor de almacenamiento de la endo-1,4-\beta-D-mananasa, a 2 13,6 kPa con el regulador de aire, para evitar la pérdida del cebador de la bomba.

Se proporciona la mezcla en el tanque de almacenamiento a 1000 MU/Litro y se aplican 100 MU a cada tonelada de alimento. Se ajusta la velocidad del flujo de agua a 900 mililitros por tonelada de alimento, usando el ajustador de longitud de palada. Después se ajusta la velocidad del flujo de la endo-1,4-\beta-D-mananasa en el otro lado de la bomba, a 100 mililitros/tonelada. Se verifica la velocidad mediante la medición de la velocidad del concentrado de la enzima que está saliendo del tambor o tanque de almacenamiento. De esta manera, después de la dilución en agua, se aplica aproximadamente 1 litro de enzima líquida diluida a cada tonelada de alimento, añadiendo solo aproximadamente 0,1 por ciento de humedad. En un modo preferido. Se aplica la enzima al alimento a través del equipo de revestimiento de grasa del molino ya existente, conocido como roto-revestidor fabricadas por APEC (Automatec Process Equipment, Co., Laural Drive, Lake Odessa, Michigan, 48849). Típicamente, la enzima se pasará por tubos al mismo lugar en donde la grasa cae sobre un plato giratorio que la dispersa sobre una cortina delgada de alimento que cae alrededor del plato a una velocidad uniforme. Usualmente, el equipo de revestimiento de grasa se encuentra en la parte superior del molino. El cambio de elevación crea suficiente presión en tubo que contiene la enzima diluida, para asentar de manera apropiada las válvulas de verificación de la bomba para su operación normal.

Se corre la señal de la computadora del molino a través del lado normalmente cerrado del interruptor de presión al iniciador del motor, la luz del piloto y la válvula de solenoide. Por lo tanto, cuando al molino empieza a hacer el alimento, el sistema de bombeo se enciende automáticamente, a menos que haya una situación de sobre presión.

Se llevan las muestras de alimento a donde se cargan dentro de recipientes o carretones para la verificación del nivel de enzima. El método de ensayo que se usa es conocido en la técnica como se describió anteriormente. Se consigue el éxito de la aplicación cuando el nivel medio de la enzima es de 100 MU/tonelada, y el coeficiente de variación (CV) es menor del 15 por ciento. La Figura 2 muestra un ejemplo de una aplicación de enzima exitosa sobre un período de varias semanas, en un molino de alimento que puede producir hasta 50 toneladas de alimento en píldoras por hora.

Claims (6)

1. Una composición de alimento que comprenda una harina de semilla leguminosa; (b) aminoácidos esenciales y (c) una enzima de hemicelulosa, en donde la composición de alimento tiene una cantidad de grasa concentrada añadida menor del 2%, y un contenido total de energía que se puede metabolizar de menos de 3086 Kcla/Kilogramo.

2. Una composición de alimento de conformidad con la Reivindicación 1, en donde la harina de semilla leguminosa es harina de frijol de soya.

3. Una composición de alimento de conformidad con la Reivindicación 1, en donde dicha enzima de hemicelulosa es una mañanasa.

4. Una composición de alimento de conformidad con la Reivindicación 3, en donde la mañanaza es la endo-1,4-\beta-D-mananasa producida por el Bacillus lentus, designado ATCC 55045.

5. Una composición de alimento de conformidad con la Reivindicación 1, en donde la composición de alimento sustancialmente no incluye grasa concentrada.

6. Una composición de alimento de conformidad con la Reivindicación 1, en donde el contenido de grasa concentrada agregada, es menor del 1 por ciento.