CN1169251A

CN1169251A - 半纤维素酶在低热焓饲料中的应用

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Publication number: CN1169251A
Application number: CN96107126A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·W·福吉; H·Y·肖
Original assignee: CHEM GEN CORP
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1998-01-07
Anticipated expiration: 2016-06-21
Also published as: DE69727805T3; DK0906030T4; IL126848A0; DK0906030T3; EP0906030A1; ES2216143T3; IL126848A; EP0906030B2; CA2253806C; CN1092495C; WO1997041739A1; MX9809162A; ATE260046T1; CA2253806A1; ES2216143T5; EP0906030A4; BR9710962A; DE69727805D1; AU2722597A; MX215829B

Abstract

一种提高单胃动物利用低热量食料的效率的方法。通过在不补充脂肪或含低脂肪量的食料中添加半纤维素酶如甘露聚糖酶来提高单胃动物利用该食料的效率。

Description

半纤维素酶在低热焓饲料中的应用

本发明涉及饲养单胃动物的方法，更具体地说，涉及使用一种或多种半纤维素酶如甘露聚糖酶的方法，通过此方法可减少为得到或增加用含酶的低热焓食物喂养的动物的体重增加(增重)所需的饲料。

世界人口在持续增长，但用于粮食生产的土地却是有限的。参见J.E.Cohen，Discover 17：42-47(1996)。为跟上不断增长的粮食需要，需要对食物源的利用进行改进，以维持目前的生活水准。已提出的一种提高有效利用率的方案是使用酶来促进饲料的消化。参见Chesson，A.，Supplementary enzymes to improve the utilization ofpig and poultry diets，pp71-89。该文收集在Haresign，W.andD.J.A.Cole(eds)，Recent Advances in Animal Nutrition-1987，Buttervorths，London中。酶助消化不仅可由每磅饲料得到更多的食用肉，而且还可减少牲口粪量和处理成本。

对四类酶在动物饲料中的价值已在市场上得到明确的肯定。在含小麦、黑麦或黑小麦的食物中，加入木聚糖酶(内-1，4-β-D-木聚糖水解酶，E.C.3.2.1.8)已被证明是有益的。参见Pettersson等，British Journal of Nutrition 62：139-49(1989)。在小麦、黑麦和大麦/黑麦杂交的黑小麦胚乳细胞壁中存在大量的非淀粉的多糖即阿拉伯木聚糖。阿拉伯木聚糖不被单胃动物消化，但可被微生物的木聚糖酶水解。

广泛应用于饲料中的酶的另一个例子是β-葡聚糖酶〔纤维素酶，内-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶E.C.3.2.1.4；或内-1，3-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶E.C.3.2.1.6〕，该酶被证明对含大麦和燕麦的食物尤其有益。参见Rotter等，Nutrition Re-port International 39：107-120(1989)。除了会影响消化，葡聚糖还会引起湿粘性粪便，从而会诱使家禽胸部起疱。在实践中，木聚糖酶和β-葡聚糖酶被同时施用，因为阿拉伯木聚糖和葡聚糖均存在于谷物之中。参见Pettersson等，Animal Production 51：201-20(1990)。

能从植酸即肌醇六磷酸分裂出磷的酶的应用是酶在动物饲料中的有益应用的第三个例子。参见Simons等，British Journal of Nu-trition 64：525-40(1990)。在单胃动物中，磷酸盐不是在消化过程中由肌醇六磷酸释放出来的，而是通过微生物作用，释放在粪便中。在典型的饲料中，肌醇六磷酸的含量很高。由于含磷酸盐的下水会引起附近的江湖海湾的季节性缺氧，已成为粪便处理过程中的一个问题。加入植酸酶可降低粪便中的磷酸盐含量并大大减少往食物中添加磷酸盐的需要。

甘露聚糖酶是另一种已在以玉米和大豆为基料的食物中得到商业性应用的酶。用含甘露聚糖酶的食物饲养的单胃动物对得到或增加增重所需的饲料减少，就以玉米为基料的食物而言，这是未曾预料到的。在发现细菌的内-1，4-β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78，也称为人内-1，4-β-甘露糖苷酶，参见McCleary，B.V.，β-D-Mannase，Methods in Enzymology 160：596-609，1988)可提高玉米-大豆类食物的饲料效率以前，很少在用玉米-大豆类食物饲养的家禽或猪的饲料中使用酶。本文引作参考的美国专利No.5,429,828给出了一种通过在食物中添加半纤维素酶，尤其是甘露聚糖酶来改善含半纤维素的动物饲料的能量效率的方法。

添加内-1，4-β-D-甘露聚糖酶在饲养效率上的正面效应对以玉米为基料的食物是未曾预料到的。在含混合交联的葡聚糖的大麦和燕麦中，或在含阿拉伯木聚糖的小麦、黑麦和黑小麦中，抗营养聚合物占种子胚乳的很大部分。相反，在普通的以玉米为基料的食物中，只存在很少量的以1-4-β-D-甘露聚糖为基本成分的聚合物。在典型的以玉米为基料的食物中，半乳甘露聚糖的主要来源是大豆粉(主要是作为蛋白质源而添加的)。根据总糖量分析和非淀粉多糖百分比，大豆粉可含1.3％数量级的甘露聚糖。因此，包含30％大豆粉的食物仅含约0.4％甘露聚糖聚合物。由这很小百分比的食物的完全消化而产生的附加的能量并不能解释在饲料换算和增重方面出现的显著改善。

在世界的许多地方，人们利用含低的可代谢能含量的食物口粮。在这些国家，并未用脂肪补充食物口粮。其结果，为利用低脂肪食物，需要提高能量效率。在发展中国家或发达国家里，出于健康方面的原因，补充的浓缩脂肪正被从食物中除去。另外，存在惊人数量的与为增加饲料的可代谢能(ME)含量而在食物口粮中添加浓缩脂肪有关联的问题。(Rouse，R.H.，Fat quality，the confusing world offeed fats，pp55-63In：Proceedings of the 1994 Maryland Nutri-tion Conference，March 24-25，Baltimore，MD，University ofMaryland Feed Industry Council，College Park，MD)。

现在已知道脂肪中的不饱和脂肪酸的氧化可导致过氧化物和自由基的形成。这反过来导致饲料营养成分和维生素的氧化。还有证据表明，高脂肪食物可导致雏鸡产生心室障碍和/或腹水问题(Mullins，T.M.and W.W.Saylor，Effects of a high fat diet ongrowth，right ventricular hypertrophy，right ventricular failure，and ascities formation in broiler chickens，Abstract 25，pll，South-ern Poultry Science Society，16^th Annual Meeting，Jan 16-17，1995，Atlanta，Georgia)。动物饲料脂肪的一些来源包括饭店的废弃脂肪，这种废脂肪已被部分氢化，从而产生可影响动物的生育力、脂肪酸代谢和饲料能量值的具有反式双键的非天然脂肪酸(Rouse，见前)。另一个问题是市售的脂肪中的游离脂肪酸的存在可对生殖产生不利的影响并可能在鸡内脏产生抗菌效果(Rouse，见上)。混合脂肪也经常被PCBs、杀虫剂残留物、重金属和来自棉籽油皂脚的棉酚污染(Rouse，见上)。饲料加工业主不得不对这些问题保持警惕。摄入的脂肪(和溶于其中的物质如PCB)可被直接掺入将其消费的动物的脂肪中并可能会存在重大的健康风险已是众所周知的。另外，动物口粮中的脂肪会影响食用肉的口味。例如，鸡的食物中加入1％以上的鱼油会使鸡肉或鸡蛋产生明显的鱼类气味。(Lesson，S.，and J.D.Summers，Chapter 2：Ingredient evaluation and diet formula-tion，(In)Commercial Poultry Nutrition，University Books，Guelph，Ontario，1991)。高脂肪含量(尤其是动物脂肪)对产品口味的影响是一些厂商开始密切关注的另一个问题。避免使用脂肪且仍能得到相同的生产率的能力具有普遍的意义。

目前仍然存在对食品生产的更高效率的持续需求，并且，寻找解决方案的紧迫性正随着时间而日益增加。使用为促进动物的高效生长而含数百分比的脂肪的高能食物由于脂肪或植物油的高成本、或在世界的一些人口最密集的地方(例如中国或印度)，可利用的动物脂肪的数量有限，而并非总是可能或可行的。在使用可利用的脂肪作为饲料中的能量方面，存在基本的低效率。例如，在化学和制皂工业，脂肪具有更大的使用价值。最后，存在一系列与在动物食物中掺入外源性浓缩脂肪有关联的健康问题和难题。这些问题进一步表明，迫切需要保持高饲养效率的低脂肪、低热量的动物饲养食物。

因此，需要一种可提高单胃动物利用含低的可代谢能含量的饲养口粮的效率的方法。同样地，需要一种可被单胃动物有效利用而不需要添加脂肪的食物口粮。

因此，本发明的目的在于提供一种提高单胃动物利用含低的可代谢能含量的饲养口粮的效率的方法。

本发明的又一个目的在于提供可被单胃动物有效利用而不需要添加脂肪的饲养口粮。

按照本发明的一个实施例，这些和其他目的通过提供一种包含下述组分的饲料组合物而达到：(a)豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纤维素酶，其中，所述饲料组合物的总可代谢能含量小于3086千卡/公斤。

本发明的另一个实施例是一种包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纤维素酶的饲料组合物，其中，所述饲料组合物的总可代谢能含量小于3086千卡/公斤。

本发明的又一个实施例是一种包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的饲料组合物，其中，所述饲料组合物的总可代谢能含量小于3086千卡/公斤。

本发明的又一个实施例是一种包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的饲料组合物，其中，所述饲料组合物的总可代谢能含量小于3086千卡/公斤且基本不含脂肪。

本发明的又一个实施例是一种包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的饲料组合物，其中，所述饲料组合物的总可代谢能含量小于3086千卡/公斤且含小于2％的总粗脂肪。

图1是本发明的应用内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的用于饲料加工的双头式泵的流程图。

图2是本发明的以高至每小时50吨颗粒饲料的生产速度进行饲料生产的成功的酶应用例。

任何半纤维素酶，包括任何甘露聚糖酶，更具体地说，内-1，4-β-D-甘露聚糖酶可用于本发明，所述内-1，4-β-D-甘露聚糖酶对减少为得到或增加消费低脂肪食物的动物的增重所需的饲料有效。作为一个例子，一个较佳的酶源是商品名为Hemicell^的Bacillus lentus(ATCC 5045)内-1，4-β-D-甘露聚糖酶(Fodge and Anderson，见上；Fodge，Anderson and Pettey，见上)。

当评价由酶产生的附加值时，“点”系统被经常使用，“点”系统是“体重”点(Pw)与“饲料转换，FC”点(P_FC)之和。FC由消费的饲料重量除以活重而算出。两种点的定义如下：

P_W＝(试验体重-对照体重)/0.06磅(在45天)

P_FC＝(对照FC-试验FC)/0.01

用Hemicell^在美国进行的绝大多数饲料试验中，观察到的鸡的改善与Fodge And Anderson(见上)报道的结果具有相等程度。在火鸡和猪身上也观察到类似结果(数据未显示)。

有时，由使用内-1，4-β-D-甘露聚糖酶而观察到的改善会大大超出事先的预期。因此，由本发明者之一在中国的四个不同地方进行了试验。参见Jia，J.R.，H.R.Zhang，Z.C.Liang，T.Li and F.R.Meng，Application of endo-1，4-β-mannanase in Feed Industry，Zhongguo Siliao(China Feed)24：19-21(1995)。计算四个试验的结果的平均值，使用内-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，出现24.6点的改善。Jia等的数据归纳在表1中。

对在中国的试验中使用的食物和典型的美国食物之间出现的差异进行了检查。根据这些差异，进行了一些精心控制的科学试验以调查产生更大的β-甘露聚糖酶冲击的原因。未预料到的结果是口粮的脂肪信号或千卡含量是增强内-1，4-β-D-甘露聚糖酶效果的关键，详见下述。

表 1

在中国的皱鸡栏饲试验中的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的效果

(Jia，R.J.，等，1995)

地域受试鸡数测试时间平均增重增重所需总点数饲料的减少 P_W+P_FC北京 2,000 52日 0.472 0.17 24.8山东青岛 2,400 56日 0.419 0.30 36.9江苏连云港 4,700 29日 0.220 0.09 12.7山东潍坊 4,000 49日 0.417 0.17 23.9

将甘露聚糖酶浓度调至1000MU/l，通过还原糖法加以确定。酶的浓度也可以确定，例如有粘度法或基于蓝色染料的检测方法。蓝色染料法一般被用作监测发酵进程的快速分析法，而还原糖法一般被用作最终产品和饲料样品的质控分析法。最终产品具有的pH被调至7.0～7.5间，酶溶液由于150g/l氯化钠的添加而对次级微生物生长呈现稳定。在该形态中，酶非常稳定且被保持在环境温度中直至被用。

宜用两种方法将酶产物施用至饲料中。第一种方法是，用流化床式干燥器将酶以每磅100MU的浓度干燥至大豆渣上(20-80目，Archer Daniels Midland公司)。干燥过的酶产物的最终含水量宜保持在8％以下。当配制饲料时，加入该产物并以1磅内-1，4-β-D-甘露聚糖酶干产物/2000磅饲料的比例掺合。在造粒过程中，当混合饲料勿需被加热至高温(例如小于160°F)时，一般使用该干产物法。

目前在饲料生产上的一种趋势是在饲料造粒机和/或饲料膨化机和挤出机中使用高温。因此，在许多情况下，可将内-1，4-β-D-甘露聚糖酶液体产物以每吨100MU的比例喷至预成形的饲料颗粒上。在顺颗粒冷却机下来的饲料生产线的一个位置，宜于喷洒酶产物的区域正前方，用导管或管道中的整流锥或整流板将下落的饲料分布成一条宽的，但浅近纵深的物流。这样，用双头式泵连续地以水稀释约100ml液体内-1，4-β-D-甘露聚糖酶/吨饲料，并被用中压以均匀型式通过喷嘴喷至下落的饲料流上。或者，将稀释的酶滴在旋转的圆盘上，接着，圆盘用所谓旋转式涂布法将酶喷至通过圆盘周围的饲料幕上。

第三种方法是将酶喷入通常在其他一些液体饲料成分如脂肪或霉菌抑制剂被施用后设置的颗粒混合装置中。在该工艺中，加至饲料中的水分的量并非很重要，这样，酶被立即吸附，且添加的水分不会加速微生物生长或侵蚀颗粒结构。添加酶后，饲料通过一混合器以确保得到酶在饲料中的均匀分布。优选能使饲料以均匀流速通过酶喷洒区的机器。

在喷洒工艺的一最优选的方式中，可使用得克萨斯州Milltron-ics公司生产的、用于根据饲料流速调节喷洒速度的流量计装置或密西根州APEC(自动工艺设备公司)生产的旋转式涂布装置(Stem-ler，T.，Extending feed processing past the pellet mill.FeedManagement 45：4，1994)。在较佳的情况下，饲料中的酶含量宜在15％以下。施用超过100MU酶/吨饲料的目标量的酶是无害的。酶的应用模式和用于高温饲料造粒机的设备的优选方式的更详细的描述将在下面的实施例3中给出。

如上所述，进行了大量的使用内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的动物栏内试验和全域试验。在进行足够的重复实验以产生统计学上结果的情况下，以及酶被以合适水平均匀施用的情况下，以及其它常见的失误如非均匀饲料被避免的情况下，数据证实，在饲料中掺入甘露聚糖酶可提高饲料效率。六个鸡栏饲试验的结果归纳在表2中。还对各种火鸡和猪用各种饲料组合物在不同的地理位置进行了研究。如Jia等报道的在中国的试验(参见表1)，试验结果往往超过所预期的。检查这些试验中与平常的差异，导出了本发明。

表 2

β-甘露聚糖酶在含有48％蛋白质的

大豆粉的美国型食物中的效能

改善

日期期间饲料/增重点备注1990年2月 46日 0.042 0.27 8.7 7次重复/组S¹1990年9月 46日 0.042 0.13 6.4 9次重复/组S1990年12月 46日 0.068 0.086 8.2 8次重复/组S1991年10月 45日 0.053 0.078 6.6 7次重复/组S1991年10月 45日 0.064 0.142 8.7 7次重复/组S1993年9月 39日 0.037 0.103 5.4 7次重复/组，11只雄鸡，S平均 0.049 0.099 7.4¹S-统计学上显著(P＞0.05)

表 3

典型的美国雏鸡口粮与Jia等在中国

使用的食物中的主要组分的比较

典型的美国雏鸡口粮

成分前期生长期后期0-21日 22-35日 36-43玉米 57.42％ 61.20％ 63.85％SBM48 27.40％ 23.80％ 21.31％面包房副产物 2.00％ 5.25％ 6.00％脂肪 3.56％ 3.11％ 2.92％家禽用饲料粉 6.00％ 3.00％ 3.00％组分NRC赖氨酸的％ 100％ 100％ 118％粗蛋白 22.5％ 19.0％ 18.5％β-甘露聚糖 0.336％ 0.292％ 0.261％ME(Kcal/Kg) 3,146 3,190 3,234典型的中国雏鸡口粮成分 1-14 15-45 49-日食物日食物市售食物玉米 62％ 60％ 73％SBM 44 33％ 26％ 22.5％鱼粉 2％ 2％ 1.5％组分NRC赖氨酸的％ 110 108 126粗蛋白 23％ 21％ 19％β-甘露聚糖 0.6％ 0.475％ 0.411％ME(Kcal/Kg) 2,950 3,000 3,050

表3比较了典型的高度优化的美国雏鸡食物与Jia等1995年研究(表1)中所用饲料的组分。两种食物均以玉米-大豆为基料，但存在一些差异。在中国食物中，很少或未加入浓缩脂肪，且ME(可代谢能)平均高于美国食物约6.3％。观察到的另一件事是，中国食物使用含约44％蛋白质的大豆粉(SBM44)，而美国食物中使用含48％蛋白质的大豆粉(SBM48)。更高的蛋白质百分比意味着由大豆豆荚而来的豆粉中的纤维更少。由于大豆豆荚富含甘露聚糖(参见Whistler，R.L.and J.Saarnio，Galatomannan from soybeanhulls，J.Am.Chem.Soc.79：6055-57)，算出的半乳甘露聚糖在两种配方中的百分比平均多于中国食物约66％，尽管在两种配方中均相当低。粗蛋白含量也类似，但中国食物中的赖氨酸量显著高于国家科学研究委员会(NRC)的推荐值。表3中的美国食物均含有以掺合料为基准，超出NRC推荐值约4.7％的赖氨酸，而中国食物中的赖氨酸含量超出NRC推荐值约13.8％。通过周密设计、精心实施的鸡生长栏饲试验，在用内-1，4-β-D-甘露聚糖酶保持甘露聚糖含量低且恒定的条件下测定脂肪(高能食物，食物B)的效果。饲养试验详见下面的实施例1。

饲养试验(详述于实施例2)中使用的食物归纳在表4中。在三个成长阶段(前期、生长期、后期)的食物A中的脂肪均少于食物B约3％，但食物A多于中国典型的雏鸡食物约85Kcal/kg。使两种食物中的粗蛋白量保持相同，添加的大豆蛋白的水平非常接近。赖氨酸和其它必需氨基酸、维生素以及矿物的含量与实际接近一致。食物A中添加了更多的玉米以补偿浓缩脂肪的去除。由于玉米成本远低于脂肪，这样做是有利的。各食物在有和无内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的条件下均进行了试验。

表 4

在实施例4的加控栏饲试验中的食物的基本组分

食物A关键成分前期生长期后期0-21日 22-35日 36-43玉米 62.40％ 68.40％ 71.40％SBM 48 31.10％ 25.00％ 21.40％添加的脂肪 0.73％ 1.10％ 1.86％组分NRC赖氨酸的％ 113％ 108％ 124％粗蛋白 22.00％ 19.50％ 18.00％ME(Kcal/Kg) 3,008.5 3,085.6 3,162.7食物B关键成分前期生长期后期0-21日 22-35日 36-43玉米 58.60％ 64.60％ 67.60％SBM48 31.70％ 25.60％ 22.00％添加的脂肪 3.86％ 4.1 9％ 4.99％组分NRC赖氨酸的％ 109 104 121粗蛋白 22.00％ 19.50％ 18.00％ME(Kcal/Kg) 3,151.7 3,228.9 3,306.0

酶在8栏中，每栏70只鸡。试验进行45天。

试验结果归纳在表5中。使用了两种饲料，加入内-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，出现统计学上非常显著(P＜0.05)的改善。但加入内-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，食物A所出现的改善优于食物B的二倍以上。当检验产生1磅鸡活重所需的千卡时，食物B减少了40千卡/磅活重，而食物A减少了91。也许最重要的是不含酶的食物B与含酶的较低脂肪的食物A之间的比较。比较两者，饲料转换和体重未见统计学上的差异，但加β-甘露聚糖酶的食物A的千卡/磅活重减少了131。该数据显示，如果按规定以100MU/吨的比例加入有效的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶，则可从食物中除去3％脂肪，降低约143Kcal/Kg的千卡含量而没有效能的下降。

由于目前工业上使用的浓缩脂肪成本高，使用食物A加酶的食物的经济利益非常显著。这令人惊异的结果是未曾预料到的。SBM44中的较高甘露聚糖含量是典型的美国食物和中国食物之间的显著差异，它被认为会引起甘露聚糖酶对中国食物产生更大的冲击。这些未曾预期的结果表明，脂肪也具有关键性的作用且内-1，4-β-D-甘露聚糖酶确实比先前发现的更多地改善了饲料的能级。为得到使用甘露聚糖酶后ME的千卡增加的全部利益，宜将必需氨基酸水平相应地调高以使它们不成为限制因素。

表 5

内-1，4-β-D-甘露聚糖酶对具有不同能级的

食物的效果的汇总表

处理平均体重饲料转换千卡/ 点₂(磅) FIG₁ 磅活重 P_W+P_FC用食物B饲养的雏鸡内-1，4-β-D-甘露聚糖酶 4.975^ab 1.828^a 2,680对照 4.870^bc 1.855^b 2,720改善 0.087 0.027 -40 4.2用食物A饲养的雏鸡内-1，4-β-D-甘露聚糖酶 4.905^ab 1.847^ab 2,588对照 4.765^d 1.911^d 2,679改善 0.140 0.064 -91 8.7食物A加半纤维素酶vs不含酶的食物B内-1，4-β-D-甘露聚糖酶 4.905^ab 1.847^ab 2,588对照 4.870^bc 1.855^b 2,720改善 0.035 0.008 -131 1.4

¹考虑到鸡的死亡，将死鸡重量计入总重量对F/G进行校正

²饲养改善点的定义见上述正文

³具有不同文字上标的栏内数字经ANOY分析法和最小显著差异法确定为具有统计学上差异(P＜0.05)

本发明的饲料增补法并不限于内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的任一来源。其它可用于本法的甘露聚糖酶在从自然界分离后和通过传统的、或本领域熟知的重组DNA技术生产后可容易地加以确定。甘露聚糖酶编码基因已从数种来源中分离得到(Luthi，E.，N.B.Jas-mat，R.A.Grayling，D.R.Love and P.L.Bergquist，Cloning，saquence analysis，and expression in Escherichia coli of a gene cod-ing for a β-mannanase from extremely thermophilic bacterium Cal-docellum saccharolyticum，Appl.Environ.Microbiol.57：694-700(1991)；Akino，T.，C.Kato，and K.Horikoshi，Two Bacillusβ-mannanases having different COOH termini are produced in Es-cherichia coli carrying pMAH5，Appl.Environ.Microbiol.55：3178-83(1989)。而且，可通过本领域熟知的“protein engineering(蛋白质工程)”的技术对酶进行改进以供使用。通过变异改变DNA编码序列，可改变蛋白质结构。例如，通过改变氨基酸序列中可在升高的温度下使氧化性能、蛋白质分解性能降低或结构更稳起的特定残基，可改善甘露聚糖酶的稳定性。在用X射线结晶学方法确定蛋白质的三维晶体结构后，这些结构变化可容易地预测到。或者，可通过基因序列的针对特定区域，但随机的诱变，以及随后对所得变异酶进行所需改善性能筛选，来进行改善。

在本发明的优选方式中，使用热稳定性提高了的、可经受造粒、膨化或挤出过程中对饲料施加的蒸汽热处理的甘露聚糖酶。在这种情形中，宜在造粒前将酶与其它饲料成分以干式直接掺合。可通过例如方法的组合来提高热稳定性。一种方法是以具有固有热稳定性的酶如从嗜热性微生物分离得到的酶开始。但在40℃的专一活性必须足以如本方法中所述，供给约100MU/吨。第二种可选择的方法是通过上述蛋白质工程或随机变异区域定点诱变和对具有改善的性能的酶的选择而提高嗜温性酶的热稳定性。第三种可选择的方法是将酶与稳定剂和/或可阻止蒸汽渗透，但不会影响酶已有的在动物内脏中的溶解性和活性的添加涂料混合。

已知一些糖如threalose可使蛋白质稳定。参见Colaco，C.，S.Sen，M.Thangavelu，S.Pinder and B.Roser，Extraordinary sta-bility of enzymes dried in threhalose：simplified molecular biology，Bio/Technology 10：1007-11(1992)；Roser，B.J.Protection ofproteins and the like，U.S.Patent 4，891，319。也已知道一些化学品如环-2，3-二磷酸甘油酸酯(Seely，R.J.and D.E.Fahrney，The cyclic-2，3-diphosphoglycerate from Methanobacterium ther-moautotrophicum is the D-enantiomer，Current Microbiol.10：85-88，1984；Hensel，R.and H.Koning，Thermoadaptation ofmethanogenic bacteria by intracellular ion concentration，FEMSMicrobiol.Lett.49：75-79，1988)和二肌醇1，1′-磷酸酯(Scholz，S.，J.Sonnenbichler，W.Schafer，and R.Hensel，Di-myo-inosi-tol-1，1′-phosphate：a new inositol phosphate isolated from Pyro-coccus woesei，FEBS 306：239-242，1992)以及高浓度盐(Bre-itung，J.，R.A.Schmitz，K.O.Stetter and R.K.Thauer，N⁵，N¹⁰-methylenetetrahydromethanopterin cyclohydrolase from the ex-treme thermophile Methanopyrus Kandleri：increase of catalytic ef-ficiency and thermostability in the presence of salts，Arch.Microbi-ol.156：517-524，1991)与一些极端嗜热性微生物中的蛋白质的稳定有关。因此，嗜热性酶、稳定化变异、稳定剂或这些因子的组合可用于制备可经受在本发明一优选方式中的饲料造粒过程中的加热处理的甘露聚糖酶。

甘露聚糖酶生产性微生物可容易地从自然界中通过选择可在作为唯一碳源的以甘露聚糖为基料的树胶中生长的微生物而选出。任何富含有机质的土壤均可成为这些微生物的良好的可能来源。例如，已知许多种树木半纤维素含大量的甘露聚糖(Sjostrom，E.，Chap-ter 3，Wood Polysaccharides，In Wood Chemistry，Fundamentalsand Applications，pp49-67，Academic Press，New York，1981)。因此，存在腐败的树木的地方往往是甘露聚糖酶的富源。某些类型的农业区域也同样可能是生产甘露聚糖酶的微生物的富源。例如，下述地方往往存在丰富的可生产内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的甘露聚糖降解微生物：豆科作物、咖啡、椰子的生长或加工地方/椰肉干的加工地方、或已知是甘露聚糖富源的其它植物种的生长或加工的地方。内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的数种来源已有描述(McCleary，B.V.，β-D-Mannanase，Methods in Enzymology 160：596-610，1988；)，它包括真菌(Johnson，K.G.，Exocellularβ-mannanases from hemicel-luloytic fungi，World J.Microbiol.Biotechnol.6：209-217，1990；Araujo，A.and O.P.Ward，Studies on the galactomannan-degrading enzymes produced by Sporotrichum cellulophilum，J.Industrial Microbiol.8：229-236，1991；Kusakabe，I.，G.G.Park，N.Kumita，T.Yasui and K.Murakami，Specificity of β-mannanase from Penicillium purpurogenum for Konjac glucoman-nan，Agric Biol.Chem.52：519-524，1988)、极端嗜热生物(Luthi et al.，1991，见上；Bicho，P.A.，T.A.Clark，K.Mack-ie，H.W.Morgan and R.M.Daniel，The characterization of athermostable endo-β-1，4-mannanase cloned from Caldocellum sac-charolyticum，Appl.Microbiol.Biotechnol.36，337-343，1991)、超嗜热生物(Adams，M.W.，and R.M.Kelly，Enzymes fromExtreme Enviroments，Chemical & Engineering News，pp32-42，December18，1995)、链霉菌(Kusakabe，I.，R.Takahashi，β-mannanase of Streptomyces，Methods in Enzymology 160：611-614，1988；Takahashi，R.，I.Kusakabe，H.Kobayashi，K.Mu-rakami，A.Maekawa and T.Suzuki，Purification and someproperties of mannanase from Streptomyces sp.Agric.Biol.Chem.48：2189-2195，1984)、和枯草菌(Araujo，A.，and O.P.Ward，Hemicellulases of Bacillus species：preliminary comparativestudies on porduction and properties of mannanases and galac-tanases，J.Appl.Bacteriol.68：253-261，1990：Araujo，A.andO.P.Ward，Mannanase components from Bacillus pumilus，Appl.Environ.Microbiol.56：1954-1956，1990；Akino et al.，1989，见上；Akino.T.，N.Nakamura and K.Horikoshi，Characteriza-tion of threeβ-mannanases of an alkalophilic Bacilhus sp.，AgricBiol.Chem.52：773-779，1988；Emi et al.，1972，见上)。还有，由黑曲霉生产的甘露聚糖酶市场上有售(两个例子是Solvey酶(半纤维素酶)和Novo Nordisk(Gamanase^TM)。

一旦根据其在以甘露聚糖作为唯一碳源进行生长的能力而鉴定微生物群体为甘露聚糖酶的潜在性来源后，通过在置入了溶于熔化的琼脂糖溶液中的蓝色染料改性过的甘露聚糖的培养皿上的涂覆培养，可容易地鉴定分泌甘露聚糖酶的单独微生物。待琼脂糖固化后，甘露聚糖酶生产微生物产生由蓝色染料标记过的甘露聚糖片段的快速扩散引起的明显的透明区域。一旦鉴定后，使用包括均为本领域熟知的基因改良(Rowlands，R.T.，Industrial strain improvement：mutagenesis and random screening procedures，Enzyme Microb.Technol.6：3-10，1984)和发酵技术在内的标准方法生产足够试验的酶。一旦鉴定了有用的甘露聚糖酶后，使用可包括基因克隆和表达在内的菌株改良以通过发酵法进一步改良酶生产。在某些情形，在接种和纯化可生产甘露聚糖酶的单独微生物种之前，克隆甘露聚糖酶也可能是更可取的。DNA可直接从天然源分离得到，克隆入例如大肠杆菌中的表达载体，然后筛选生产所需甘露聚糖酶的重组克隆(Robertson，D.E.，E.J.Mathur，R.V.Swanson，B.L.Marrs，and J.M.Short，The discovery of new biocatalysts from microbialdiversity，SIM News，46：3-8，1996)。

可用于该应用的甘露聚糖酶的另一个来源来自植物源。由于甘露聚糖在种子中经常用作贮存聚合物，一些发芽种子如紫花苜蓿(Medicago sativa)或瓜尔豆(Cyamosis tetragonolobus)是甘露聚糖酶的良好来源(McCleary，1988，见上)。使种子发芽，然后加工以产生酶的浓缩源。另外，可将完全发芽的种子磨成粉，以直接用于饲料。这时，种子在饲料中可有两个用途，第一个是作为甘露聚糖酶源，第二个是作为蛋白质和碳水化合物源。然而，若发芽种子具有压倒甘露聚糖酶效应的其它一些抗营养性能，则这类种子往往不会对本方法十分有用。也可以对植物进行基因工程操作以使植物的果实、种子、茎干或叶子产生甘露聚糖酶。作为可引用的无数例子中的一个，外源酶已在被大规模栽培的商用油籽植物油菜中被表达(van Rooijen，G.J.H.，and M.M.Moloney，Plant seed oil-bodies as carriers forforeign proteins，Bio/Technology 13：72-77，1995)。植物基因工程是本领域熟知的另一个可能的甘露聚糖酶源，它可用于本发明的实践。

另一种在消化道中将甘露聚糖酶导入饲料中的方案和本发明的优选方式是对动物(即猪、鸡或火鸡)进行遗传改良，以使内-1，4-β-D-甘露聚糖酶在消化道中被合成。这可通过下述方法进行：导入具有交替结构的甘露聚糖酶基因，这样，使其受控于调节序列，调节序列一般调节另一种消化酶如一种进入消化道的蛋白酶的生产和/或引起分泌。通过使用编码被分泌至消化道的不同部分中的酶的基因中的调节序列，可使甘露聚糖酶分泌定向至使其冲击效果最优化的不同部位。这种转基因技术已被用于例如使基因动物乳腺的奶中产生异源蛋白质(Campbell，A.M.，Transgenic technology，Bio-pharm 9：28，1996；Velander，W.H.，J.L.Johnson，R.L.Page，C.G.Russell，A.Subramanian，T.D.Wilkins，F.C.Gwazdauskas，C.Pittius，W.N.Drohan，High-level expressionof a heterologous protein in the milk of transgenic swine using thecDNA encoding human protein C，Proc.Natl.Acad.Sci.89：12003-12007，1992；Hansson，L.，M.Elund，A.Elund，T.Jo-hansson，S.L.Marklund，S.Fromm，M.Stromqvist，and J.Tornell，Expression and characterization of biologically active hu-man extracellular superoxide dismutase in milk of transgenic mice，J.Biol.Chem.269：5358-63，1994)。

与制造或导入消化道中的方法无关，本方法中的各甘露聚糖酶均需在动物饲养试验中进行测试。这样的测试最好按与实施例1和2中详述的方法类似的方法进行。试验中加入的酶的数量宜根据这里所用的pH和温度确定，即使这些条件对被测试的酶而言并非最佳。然后，在每吨饲料中加入100MU酶。

在本发明中，对本发明的展开过程中所用的技术的某些方面给出下列定义。甘露聚糖被认为是可被内-1，4-β-D-甘露聚糖酶部分或广泛地降解的任何碳水化合物聚合物。因此，“甘露聚糖”一词包括以β-1，4-D-甘露聚糖为基的聚合物，如在1，4-β-D-甘露聚糖聚合物主链上具有1，6交联的半乳糖支链(或任何其它分支糖)的半乳甘露聚糖，或具有一些散开在主聚合物链上的1，4-β-D-葡萄糖残基的葡甘露聚糖。根据该定义的甘露聚糖的一些实际例子包括瓜尔(Cyamop-sis tetragonolobus)胶、剌槐豆胶、太卡棕榈(象牙椰子)、干椰子仁甘露聚糖(椰子)、色利普粉甘露聚糖、咖啡甘露聚糖和稻子豆胶(Cera-tonia siliqua)甘露聚糖(Whistler，R.L.and C.L.Smart，Polysaccharide chemistry，Academic press，1953)。半乳甘露聚糖非常广泛地分布于自然界中。例如，半乳甘露聚糖存在于大多数，但非所有的豆科作物的胚乳中(Whistler and Smart，1953，见上)。因此，就含大量的肯定存在胚乳甘露聚糖的任何豆粉的任何饲料而言，添加有效甘露聚糖酶的有益效果是预料到的。

在本发明中，内-1，4-β-D-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)也用其它名称描述，例如用甘露聚糖内-1，4-β-D-甘露糖苷酶或简便地用胞内甘露聚糖酶、甘露聚糖酶或半纤维素酶。用于动物饲料应用的有效甘露聚糖酶被定义为一种可酶促降低刺槐豆胶或瓜尔胶溶液的粘性并对在使用首先由Fodge和Anderson(Fodge and Anderson，见上，U.S.Patent 5,429,828)描述的以玉米/豆粉(例如大豆粉)为基料的食物进行的科学控制的饲养试验中提高饲料转移效率的酶制剂(纯品或粗品)。大豆粉是目前广泛使用的商品并主要用作动物饲料的蛋白质源。大豆粉经过大豆油的萃取和脱去绝大部分豆壳后，富含蛋白质，目前是高度优化的动物饲料中的主要甘露聚糖源。适用于本发明的大豆粉一般含44％粗蛋白(称为SBM44)或48％粗蛋白(称为SBM48)。

就含其它甘露聚糖源，尤其是含来自其它豆科植物如豌豆、菜豆、兵豆、苜蓿及其它的甘露聚糖源的食物而言，甘露聚糖酶效应与低食物ME能量对饲养改善的正的相互作用是预料到的。本发明中使用的“豆科(legume plant family)”一词是用于表示Leguminosae或Fabaceae科的通用名，英文中也常称作pulse family(豆科)。该科中的许多植物如大豆，富含优质蛋白，它们的胚乳中存在甘露聚糖(Whistler and Smart，1953，见上)。许多豆科植物是理想的饲料成分，通过本发明的运用，其价值得到进一步地提高。

在本发明中，内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的单位可通过本文描述的测定法得到。甘露聚糖酶的有效剂量相当于100,000,000单位(100MU)/吨饲料。Hemicell^是适用于本发明的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶的注册商标，但任何其它有效的甘露聚糖酶也可用于本发明。

可代谢能(ME)是可被动物消化的饲料中的热能含量(以千卡/公斤计)。对一给定饲料成分而言，可代谢能随消费该成分的动物种类而异。常见饲料成分的大致的ME值已有发表(Dale，N.，Ingre-dient analysis table：1995 Edition，Feedstuffs 67：24-39，1995)。当配制营养平衡的食物时，以及当由于饲料成分的价格和市场供给情况变化而以最低成本重新调配时，动物营养学家将会利用上述信息。在本发明中，饲料可代谢能由《Feedstuffs》杂志中的《成分分析表》(Dale，1995，见上)或其最新版中确定含量的各成分产生的可代谢能(ME)之和确定。

对本发明而言，NRC必需氨基酸要求如《Feedstuffs》就猪(Easter，R.A.，J.Odle，G.R.Hollis and D.H.Baker，Dietarynutrient allowances for swine，Feedstuffs，67：40-46，1995)和家禽(Waldroup，P.W.，Dietary nutrient allowances for poultry，Feedstuffs 67：69-76，1995)发表的文献所描述的。上述要求在该文献中以术语“每单位食物的可代谢能含量所要求的氨基酸量”来确定。

在本发明中，术语“转基因操作”的定义为通过重组DNA的应用，在动物体内生产蛋白质。重组DNA的定义为DNA(不论其是从天然源分离得到的，还是完全化学合成的)在体外操作，然后为了其后的表达，将其导入生物内。变异在本发明中的定义为通过针对特定区域、针对特定部位或随机的变异来改变基因的DNA序列。

内-1，4-β-D-甘露聚糖酶可用任何已知的方法，例如用还原糖测定法方便地制成。

在典型的还原糖测定法中，下列物质被使用：

3，5-二硝基水杨酸(DNS)，Aldrich，＞98％纯

苯酚-试剂级

四水(合)酒石酸钾钠——试剂级

氢氧化钠(NaOH)

盐酸(HCl)

亚硫酸钠(无水)

剌槐豆胶(Sigma公司，#G0753)

三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液

D-(+)-甘露糖，试剂级(Sigma公司，#M-4625)

四环素-HCl

40℃水浴

沸水浴

Sorvall台式离心机

微量离心机(例如Eppindorph，1.5ml塑料管)

旋转式混合器

分光光度计(用于在550nm读数)

pH仪

16×100mm玻璃管

13×100mm玻璃管

磁力搅拌棒和磁力搅拌/加热板

烧杯、量杯、贮存瓶、分析天平

带一次性枪头的可变式移液管装置(1ml)

250ml挡板摇瓶(Bellco公司)

平台式摇瓶机(New Brunswick Scientific公司)

试剂二硝基水杨酸(DNS)可用作试剂。为制备1升稳定的储液，将下列成分溶于水中。

NaOH 10g(先加)

DNS 10g

苯酚 2g

四水合酒石酸钾钠 200g

使用前，使溶液放置1日并在黑暗中保存。工作液应通过往储液中加入0.5克/千无水亚硫酸钠来制备。

底物刺槐豆胶(LBG)可通过室温下将LBG缓缓加至50mMTris缓冲液(pH7.5)的快速搅拌液中而制成5克/升悬浮液。将粉末分散后，加热悬浮液至沸腾并在搅拌下于加热搅拌板上慢慢煮1小时以得到非常均匀的、充分水合的凝胶。确认溶液中无未水合的凝胶的小团块存在。若有小团块存在，重新以更慢的速度往Tris缓冲液中加入LBG。冷却所得溶液至室温并将其调整至所需的最终体积以得到5克/升LBG。往树脂溶液中添加作为防腐剂的四环素盐酸盐(30mg/ml)。不用时，在4℃贮存。贮存后，使用前应充分混合。

标准液和标准曲线可通过制备一系列浓度在0.1～0.5克/升的溶于水的D-(+)-甘露聚糖标准液而得到。在13×100mm玻璃管中加入含1.5mlDNS工作液和0.6ml各甘露糖标准液(一式两份或三份)。在1.5ml DNS工作液中加入0.6ml水作为反应空白以使分光光度计归零。在沸水浴中加热5分钟，冷却至环境温度并读出在550nm的吸光度。期望的结果是一条在0.25×1.7O.D.单位间的线性剂量反应线。〔注：在酶分析法(下述)中，由于底物的限制，仅出现在0.25-1.2O.D.间的数据被用于计算，超出上述范围，酶反应呈非线性〕。仅从曲线的线性部分计算标准曲线的斜率(550/克/升甘露糖)。

该标准曲线随所得DNS试剂的批次而异。若预计将进行许多测试，购买时最好买大批量的DNS。典型的标准曲线如附图所示。该曲线的斜率等于4.706O.D./克/升甘露糖。

通过以20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释液体样品至约100,000U/l(0.1MU/l)来制备样品。为最精确计，首先确定酶液的密度，然后使用分析天平以非常精确地通过重量来进行稀释。在测试前，萃取动物饲料的固体样品。加入10克固体酶载体至在250ml非挡板式摇瓶中的100ml水中，并在室温下以200rpm混合30分钟。将萃取液的一部分移至Eppindorph离心管中并离心(10,000-12,000RPM)2分钟。取出部分透明的上清液并用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释至约0.1MU/l供测试。

在酶测试中，所有测试宜在试验的各稀释水平进行二或三次。称取4克LBG底物至16×100mm玻璃管中并用水浴加热至40℃〔注：由于LBG溶液的粘性使其难以被移液，因此，称重是最精确的〕。加入0.8ml酶溶液，用旋转式混合器剧烈混合，重新置入40℃水浴中，开始计时。用水代替酶溶液作为对照，以使分光光度计调整归零。酶反应约每5分钟混合并就在取样之前立即混合。在12、18和24分钟时，取出0.6ml反应液并加至13×100mm玻璃管内的1.5mlDNS工作试剂中。立刻振荡以停止反应。置入沸水浴中整5分钟。冷却至室温，用台式离心机以2700RPM离心10分钟，读出上清液在550nm的光密度(O.D.)。使用在测试的线性范围(0.25-1.2O.D.550)中的读数，以O.D./min算出酶率(enzyme rate)。

甘露聚糖酶(半纤维素酶)的chemGen(化学基因)单位具有由粘度法原始确定的任意的定义。单位的大小根据某些效能特性而选择，且没有转换因子则不能直接与其它测试法比较。当将粘度法与此处描述的还原糖法联系起来时，1CG单位(U)由LBG产生0.574微克还原糖/分。因此1CG MU产生0.574克还原糖/分。

在实际中，可用下法计算。

就内-1，4-β-D甘露聚糖酶(液体)而言：

MU/l(在测试溶液中)×稀释因子＝MU/l(原液)就内-1，4-β-甘露聚糖酶(不加水的)而言：

MU/l(在测试液中)×稀释因子＝MU/l(原萃取液)

MU/l(原萃取液)×0.1l/0.01kg＝MU/kg内-1，4-β-D-甘露聚糖酶还可通过糖度法得到。

本法是一种非常敏感的水解刺槐豆胶的内甘露糖苷键的甘露糖酶型活性的测试法。底物粘度中的相应还原是用校准粘度计测量的且被用于计算由ChemGen(CG单位)定义的活性单位。当需测量的活性很低或需要很高的精确性时，可使用该测试法。然而，操作手续较花时间。

宜使用下列装置和材料：

粘度计使用规格100的校准Cannon-Fenake型粘度计或其等

同物。一种合适的粘度计是伊利诺斯州Scientific

Products公司生产的商品目录号为No.2885-100的

粘度计。

玻璃水浴使用保持在40±0.1℃的恒温玻璃水浴，一种合适

的水浴是Scientific Products公司生产的商品目录

号为No.3520-10的水浴。两个电子计时器pH仪烧杯，量杯(1000ml，500ml)NaOH，HCl甘油(试剂级)磁力混合器/加热板和磁力搅拌棒10ml移液吸管，2.0ml移液吸管带一次性枪头的1.0ml移液枪(例如Pipettman，Rainin Iustrumets公司)带一次性枪头的0.1ml移液枪(例如Pipettman，Rainin Iustrumets公司)分析天平18×150mm玻璃管抽吸装置(为使用移液吸管而设计的)试管旋转式混合器铝箔

宜在粘度测试法中使用下列试剂和溶液：

A.刺槐豆胶(LBG)可使用Sigma公司生产的粉状剌槐豆胶。剌槐豆胶的粘度会附着时间升高。为使结果精确，底物应至少每月重新配制一次。为得到很好的底物，TS(见下述)应大于110秒。

室温下将LBG缓慢加至去离子水的快速搅拌液中，制成2克/升(0.2％)的LBG。将2克LBG非常缓慢地加至约900ml去离子水中并在搅拌板上迅速混合。等粉末充分分散后，缓慢加热悬浮液至沸腾并在加热搅拌板上慢慢煮并连续快速混合1小时或更长时间以得到非常均匀、充分水合的凝胶。确保溶液中无未水合凝胶的小团块存在。若有，重新配制，将LBG更缓慢地加至水溶液中。冷却至室温并通过定量移至1000ml量杯中，用水稀释和混合来调节溶液至所需的最终体积。贮存后，用前充分混合。最终溶液的pH应与pH6接近。

B.甘氨酸缓冲液，2M(pH9.0)将75克甘氨酸溶于450ml去离子水中，连续搅拌下加入5N至pH计测得pH为9.0±0.05。定量移至500ml量杯中并用水稀释。确认最终溶液中的pH为9.0。

C.样品配制液配制样品在去离子水中的溶液，使0.5ml最终溶液在下述步骤中的特定条件下产生0.035-0.045/min间的相对流度(F_R)的变化。这与在样品的约1850-2400CG U/l范围的活性相一致。超出该活性范围，则测试的线性不能保证。对水溶液中的液体样品，用水稀释并用分析天平测量酶和添加的水以使精确度达到最佳。

对由固体萃取的试样，离心或过滤以除去会阻塞粘度计细孔的固体。

为进行操作和计算，通过仪器抽入大量洗涤液(若需要除去粘附的残留物)，再抽入水，并将预先校准的粘度计精确地以垂直位置置入70℃的玻璃水浴中，以彻底地清洗粘度计。在每次测量后均需进行上述步骤。

测定T_W将20ml去离子水吸移至粘度计贮液器中，并静置数分钟以使温度平衡。将水抽提至粘度计中，使其高过顶标。让溶液回流，当水的凹面下落通过第二标记时停止计时。重复测量数次。将平均时间定为T_W(水溢出时间)。

测定T_S和对照率(control rate)将10ml LBG底物置入一18×150mm玻璃管中，加入2ml 2.0M甘氨酸缓冲液(pH9.0)，混合，用铝箔封盖并置入70℃水中数分钟以加热。加入0.5ml水，用旋转式混合器迅速混合，并立即启动第一计时器。将10ml溶液吸移至粘度计贮液器中，静置片刻以进行平衡，然后抽提溶液，并用第二计时器确定溢出时间，这即是T_S(以秒记录)。每次测定T_S，当溶液的凹面下落通过顶标时在第一计时器上记录经过的时间(T_R，反应时间，以数字分钟记录)。在理想的情况下，T_S将无变化，显示粘度无对照损失，在这种情况下，计算所用的T_S应为各次测定的平均值。然而在某些情况下，存在本底率(Background Rate)。就本底率而言，底物溢出值被当作用相应的T_R值计算的T_T以计算下述的本底率。开始后测得的第一溢出时间被用作此本底率计算中的T_S。某些批次的底物可能被少量的甘露聚糖酶型活性污染。若测得大于500U/l或初始T_S小于110秒，最好制备新的底物溶液。

酶率(Euxyme Rate)将10mlLBG底物置入18×150mm玻璃管中，加入2ml2.0M甘氨酸缓冲液(pH9.0)，混合并置入70℃水中数分钟以加热。用铝箔封口以防止用前水分蒸发。加入0.5ml酶稀释液，用旋转式混合器迅速混合并立即启动第一计时器以测定T_R值。将10ml溶液吸移至粘度计贮液器中，静置片刻以平衡，然后抽提溶液。当溶液的凹面通过顶标时，用第一计时器记录T_R并用第二计时器开始测定溢出时间，这即是T_T。立即重新抽提溶液至溶液高过顶标，以便在第二T_R得到T_T。继续重复测量直至在最后一次T_R测量后时间经过约15分钟。推荐至少应有4个时间点。

为进行所需的计算，数据被用于计算相对流度(F_R)和归一化的反应时间(T_N)(为T_R加相应的溢出时间的半值)。计算按下式进行：

F_R＝T_S-T_W)/(T_R-T_W)和

T_N＝0.5(T_T/60s/min)+T_R＝(T_T/120)+T_R

将相对流度(F_R)作为纵坐标对作为横坐标的四个反应时间(T_N)进行标绘。应得到一直线。线的斜率与每分钟相对流度的变化(F_R/min)一致并且与酶的浓度相一致。使用通过一系列点得出的斜率较使用单一的相对流度值是更好的酶的判断依据。理想的是，相对流度变化应为约0.04/min。若反应中存在本底底物降解，曲线图的起始部分将是非线性的。使用标绘线变成线性后的数据来确定斜率。我们一般使用Lotus总分析表程序进行标绘和计算曲线斜率的最佳拟合以及进行为得到单位所必需的其它计算。

加入反应中的0.5ml样品的CG单位(U)/升的定义为

CG U/l＝9.397×10⁴×F_R/min因素，原样品酶浓度可按下式计算：

CG U/l(原样品)＝1(CG U/l-底物对照U/l)×稀释因子内-1，4-β-D-甘露聚糖酶还可用蓝色染料测试法测试。

按照该测试法，宜使用生产RBB(remizol亮蓝)的方法(Meth-ods in Enzymology 160：538，1988)制备酶底物，其中，木聚糖被用来将RBB蓝色染料结合至剌槐豆胶上。可通过加入0.7％剌槐豆胶(LBG)和0.07％染料至初始反应中而对上述方法进行改良。另外，在乙酸钠和氢氧化钠的存在下与RBB反应后，染色了的树胶溶液在乙醇沉淀前通过渗析来除去盐。这便于沉淀后的刺槐豆胶的再悬浮。与木聚糖法中使用的2倍体积的冰相比，在室温下使用1倍体积的乙醇更可使染料结合的树胶沉淀。

通过将干粉缓慢加入迅速搅拌中的缓冲液中，使3.5克RBB-LBG溶解于1升50mM Tris-HCl(pH7.5)中。在搅拌下加热至沸腾，然后在121高压加热20分钟，接着冷却至室温。离心以除去未溶解的物质。将上清液倾入合适的试管中，然后再次高压灭菌。若无微生物污染被导入瓶中，该溶液在至少6个月期间是稳定的。当以70％乙醇为对照进行读数时，测试中的空白试剂(见下述)的光密度(O.D.)值应小于0.15。若该O.D.较高，舍弃此RBB-LBG试剂。测试方案

A.用未氯化的水制备合适的样品稀释液和标准液。为得到标准曲线，用预先用还原糖法测定的酶标准液制备约1.5、2.0和2.5MU/l的稀释液。应稀释所测样品以使活性位于1.5-2.5MU/l的范围内。为得到最佳结果，用量杯和分析天平准确测定所需添加的酶溶液的量来制备稀释液。

B.将0.54ml RBB-LBG试剂加入1.5ml微型离心管中，并将该管置于40℃水浴中至少10分钟。

C.加入20μl酶并旋转混合以启动反应。孵育各样品10分钟整。为得到最佳结果，样品应测试两次。

D.加入0.9ml无水乙醇(试剂乙醇)并充分混合以终止反应。在室温下静置该试管至少10分钟。

E.用离心机以8-12,000RPM离心试管3分钟。

F.用20μl水代替酶以使分光光度计调整归零，用反应空白当作上述试样，读出在590nm的光密度。

G.相对于稀释的标准液的活性(MU/l)，标绘用该标准液测得的在590nm的OD值，得出斜率。计算

样品活性(MU/l)＝OD 590nm×斜率×试样稀释因子

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 鸡生长栏饲试验法

使用马里兰州ConAgra Hatchery公司提供的商用雏鸡(雌雄各半，Peterson×Arbor Acres)，每栏70只，饲养1-45日，在小鸡出壳日将其送至试验处。所有小鸡均在孵化场接种疫苗并作为正常处理。在第1日使用大小为5×12英尺的饲养栏，密度为每只鸡占0.75平方英尺。建筑物为木头/炉渣砖结构，用强制空气加热(第一周加上加热灯)和白炽照明的方式加热。每日监测温度并在开始3日保持温度在92°F然后每日降低1°F至达到70°F并保持至试验结束。时间延迟地平均每10分钟启动鼓风机1-4分钟，促进空气交换。试验是在马里兰州东海岸从1995年10月31日进行至1996年12月15日。

按典型的家禽工业和商品规格的已知要求制备饲料。用于整个试验的饲料均进行混合并在约175°F造粒。实验中使用的饲料均同时制备并满足或超过由国家科学研究委员会制定的营养要求(Nu-trient Requirements of Poultry，9th Revised Edition，U.S.Nation-al Research Council，1994)。采取部分控制混合，通过均匀喷射液体浓缩物，进行酶添加。供0至第21日使用的前期饲料为碎颗粒。生长期和后期饲料是以整粒形式使用的。

最初孵化25只小鸡并称重。测出平均体重并求出平均值上下5克的范围。随机选出体重在该范围内的小鸡并分成每栏70只。实验中，共使用3,840只鸡(雌雄各半)。在研究过程中，每日三次监测各栏。更具体地说，监测食物和水的供给情况、温度保持以及小鸡和褥草的总体条件。在实验的最初7天，用分别以它们各自的食物饲养并随机选出的一群小鸡中的小鸡替换死亡的小鸡。

对用于各不同处理的8个饲养栏的建筑物全面进行随机化以消除由建筑物中的饲养栏的物理位置引起的任何可能的偏差。在试验过程中收集下列数据：

1.在第21日和第45日的各个体重。

2.以饲料/增重之比算出饲养效率。增重为活鸡体重和任何死鸡的死亡时的体重之和。将已知数量的饲料加至各栏并减去在对鸡秤重时栏内留存的任何未被食去的饲料的重量，测出饲料重量。

3.死亡分析包括总死亡率以及死亡日。

4.就第21日和第45日的各个体重算出标准误差和变异系数。

5.鸡的其它观察包括观察鸡的羽毛、物理外表和用Minolta色度计观察皮肤色素。

表 6

栏饲试验体重数据，第1-45日平均栏体重(磅)

Rep T1 T2 T3 T4R1 4.819 5.026 4.822 5.080R2 4.850 4.946 4.831 4.936R3 4.974 4.881 4.657 4.819R4 4.885 5.021 4.793 4.841R5 4.892 4.918 4.705 4.809R6 4.946 4.943 4.695 4.849R7 4.782 4.895 4.794 4.955R8 4.812 5.025 4.823 4.950平均 4.870 4.957 4.765 4.905Stat. bc a d adS.D. 0.063 0.056 0.064 0.087C.V. 1.286 1.127 1.341 1.765

在死亡率、羽毛、物理外表或皮肤色素方面，未观察到各组之间存在任何显著差异。结果归纳在上面表5中，食物配方的详细内容显示在实施例5(表8)中。详细数据在下面的表6和表7中给出。

表 7

栏饲试验饲料转换数据

就鸡死亡校正过的第1-45日饲料/增重

Rep T1 T2 T3 T4R1 1.872 1.810 1.920 1.850R2 1.851 1.871 1.923 1.871R3 1.866 1.864 1.926 1.892R4 1.877 1.848 1.944 1.879R5 1.852 1.800 1.905 1.820R6 1.822 1.803 1.881 1.842R7 1.818 1.818 1.889 1.807R8 1.883 1.807 1.900 1.815平均 1.855 1.828 1.911 1.847Stat. b a d abS.D. 0.023 0.027 0.020 0.030C.V. 1.234 1.483 1.030 1.607

在表6和表7中，对处理组指定如下：T1＝3229千卡/公斤，无酶T2＝3229千卡/公斤，加酶T3＝3085千卡/公斤，无酶T4＝3085千卡/公斤，加酶实施例2 在评定食物能量与甘露聚糖酶的相互作用的栏饲试验中

使用的食物的详细内容

表8提供了此处所述栏饲试验中使用的食物的详细描述。各成分均是动物营养领域的任何技术人员很熟悉的东西。在第0-21日使用前期饲料，在第22-35日使用生长期饲料，在第36-45日使用后期饲料。

表 8

在评定能级效果的栏饲试验中使用的食物的详细描述

重量％—食物A 重量％—食物B

成分前期生长期后期前期生长期后期黄玉米 62.381 68.415 71.406 58.593 64.627 67.618大豆粉48％ 31.077 24.982 21.352 31.726 25.63 22.000脂肪3700 0.731 1.063 1.857 3.858 4.191 4.985盐(NaCl) 0.307 0.305 0.258 0.307 0.305 0.258石灰石 0.537 0.583 0.544 0.527 0.573 0.533DEF PHOS32-18 1.258 1.095 1.077 1.267 1.104 1.086胆碱CH-60％ 0.073 0.049 0.010 0.081 0.057 0.017混合肉-58％ 3.000 3.000 3.000 3.000 3.000 3.000维生素预混合物 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025微量矿物质PRX 0.075 0.075 0.075 0.075 0.075 0.075DL-蛋氨酸 0.285 0.156 0.145 0.290 0.161 0.151SACOX 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100杆菌肽MD 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042cromophyl-Oro 0.110 0.110 0.110 0.110 0.110 0.110组分赖氨酸(总) 1.212 1.031 0.922 1.223 1.043 0.934蛋氨酸+半胱氨酸 1.020 0.83 0.788 1.020 0.830 0.780粗蛋白 22％ 19.5％ 18％ 22％ 19.5％ 18％千卡/公斤 3008.5 3085.6 3162.7 3151.7 3228.9 3306.0

实施例3 用于在家禽饲料粉碎机中将酶施用至饲料颗粒上的喷洒

系统

在许多情况下，若在颗粒成型过程中使用超高温，则将酶喷洒在预成型的饲料颗粒上可能较适宜。在某些位置，在颗粒成形过程中使用蒸煮饲料所需的加热时间和温度，这样，绝大多数在本法中有效的酶将变性。

图1显示用于用酶涂布饲料的泵送系统的流程图。泵是双头式隔膜泵(duriron#E2＝(16)(07)115-68A31)，它被用于以约9∶1的比例将水和内1，4-β-D-甘露聚糖酶泵送至共用出口。混合物流过脉冲阻尼器(Blach#A301N)，当泵停止时，使用电磁阀(Asco#EF8210G87)以阻止水流动。流量计可用来肉眼观察液体流速和用水稀释的酶溶液的颜色。

可调式压力开关(Omega#PSW121)被用来探测任何管线阻塞和当压力超过设定时，进行自动关闭。所用设定视酶出口相对于泵的高度而定，一般略大于由头高产生的压力。阀门被设置来进行液体取样和泵头的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶一侧的启动。用水压调节器将生活用水水压降至泵前的15磅/平方英寸。可用空气调节器对内-1，4-β-D-甘露聚糖酶贮存罐或贮存桶增压以防止泵起动的损失。

贮存罐中的混合液的浓度设为1000MU/l，在每吨饲料中加入100MU酶。用行程长度调节器将泵另一侧的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶流量调节至900ml/吨。上述流量通过测量酶浓缩物离开贮存桶或贮存罐的流量而进行检验。这样，用水稀释后，将1升稀释过的液体酶加入每吨饲料中而仅增加约0.1％水分。在较佳实施方案中，通过现有的APEC(密西根州Automated Process Equipment公司)制造的称为旋转涂布机的粉碎机中的脂肪涂布设备将酶加至饲料中。一般，将酶用管道输送至与脂肪落在旋转盘上相同的位置，其中，所述的旋转盘将脂肪分散至以均一的速度在旋转盘周围下落的饲料薄幕上。脂肪涂布设备通常在粉碎机的顶部。高度变化在含稀释酶的管道中产生足够的压力以正确地安装用于正常运转的泵逆止阀。

来自粉碎机中的计算机的信号通过压力开关的常闭侧传至马达启动器、领示灯和电磁阀。因此，当粉碎机开始制造饲料时，泵送系统自动启动，除非出现超压情况。

在将饲料装入贮藏库或货车时，进行取样，以检验酶含量。所用的测试法如上所述，在本领域是已知的。当平均酶含量为100MU/吨，变异系数(CV)小于15％时，即获得了应用的成功。图2显示在一可生产高至50吨颗粒饲料/小时的饲料粉碎机上成功地进行数星期的酶应用的例子。

Claims

1.一种饲料组合物，包括(a)豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纤维素酶，其中，所述饲料组合物具有小于3086千卡/公斤的总平均可代谢能含量。

2.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，所述豆粉为大豆粉。

3.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，所述半纤维素酶是甘露聚糖酶。

4.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，所述甘露聚糖酶是保藏号为ATCC 55045的Bacillus lentus生产的内-1，4-β-D-甘露聚糖酶。

5.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，所述饲料组合物基本上不含浓缩脂肪。

6.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，添加的总脂肪含量小于2％。

7.如权利要求1所述的饲料组合物，其特征在于，添加的总脂肪含量小于1％。