ES2214273T3 - Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis. - Google Patents

Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis.

Info

Publication number
ES2214273T3
ES2214273T3 ES00928586T ES00928586T ES2214273T3 ES 2214273 T3 ES2214273 T3 ES 2214273T3 ES 00928586 T ES00928586 T ES 00928586T ES 00928586 T ES00928586 T ES 00928586T ES 2214273 T3 ES2214273 T3 ES 2214273T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
benzodiazepine
compounds
group
cells
atoms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00928586T
Other languages
English (en)
Inventor
Gary D. Glick
Anthony W. Opipari, Jr.
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Michigan
Original Assignee
University of Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Michigan filed Critical University of Michigan
Application granted granted Critical
Publication of ES2214273T3 publication Critical patent/ES2214273T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D243/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D243/06—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4
    • C07D243/10—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D243/14—1,4-Benzodiazepines; Hydrogenated 1,4-benzodiazepines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D243/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D243/06—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4
    • C07D243/10—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D243/14—1,4-Benzodiazepines; Hydrogenated 1,4-benzodiazepines
    • C07D243/16—1,4-Benzodiazepines; Hydrogenated 1,4-benzodiazepines substituted in position 5 by aryl radicals
    • C07D243/18—1,4-Benzodiazepines; Hydrogenated 1,4-benzodiazepines substituted in position 5 by aryl radicals substituted in position 2 by nitrogen, oxygen or sulfur atoms
    • C07D243/24—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Abstract

Utilización de un compuesto benzodiazepina para la fabricación de un medicamento para ser utilizado en el tratamiento de un trastorno autoinmune asociado con una incapacidad de las células de sufrir muerte celular a través de necrosis o apoptosis en un sujeto, en donde el compuesto benzodiazepina se selecciona a partir de compuestos de la siguiente fórmula:**(fórmula)**

Description

Utilización de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis.
Campo de la invención
La presente invención reside en el campo de la química médica y está relacionada con otras áreas, tales como la farmacología, la bioquímica y la química orgánica. En particular, la misma proporciona nuevos compuestos químicos y sus usos terapéuticos.
Antecedentes
Los organismos multicelulares ejercen un control preciso sobre el número de células. La estructura y el funcionamiento normal de los tejidos depende del mantenimiento de números de células adecuados. Un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular (White, E (1996) Genes Dev. 10:1-15) alcanza esta homeóstasis.
La muerte celular se produce en casi todos los tipos de células de vertebrado a través de necrosis o a través de una forma suicida de muerte celular, conocida como apoptosis. La apoptosis se desencadena a través de una diversidad de señales intracelulares y extracelulares que componen un mecanismo común de muerte programada genéticamente (Wyllie, A.H. (1995) Curr. Opin. Gen. Dev. 5:97-104). Al ser un proceso regulatorio, la apoptosis ejerce influencia sobre diversos fenómenos biológicos, incluyendo el desarrollo de la arquitectura nerviosa, la capacidad del sistema inmune de discriminar entre células propias y no propias, y la eliminación de las células infectadas, dañadas o redundantes.
Resulta evidente que muchas enfermedades han sido asociadas con la desregulación del proceso de muerte celular. Los modelos experimentales han establecido una relación causa efecto entre el desajuste en el mecanismo que regula la apoptosis o la necrosis y la patenogénesis de diversas enfermedades neoplásicas, autoinmunes y víricas (Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462). Un ejemplo bien definido lo constituye el efecto de la expresión aberrante, de elevado nivel de expresión de bcl-2 sobre el desarrollo de linfoma. El oncogen bcl-2 fue identificado originalmente como el elemento genético localizado en el punto de rotura translocacional del cromosoma t(14:18), presente en muchos linfomas foliculares de linfocitos B (Korsmeyer, SJ. (1992) Blood 359:554-556). Desde este descubrimiento, ha quedado establecido de una manera convincente que el producto del gen bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por una diversidad de estímulos y que su potencial oncogénico procede de su capacidad para hacer fracasar la apoptosis (Sentman, C.L. et al (1994) Cell 67:878-888; y McDonnell, T.J. y Korsmeyer, S.J. (1991) Nature 349:254-256).
La apoptosis nula o reducida se encuentra asociada con el desarrollo del síndrome linfoproliferativo autoinmune humano, al igual que con modelos de ratón de esta enfermedad. Los ratones MRL-lpr o gld desarrollan linfadenopatía, esplenomegalia, nefritis y artritis, al tiempo que producen grandes cantidades de autoanticuerpos (Cohen, P.L. y Eisenberg, R.A. (1991) Annu. Rev. Inmunol. 9:243-269).
Estos ratones son portadores de pérdida de mutaciones de funciones en los genes que codifican para FAS y ligando Fas, respectivamente (Adachi, M. Et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1756-1760); Takakashi, T. et al., (1994) Cell 76:969-976). El FAS, un receptor superficial celular ubicuamente expresado, genera normalmente una respuesta apoptótica después de la unión con el ligando Fas (Itoh, N. Et al., (1991) Cell 66:233-243). En ratones que son portadores de estas pérdidas de mutaciones funcionales, la interrupción de las señales FAS convierte a los linfocitos T en resistentes a la supresión periférica a través de apoptosis (Russell, H. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 4409-4413). La supervivencia inadecuada de estas células da como resultado una acumulación patológica de linfocitos B y T, puesta en evidencia a través del crecimiento de tipo neoplásico de tejidos linfoides y la producción de autoanticuerpos de nivel elevado. En humanos, el síndrome linfoproliferativo autoinmune comparte similitudes con el fenotipo de ratón, incluyendo linfodenopatía, esplenomegalia, autoanticuerpos y manifestaciones autoinmunes. Los pacientes con esta enfermedad son portadores similarmente de mutaciones en el gen FAS (Nagata, S. (1998) J. Hum. Genet. 43: 2-8).
Los compuestos benzodiazepinas han sido tradicionalmente conocidos por unirse a los receptores benzodiazepina en el sistema nervioso central (CNS) y por tanto han sido utilizados para tratar diversos trastornos del CNS, incluyendo ansiedad y epilepsia. Más recientemente, se han identificado también receptores periféricos de benzodiazepina, los cuales pueden también encontrarse presentes en el CNS. Las benzodiazepinas y estructuras relacionadas poseen propiedades pro-apópticas y citotóxicas que resultan de utilidad en el tratamiento de células transformadas cultivadas en cultivo de tejido. Existe un potencial terapéutico para esta clase de agentes contra el cáncer y otras enfermedades neoplásicas. El neuroblastoma y el cáncer de ovario constituyen dos ejemplos específicos mostrados.
El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más habitual en niños. Los tratamientos modernos, los cuales incluyen quimioterapia, terapia por radiación y cirugía, no han reducido de manera significativa la mortalidad provocada por neuroblastoma metastásico. Hacen falta nuevas terapias para mejorar la supervivencia de los niños afectados por esta enfermedad. Nosotros demostramos que los compuestos benzodiazepina son capaces de reducir el crecimiento de estas células tumorales. Ver, Sugimoto, T. Et al (1984) J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57; Schwab, M. et al (September 15, 1983) Nature 305: 245-248; y Dive, C. y Wyllie, A.H. (1993) Apootosis and Cancer.
El cáncer de ovario resulta difícil de tratar, debido a la resistencia a la quimioterapia mostrada por el paciente a los fármacos quimioterápicos estándar. Los fallos en el tratamiento son habitualmente atribuidos a la aparición de células resistentes a la quimioterapia. Nosotros demostramos que los compuestos benzodiazepina son capaces de destruir células de cáncer de ovario que son resistentes a la quimioterapia. Ver, Pestell, K.E. et al., (1998) Int. J. Cancer 77(6):913-918; Beale, P.J. et al (2000) Br. J. Cancer 82(2): 436-440; Ozols, R.F. (Feb. 1999) Semin Oncol 26(1 Suppl.2):84-89; Liu, J.R. et al (Sep 1998) Gynecol. Oncol 70(3):398-403; Chumakov, A.M. et al. (Nov.1993) Oncogene 8(11):3005-3011; y Raynaud, F.I. et al (Aug.1996) Br. J. Cancer 74(3):380-386.
Se ha informado acerca de que diversos análogos de benzodiazepina son agentes antiinflamatorios y analgésicos. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU Nºs. 4.076.823; 4.110.337; 4.495.101; 4.751.223 y 5.776.946.
Las patentes de EE.UU Nºs. 5.324.726 y 5.597.915 describen que algunas benzodiazepinas son antagonistas de la colecistoquinina y de la gastrina y, por consiguiente, podrían resultar de utilidad para el tratamiento de determinados trastornos gastrointestinales.
Determinadas benzodiazepinas han sido también exploradas como inhibidores de la elastasa neutrófila humana y, por consiguiente, como potencialmente útiles para tratar las dolencias mediadas por elastasa neutrófila humana, tales como la isquemia miocárdica, el síndrome de choque septicémico, entre otros. Ver la patente de EE.UU Nº. 5.861.380.
La patente de EE.UU Nº. 5.041.438 informaba al respecto de que determinadas benzodiazepinas podrían resultar de utilidad como agentes anti-retrovirales.
Tanimoto et al., 1999, Jpn J. Pharmaco., Vol. 79, pp. 177-183 (D1) describe estudios de los efectos de una benzodiazepina de tipo central (clonazepam) y de una benzodiazepina de tipo periférico (4'-clorodiazepam) sobre timocitos murinos.
Blum et al., 1991, Movement Disorders, Vol. 6, Nº. 1, pp. 12-20 (D2) describe casos de estudios de pacientes que padecen el "síndrome de la persona rígida" y que han sido tratados, entre otros, con uno o con ambos tipos de las benzodiazepinas de tipo central diazepam y clonazepam.
Taupin et al., 1991, Lymphokine and Cytokine Res., 1991, Vol. 10, Nº. 1, pp. 7-13 (D3) informan acerca de que los ligandos de tipo mezclado y periférico (clonazepam, diazepam, Ro-5-4864) interaccionan con receptores específicos de tipo periférico sobre fagocitos y refuerzan la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) inducida por lipopolisacárido (LPS) ye interleuquina-1 (IL-1).
Schlumpf et al,. 1994, Toxic. In vitro, Vol. 3; Nº. 5; pp. 1061-1065 (D4) informan al respecto de que la exposición anterior al nacimiento a un tipo de benzodiazepina central (diazepam) o a un agonista de receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PK11195, un derivado isoquinolina), da como resultado una depresión de larga duración de la respuesta inmune humoral y celular.
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., 1990, EP 0 349 949 (D5) describe 1,4-benzodiazepinonas específicas, las cuales son antagonistas de la colecistoquinina (CCK) y son propuestas como agentes terapéuticos para el tratamiento de la émesis, la pancreatitis, el control de la saciedad y el apetito, el control del dolor, el insulinoma, la gastroparesis, la colecistitis obstructiva aguda, el síndrome e colon irritable, el carcinoma de páncreas, etc.
Miller et al., 1998, Soc. Neurosci. Absts., Vol. 22, Nos. 1-2, p. 979 (382.14) (D6) describen que el diazepam y el imidacenilo (un compuesto tricíclico, específicamente una imidazobenzodiazepina), los cuales previenen la muerte neuronal por apoptosis y necrosis.
Malgrange et al., 1996, Neuroreport, Vol. 7 Nº. 18, pp. 3041-3045 (D7) pertenece a las beta-carbolinas y se refiere únicamente a diazepam en una descripción de una búsqueda relativa a posibles agentes que ofrecen protección frente a la neurotoxicidad inducida por beta-carbolinas.
Labotaroires UPSA, 1999, WO 99/29347 (D8) describe combinaciones farmacéuticas que opcionalmente comprenden benzodiazepinas, acerca de las cuales se manifiesta que "poseen propiedades ansiolíticas, relajantes musculares, anti-convulsivas e hipnóticas". Las benzodiazepinas citadas (prazepam, bromazepan, clordiazepóxido, lorazepam, clobazam y diazepam) son todas ellas conocidas como fármacos ansiolíticos y/o relajantes musculares y todas ellas son benzodiazepinas de tipo mezcla o de tipo central. Los únicos ejemplos que utilizan la benzodiazepina opcional (página 10 en el documento) utiliza diazepam.
Roussel-Uclaf, 1987, EP 0 227 539 (D9) describe un determinado número de benzodiazepinas (ver, por ejemplo, columna 3, líneas 20-27 en este documento; los nombres químicos completos de estos compuestos se mencionan en la columna 14 de la patente de EE.UU Nº. 5.550.124), los cuales se unen a receptores de benzodiazepina de elevada afinidad (afinidad submicromolar) a periférica y acerca de los cuales se informa de su utilidad como agentes antiinflamatorios.
McGeer et al., 1998, USP 5.776.946 (D10) pertenece a las triazolobenzodiazepinas (compuestos tricíclicos) los cuales, aparentemente, se preparan a partir de benzodiazepinas.
Walser et al., 1973, J. Org. Chem., Vol 38, Nº. 20, pp. 3502-3506 (D11) pertenece a la síntesis de pirrolobenzodiazepinas (compuestos tricíclicos) a partir de diversos intermedios, incluyendo determinados compuestos benzodiazepina, específicamente dos derivados de diazepam (compuestos 3f y 3g en el documento).
C.H. Boehringer, 1969, DE 1 810 423 (D12) describe la utilización de determinadas 1-fenil-1,4-benzodiazepin-2,5-dionas opcionalmente sustituidas, como agentes sedantes y anticonvulsivos.
Kim et al., 1998, J. Braz. Chem. Soc. Vol.9; Nº. 4; pp. 375-379 (D13) describen diversas 1,4-benzodiazepin-2-onas, las cuales aparentemente encuentran utilidad en el tratamiento de la enfermedad autoinmune lupus eritematoso generalizado.
Sanofi-Synthelabo, 1999, WO 99/58117 (D14) describe una gama de compuestos, incluyendo algunas 1,4-benzodiazepin-2-onas (clonazepam, flunitrazepam, diazepam, RO-5-4864, ver la Figura 1 en el presente documento), las cuales son ligandos para receptores periféricos de benzodiazepina y acerca de los cuales se indica encuentran utilidad para reducir la apoptosis.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona el uso de un compuesto benzodiazepina para la fabricación de un medicamento para ser utilizado en el tratamiento de un trastorno autoinmune asociado con una incapacidad de las células de sufrir muerte celular a través de necrosis o apoptosis en un sujeto, en donde el compuesto benzodiazepina es tal como se indica en la reivindicación 1.
La presente invención proporciona también compuestos benzodiazepinas, tal como se indica en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas, tal como se indica en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona también compuestos benzodiazepina para ser utilizados en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de composiciones farmacéuticas terapéuticas, tal como se indica en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona también compuestos benzodiazepina para ser utilizados en un procedimiento de tratamiento de un trastorno autoinmune asociado con una incapacidad de que las células sufran muerte celular a través de necrosis o de apoptosis en un sujeto, tal como se indica en las reivindicaciones.
En la presente documento se describen procedimientos para el tratamiento de una dolencia asociada con la disregulación del proceso de muerte celular en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto benzodiazepina. En un caso, las benzodiazepinas de la clase son identificadas a través de su incapacidad para unirse a un receptor central de benzodiazepina o con baja afinidad a un receptor periférico de benzodiazepina. En otro caso, las benzodiazepinas de la clase son identificadas por tener una capacidad de inducir muerte celular en condiciones de suero bajas, tal como se define, infra. En otro caso, las clases de benzodiazepinas son identificadas por tener ambas las dos características destacadas anteriormente. En otro caso, las dolencias inflamatorias crónicas están específicamente excluidas del grupo de dolencias que pueden ser tratadas a través de cualquier clase de compuestos específicos de la clase de benzodiazepina identificados en el presente documento.
La muerte celular puede ser inducida por necrosis, apoptosis o por regulación de la ruta FAS. Las condiciones asociadas con la disregulación de un proceso de muerte celular incluyen, sin que ello suponga una limitación, enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide, síndrome de Sjouml;gren, enfermedad de injerto contra huésped y miastenia grave, dolencias inflamatorias crónicas, tales como psoriasis, asma y enfermedad de Crohn; trastornos hiperproliferativos o neoplasmas, tales como linfomas de linfocitos B o de linfocitos T y otras dolencias tales como osteoartritis y ateroesclerosis. Se describen también procedimientos para la utilización de compuestos benzodiazepinas para el tratamiento de dolencias asociadas con la disregulación de la muerte celular, en los cuales la dolencia es inducida por una infección vírica. Además, se describen procedimientos para tratar una infección vírica a través de la utilización de benzodiazepinas.
Se describen también procedimientos para co-administrar uno o más agentes adicionales con las benzodiazepinas de la presente invención, pudiendo incluirse dentro de los citados agentes adicionales agentes antineoplásicos, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes antivíricos o radiación.
Para que a través de los procedimientos y composiciones descritas en la presente pueda alcanzarse la muerte celular, deben estar implicadas las células presentes en un tejido que sean: autoinmunogénicas o afectadas por un trastorno autoinmune; inflamatorias o afectadas por inflamación; hiperproliferativas; infectadas víricamente, con ateroesclerosis u osteoartritis.
Se han descrito también procedimientos de ensayo y de diagnosis para identificar agentes que resultan de utilidad para el tratamiento de una dolencia asociada con la disregulación del proceso de muerte celular en un sujeto, en donde la capacidad de un agente candidato potencial para inducir muerte celular es sometida a ensayo a través de la puesta en contacto de la células disregulada con un compuesto benzodiazepina. El ensayo incluye el mantenimiento de la célula o tejido adecuados preferiblemente en un suero bajo.
Se presentan también procedimientos para preparar medicamentos para tratar una dolencia asociada con la disregulación del proceso de muerte celular en un sujeto, en el cual las dolencias, las células afectadas o el tejido y los compuestos benzodiazepina se describen tal como se ha indicado anteriormente.
Estos diversos procedimientos, usos y composiciones son descritos adicionalmente más adelante con mayor detalle.
Breve descripción de los gráficos
La Figura 1 muestra un esquema sintético general para síntesis en fase sólida de compuestos 1,4-benzodiazepin-2-ona de la presente invención.
La Figura 2 muestra un esquema sintético general para la síntesis en fase sólida de compuestos 1,4-benzodiazepin-2,5-diona de la presente invención.
La Figura 3 detalla el análisis del avance de la enfermedad para ratones MRL-lpr tratados según los procedimientos descritos en el presente documento (línea sólida). Se representa el porcentaje de animales exentos de enfermedad (eje y) frente al tiempo (eje x).
Las Figuras 4A-4C detallan el hinchamiento de las plantas de los pies en ratones MRL-lpr tratados según los procedimientos descritos en el presente documento (Figura 4A), en comparación con los ratones control (Figura 4B). La Figura 4C constituye un análisis gráfico.
La Figura 5 muestra la estructura del compuesto 1 (Bz-423)
Las Figuras 6A-6B son gráficas que detallan el tratamiento in vivo de esplenocitos NZB/WC. La Figura 6A muestra la linfotoxicidad dosis-respuesta del Compuesto 1. La viabilidad relativa expresa las células viables después de tratamiento, en forma de porcentaje de células control viables para permitir una comparación significativa entre los experimentos múltiples. La Figura 6B muestra una comparación del Compuesto 1 con otros ligandos de receptores de benzodiazepina y la protección frente la destrucción por el compuesto por medio de CsA. Los compuestos fueron comparados a 10 y 20\muM, mostrándose los resultados a 10\muM. A 20\muM, tan solo el compuesto 1 demostró tener efecto citotóxico (datos no mostrados).
La Figura 7 detalla el análisis in vitro de poblaciones celulares. Las condiciones experimentales son idénticas a la Figura 6. Las barras sólidas representan el porcentaje de células viables teñidas con B220 (linfocitos B), después e tratamiento con el indicado agente. Las barras sombreadas representan células tenidas con Thy 1.2 (linfocitos T).
La Figura 8 es una serie de fotografías que muestran glomérulos representativos a partir de ratones NZB/W. Grupo 1-H&E, grupo 2-deposición de IgG, y grupo 3-deposición de C3 complementaria. La totalidad de las secciones fueron fotografiadas a 400X.
La Figura 9 muestra que el tratamiento con el Compuesto 1 evita el desarrollo de glomerulonefritis autoinmune. Las secciones de riñón teñidas con H&E fueron analizadas para conocer el grado de nefritis utilizando una escala 0-4. Las barras sólidas representan ratones con enfermedad (>2+) en el momento del sacrificio, mientras que las barras sombreadas representan ratones sanos (<2+); p<0,003.
La Figura 10 es una fotografía de secciones esplénicas representativas obtenidas a partir de ratones NZB/W. Grupo 1-secciones H&E de aumentos bajos (50X) que indican un descenso en el contenido linfoide en los ratones sometidos a tratamiento. El grupo 2- secciones de aumentos medios (200X) que indican números incrementados y grupos de células TUNEL positivo en los ratones sometidos a tratamiento. Grupo 3- secciones de aumentos elevados (400X) co-teñidas para células TUNEL positivo (verdes) y B220 (rojo) que indican números crecientes de células B220^{+} con TUNEL positivo en los ratones en tratamiento.
La Figura 11 es un gráfico de barras que detalla la eficacia de la utilización de benzodiazepinas para destruir las células neuroblastoma D2 in vitro.
La Figura 12 es un gráfico de barras que muestra que las células 2B1 y SKOV3 son resistentes a CDDP.
La Figura 13 es una gráfica que demuestra que las células de cáncer de ovario son destruidas mediante la aplicación de benzodiazepina in vitro.
Modos para llevar a cabo la invención
A lo largo de esta descripción se referencian diversas publicaciones, patentes y memorias de patentes publicadas a través de una cita identificativa. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y memorias de patentes publicadas son citadas con vistas a describir más plenamente el estado de la técnica al cual pertenece la invención.
A. Técnicas generales
La práctica de la presente invención utiliza, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química orgánica, farmacología, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales pertenecen al ámbito de conocimientos del experto en la materia. Las citadas técnicas son completamente explicadas en la literatura, tal como en "MOLECULAR CLONING: A LABORATOTY MANUAL", Second Edition (Sambrook et al., 1989); "OLIGNUCLEOTIDE SYNTHESIS" (M.J. Gait, ed. 1984); "ANIMAL CELL CULTURE" (R.I. Freshney, ed. 1987); las series "METHODS IN ENZYMOLOGY" (Academic Press, Inc); "HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, ed.); "GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" (F.M.Ausubel et al., eds. 1987, and periodic updates); "PCR: THE POLIMERASE CHAIN REACTION" (Mullis et al., eds. 1994); and "CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY" (J.E. Coligan et al., eds. 1991).
B. Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, determinados términos pueden tener los siguientes significados definidos. Tal como se utiliza en la memoria y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias al plural, salvo que del contexto se desprenda claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una diversidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. De manera similar, la utilización de "un compuesto" para el tratamiento o la preparación de medicamentos, tal como se describe en la presente, contempla la utilización de uno o más compuestos de esta invención para el citado tratamiento o preparación, salvo que del contexto se desprenda claramente lo contrario.
Tal como se utiliza en la presente, el término "comprende" pretende dar a entender que las composiciones y procedimientos incluyen los elementos citados, pero sin excluid a otros. "Consistente esencialmente en", cuando se utiliza para definir composiciones y procedimientos, significará que excluye a otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. Por lo tanto, una composición que consista esencialmente en los elementos tal como se definen en la presente no excluiría trazas de contaminantes procedentes del procedimiento de aislamiento y purificación y soportes farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes, y similares. "Consistente en" significará la exclusión de otros ingredientes presentes en cantidades superiores a la traza y pasos procedimentales sustanciales pata administrar la composición de esta invención.
Una "benzodiazepina" se refiere a un anillo heterocíclico no aromático de siete elementos fusionado a un anillo fenílico, en el cual el anillo de siete elementos tiene dos átomos de nitrógeno, formando parte del anillo heterocíclico. En algunos casos, los dos átomos de nitrógeno se encuentran en las posiciones 1 y 4, tal como se muestra en la siguiente estructura general:
1
La benzodiazepina puede estar sustituida por un grupo cetona (habitualmente en la posición 2), o por dos grupos cetona (cada uno de ellos en las posiciones 2 y 5). Cuando la benzodiazepina tiene dos grupos cetona ( a saber, cada uno de ellos en las posiciones 2 y 5), se la identifica como benzodiazepin-2,5-diona. Muy habitualmente, la benzodiazepina se encuentra adicionalmente sustituida ya sea en el anillo fenílico de seis elementos o en el anillo heterocíclico de siete elementos o en ambos anillos, a través de una diversidad de sustituyentes. Estos sustituyentes se describen con mayor detalle más adelante.
El término "disregulación de proceso de muerte celular" pretende abarcar cualquier aberración en la capacidad (o en la predisposición) de una célula de sufrir muerte celular a través de ya sea necrosis o apoptosis. La disregulación de la muestre celular está asociada con o es inducida por una serie de condicionantes, incluyendo por ejemplo, trastornos autoinmunes (por ejemplo, lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide, enfermedad injerto contra huésped, miastenia grave, síndrome de Sjögren, etc.), dolencias inflamatorias crónicas (por ejemplo, psoriasis, asma y enfermedad de Crohn), trastornos hiperproliferativos (por ejemplo, tumores, linfomas de linfocitos B, linfomas de linfocitos T, etc.), infecciones víricas (por ejemplo, herpes, papilloma, HIV) y otras dolencias tales como la osteoartritis y la ateroesclerosis.
Debe ser tenido en cuenta que cuando la disregulación es inducida por o está asociada con una infección vírica, la infección vírica puede ser o no detectable en el momento que tiene lugar la disregulación o en el que es observada. Es decir, la disregulación inducida por virus puede producirse incluso después de la desaparición de los síntomas de la infección vírica.
Un "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Entre los mamíferos se incluyen, sin que ello suponga una limitación, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales para deporte y mascotas.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para proporcionar los efectos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede ser administrada a través de una o más administraciones, aplicaciones o dosis.
Un "trastorno autoinmune" es cualquier dolencia en la cual un organismo produce anticuerpos o células inmunes las cuales reconocen las moléculas, células o tejidos del propio organismo. Entre los ejemplos no limitativos de trastornos autoinmunes se incluyen la artritis reumatoide, el síndrome de Sjögren, la enfermedad de injerto contra huésped, la miastenia grave, y el lupus eritematoso generalizado.
Un "trastorno hiperproliferativo" es cualquier trastorno en el cual una población localizada de células proliferativas en un animal no está gobernada mediante la limitación habitual del crecimiento normal. Entre los ejemplos de trastornos hiperproliferativos se incluyen tumores, neoplasmas, linfomas y similares. Se dice que un neoplasma es benigno si el mismo no sufre invasión o metástasis y maligno si hace cualquiera de las dos cosas. Una célula o tejido metastásico significa que la célula puede invadir y destruir estructuras corporales vecinas. La hiperplasia constituye una forma de proliferación celular que conlleva un incremento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. La metaplasia constituye una forma de crecimiento celular controlado en el cual un tipo de células diferenciadas es sustituido por otro tipo de células completamente diferenciadas. La metaplasia puede originarse en células del tejido conjuntivo o epitelial. Una metaplasia típica conlleva un epitelio metaplásico desordenado de alguna manera.
Una "dolencia inflamatoria crónica" significa aquella dolencia que se caracteriza por una respuesta inflamatoria persistente con secuelas patológicas. Este estado se caracteriza por la infiltración de células mononucleares, proliferación de fibroblastos y de pequeños vasos sanguíneos, incremento en el tejido conjuntivo y destrucción de tejido. Entre los ejemplos de enfermedades inflamatorias crónicas se incluyen la enfermedad de Crohn, la psoriasis y el asma. Enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso generalizado pueden también dar lugar a un estado inflamatorio crónico.
La "co-administración" se refiere a la administración de más de un agente o de terapia a un sujeto. Por "agente sensibilizante" se quiere dar a entender cualquier agente que incremente la sensibilidad de una célula o tejido objetivo para otros agentes terapéuticos. En el contexto de la presente invención, la co-administración de los compuestos reivindicados da como resultado un efecto terapéutico sorprendente e inesperado, particularmente en el tratamiento de dolencias en las cuales la apoptosis o necrosis se encuentra disregulada. Los compuestos descritos en la presente parecen también sensibilizar a las células objetivo para las acciones terapéuticas de otros agentes.
La co-administración puede ser simultánea o alternativa, los compuestos químicos descritos en la presente pueden ser administrados con antelación o después de la administración del otro agente(s). La dosis apropiada para la co-administración puede ser determinada rápidamente por los expertos en la materia. Cuando se administra simultáneamente con otro agente terapéutico, ambos agentes pueden ser utilizados a dosis más bajas. Por lo tanto, la co-administración resulta especialmente deseable cuando los compuestos reivindicados se utilizan para disminuir la dosis necesaria de agentes tóxicos conocidos. "Tóxico" se refiere a cualquier efecto dañino o perjudicial sobre una célula o un tejido.
Por "composición" se pretende dar a entender una combinación de agente activo y de otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un soporte sólido, un agente detectable o marca) o un ingrediente activo, tal como un adyuvante.
Tal como se utiliza en el presente documento, "soporte en fase sólida" o "soporte sólido", utilizado de manera intercambiable, no está limitado a un tipo específico de soporte. Un número bastante grande de soportes se encuentran disponibles y resultan conocidos por un experto ordinario en la materia. Entre los soportes en fase sólida se incluyen geles de sílice, resinas, películas plásticas derivatizadas, bolas de vidrio, algodón, bolas de plástico, geles de alúmina. Tal como se utiliza en la presente, en el término "soporte sólido" se incluyen también matrices sintéticas con presencia de antígeno, células y liposomas. Un soporte en fase sólida adecuado puede ser seleccionado en base al uso final deseado y a su adecuabilidad para diversos protocolos. Por ejemplo, para la síntesis de péptidos, el soporte en fase sólida puede referirse a resinas tales como poliestireno (por ejemplo, resina-PAM adquirida en Bachem, Inc, Península Laboratoires, etc.), resina POLYHIPE® (adquirida en Aminotech, Canada), resina de poliamida (adquirida en Peninsula Laboratoires), resina de poliestireno injertada con polietilenglicol (TentaGel®, Rapp Polymere, Tubingen, Germany) o resina de polidimetilacrilamida (adquirida en Milligen/Biosearch, California).
Una "composición farmacéutica" pretende incluir la combinación de un agente activo con un soporte, inerte o activo, que convierte a la composición en adecuada para uso en diagnosis o uso terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "soporte farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier soporte farmacéutico estándar, tal como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones, tales como emulsión aceite/agua o agua/aceite y diversos tipos de agentes humectantes. Las composiciones pueden también incluir estabilizadores y conservantes. Para ejemplos de soportes, estabilizadores y adyuvantes, ver la publicación de Martin REMINGTON, PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15th Ed.. Mack Publ. Co. Easton, PA (1975).
El término "sal, profármaco o derivado farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, está relacionado con cualquier tipo de sal, éster, éter, sal de un éster, solvato, tal como etanolato, u otro derivado de un compuesto de la presente invención, el cual, tras su administración a un receptor, resulta capaz de proporcionar (directa o indirectamente, en el caso de un profármaco) un compuesto de esta invención o un metabolito activo o uno de sus restos. Entre los derivados y profármacos particularmente favorecidos se encuentran aquellos que incrementan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando los citados compuestos son administrados a un mamífero (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado por vía oral sea absorbido más rápidamente en sangre) o que refuerzan el suministro del compuesto inicial a un compartimiento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático).
Tal como resulta conocido por los expertos en la materia, las "sales" de los compuestos descritas en el presente documento pueden ser obtenidas a partir de ácido y bases orgánicas e inorgánicas. Entre los ejemplos de ácidos se incluyen clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, p-toluensulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico y bencenosulfónico. Otros ácido, tales como el oxálico, si bien de por sí no son farmacéuticamente aceptables, pueden ser utilizados en la preparación de sales que resultan de utilidad como intermedios en la obtención de los compuestos descritos en la presente y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.
Entre los ejemplos de bases se encuentran los hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), hidróxidos de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amoníaco, y compuestos de fórmula NW_{4}^{+}, en la cual W es alquilo C_{1-4}. Entre los ejemplos de sales se incluyen: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención con un catión adecuado, tal como Na^{+}, NH_{4}^{+} y NW_{4}^{+} (en donde W es un grupo alquilo C_{1-4}).
Para uso terapéutico, las sales de los compuestos descritos en la presente serán farmacéuticamente aceptables. No obstante, las sales de los ácidos y las bases que no sean farmacéuticamente aceptables pueden también resultar de utilidad, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.
El término "derivado" de un compuesto, tal como se utiliza en el presente documento, significa un compuesto modificado químicamente en el cual las modificaciones químicas tienen lugar o bien en un grupo funcional del compuesto o sobre el anillo aromático. Entre los ejemplos no limitativos de derivados 1,4-benzodiazepina se incluyen grupos N-acetilo, N-metilo, N-hidroxi en cualquiera de los nitrógenos disponibles del compuesto. Derivados adicionales pueden incluir aquellos que tienen un grupo trifluorometilo sobre el anillo fenílico.
C. Procedimiento de tratamiento
El potencial terapéutico derivado de la utilización de benzodiazepina, debido a sus propiedades pro-apópticas y citotóxicas es grande. La clase de agentes resulta eficaz en el tratamiento de cánceres y otras enfermedades neoplásicas. Tal como se hace notar anteriormente, en el presente documento se describen procedimientos para el tratamiento de dolencias que están, en un caso, relacionados en el sentido de que surgen como resultado de la disregulacón del proceso normal de muerte celular en las células o tejidos de un sujeto.
Únicamente a efectos ilustrativos, entre las citadas dolencias se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, trastornos autoinmunes (por ejemplo, lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de Sjögren y miastenia grave); trastornos hiperproliferativos, (tales como linfoma de linfocitos B o de linfocitos T, neuroblastoma, y leucemia linfocítica crónica); dolencias inflamatorias crónicas (tales como psoriasis, asma, o enfermedad de Crohn); otras dolencias tales como osteoartritis y ateroesclerosis; y aquellas inducidas por infecciones víricas de DNA y/o RNA, en las cuales entre los virus se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, virus de herpes, virus papilloma, y virus de inmunodeficiencia humana (HIV).
Estos trastornos son tratados por medio de la administración de una cantidad eficaz de los compuestos benzodiazepina descritos en la presente. Los diversos compuestos benzodiazepina son descritos más adelante con mayor detalle. Estos compuestos resultan terapéuticamente eficaces de por sí, y tienen nulos o escasos efectos tóxicos cuando son administrados a grandes dosis. Además, tal como se describe en detalle más adelante, la co-administración de estos compuestos con otros agentes proporciona un beneficio terapéutico sinérgico inesperado. En procedimientos de co-administración, los compuestos reivindicados resultan también de utilidad para la reducción de efectos secundarios nocivos de los agentes terapéuticos conocidos, por medio de la disminución de la cantidad que tiene que ser administrada al sujeto.
Las dolencias que resultan beneficiadas del tratamiento con los compuestos descritos en la presente parecen compartir la etiología común de la disregulación del proceso de muerte celular. Tal como se ha descrito anteriormente en los antecedentes, la apoptosis normal tiene lugar a través de diversas vías, teniendo cada una de ellas múltiples pasos. Los procedimientos descritos en la presente resultan de utilidad en el tratamiento de la apoptosis disregulada, con independencia de la ruta o del paso de la ruta en el cual se ha producido la disregulación. En un caso, la dolencia surge como resultado de la disregulación de la ruta apóptica FAS. De manera similar, los compuestos resultan también de utilidad para el tratamiento de necrosis disregulada, con independencia de la ruta o del paso de la ruta en el cual ha tenido lugar la disregulación.
La disregulación del proceso de muestre celular está asociada con muchas dolencias. En neoplasmas, por ejemplo, resulta inhibida la muerte celular normal, permitiéndose el crecimiento hiperproliferativo de las células. El funcionamiento aberrante de este proceso puede también dar como resultado graves patologías, incluyendo trastornos autoinmunes, infecciones víricas, dolencias inducidas por infecciones víricas, enfermedad neurodegenerativa y similares. En el presente documento se describen procedimientos para el tratamiento de estas y de otras dolencias. Sin que ello suponga estar atado por ninguna teoría, parece que los compuestos eficaces descritos en el presente documento inducen o favorecen la muerte celular cuando este proceso funciona incorrectamente. Por lo tanto, además de tratar estas dolencias asociadas con la disregulación de la apoptosis, los compuestos descritos en el presente documento también tratan dolencias en las cuales puede que no exista ningún defecto apóptico, la muerte celular puede ser favorecida por medio de la inducción de necrosis.
La dolencia que tiene que ser tratada es determinada generalmente por medio de la consideración de los síntomas del sujeto o a través de la consideración de los cambios en el fenotipo o en el genotipo en las células del sujeto, en particular, la incapacidad de que las células sufran apoptosis o necrosis. Entre los cambios en el fenotipo asociados con el estado de neoplasia de una célula (un juego de características in vitro asociadas con una capacidad de generación de tumores in vivo) se incluyen una morfología celular más redondeada, una unión al sustrato más débil, pérdida de inhibición por contacto, pérdida de dependencia de anclaje, liberación de proteasas, incremento en el transporte de azúcar, disminución en las necesidades de suero, expresión de antígenos fetales, etc. Ver Luria et al., (1978) GENERAL VIROLOGY, 3rd. Edition, pp. 436-446 (John Wiley & Sons, New York). Por el término "tratamiento" se entiende en el presente documento la inducción de muerte celular (en donde la muerte celular es o bien apóptica o necrótica) en células o tejidos que son los causantes (principales o distales) del trastorno que está siendo tratado. Por ejemplo, en trastornos hiperproliferativos, el procedimiento tratará el trastorno mediante la inducción de apoptosis de las células hiperproliferativas, tales como células neoplásicas. En este caso, la reducción en el tamaño o en la carga del tumor es uno de los medios de que se dispone para identificar que el objetivo del procedimiento ha sido logrado. En otros casos, "tratar" abarca la recuperación de la función inmune o la regulación de la disfunción inmune, tanto en trastornos autoinmunes como en dolencias inflamatorias crónicas. En otros casos, el nivel vírico es eliminado o reducido en el sujeto que está siendo tratado. En casos adicionales, "tratar" significa mejorar los síntomas asociados con una particular enfermedad, por ejemplo, caquexia en cáncer o infección HIV o inflamación en artritis. En todavía casos adicionales, se pretende obtener un uso profiláctico, al igual que terapéutico, de los compuestos y procedimientos descritos en el presente documento.
En la realización en la cual la dolencia que está siendo tratada es una enfermedad autoinmune, el uso de los procedimientos descritos en el presente documento reducirá la producción de autoanticuerpos y conducirá a un descenso en la inflamación y en la destrucción de tejidos. Por lo tanto, la célula que está siendo tratada puede ser la célula que de pos sí es autoinmunogénica o está afectada distalmente por una reacción autoinmune, en donde resulta deseable inducir muerte celular en las citadas células o tejidos que contienen las células en cuestión. De manera similar, en el caso de tratamiento de dolencias inflamatorias, la célula que está siendo tratada puede ser la propia célula inflamatoria o está afectada distalmente por la inflamación cuando resulta deseable inducir la muerte celular en las citadas células o tejido que contiene tales células, reduciendo por tanto la inflamación.
En una nueva realización, la célula que está siendo tratada es una célula infectada por virus o una célula o tejido que ha sido infectado previamente. La terapia exitosa induce la muerte celular y por lo tanto una reducción en el nivel vírico. Este resultado es determinado fácilmente sometiendo a ensayo el nivel vírico o tomando nota de una reducción en el número de células. Debe ser tenido en cuenta que, tal como puede ser deducido a partir las declaraciones, supra, puede ser deseable inducir la muerte celular incluso entre aquellas células que no tienen ningún remanente vírico u otras señales de infecciones víricas en el momento del tratamiento, debido a que una infección vírica ocurrida mucho más atrás en el tiempo podría todavía provocar la interrupción de la muerte celular en un momento mucho más
tardío.
La muerte celular puede ser comprobada en ensayo tal como se describe en el presente documento y en el estado de la técnica. Las líneas celulares son mantenidas en condiciones de cultivo adecuadas (por ejemplo, gas (CO_{2}), temperatura y medios) y durante una cantidad de tiempo adecuada para alcanzar la proliferación exponencial sin restricciones dependientes de la densidad. El número de células y /o la viabilidad pueden ser medidas utilizando técnicas estándar, tales como la hemocitometría/exclusión de azul tripano, o el ensayo de conversión de colorante MTT. De manera alternativa, la célula puede ser analizada en búsqueda de la expresión de los genes o de los productos genéticos asociados con aberraciones en apoptosis o necrosis.
Debe quedar claro que los diversos trastornos disregulatorios descritos anteriormente pueden ser tratados mediante uno o más de los compuestos benzodiazepina, incluyendo las muchas alternativas y los compuestos específicos presentes en el este documento. Estas benzodiazepinas son descritas con mayor detalle más adelante.
Actividad antivírica
En otra realización, los compuestos descritos en el presente documento pueden presentar actividad antivírica, con independencia de su eficacia para inducir muerte celular. En el presente documento se describe un procedimiento para la inhibición de la replicación vírica y/o la propagación, el cual comprende la puesta en contacto del virus con una cantidad eficaz de uno o más compuestos y/o composiciones, tal como se describe en el presente documento. La puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para inhibir la replicación vírica y/o la propagación. En el presente documento se describe también un procedimiento que comprende el evitar que se produzca una infección y/o la propagación vírica en una célula o tejido, mediante la puesta en contacto de la célula o tejido con una cantidad eficaz de los compuestos o de las composiciones tal como se han definido anteriormente. La puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para lograr la citada inhibición y/o propagación vírica.
En la inhibición o prevención de infección vírica, la replicación y/o propagación pueden ser medidas mediante el sometimiento a ensayo del nivel vírico, procedimientos estos que resultan bien conocidos por los expertos en la materia. A través de la inhibición y de la reducción de la replicación y de la proliferación vírica, resulta también inhibida y reducida la infectividad, y las células huésped son adecuadamente tratadas en lo concerniente a la infección vírica, con el beneficio adicional de que resultan también tratadas las patologías asociadas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "condiciones adecuadas" incluye las condiciones in vitro, ex vivo o in vivo. Estos términos resultan perfectamente conocidos en el estado de la técnica.
Entre los virus que son contemplados en los presentes procedimientos se incluyen los virus RNA y/o DNA. Tan sólo a modo de ejemplo, los citados virus tienen su origen en herpes, no herpes y retrovirus. Entre los principales ejemplos de patógenos humanos de la familia de los virus tipo herpes se incluyen los virus simplex herpes (HSV) 1,2 y los virus herpes cercopitecino 1 (virus-B), el varicela-zoster, el virus Epstein-Barr (EBV); el linfocriptovirus, los virus herpes humanos 6-8 (HHV6-S); los virus herpes asociados con Kaposi ( los herpervirus simiae y los citomegavirus humanos (HCMV). Ver, por ejemplo, Gallant, J.E. et al., J. Infect. Dis. 166: 1223-1227, (1992).
Entre los patógenos animales de origen herpesvírico se incluyen el virus rhinotracheitis bovino, el virus mammillitis bovino y el virus herpes cercopitecino (virus-B), entre otros.
Entre los virus humanos de origen no herpes se incluyen los virus de la gripe A, B y C; los virus para-gripe, el virus coxsakie, el virus echo, el virus de la rubeola, los virus de la hepatitis de tipo B y C (HBV y HCV); y los papovavirus.
Entre los virus animales de origen no herpes se incluyen el virus pseudorabies (PRV, porcino), el rhinopneumonitis equino, los virus de exantema coital (virus varicela); linfocriptovirus, el virus de la enfermedad de Marek, el herpesvirus-1 bovino (BHV-1) y el herpesvirus pseudorabies (PRV).
Entre los virus de origen retrovírico que son contemplados como tratables por medio de los compuestos y composiciones descritas en el presente documento se incluyen los virus de inmunodeficiencia humana (HIV) de los tipos 1 y 2 y los virus linfotrópicos humanos 1 y 2 (HTLV-1 y II).
D. Procedimientos para identificar potenciales agentes terapéuticos
En el presente documento se describe también un ensayo para identificar un agente potencial para el tratamiento de una dolencia asociada con la disregulación de la ruta de apoptosis o necrosis. El procedimiento comprende la puesta en contacto de la célula disregulada, a saber, la célula afectada por el trastorno (por ejemplo, una célula tumoral cuando la dolencia es de tipo hiperproliferativo) o una célula inmune (un neutrófilo, basófilo, eosinófilo, monocito o linfocito) cuando la dolencia es una dolencia inflamatoria de tipo crónico o un trastorno autoinmune) con el agente. En un caso, una célula control es sometida a un ensayo adicional con o sin un compuesto benzodiazepina. El compuesto benzodiazepina puede ser un compuesto 1,4-benzodiazepina, tal como los que se describen en el presente documento. Se toma nota de la muerte celular en comparación con las células control. Para identificar estos agentes terapéuticos potenciales, las condiciones de ensayo adecuadas (por ejemplo, tiempo de incubación, temperatura, medio de mantenimiento de cultivo, etc) pueden ser determinadas rápidamente por medio de un experto en la materia. El suero puede ser obtenido a partir de cualquier fuente de suministro comercial, por ejemplo, el suero fetal bovino en Gibco BRL (Gaithersburg, MD). Las células son cultivadas con el agente de comprobación durante un período de tiempo suficiente. Una vez transcurrido el período de incubación apropiado, puede someterse a ensayo la muerte celular a través de cualquier medio descrito anteriormente, por ejemplo, a través de exclusión de colorante tripano MTT. Por lo tanto, los nuevos agentes citotóxicos pueden ser identificados por su capacidad de inducir muerte celular en las células disreguladas. Además, pueden efectuarse también comparaciones con la muerte celular en células control.
Los inventores han descubierto que cuando las células son mantenidas en condiciones bajas de suero, la citotoxicidad resulta exacerbada en gran manera y el período de incubación se reduce hasta aproximadamente 2 horas o menos. Este constituye un resultado inesperado dado que, bajo condiciones de incubación estándar, las cuales utilizan niveles de suero más elevados, el período de incubación necesario es a menudo de varias horas, acercándose, en algunos casos, a las 24 horas o más. El término "suero bajo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a medios de cultivo que contienen entre menos de aproximadamente el 10% en volumen e igual o menos de aproximadamente el 0,1 en volumen. Debe darse por entendido que dentro de esta banda la concentración es flexible y los solicitantes contemplan cualquier posible sub-banda con incrementos de aproximadamente el 0,1% dentro de la banda, por ejemplo, menos de o igual a aproximadamente cualquiera de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;0,6;0,7; 0,8;...1,0;....1,5;...2,0;....2,5;...3,0;...3,5;....5%, etc hasta aproximadamente 9,9, y hasta aproximadamente el 10% de suero (% en volumen).
Por lo tanto, en un aspecto, las benzodiazepinas descritas en el presente documento inducen apoptosis en suero bajo, tal como se ha definido anteriormente.
En un aspecto adicional, las benzodiazepinas descritas en el presente documento son caracterizadas adicionalmente por su falta de capacidad de unión a los receptores periféricos de la benzodiazepina. Estos compuestos pueden ser identificados utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica.
Por ejemplo, la capacidad de unión de una benzodiazepina para un receptor periférico de la benzodiazepina puede ser determinada, según la bien establecida metodología descrita en Schoemaker, H. et al., (1983) J. Pharm. Exp. Ther. 225:61-69; y Doble, A. et al., (1987) Brain Res. Bull. 18:49-61.
Brevemente, el procedimiento comprende la comparación de la potencia de un compuesto benzodiazepina con la de un agente de unión de una bien conocida elevada afinidad, tal como 1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolinocarboxamida (PK 11195), en el cual la capacidad del compuesto benzodiazepina de desplazar al PK 11195 desde los receptores periféricos de benzodiazepina, en un ensayo de unión comparativo.
En cualquiera de los procedimientos de ensayo mencionados anteriormente, el compuesto benzodiazepina puede ser marcado de una manera detectable. Dentro de los marcajes detectables se incluye el marcaje con un isótopo o con un resto fluorescente. Entre los ejemplos de marcaje con isótopo se incluye la utilización de isótopos radioactivos de uno o más átomos sobre la molécula de benzodiazepina.
Los procedimientos para la introducción de marcas detectables y para la detección de las marcas son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, la marca radioisótopo puede ser detectada utilizando una instrumentación especial, incluyendo espectrómetros de resonancia de rotación de electrón. Los isótopos estables pueden ser detectados utilizando espectrómetros de masa o espectrómetros de resonancia magnética. Las marcas fluorescentes pueden ser detectadas utilizando espectrómetros fluorescentes. Muchos de estos instrumentos se encuentran disponibles comercialmente y su operatividad cae dentro de la práctica de un experto ordinario en la materia.
Los compuestos benzodiazepina que pueden ser utilizados en los procedimientos de ensayo y de diagnosis se describen más adelante con mayor detalle. Debe darse por entendido que la totalidad de compuestos descritos en el presente documento, incluyendo muchas de las realizaciones generales y específicas, pueden ser utilizados en la metodología de ensayo y diagnóstico.
E. Uso de compuestos benzodiazepina para la preparación de medicamentos
Los compuestos benzodiazepina descritos en el presente documento resultan también de utilidad en la preparación de medicamentos para tratar una diversidad de dolencias asociadas con la disregulación de la muerte celular, tal como se ha descrito anteriormente. Además, los compuestos pueden también ser utilizados para la preparación de medicamentos para el tratamiento de otros trastornos, en los cuales la eficacia de las benzodiazepinas es conocida o resulta predecible. Entre los citados trastornos pueden incluirse los trastornos neurológicos o neuromusculares. Los procedimientos y las técnicas utilizadas para la preparación de medicamentos de un compuesto resultan bien conocidos en el estado de la técnica. Algunas de las posibles formulaciones farmacéuticas y de las vías de suministro se detallan más adelante.
Por lo tanto, un experto en la materia se daría cuenta rápidamente de que cualquiera de los compuestos descritos más adelante con mayor detalle, incluyendo las muchas realizaciones específicas, puede ser utilizado, mediante la aplicación de procedimientos de fabricación farmacéutica estándar, para tratar muchos de los trastornos descritos anteriormente en el presente documento. Los citados medicamentos pueden ser suministrados al sujeto utilizando procedimientos de aporte que resultan bien conocidos en la tecnología farmacéutica.
F. Composiciones y formulaciones
Si bien resulta posible administrar el agente en solitario, es mejor presentarlo en forma de formulación farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo, tal como se ha definido anteriormente, conjuntamente con un soporte sólido o, de forma alternativa, conjuntamente con uno o más soportes para los mismos que resulten farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Cada uno de los soportes tiene que ser "aceptable", en el sentido de ser compatible con los restantes ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente.
Entre las formulaciones se incluyen aquellas que resultan adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo la transdérmica, la bucal y la sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo la subcutánea, la intramuscular, la intravenosa y la intradérmica) y pulmonar. La formulación puede ser presentada de manera conveniente en forma de dosis unitaria y preparada a través de cualquier procedimiento perfectamente conocido en el campo de la técnica de la farmacia. Entre los citados procedimientos se incluye el paso de poner en asociación el ingrediente activo con el soporte, lo cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son preparadas poniendo en contacto intimo y uniforme el ingrediente activo con los soportes líquidos o los soportes sólidos finamente divididos o con ambos y, después, si resulta necesario, dar forma al producto.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden ser presentadas en forma de unidades discretas, tales como cápsulas, cápsulas lisas o comprimidos, conteniendo cada uno de ellos una cantidad predeterminada de ingrediente activo; en forma de polvo o de gránulos, en forma de solución o de suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de emulsión líquida aceite en agua o de emulsión líquida agua en aceite. El ingrediente activo puede también ser presentado en forma de inyección intravenosa rápida, electuario o pasta.
Puede prepararse un comprimido por medio de compresión o de moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos sometidos a compresión pueden ser preparados comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo bajo una forma que aporte libertad de fluidez, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo, almidón glicolato sódico, povidona reticulada, carboximetilcelulosa sódica reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden ser preparados mediante el moldeado en una máquina adecuada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente recubiertos o ser marcados y pueden ser formulados de tal forma que proporcionen una liberación lenta o controlada del ingrediente activo, utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en diversas proporciones, para proporcionar el perfil de liberación deseado. Opcionalmente, los comprimidos pueden ser proporcionados con un revestimiento entérico, para obtener una liberación parcial en partes del intestino, más que en el estómago.
Entre las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca se incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una bases aromatizada, habitualmente sucrosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sucrosa y acacia; y colutorios que comprenden el ingrediente activo en un soporte líquido adecuado.
Las composiciones farmacéuticas para administración tópica pueden ser formuladas en forma de ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, solución, pasta, gel, spray, aerosol o aceite. De manera alternativa, una formulación puede comprender un parche o apósito, tal como un vendaje o emplasto adhesivo impregnado con ingredientes activos y, opcionalmente, uno o más excipientes o diluyentes.
Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30% en peso de un alcohol polihídrico, a saber, un alcohol que tenga dos o más grupos hidroxilo tal como propilenglicol, butano-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol, y polietilenglicol o mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir, de manera deseable, un compuesto que refuerce la absorción o la penetración del agente a través de la piel o de otras áreas afectadas. Entre los ejemplos de los citados reforzadores de penetración dérmica se incluyen el dimetilsulfóxido (DMSO) y análogos relacionados.
La fase aceitosa de las emulsiones puede estar constituida por ingredientes conocidos, de una forma ya sabida. Si bien esta fase puede comprender simplemente un emulsionante (conocido por otra parte como un emulgente), de manera deseable comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o aceite o con, a la vez, una grasa y un aceite.
Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo conjuntamente con un emulsionante lipófilo, el cual actúa como estabilizador. Resulta también preferido incluir, a la vez, un aceite y una grasa. Conjuntamente, el emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) constituye la así denominada cera emulsionante y la cera, conjuntamente con el aceite y/o la grasa, constituye la así denominada base de ungüento emulsionante, la cual forma la fase dispersada aceitosa de las formulaciones en crema.
Entre los estabilizadores emulgentes y las emulsiones adecuadas para ser utilizadas en las formulaciones se incluyen el Tween 60, el Span 80, el alcohol cetostearilo, al alcohol miristilo, el monoestearato de glicerilo y el laurilsulfato sódico.
La elección de aceites y grasas adecuados para la formulación se basa en la obtención de las propiedades cosméticas deseadas, dado que la solubilidad del compuesto activo en la mayoría de los aceites que tienen que ser utilizados en las formulaciones de emulsión farmacéutica es muy baja. Por lo tanto, la crema debería ser preferiblemente un producto no grasoso, lavable y que no tiña, con la consistencia adecuada para evitar pérdidas procedentes de los tubos o de otros envases. Pueden ser utilizados ésteres alquílicos mono o dibásicos, de cadena lineal o ramificada, tales como disoadipato, estearato de isoacetilo, diésteres de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo, o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocida como Cromadol CAP, siendo los tres últimos los ésteres preferidos. Estos pueden ser utilizados en solitario o en combinación, en función de las propiedades requeridas. De manera alternativa, pueden ser utilizados lípidos de punto de fusión elevado, tales como aceites de parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales.
Entre las formulaciones adecuadas para administración tópica ocular se incluyen gotas para ojos, en las cuales el ingrediente activo se encuentra disuelto o suspendido en un soporte adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el agente.
Las formulaciones para administración rectal pueden ser presentadas en forma de supositorios con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o salicilato.
Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden ser presentadas en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones para rociado que contienen, además del agente, los soportes conocidos en el campo de la técnica que resulten adecuados.
Entre las formulaciones adecuadas para administración nasal en las cuales el soporte es un sólido se incluye un polvo basto con un tamaño de partícula comprendido, por ejemplo, en la banda de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 500 micras, el cual es administrado según la manera en la cual la materia aspirada es ingerida, a saber, mediante inhalación rápida a través del paso nasal a partir de un recipiente que contiene el polvo mantenido cerca de la nariz,. Entre las formulaciones adecuadas en las cuales el soporte es un líquido para administración, tal como por ejemplo un spray nasal, gotas nasales o a través de administración de aerosol a través de nebulizador se incluyen soluciones acuosas o soluciones aceitosas del agente.
Entre las formulaciones adecuadas para administración parenteral se incluyen soluciones para inyección estéril isotónicas acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, y solutos que convierten a la formulación en isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden incluir agentes en suspensión y agentes espesantes; y liposomas u otros sistemas microparticulados los cuales están diseñados para dirigir el compuesto hacia los componentes de la sangre o hacia uno o más órganos. Las formulaciones puede ser presentada en forma de recipientes cerrados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden ser almacenadas en estado liofilizado, requiriéndose tan solo la adición del soporte líquido estéril, por ejemplo, agua para inyectables, inmediatamente antes de su utilización. A partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente pueden prepararse soluciones y suspensiones extemporáneas.
Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, una subdosis diaria, tal como se he indicado anteriormente en el presente documento, o una fracción adecuada de la misma, de un agente.
Debe darse por entendido que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones pueden incluir oros agentes convencionales en la técnica, haciendo referencia al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellas adecuadas para la administración oral pueden incluir agentes tales como edulcorantes, espesantes, y aromatizantes. Se pretende también que los agentes, composiciones y procedimientos descritos en el presente documento sean combinados con otras composiciones y terapias adecuadas.
G. Suministro farmacéutico
Se conocen diversos sistemas de suministro y los mismos pueden ser utilizados para administrar un agente terapéutico descrito en el presente documento por ejemplo, la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu and Wu (1987), J. Biol. Chem. 262: 4429- 4432) y similares. Entre los procedimientos de suministro se incluyen, sin que ello suponga una limitación, la ruta intra-arterial, intramuscular, intravenosa, intranasal y oral. En una realización específica puede resultar deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en el área que necesite el tratamiento; esto puede ser logrado, por ejemplo, a través de limitación, infusión local durante cirugía, a través de inyección o por medio de un catéter.
Los agentes identificados en el presente documento, eficaces para el propósito pretendido, pueden ser administrados a sujetos o individuos susceptibles de desarrollar o en riesgo de padecer una dolencia correlacionada con la disregulación de la ruta apoptópica o necrótica. Cuando el agente es administrado a un sujeto tal como un ratón, una rata o un paciente humano, el agente puede ser añadido a un soporte farmacéuticamente aceptable y administrado a un sujeto de forma tópica o generalizada. Para determinar los pacientes que pueden ser tratados de manera beneficiosa, se extrae una muestra de tejido del paciente y se somete a ensayo a las células para determinar la sensibilidad para el agente.
Las cantidades terapéuticas pueden ser determinadas de manera empírica y variarán con la patología que esta siendo tratada, el sujeto que está siendo tratado y la eficacia y toxicidad del agente. Cuando se suministra a un animal, el procedimiento resulta de utilidad para confirmar, adicionalmente, la eficacia del agente. Un ejemplo de un modelo animal es MLR/MpJ-lpr/lpr ("MLR-lpr") (disponible en Jackson Laboratoires, Bal Harbor, Maine). Los ratones MLR-lpr desarrollan una enfermedad autoinmune generalizada. De manera alternativa, pueden desarrollarse otros modelos animales mediante la inducción de crecimiento tumoral, por ejemplo, mediante la inoculación subcutánea a ratones atímicos de entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{9} células objetivo, cancerígenas o hiperproliferativas, tal como se definen en el presente documento. Cuando se establece el tumor, los compuestos descritos en el presente documento son administrados, por ejemplo, a través de inyección subcutánea alrededor del tumor. Las mediciones tumorales para determinar la reducción del tamaño del tumor se hacen en dos dimensiones, utilizando calibradores, venosos dos veces por semana. Otros modelos animales pueden ser también utilizados según resulte apropiado. Los citados modelos animales para las enfermedades y dolencias descritas anteriormente, resultan bien conocidos en el estado de la técnica. Ver, por ejemplo, (1992) Am. J. Pathol. 36:875-882.
La administración in vivo puede ser efectuada en una sola dosis, de manera continua o intermitente, durante el transcurso del tratamiento. Los procedimientos para la determinación de los medios más eficaces de administración son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán en función de la composición utilizada en terapia, el propósito de la terapia, la célula objetivo que esté siendo tratada y el sujeto que esté siendo tratado. Las administraciones únicas o múltiples pueden ser llevadas a cabo con los niveles y patrones seleccionados por los doctores responsables del tratamiento.
Las formulaciones de dosificación adecuadas y los procedimientos para la administración de los agentes pueden ser determinados rápidamente por los expertos en la materia. Preferiblemente, los compuestos son administrados a razón de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg e incluso más preferiblemente a razón de entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg. Cuando los compuestos descritos en el presente documento son administrados en paralelo con otro agente (por ejemplo, como agentes sensibilizantes), la cantidad eficaz puede ser inferior a la utilizada en caso de utilización en solitario.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas de forma oral, intranasal, parenteral o mediante terapia de inhalación, y pueden adoptar la forma de comprimidos, pastillas, gránulos, cápsulas, píldoras, ampollas, supositorios, o aerosoles. Pueden también adoptar la forma de suspensiones, soluciones y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos. Además del agente de la presente invención, las composiciones farmacéuticas pueden contener también otros compuestos farmacéuticamente activos o una diversidad de compuestos de la invención.
Más particularmente, un agente tal como los que se describen en el presente documento, también referido en el presente documento como el ingrediente activo, puede ser administrado para terapia a través de cualquier ruta que resulte adecuada, incluyendo la oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo la transdérmica, aerosol, bucal o sublingual) y pulmonar. Será también tenido en cuenta que la ruta preferida variará en función de la dolencia y de la edad del receptor y de la enfermedad que esté siendo tratada.
De forma ideal, el agente debe ser administrado para alcanzar concentraciones pico de compuesto activo en los puntos de la enfermedad. Esto puede ser logrado, por ejemplo, a través de inyección intravenosa del agente, opcionalmente en solución salina, o administrado por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimido, cápsula o jarabe que contiene el ingrediente activo.
Los niveles deseables de agente en sangre pueden ser mantenidos a través de infusión continua para proporcionar una cantidad terapéutica del ingrediente activo dentro el tejido de la enfermedad. La utilización de combinaciones operativas es contemplada para proporcionar combinaciones terapéuticas que requieren una dosificación total más baja de cada uno de los componentes agentes antivíricos que pueden resultar necesarios cuando cada uno de los compuestos o fármacos terapéuticos individuales es utilizado en solitario, reduciéndose con ello los efectos adversos.
H. Co-administración
En el presente documento se describen también procedimientos que conllevan la co-administración de los compuestos descritos en este documento con uno o más agentes activos adicionales. En el presente documento se describen también procedimientos para reforzar terapias existentes en el estado de la técnica y/o composiciones farmacéuticas, a través de la co-administración de un compuesto. En los procedimientos de co-administración, los agentes pueden ser administrados de forma concurrente o secuencial. En un caso, los compuestos descritos en el presente documento son administrados con anterioridad al otro agente(s) activo(s). Las formulaciones farmacéuticas y los modos de administración pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente. Además, los dos o más agentes químicos, biológicos, o la radiación, administrados en paralelo pueden, cada uno de ellos, ser administrados utilizando diferentes modos o diferentes formulaciones.
El agente o agentes que tienen que ser co-administrados dependerán del tipo de dolencias que estén siendo tratadas. Por ejemplo, cuando la dolencia que está siendo tratada es la hiperproliferación, el agente adicional puede ser un agente de quimioterapia o radiación. Cuando la dolencia que está siendo tratada es un trastorno autoinmune, el agente adicional puede ser un inmunosupresor o un agente antiiflamatorio. Cuando la dolencia que está siendo tratada es una inflamación crónica, el agente adicional puede ser cualquier agente antiinflamatorio. Cuando la dolencia que está siendo tratada es una infección o dolencia vírica, inducida a través de una infección vírica, el agente adicional puede ser un agente antivírico. Los agentes adicionales que tienen que ser co-administrados, tales como los agentes anticancerígenos, inmunosupresores, antiinflamatorios y antivíricos, pueden ser cualquiera de los agentes perfectamente conocidos en el estado de la técnica, incluyendo aquellos que son habitualmente conocidos en uso clínico. La determinación del tipo adecuado y de la dosis del tratamiento de radiación se incluyen también dentro del estado de la técnica o pueden ser determinadas con relativa facilidad.
En la actualidad, el tratamiento de las diversas dolencias asociadas con apoptosis anormal se encuentra limitado por los siguientes dos importantes factores: (1) el desarrollo de la resistencia al fármaco y (2) la toxicidad de los agentes terapéuticos conocidos. En determinados tipos de cáncer, por ejemplo, se ha demostrado que la resistencia a los productos químicos y a la terapia de radiación se encentra asociada con la inhibición de la apoptosis. Ver, Desoize, B. (1994) Anticancer Res. 14: 221-224. De manera similar, algunos agentes terapéuticos presentan efectos dañinos secundarios, incluyendo linfotoxicidad no específica, toxicidad renal y de médula ósea.
Los procedimientos descritos en el presente documentos van dirigidos a ambos problemas. La resistencia a fármacos, en aquellos casos en los cuales hacen falta dosis crecientes para alcanzar el beneficio terapéutico, es superada mediante la administración en paralelo de los compuestos descritos en el presente documento con el agente conocido. Los compuestos descritos en el presente documento parecen sensibilizar a las células objetivo hacia agentes conocidos y, por consiguiente, se necesitan menores cantidades de estos agentes para alcanzar un beneficio terapéutico.
La función sensibilizadora de los compuestos reivindicados trata también los problemas asociados con los efectos tóxicos de los productos terapéuticos conocidos. En circunstancias en las cuales el agente conocido es tóxico, resulta deseable limitar las dosis administradas en todos los casos y particularmente en aquellos en los cuales la resistencia al fármaco ha incrementado la dosis requerida. Cuando los compuestos descritos en el presente documento son administrados en paralelo con el agente conocido, los mismos reducen la dosis requerida lo cual, a su vez, reduce los efectos perjudiciales. Además, debido al hecho de que los compuestos descritos en el presente documento son a la vez eficaces y no tóxicos en grandes dosis, la administración en paralelo de proporcionalmente más de estos compuestos que de los agentes tóxicos conocidos permitirá alcanzar los efectos deseados, minimizando los efectos tóxicos.
I. Los compuestos benzodiazepina
Los compuestos descritos en el presente documento son compuestos benzodiazepina. En algunos casos, los compuestos benzodiazepina presentan la siguiente estructura:(los compuestos de la primera fórmula se incluyen a efectos comparativos: los mismos no forman parte de la invención reivindicada)
2
o
3
o su enantiómero,
en donde,
R_{1} es alifático o arilo;
R_{2} es alifático, arilo, -NH_{2},-NHC(=O)-R_{5}, o un resto que participa en la unión hidrógeno,
en donde R_{5} es arilo, heterociclo, -R_{6}-NH-C(=O)-R_{7} o R_{6}-C(=O)-NH-R_{7}, en done R_{6} es un producto de unión alifático de 1-6 carbonos y R_{7} es alifático, arilo, o heterociclo,
Cada uno de R_{3} y R_{4} es, independientemente, hidrógeno, hidroxi, alcoxi, halo, amino, amino sustituido por alquilo inferior, acetilamino, hidroxiamino, un grupo alifático que tiene entre 1-8 átomos de carbono y entre 1 y 20 hidrógenos, arilo o heterociclo.;
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y derivados.
En algunos casos, los compuestos benzodiazepina tienen la siguiente estructura: (los compuestos de la primera fórmula se incluyen a efectos comparativos: los mismos no forman parte de la invención reivindicada)
4
o
5
o su enantiómero,
en donde,
R_{1} es alifático o arilo;
R_{2} es -NHC(=O)-R_{5},
en donde R_{5} es arilo, heterociclo, -R_{6}-NH-C(=O)-R_{7} o R_{6}-C(=O)-NH-R_{7}, en done R_{6} es un producto de unión alifático de 1-6 carbonos y R_{7} es alifático, arilo, o heterociclo; y
cada uno de R_{3} y R_{4} es, independientemente, hidrógeno, hidroxi, alcoxi, halo, amino, amino sustituido por alquilo inferior, acilamino, hidroxiamino, un grupo alifático que tiene entre 1-8 átomos de carbono y entre 1 y 20 hidrógenos, arilo o heterociclo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y derivados.
En las estructuras indicadas anteriormente, R_{1} es un grupo hidrocarbilo de entre 1-20 átomos de carbono y entre 1-20 hidrógenos. Preferiblemente, R_{1} tiene entre 1-15 átomos de carbono y, más preferiblemente, entre 1-12 átomos de carbono. Preferiblemente, R_{1} tiene 1-12 átomos de hidrógeno y, más preferiblemente, 1-10 átomos de hidrógeno. Por los tanto, R_{1} puede ser un grupo alifático o un grupo arilo.
El término "alifático" representa los grupos habitualmente conocidos como alquilo, alquenilo, alquinilo y alicíclico. El término "arilo", tal como se utiliza en el presente documento representa un anillo aromático simple tal como un anillo fenílico o dos o más anillos aromáticos conectados el uno con el otro (por ejemplo, bisfenilo) o fusionados conjuntamente (por ejemplo, naftaleno o antraceno). El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido por otro grupo alifático (por ejemplo, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo, alquinilo, o alicíclico C_{3}-C_{6}). Adicionalmente, los grupos alifáticos y arilo pueden estar adicionalmente sustituidos por uno o más grupos funcionales tales como -NH_{2}, -NHCOCH_{3}, -OH, alcoxi inferior (C_{1}-C_{4}), halo (-F, -Cl, -Br, o -I). Resulta preferible que R_{1} sea principalmente un resto no polar.
En las anteriores estructuras, R_{2} puede ser alifático, arilo, -NH_{2}, -NHC(=O)-R_{5}, o un resto que participa en el enlace hidrógeno, en donde R_{5} es arilo, heterociclo, R_{6}-NH-C(=O)-R_{7} o R_{6}-C(=O)-NH-R_{7}, en donde R_{6} es un producto de unión alifático de 1-6 átomos de carbono y R_{7} es alifático, arilo o heterociclo. Los términos "alifático" y "arilo" son tal como se han definido anteriormente.
El término "un resto que participa en el enlace hidrógeno", tal como se usa en el presente documento, representa un grupo que puede aceptar o donar un protón para formar un enlace hidrógeno. Entre algunos ejemplos no limitativos de restos que participan en el enlace hidrógeno se incluyen grupos fluoro, grupos que contienen oxígeno y grupos que contienen nitrógeno y que son bien conocidos en el estado de la técnica. Entre algunos de los ejemplos de grupos que contienen oxígeno que participan en el enlace hidrógeno se incluyen: hidroxi, alcoxi inferior, carbonilo inferior, carboxilo inferior, éteres inferiores y grupos fenólicos. El calificativo "inferior", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a grupos alifáticos inferiores (C_{1}-C_{4}) a los cuales se encuentra unido el respectivo grupo funcional que contiene oxígeno. Por lo tanto, por ejemplo, el término "carbonilo inferior" se refiere inter alia, a formaldehido, acetaldehido.
Algunos ejemplos no limitativos de grupos que contienen nitrógeno que participan en la formación de la unión hidrógeno se incluyen grupos amino y amido. Adicionalmente, pueden también participar grupos que contienen tanto un átomo de oxígeno como un átomo de nitrógeno. Entre los ejemplos de tales grupos se incluyen grupos nitro, N-hidroxy y nitroso.
Resulta también posible que el aceptante del enlace hidrógeno puedan ser los electrones \pi de un anillo aromático. No obstante, los participantes en la unión hidrógeno no incluyen aquellos grupos que contienen átomos metálicos tales como boro. Además, los enlaces hidrógeno formados no incluyen aquellos formados entre dos hidrógenos, conocidos como "enlaces dihidrógeno". Ver, Crabtree, R.H. (1998) Science 282: 2000-2001, para descripción adicional de los citados enlaces dihidrógeno.
El término "heterociclo" representa un anillo aromático o no aromático de 3-6 elementos que contiene uno o más heteroátomos. Los heteroátomos pueden ser iguales o diferentes los unos de los otros. Preferiblemente, al menos uno de los heteroátomos es nitrógeno. Entre otros heteroátomos que pueden estar presentes sobre el anillo heterocíclico se incluyen oxígeno y azufre.
Los anillos aromáticos y no aromáticos son bien conocidos en el estado de la técnica. Algunos ejemplos no limitativos de anillos heterocíclicos aromáticos incluyen piridina, pirimidina, indol, purina, quinolina e isoquinolina. Entre los ejemplos no limitativos de compuestos heterocíclicos no aromáticos se incluyen piperidina, piperazina, morfolina, pirrolidina y pirazolidina. Entre los ejemplos de anillos heterocíclicos que contienen oxígeno se incluyen, sin que ello suponga una limitación, furano, oxirano, 2H-pirano, 4H-pirano, 2H-cromeno, y benzofurano. Entre los ejemplos de anillos heterocíclicos que contienen azufre se incluyen, sin que ellos suponga una limitación, tiofeno, benzotiofeno y paratiazina.
Entre los ejemplos de anillos que contienen nitrógeno se incluyen, sin que ello suponga una limitación, pirrol, pirrolidina, pirazol, pirazolidina, imidazol, imidazolina, imidazolidina, piridina, piperidina, pirazina, piperazina, pirimidina, indol, purina, bencimidazol, quinolina, isoquinolina, triazol y triazina.
Entre los ejemplos de anillos heterocíclicos que contienen dos diferentes heteroátomos se incluyen, sin que ellos suponga una limitación, fenotiazina, morfolina, paratiazina, oxazina, oxazol, tiazina y tiazol.
El anillo heterocíclico es sustituido opcionalmente con uno o más grupos seleccionados a partir de grupos alifáticos, nitro, acetilo (a saber, -C(=O)-CH_{3}) o grupos arilo.
Cada uno de R_{3} y R_{4} pueden ser, independientemente, hidroxi, alcoxi, halo, amino, o amino sustituido (tal como amino sustituido por alquilo inferior o acetilamino o hidroxiamino) o un grupos alifático que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono y entre 1 y 20 átomos de hidrógeno. Cuando cada uno de los grupos R_{3} y R_{4} es un grupo alifático, el mismo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos funcionales tales como hidroxi, alcoxi, halo, amino, o aminos sustituido, tal como se ha descrito anteriormente. El término "alifático" se ha definido anteriormente. De manera alternativa, cada uno de R_{3} y R_{4} puede ser hidrógeno.
Es bien conocido que muchas de las 1,4-benzodiazepinas existen como isómeros ópticos debido a la quiralidad introducida en el anillo heterocíclico de la posición C_{3}. Los isómeros ópticos son descritos a veces como isómeros L- y D- en la literatura. De forma alternativa, los isómeros ópticos se denominan también enantiomorfos R- y S-. En aras a simplicidad, estos isómeros son identificados como enantiomorfos o enantiómeros. Los compuestos 1,4-benzodiazepina descritos en el presente documento incluyen sus formas enantiómeras, al igual que las mezclas racémicas, Por lo tanto, el uso "benzodiazepina o su enantiómero" en el presente documento se refiere a la benzodiazepina tal como se ha descrito o detallado, incluyendo la totalidad de sus enantiomorfos, así como su mezcla racémica.
A partir de la anterior descripción, resulta evidente que muchos ejemplos específicos están representados a través de las fórmulas presentadas anteriormente. Así pues, en un ejemplo, R_{1} es alifático, R_{2} es alifático, mientras que en otro ejemplo R_{1} es arilo y R_{2} es un resto que participa en la formación del enlace hidrógeno. Alternativamente, R_{1} puede ser alifático y R_{2} puede ser -NHC(=O)-R_{5}, o un resto que participa en el enlace hidrógeno, en donde R_{5} es arilo, heterociclo, R_{6}-NH-C(=O)-R_{7} o R_{6}-C(=O)-NH-R_{7}, en donde R_{6} es un producto de unión alifático de 1-6 átomos de carbono y R_{7} es alifático, arilo o heterociclo. Resulta posible una amplia variedad de tales combinaciones a partir de la selección de un grupo particular en cada una de las posiciones de sustituyente y la totalidad de las citadas combinaciones se describen en el presente documento.
Además, debe darse por entendido que las bandas numéricas proporcionadas a lo lardo de esta descripción deben ser construidas como una banda flexible que contempla cualquier posible sub-banda dentro de la banda. Por ejemplo, la descripción de un grupo que tiene la banda de 1-10 carbonos contemplaría también un grupo que posee una sub-banda de por ejemplo, 1-3; 1-5; 1-8; o 2-3; 2-5; 2-8; 3-4; 3-5; 3-7; 3-9; 3-10; carbonos. Por lo tanto, la banda 1-10 debería ser entendidas como representante de los límites más externos de la banda dentro de la cual se contemplan claramente muchas posibles sub-bandas. A lo largo de esta descripción pueden encontrarse ejemplos adicionales que contemplan bandas en otros contextos en donde las citadas bandas incluyen dentro sub-bandas análogas.
Entre los ejemplos específicos de compuestos benzodiazepina se incluyen: (incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
6
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
7
incluido a efectos comparativos: (no forma parte de la invención reivindicada)
8
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
9
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
10
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
11
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
12
(incluido a efectos comparativos: no forma parte de la invención reivindicada)
13
130
En resumen, en el presente documento se presentan diversos compuestos benzodiazepina. Para tratar una variedad de trastornos disregulatorios relacionados con la muerte celular puede utilizarse cualquiera o más de estos compuestos benzodiazepina. Entre los citados trastornos se incluyen trastornos autoinmunes, dolencias inflamatorias, dolencias hiperproliferativas, infecciones víricas y ateroesclerosis. Además, los anteriormente indicados componentes pueden ser utilizados para preparar medicamentos para tratar los trastornos disregulatorios descritos anteriormente. Las benzodiazepinas descritas anteriormente pueden ser también utilizadas en ensayos de cribado de fármacos y otros procedimientos de diagnosis. El amplio espectro de la metodología, los usos y las composiciones descritas en el presente documento devienen rápidamente evidentes a partir de la lecturas global de la descripción completa, teniendo en cuenta que las características preferidas y ventajosas de algunos de los aspectos resultan aplicables a otros aspectos.
J. Preparación de los compuestos
Los compuestos benzodiazepina descritos anteriormente pueden ser preparados utilizando o bien procedimientos sintéticos combinatorios en fase sólida o fase soluble, al igual que sobre base individual, a partir de técnicas bien establecidas. Ver por ejemplo, Boojamra, C.G. et al., (1996) J. Org. Chem. 62: 1240-256; Bunin, B.A. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712; Stevens, S.Y. et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 10650-10651; Gordon, E.M. et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 51385-1401; y patentes de EE.UU Nos. 4.110.337 y 4.076.823. Para ilustración, se proporciona la siguiente metodología general.
1. Preparación de compuestos 1,4-benzodiazepin-2-ona
Se ha informado en la literatura acerca de la existencia de procedimientos sintéticos mejorados en fase sólida para la preparación de una diversidad de derivados 1,4-benzodiazepina con rendimientos globales muy elevados. Ver, por ejemplo, Bunin and Ellman ((1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 10997-10998). Utilizando estos procedimientos mejorados, pueden prepararse 1,4-benzodiazepin-2-onas sobre un soporte sólido a partir de tres componentes separados: 2-aminobenzofenonas, \alpha-aminoácidos y (opcionalmente) agentes alquilantes tales como los mostrados en el esquema de reacción de la Figura 1.
Entre las 2-aminobenzofenonas preferidas se incluyen las 2-aminobenzofenonas sustituidas, por ejemplo, las 2-aminobenzofenonas sustituidas por halógeno e hidroxi y halo-hidroxi, tales como la 4-halo-4'-hidroxi-2-aminobenzofenona. Una 2-aminobenzofenona sustituida preferida es la 4-cloro-4'-hidroxi-2aminobenzofenona. Entre los \alpha-aminoácidos preferidos se incluyen los 20 aminoácidos de origen natural, al igual que los \alpha-aminoácidos que imitan sus estructuras, tales como la homofenilalanina, la homotirosina y la tiroxina.
Entre los agentes alquilantes se incluyen tanto los electrófilos activados como los inactivados, de los cuales una amplia variedad son conocidos en el estado de la técnica. Entre los agentes alquilantes preferidos se incluyen los electrófilos activados bromuro de p-bromobencilo y bromoacetato de t-butilo.
En el primer paso de la citada síntesis, el derivado 2-aminobenzofenona (1) de la Figura 1 es unido a un soporte sólido, tal como un soporte sólido poliestireno, a través de, o bien un grupo funcional hidroxi o un grupo funcional ácido carboxílico, utilizando procedimientos bien conocidos y un producto de unión que puede romperse con ácido, tal como el ácido [4-(hidroximetil)fenoxi]acético, disponible comercialmente, para producir la 2-aminobenzofenona (2) soportada. Ver, por ejemplo, Sheppard and Williams, ((1982)) Int. J. Peptide Protein Res. 20:451-454). El grupo 2-amino de la aminobenzofenona es preferiblemente protegido con anterioridad a la reacción con el reactivo de unión, por ejemplo mediante reacción con FMOC-Cl (cloroformato de 9-fluoroenilmetilo) para generar el grupo amino protegido 2'-NHFMOC.
En el segundo paso, el grupo 2-amino protegido es desprotegido (por ejemplo, el grupo -NHFMOC puede ser desprotegido mediante tratamiento con piperidina en dimetilformamida (DMF) y la 2-aminobenzofenona desprotegida es acoplada posteriormente, a través de una unión amida, a un \alpha-aminoácido (el grupo amino del cual ha sido a su vez protegido, por ejemplo, como un grupo -NHFMOC) para generar el intermedio (3). Pueden utilizarse los procedimientos de activación estándar utilizados para la síntesis de general de péptidos en fase sólida (tal como la utilización de carbodiimidas e hidroxibenzotriazol o ésteres activos de pentafluorofenilo) para facilitar el acoplamiento. No obstante, un procedimiento preferido de activación utiliza el tratamiento de la 2-aminobenzofenona con una solución en cloruro de metileno del fluoruro del \alpha-N-FMOC-aminoácido en presencia de el citado eliminador de ácido, 4-metil-2,6-di-terc-butilpiridina, conduce al acoplamiento completo a través de la unión amida. Se ha averiguado que este procedimiento de acoplamiento preferido resulta eficaz incluso pare el caso de derivados aminobenzofenona no reactivos, generando esencialmente el acoplamiento completo para los derivados que poseen tanto los sustituyentes desactivantes 4-cloro como 3-carboxi.
En el tercer paso, el grupo amino protegido (procedente del aminoácido) es primeramente desprotegido (por ejemplo, el grupo -NHFMOC puede ser convertido en -NH_{2} con piperidina en DMF) y el compuesto desprotegido se hace reaccionar con ácido, por ejemplo, ácido acético al 5% en DMF a 60ºC, para generar el derivado soportado 1,4-benzodiazepina (4). Se ha informado acerca de una ciclación completa utilizando este procedimiento para una diversidad de derivados 2-aminobenzofenona con propiedades estéricas y electrónicas ampliamente diferentes.
En un cuarto paso opcional, el derivado 1,4-benzodiazepina puede ser alquilado a través de reacción con un agente alquilante adecuado y una base, para generar el derivado plenamente soportado 1,4-benzodiazepina (5). Pueden utilizarse procedimientos de alquilación estándar, por ejemplo, un exceso de base fuerte tal como LDA (litio diisopropilamida) o NaH, no obstante, los citados procedimientos pueden dar como resultado una desprotonación no deseada de otras funcionalidades ácidas y sobre-alquilación. Las bases preferidas que pueden evitar la sobre-alquilación de los derivados benzodiazepina (por ejemplo, aquellas que tienen funcionalidades éster y carbamato) son aquellas que son lo suficientemente básicas para completar la desprotonación del grupo funcional anilida, pero no lo suficientemente básicas como para desprotonar los grupos amida, carbamato o éster. Un ejemplo de base de estas características es la 5-(fenilmetil)-2-oxaolidinona litiada, la cual puede ser hecha reaccionar con la 1,4-benzodiazepina en tetrahidrofurano (THF) a -78ºC. Después de la desprotonación, se añade un agente alquilante adecuado, tal como se ha descrito anteriormente.
En el paso final, la 1,4-benzodiazepina (6) completamente derivatizada se descuelga del soporte sólido. Esto puede lograrse (junto con la eliminación concomitante de los grupos protectores atacables con ácido), por ejemplo, por medio e la exposición a un ácido adecuado, tal como una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y dimetilsulfuro (85:5:10, en volumen). De manera alternativa, las benzodiazepinas mencionadas anteriormente pueden ser preparadas en fase soluble. La metodología sintética fue ya apuntada por Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 1386-1401. Brevemente, la metodología comprende la transamidación de una resina aminoácido con iminas 2-aminobenzofenona adecuadamente sustituidas, para formar iminas unidas a la resina. Estas iminas pueden ser cicladas y fijadas a través de procedimientos similares a los descritos anteriormente en la síntesis en fase sólida. La pureza general de las benzodiazepinas preparadas utilizando la anteriormente indicada metodología puede ser del 90% o superior.
2. Preparación de 1,4-benzodiazepin-2,5-dionas
Por parte de Boojamra, C.J. et al., (1996) J. Org. Chem. 62:1240-1256 se ha informado acerca de un procedimiento general para la síntesis en fase sólida de 1,4-benzodiazepin-2,5-dionas. Este procedimiento puede ser utilizado para preparar los compuestos descritos en el presente documento. El mismo se detalla en la Figura 2.
Brevemente, una resina Merrifiels, por ejemplo, un (clorometil)poliestireno, se derivatiza a través de alquilación con 4-hidroxi-2,6-dimetoxibenzaldehido sódico (3), para proporcionar el aldehido (4) unido a la resina. Un \alpha-aminoéster es unido después l soporte derivatizado a través de aminación reductora utilizando NaBH(Oac)_{3} en ácido acético al 1% en DMF. Esta aminación reductora da como resultado la formación de una amina secundaria (5) unida a la resina.
La amina secundaria (5) es acilada con una amplia variedad de ácido antranílicos desprotegidos dando como resultado amidas terciarias (6) unidas al soporte. Esta acilación puede ser efectuada mejor llevando a cabo la reacción de acoplamiento en presencia de una carbodiimida y la sal clorhidrato de una amina terciaria. Un buen agente para acoplamiento es el clorhidrato de 1-etil-8-[8-(dimetilamino)propil]carbodiimida. La reacción se lleva habitualmente a cabo en presencia de 1-metil-2-pirrolidinona anhidra. El procedimiento de acoplamiento puede ser repetido una vez más para asegurar la completa acilación.
La ciclación del derivado acilo (6) puede ser lograda a través de lactamación catalizada por base, a través de la formación de una unión anilida (7) la cual reaccionaría con un haluro de alquilo para la introducción simultanea del sustituyente en la posición 1 sobre el nitrógeno del anillo heterocíclico de la benzodiazepina. La sal de litio de la acetanilida constituye una buena base para catalizar la reacción. Por lo tanto, el producto (6) puede ser hecho reaccionar con acetanilida de litio en DMF/THF (1:1) por espacio de 30 horas, seguido de la reacción con el agente alquilante adecuado proporciona la benzodiazepina (8) unida al soporte completamente derivatizada. Los compuestos (1) pueden ser partidos a partir del soporte con buen rendimiento y una elevada pureza, utilizando TFA/DMS/H_{2}O (90:5:5).
Boojamra, supra 1246 relaciona algunos ejemplos de los materiales de partida \alpha-aminoéster, agentes alquilantes y derivados de ácido antranílico que pueden ser utilizados. Los reactivos adicionales pueden ser determinados rápidamente y o bien pueden ser obtenidos comercialmente o preparados rápidamente por parte de un experto ordinario en la materia, para llegar a los nuevos sustituyentes descritos en el presente documento.
Por ejemplo, a partir de la Figura 2, y a partir de Boojamra, supra, uno se da cuenta de lo siguiente: los agentes alquilantes proporcionan los sustituyentes R_{1}; los materiales de partida \alpha-aminoéster proporcionan los sustituyentes R_{2} y los ácidos antranílicos proporcionan los sustituyentes R_{4}. Utilizando estos materiales de partida adecuadamente sustituidos, se llega a la 1,4-benzodiazepin-2,5-diona. Los sustituyentes R_{3} pueden ser obtenidos mediante la sustitución adecuada de la amina del material de partida \alpha-aminoéster. Si la acumulación estérica deviene un problema, el sustituyente R_{3} puede ser unido a través de procedimientos convencionales, una vez aislada la 1,4-benzodiazepin-2,5-diona.
3.Quiralidad
Debe ser reconocido que muchas de las benzodiazepinas descritas en el presente documento pueden existir como isómeros ópticos, debido a la quiralidad cuando el estereoisómero es introducido a través del \alpha-aminoácido y sus materiales éster de partida. El procedimiento general descrito anteriormente conserva la quiralidad de los materiales de partida \alphaa-aminoácido o éster. En muchos casos, la citada conservación e la quiralidad resulta deseable. No obstante, cuando el isómero óptico deseado del material de partida \alpha-aminoácido o éster resulta no disponible o caro, puede prepararse una mezcla racémica, la cual puede ser separada en sus correspondientes isómeros ópticos y se puede aislar el compuesto benzodiazepina deseado.
Por ejemplo, en el caso de compuestos 2,5-diona, Boojamra, supra, describe que la racemización completa puede ser lograda a través del reequilibramiento de la sal clorhidrato del material de partida \alpha-aminoéster enantioméricamente puro con 0,3 equivalentes de i-Pr_{2}EtN y el aldehido unido a la resina, durante un período de 6 horas antes de la adición de NaBH(OAc)_{3}. El resto del procedimiento sintético descrito anteriormente permanece igual. En el caso de compuestos 1,4-benzdoiazepin-2-diona pueden utilizarse también pasos similares, en caso necesario.
Existen procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica para la preparación de benzodiazepinas individuales. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU Nos. 3.415.814; 3.384.635 y 3.261.828,. Mediante la selección de los productos de partida adecuadamente sustituidos en cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, las benzodiazepinas descritas en el presente documento pueden ser preparadas con relativa facilidad.
A partir de la descripción facilitada anteriormente, un experto en la materia entenderá rápidamente que los diversos procedimientos de tratamiento, los procedimientos de diagnosis, en uso de los compuestos para la preparación de medicamentos, el suministro de tales medicamentos y la preparación de los compuestos, puede ser llevada a la práctica de diferentes maneras. Se da también por entendido que las características preferidas de un aspecto resultan aplicables a cualquier otro aspecto. Además, esta descripción, acoplada con la práctica ordinaria en el campo de la técnica puede conducir a nuevos tratamientos, procedimientos de diagnosis, usos, formulaciones y composicio-
nes.
Ejemplos Procedimientos generales Preparación celular
Se cultivaron líneas celulares en medios completos (RPMI o DMEM conteniendo un 10% de suero bovino fetal suplementado con penicilina, estreptomicina y L-glutamina) a 37ºC, 5% de CO_{2}. Para ensayos de actividad, se extrajeron las células de crecimiento en fase logarítmica y se diluyeron a una concentración comprendida entre 100.000 y 300.000/mL. Algunas de las células fueron mantenidas en medio completo, mientras que una parte alícuota idéntica fue intercambiada en medio de suero reducido (RPMI o DMEM conteniendo suero bovino fetal al 0,2% suplementado con penicilina, estreptomicina y L-glutamina) a través de centrifugación.
Ensayo de actividad
Células en medio completo y medio de suero reducido fueron ubicadas en placas de 96 pocillos en alícuotas de 100 \muL, proporcionando entre 10.000 y 30.000 células/pocillo. Se añadió seguidamente el compuesto a los pocillos apropiados en la placa (2\muL de cada uno del stock 50X), a concentraciones comprendidas entre 1nM y 20 \muM. Las células fueron entonces cultivadas durante el transcurso de una noche a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se midió la relación número de células relativas/viabilidad celular, utilizando técnicas estándar (exclusión de azul tripano/hemocitometría, ensayo de conversión de colorante MTT).
Ejemplo Comparativo 1
Capacidad para inducir muerte celular
Anteriormente se han mostrado diversos compuestos representativos individuales para la inducción de apoptosis. De entre los mismos, el compuesto más preferido es identificado como Compuesto 1, el cual se muestra seguida-
mente:
14
Compuesto 1
El Compuesto 1 fue utilizado para inducir muerte celular en una diversidad de células, a través de la utilización de los materiales y procedimientos descritos anteriormente. La Tabla 1 muestra datos de viabilidad celular una vez transcurridas 18 horas de cultivo con el Compuesto 1 en medio de suero reducido, tal como se ha descrito anteriormente.
TABLA 1
15
(los números más bajos indican destrucción incrementada).
Nd= no determinada.
Ejemplo comparativo 2
Los ratones MRL/MpJ-lpr/lpr (MRL-lpr) desarrollan manifestaciones serológicas e histológicas de enfermedad autoinmune similares a la SLE humano. Estos ratones fueron criados a través de una serie de cruces de cepas ingénitas, hasta la aparición de un fenotipo autoinmune. (Theofilopoulos, A.N. and Dixon, F.J. (1985) Adv. Immunol. 37:269-390). Los ratones MRL-lpr se caracterizan por el desarrollo espontáneo de enfermedad autoinmune generalizada. Esta enfermedad se manifiesta en diferentes localizaciones fisiológicas y se parece a una diversidad de enfermedades humanas. Por ejemplo, el daño a los riñones en estos ratones está asociado con una valoración serológica elevada de anti-DNA, tal como en el SLE humano. Ellos desarrollan también una artropatía erosiva y una infiltración linfocítica de las glándulas salivares, similar a la de la artritis reumatoide (RA) humana y a la enfermedad de Sjörgen, respectivamente (Theofilopoulos, supra).
En general, los ratones MRL-lpr presentan un defecto profundo en la apoptosis, debido a la mutación en la localización del gen lpr (Sakata K, et al., (1998) Clin. Immunol. Immunophatol. 87: 1-7). El defecto ha sido vinculado a una mutación en el gen receptor Fas, importante en la señalización de apoptosis en linfocitos activados (Watanabe-Fukunaga, R et al., (1992) Nature 356:314-317). Cono consecuencia, estos ratones muestran una profunda hiperproliferación, que da como resultado una masiva ampliación de los nódulos linfáticos y bazo. En términos generales, estos ratones muestran hinchazón en las plantas de los pies y lesiones de piel eritematosas. Histológicamente, la glomerulonefritis, la artritis y la infiltración inflamatoria de las glándulas salivares resulta destacada.
Procedimientos Ratones
Se adquirieron ratones hembra MRL-lpr de seis semanas de edad a Jackson Laboratories (Bal Harbor, ME). Se permitió que los animales se adaptaran a su entorno durante un período de una semana, con anterioridad al inicio del estudio de tratamiento. Los ratones fueron alojados en un entorno específico libre de patógenos, con el clima controlado, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y comida y bebida a voluntad. Una vez por semana, se midieron los pesos y se examinó la proteinuria, utilizando una reacción colorimétrica (Boehringer Manheim ChemStrip 6).
Régimen de tratamiento
Los ratones fueron distribuidos al azar en tres grupos: los de control que recibieron PBS (50 \muL, qod), los de control que recibieron DMSO (50 \muL, qod) y los de control que recibieron el Compuesto 1 en 50 \muL de DMSO (60 mg/kg qod ip para 20 ratones y 30 mg/kg qod ip para 10 ratones). Las inyecciones ip se administraron con una aguja 30G y jeringas de cristal (Hamilton), en base a una pauta de días alternos. El tratamiento se inició a las 7 semanas de edad para los ratones control (aquellos que recibieron PBS y DMSO) y a las 8 ó 9 semanas para los ratones de tratamiento. A la finalización del estudio, se recogieron muestras de sangre mediante incisión en la cola. Los ratones fueron posteriormente anestesiados mediante inhalación de metofano y sacrificados por desangramiento tras disección axilar. Se recogieron después muestras para análisis histológico.
Análisis estadístico
Se llevó a cabo un análisis de significado estadístico utilizando el programa de ordenador SPSS. Salvo que se indique lo contrario, se utilizó la prueba Mann-Whitney U (una cola) y los valores de probabilidad >5% fueron considerados insignificantes.
Resultados Avance de la enfermedad
Los ratones MRL-lpr son conocidos por desarrollar una enfermedad de riñón muy similar a la observada en la enfermedad humana Lupus Eritematoso Generalizado (SLE). La señal característica es una glomerulonefritis que desemboca en una pérdida de la función renal y a la consiguiente muerte debido a fallo renal. La cantidad de proteína presente en la orina constituye un marcador para el desarrollo de la enfermedad de riñón. A medida que la función del riñón se deteriora, falla el mecanismo de filtración y se incrementa la proteinuria. A diferencia de la periodicidad de la enfermedad en humanos, la forma murina del lupus es progresiva, por lo tanto, una vez un ratón ha desarrollado nefritis y la subsiguiente proteinuria, la enfermedad avanza de forma continua hasta la muerte. Esto permite la utilización de mediciones de proteinuria para seguir el avance de la enfermedad de riñón en los ratones MRL-lpr.
El desarrollo de la enfermedad en nuestro estudio fue seguido en base a mediciones semanales de la proteinuria. Se averiguó que un determinado ratón padecía lupus si tenía valores de proteinuria >2+(>100 mg/dL) durante 2 ó mas semanas consecutivas. No se encontraron ratones cumpliendo este criterio con caídas en la proteinuria por debajo de 2+. Además, se averiguó que los ratones que murieron con proteinuria >2+ tenían una glomerulonefritis muy significativa y que los ratones que murieron con valores <2+ presentaban riñones sanos y las causas de la muerte no estaban relacionadas con la enfermedad autoinmune.
La Figura 3 proporciona un análisis del avance de la enfermedad para los ratones tratados con 60 mg/kg qod. Se obtienen datos similares con la pauta de dosificación de 30 mg/kg qod. Tal como se observa en la Figura 3, el tratamiento de ratones con el Compuesto 1 retrasa de una manera significativa la aparición de una enfermedad tipo lupus y trata la misma de una manera eficaz, en relación con los ratones control (p=0,0043). Estos datos son apoyados por la observación de que los valores BUN para los animales tratados son normales, mientras que los de los que recibieron únicamente vehículo se relacionan con el dolor renal.
Diagnosis de laboratorio
Se analizó la sangre obtenida a partir de los animales en busca de alteraciones en el número total de glóbulos blancos (WBC), y también de representación diferencial de subtipos. Los ratones que recibieron el compuesto 1 (60 mg/kg) presentan valores casi idénticos para hematocrito, contaje de plaquetas y WBC, en relación con aquellos que recibieron únicamente vehículo (Tabla 2).
\newpage
TABLA 2
Hemograma completo con diferencial (promedio \pm desviación estándar)
16 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}[t]{147mm} HCT, hematocrito (%); PLAT,
plaquetas (K/ \mu L); WBC, glóbulos blancos (K/ \mu L); POLYS,
células polimorfonucleares (%); LYMPHS, linfocitos (%); MONO,
monocitos (%); EOS, eosinófilos (%); BASO, basófilos
(%).\end{minipage} \cr}
Autoanticuerpos
Se analizaron muestras de suero obtenidas de los ratones para determinar el nivel de anticuerpos para diversos autoantígenos (Tabla 3). Estos anticuerpos son anticuerpos policlonales de suero total. A la finalización del estudio, los ratones que recibieron el Compuesto 1 mostraron niveles de anticuerpos significativamente más bajos que ssDNA (p=0,019), histonas (p=0,0056) y antígeno La (p=0,0265). Los niveles anti-dsDNA eran más bajos en los ratones en tratamiento pero no estadísticamente diferentes a los de los animales control (p=0,082). Tampoco existía diferencia en los anticuerpos para antígeno Ro entre los dos grupos de ratones; no obstante, las mediciones reales de absorbancia resultaban muy bajas para estas ELISAs y cualquier diferencia puede haber sido enmascarada por la sensibilidad del ensayo. Los niveles anti-Sm fueron únicamente observados en unos pocos de los animales en ambos grupos y no pudieron extraerse conclusiones en relación con las diferencias entre los dos grupos. Estas averiguaciones anti-SM estaban en consonancia con la literatura, la cual informa en el sentido de que únicamente se esperaba que el 10% de los ratones MRL-lpr dieran positivo al respecto de anticuerpos frente al antígeno Sm (Murphy, E.D. (1981). En lo concerniente a los datos relativos a la linfoproliferación (lpr) y a otros modelos de ubicación única para lupus murino, ver Immunologic Defects in Laboratory Animals (E.M. Gershwin and B. Merchant, eds.); Vol. 2, pp. 143-173 (Plenum, New York). Las diferencias observadas en los niveles de autoanticuerpo se localizan en un trasfondo de concentraciones de IgG total muy elevadas, las cuales no difieren estadísticamente entre los grupos de tratamiento (p=0,3312) y los grupos control.
TABLA 3 Niveles de autoanticuerpo
17 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}[t]{140mm}*Los niveles no estaban
disponibles en el momento de preparar este informe. Los niveles de
anti-histona son proporcionados en forma de valores
OD _{405}  a una dilución 1/400 de
suero.\end{minipage} \cr}
Además de síndrome de lupus, los ratones MRL-lpr desarrollan espontáneamente una artropatía erosiva que guarda parecido con la artritis reumatoide humana, tanto desde el punto de vista histológico como serológico. Las lesiones artríticas en estos ratones se caracterizan por modificaciones inflamatorias en el sinovio y en el tejido conjuntivo periarticular, frecuentemente acompañadas de la presencia de factores reumatoides circulantes en el suero. Este procedimiento artrítico es progresivo y se desarrolla a través de diferentes estadios, desde una sinusitis moderada hasta una artritis erosiva, la cual puede conducir finalmente a una articulación cicatrizada. Desde el punto de vista histológico, la mayor parte de los ratones MRL-lpr de 5 meses de edad mostraron proliferación celular sinovial, destrucción del cartílago articular y del hueso subcondrial, infiltración de estroma sinovial a través de células inflamatorias, inflamación periarticular (vasculitis, miositis, tendinitis, perineuritis), exudados, formación de paño, y nódulos fibrinoides subcutáneos (Hang, L. et al., (1982) J. Exp. Med. 155: 1690-1701; Koopman, W.J. and Gay, S. (1988) Scand. J. Rheumatology, Suppl. 75:284-289).
Las garras de todos los ratones tratados con el Compuesto 1 fueron examinadas en busca de señales de artritis y de sinovitis. Los ratones control (aquellos que recibieron únicamente vehículo) presentan una sinovitis grave, caracterizada por una marcado espesamiento del sinovio con formación ocasional de configuraciones vellosas, papilares.. Habitualmente, la patología sinovial se originaba como resultado de la proliferación celular sinovial y de infiltración del estroma sinovial a través de células inflamatorias. En un porcentaje sustancial de los ratones control, el proceso de la enfermedad iba acompañado de la formación de paño y de erosión de la superficie articular (tanto del cartílago articular como del hueso subcondrial). Como contraste, se averiguó que los ratones sometidos a tratamiento presentaban una sinovitis más moderada. Al igual que menos erosiones y formación de paño limitada (Tabla 4). El carácter de la enfermedad en los animales que recibieron el Compuesto 1 era mucho menos agresivo con menos proliferación de células sinoviales e infiltración inflamatoria. De nuevo interés, se observó que los ratones sometidos a tratamiento presentaban una grado de inflamación periarticular rebajado. La combinación de estas averiguaciones sugiere que el Compuesto 1 mejora el proceso de la enfermedad artrítica que destruye habitualmente las articulaciones de los ratones MLR-lpr.
TABLA 4 Patología sinovial
18
El valor *p es determinado a través de tabulación cruzada y análisis ji al cuadrado
Hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH)
Los ratones tratados con el Compuesto 1 (60 mg/kg) no mostraron diferencia en la respuesta DTH a TNBS, en comparación con los ratones control (Figura 4C). Es importante tener en cuenta que, ninguno de los grupos de animales mostró una hinchazón significativa en la planta de los pies después de la provocación del antígeno. Este fenómeno ha sido documentado y se esperaba que los ratones MRL-pr (> 10 semanas) presentasen una respuesta de linfocitos T reducida in vivo al estímulo, tal como se pone en evidencia a través de ausencia de una respuesta DTH. Ver Okuyarna H et al., (1986) Clin. Exp. Immunol. 63:87-94 y Scott, C.F. et al., (1984) J. Immunol. 132:633-639. No obstante, la eliminación de linfocitos T puede dar como resultado una recuperación en la respuesta DTH. Ver, Okuyama, H. Et al., (1989) Int. Arch. Allergy Applic. Immnunol. 1588:394-401. La citada recuperación no fue observada es este protocolo de tratamiento del estudio. Estos datos sugieren que el Compuesto 1 no modifica la función de los linfocitos T. Las Figuras 4A-4C muestran los resultados del experimento de hinchamiento de las plantas de los pies.
Función celular inmune
Se llevaron a cabo ensayos de ingesta de timidina, utilizando linfocitos B y T, tanto estimulados como no estimulados, para determinar si el Compuesto 1 afecta a la linfoproliferación in vitro. A aproximadamente una concentración de 10 \muM no se observó efecto alguno sobre la proliferación de linfocitos.
\newpage
Ejemplo comparativo 3
El Compuesto 1 como agente linfotóxico Procedimientos
Animales y diseño experimental: ratones hembra NZB/W (Jackson Labs) fueron alojados en habitaciones específicas exentas de patógenos, controladas medioambientalmente, operadas por University of Michigan's Unit for Laboratory Animal Medecine, con ciclos de 12 horas de luz-oscuridad y se les proporcionó alimentos y agua a voluntad. Los ratones fueron distribuidos al azar en grupos de control y de tratamiento. La totalidad de ratones fueron objeto de dosificación a través de inyecciones intraperitoneales utilizando un dispensador repetitivo Hamilton con jeringas microlíticas de cristal y agujas de calibre 30. Los ratones control recibieron vehículo (50 \muL de DMSO acuoso) y los ratones de tratamiento recibieron el Compuesto 1 disuelto en vehículo. Los pesos de los animales fueron determinados semanalmente, y los programas de dosificación reajustados seguidamente.
Recogida de sangre/tejidos: se obtuvo sangre periférica procedentes de las venas de las colas de todos los ratones para llevar a cabo un análisis de recuento sanguíneo completo y de recogida de suero. La sangre se dejó primeramente coagular a temperatura ambiente, por espacio de 1 hora y, posteriormente, durante el transcurso de una noche a, 4ºC. Se separó el suero del coágulo formado mediante centrifugación (6 min, 16.000xg). Se extrajo asépticamente una sección de bazo para la preparación de suspensiones celulares sencillas. Se conservaron muestras de los siguientes órganos en formalina tamponada al 10%: corazón, hígado, pulmón, bazo, riñón, intestino delgado, sistema reproductor, glándulas salivares, timo, nódulos linfáticos axilares y mesentéricos y piel. Se conservaron secciones adicionales de riñón y de bazo mediante congelación rápida en OCT. Se prepararon frotes de médula ósea a partir de cada uno de los huesos del fémur.
Histología: La totalidad de las determinaciones histológicas se efectuaron de forma ciega, por medio de un patólogo. Las secciones fijadas en formalina fueron cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H&E), utilizando protocolos estándar (Luna, L.G. en : Manual of Histological Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology, McGraw-Hill, New York (1960)).Se evaluó la deposición de inmunocomplejo en los riñones a través de inmunofluorescencia, utilizando secciones congeladas teñidas con IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Southern Biotecnology Associates, Birmingham, AL) y C3 (Cappel-Organon Teknika, Durham, NC). El grado de hiperplasia linfoide fue marcada como escala 0-4+.
Teñido TUNEL: secciones de bazo congeladas (4 pm de espesor) fueron sometidas a ensayo en busca de roturas de hélice de DNA utilizando el equipo In Situ Cell Death Detection (Roche Molecular Biochemicals), según los protocolos del fabricante. Las secciones fueron analizadas utilizando una escala 0-4+. Las secciones fueron evaluadas de forma ciega y se les asignó una marca en base a la cantidad de teñido Tunel positivo.
Análisis de fluorescencia de las poblaciones linfocíticas: se prepararon suspensiones celulares simples por medio de separación del bazo en el medio, seguido de extracción de glóbulos rojos con tampón de lisis isotónico (Kruisbeek, A.M., en: Current Protocols in Immunology, eds. Coligan, J.E. et al., pp. 3.1.2-3.1.5., John Wiley & Sons. Inc. (1997)). 106 células fueron teñidas a 4ºC con anti-Thy 1.2 conjugado fluorescentemente (Pharmingen, clone: 53-2.1, 1\mug/mL) y/o anti-B220 (Pharmingen, clone: RA3-6B2 1 \mug/mL) por espacio de 15 min. En muestras teñidas para detectar fosfatidil serina en membrana externa, las células fueron después incubadas con Annexina V y PI conjugadas con FITC, según los protocolos del fabricante (Roche Molecular Biochemicals). Las células fueron analizadas en un citómetro de flujo Coulter ELITE. Para cada una de las muestras, se contabilizaron por lo menos 10.000 acontecimientos.
Suero anti-DNA: se determinaron los niveles por medio de ELISA directo, tal como se ha descrito anteriormente (Swanson, P.C. et al., J. Clin. Invest. 97:1748-1760 (1996)). La detección de IgG anti-DNA utilizaba un anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (únicamente cadena H) (dilución 1/1000, SIGMA). Para convertir las lecturas de absorbancia en niveles, se utilizó suero agrupado procedente de ratones NZB/W hembra, de ocho meses de edad, no manipulados como referencia estándar, a los cuales se les asignó un valor de 1000 U/mL.
Inmunoglobulina en suero: se determinaron las concentraciones mediante captura ELISA. La Ig anti-ratón de cabra (Southern Biotecnology Associates) fue diluida hasta 10 pg/mL en PBS y se revistió durante el transcurso de una noche a 4ºC sobre placas de microvaloración Immulon II. Por el contrario, se llevaron a cabo los ELISA según lo descrito anteriormente. Para convertir las absorbancias en concentraciones se generó una curva estándar utilizando un suero de referencia de inmunoglobulina de ratón cuantificado previamente (ICN Biomedicals, Aurora, OH).
Nitrógeno ureico en sangre (BUN) y contaje sanguíneo completo (CBS): se llevaron a cabo mediciones de BUN en suero por parte del laboratorio de patología clínica de la University of Michigan Hospital's. Los análisis de CBS se llevaron a cabo por parte del laboratorio de diagnóstico de la University of Michigan's Unit for Laboratory Animal Medecine. Los contajes automáticos determinados por un aparato Hemavet 15 OR fueron confirmados mediante examen visual de frotes de sangre.
Niveles de 1,4-benzodiazepina en suero: muestras de suero procedentes de ratones inyectados con el Compuesto 1 fueron precipitadas con acetona (5x volumen, --20ºC, 10 min). Una vez efectuada la centrifugación (16.000 x g, 10 min), se concentró al vacío el sobrenadante que contenía el Compuesto 1 y se extrajo después cualquier proteína remanente utilizando una columna Sep-pak C18 (Waters Corp.), en base a un gradiente progresivo desde el 10% de acetonitrilo en agua hasta el 100% de acetonitrilo. El material eluido en la fracción orgánica fue concentrado al vacío y analizado posteriormente por medio de HPLC de fase inversa, utilizando una columna C18 Phenomenex. Las áreas pico fueron determinadas utilizando un integrador Shimadzu y fueron referenciadas en relación con una curva estándar.
Análisis estadístico: Se llevaron a cabo análisis estadísticos utilizando el paquete de software SPSS. Se utilizaron las pruebas Mann-Whitney y de ji al cuadrado para determinar los datos clínicos e histológicos. Para los datos de citometría de flujo se utilizó la prueba de Student. Las correlaciones fueron evaluadas a través de ANOVA.
Ejemplo comparativo 4
Se llevaron a cabo una serie de experimentos para caracterizar la naturaleza de la muerte celular provocada por el Compuesto 1, en términos que pudieran apuntar hacia el mecanismo de la muerte. Las células tratadas con el Compuesto 1 se tiñeron positivamente en ensayos TUNEL, sugiriendo que el tratamiento dio lugar a terminaciones libres de DNA (Gorczyca, W et al., Leukemia 7:659-670 (1993)), una característica de la apoptosis. La actividad de la caspasa y la permeabilidad mitocondrial son dos componentes centrales de la maquinaria de muerte celular (Ver, Zamzami, N. et al., J. Exp. Med. 183:1533-1544 (1996) y Los, M. Et al., Immunity 10: 629-639 (1999)). La ciclosporina A (CsA) regula la transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) (Zoratti, M. and Szabo, I. Biochim. Biophys. Acta 1241: 139-176 (1995)), que protege a las células de las rutas mortales que se basan en la liberación de factores apoptógenos procedentes de las mitocondrias. La CsA proporcionaba protección destacada frente al Compuesto 1, de tal forma que el 90% de las células que hubieran sido destruidas por el Compuesto 1 sobreviven cuando se añade CsA (10 \muM) al cultivo (Figura 6B). El pretratamiento de las células con z-VAD-fmk (20 pM), un inhibidor no específico de la caspasa (García Calvo, M. et al., J. Biol. Chem. 273:32608-32613 (1998)), protege a las células en menor grado: la viabilidad de las células pretratadas con z-VAD-fmk es un 25% superior que en las células tratadas únicamente con el Compuesto 1. Conjuntamente, estos datos sugieren que la muerte de los linfocitos NZB/W inducida por el Compuesto 1 requiere MPT, mientras que la activación de la caspasa es de importancia secundaria.
Para determinar si los efectos sobre los linfocitos in vitro también tienen lugar in vivo, ratones hembra NZB/W de 8 meses de edad fueron dosificados con el Compuesto 1 (60 mg/kg IP diariamente). Esta dosis da como resultado concentraciones pico en suero de 10 \muM (1 h post-inyección) con niveles mínimos de 1-2 \muM (18-24 h post inyección). Transcurridos 7 días, los ratones fueron sacrificados y sus células del bazo examinadas a través de citometría de flujo. La viabilidad esplenocítica, medida en base a la exclusión PI, resultada disminuida de manera significativa en los ratones tratados frente a los animales control inyectados, tal como se muestra en la Tabla 5 que sigue:
TABLA 5
Viabilidad celular Linfocitos B apoptóticos Linfocitos T apoptóticos
(PI) (B220^{+}, Thy1,2^{+}) (B220^{+}, Thy1,2^{+})
Control 85\pm2 25\pm5 12\pm4
Bz-423 81\pm2 32\pm6 12\pm9
p=0,003 p=0,02 p=0,50
Medidas de citometría de flujo de esplenocitos después de tratamiento in vivo.
En este experimento, ratones NZB/W de 8 meses de edad fueron divididos en grupos de control y de tratamiento de siete ratones cada uno de ellos. A los ratones en tratamiento se les administró el Compuesto 1 (60 mg kg qd) y los ratones control recibieron vehículo (50 \muL de DMSO qd) durante un período de 7 días. La viabilidad global de los esplenocitos aislados a partir de cada uno de los ratones fue determinada en base a la exclusión de PI. El descenso en la viabilidad es más pequeño que el observado después del tratamiento in vitro debido a que los procedimientos que intervienen (a saber, el reclutamiento celular, la proliferación y la liberación de células apoptóticas tempranas por parte del sistema retículo endotélico (RES)) reducen la muerte de esplenocitos detectable. Las células apoptópicas son mostradas en forma de porcentaje de linfocitos B y T excluyentes de PI. Los esplenocitos mezclados fueron aislados a partir de animales tratados y colocados posteriormente brevemente en cultivo (2x106 células/mL durante 3 h en RPMI conteniendo FBS al 10%), para permitir la expresión del fenotipo apoptótico en ausencia de liberación de RES. Subsiguientemente, las células fueron teñidas con Annexina V-FITC, PI y anticuerpos monoclonales específicos para Thy-1,2 ó B-20. Cada uno de los valores está basado en análisis citométrico de flujo de 20.000 células viables.
Tratamiento de ratones NZB/W con el Compuesto 1
A dosis terapéuticas, los actuales tratamientos para el lupus que amenaza a los órganos afectan gravemente a todas las células linfoides, dando como resultado graves efectos secundarios asociados con la inmunosupresión (Donadio, J.V. y Glassock, R.J., Am. J. Kidney Dis. 21: 239-250 (1993)). La selectividad de los linfocitos B acoplada con el efecto global moderado sobre la viabilidad linfocítica esplénica distingue al Compuesto 1 de estos tratamientos. Por lo tanto, el Compuesto 1 representa un compuesto líder en un nuevo tipo de agentes linfotóxicos posiblemente con un perfil benefico-toxicidad favorable. Para determinar el efecto del Compuesto 1 sobre la nefritis autoinmune y como los efectos de la dosificación a largo plazo afectan al sistema inmune, se llevó a cabo un tratamiento longitudinal utilizando ratones NZB/W hembra.
En este estudio, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales del Compuesto 1 (n=25; 60mg/Kg) o vehículo (n=20), cada día alterno durante tres meses, desde la edad de 6,5 meses hasta los 9,5 meses. La expansión temporal representa un punto después del inicio de la glomerulonefritis y continua hasta alcanzar el punto de mortalidad del 50% (Theofilopoulus, A.N. and Dixon, F.J., Adv. Immunol. 37:269-390 (1985)). Los ratones fueron sacrificados periódicamente y examinados en busca del impacto del Compuesto 1 sobre la nefritis y el sistema periférico inmune.
El examen microscópico del tejido de riñón revela que el tratamiento con el Compuesto 1 conlleva efecto protector a lo largo del transcurso del tratamiento. Secciones de riñón tomadas a partir de ratones control indican una glomerolunefritis proliferativa difusa, con proliferación de todos los elementos celulares y ocasionalmente la formación de bucles en consonancia con una marcador histopatológico promedio de 3+ (Figuras 6 y 7). Como contarte, los ratones en tratamiento presentan cambios más moderados con menor proliferación celular y formación de bucles y un marcador de 1+ (p<0,002). Tal como se observa en la Figura 6, la administración del Compuesto 1 reducía tanto la IgG glomerular como la deposición de C3 a lo largo del transcurso del tratamiento (IgG, p<0,003; C3, p<0,04). El grado de deposición dentro de un ratón individual está fuertemente correlacionado con su marcador histopatológico: los ratones con deposición de Ig reducida muestran menos lesión glomerular (p<0,002). Mecánicamente, este hallazgo está de acuerdo con la muerte celular linfoide in vivo, conduciendo presumiblemente a menos linfocitos B (patogénicos).
Las diferencias histológicas observadas entre los grupos de tratamiento y de control fueron confirmadas a través de mediciones clínicas de la función del riñón. En el momento del sacrificio, el 85% de los ratones de control presentan niveles de nitrógeno uréico en sangre (BUN) anormalmente elevados (230 mg/dL) (Gordon, C. et al., Clin. Immunol. Immunopath. 52:421-434 (1989), mientras que el 31% de los ratones en tratamiento presentan elevados niveles de BUN (p<0,007). De manera similar, el 39% de los ratones control presentan una proteinuria significativa (>100 mg/dL) (Adelman, N.E. et al., J. Exp. Med. 158:1350-1355 (1993)), mientras que tan solo el 18% de los ratones en tratamiento desarrollaron este descubrimiento (p<0,11). Para cada uno de los ratones, la marca histológica está fuertemente correlacionada tanto con los niveles de proteinuria como con los de BUN (p<0,002); los ratones con una enfermedad menos grave presentan niveles de proteinuria y de BUN inferiores. Estos datos confirman que las mediciones histológicas de la nefritis reflejan el estatus funcional de los riñones. Conjuntamente, estas averiguaciones indican que el Compuesto 1 protege a los ratones NZB/W frente a tanto el avance como a los efectos de la glomerulonefritis autoinmune.
El Compuesto 1 reduce el número de linfocitos B
Ratones NZB/W desarrollan hiperplasia linfoide relacionada con la enfermedad, marcada por una expansión de linfocitos B que coincide con el incremento en los niveles de autoanticuerpo en suero (Ver, Theofilopoulos, A.N. and Dixon, F.J., Adv. Immunol. 37: 269-390 (1985) y Ermak, T.H. et al., Lab. Invest. 61: 447-456 (1989)). Los bazos obtenidos a partir de los ratones control confirman este fenómeno: se observa una expansión de la pulpa blanca que provoca tanto distorsión de la arquitectura de bazo normal como una reducción en la pulpa roja (Figura 10). Los ratones que recibieron el Compuesto 1 presentan un equilibrio más normal entre la pulpa blanca y la pulpa roja. El marcado de múltiples secciones de bazo procedentes de todos los animales de control y de tratamiento reveló que se producía una reducción estadísticamente significativa de la hiperplasia linfoide en el grupo de tratamiento (2+ frente a 3+, en una escala 0-4+; p<0,02).
La constitución del compartimento de células linfoides esplénicas una vez transcurridas 6 y 12 semanas de tratamiento fue analizada mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la Tabla 6, el Compuesto 1 reduce la fracción de linfocitos B entre un 10-15% en relación con los ratones control (p<0,05), mientras que la fracción de linfocitos T permanece inalterada por el tratamiento.
TABLA 6
19
Determinación de citometría de flujo de poblaciones linfocíticas esplénicas presente después de tratamiento longitudinal.
Esta diferencia puede ser explicada ya sea mediante un efecto sobre la proliferación linfocítica o por medio de la reducción selectiva de linfocitos. Dado que el Compuesto 1 no altera la proliferación de linfocitos in vitro, estamos en favor de esta última explicación. El hecho de que no se observe un incremento significativo en la fracción de linfocitos T, sugiere que la destrucción de linfocitos T tiene lugar en menor grado que la destrucción de linfocitos B, lo cual está en consonancia con las averiguaciones obtenidas a partir de los estudios in vitro y de los experimentos de dosificación a corto plazo presentados anteriormente.
Para determinar directamente el efecto del Compuesto 1 sobre la muerte celular linfoide in vivo, se analizó tejido esplénico en búsqueda de evidencias de muerte celular, utilizando la reacción TUNEL. En secciones obtenidas a partir de 10 ratones control representativos, las células TUNEL positivas representan menos del 1% del número total de células y el teñido fue dispersado al azar a través de la sección. Como contraste, los ratones tratados con el Compuesto 1 poseen hasta un incremento de 5 veces en el número de células TUNEL positivas (ca. 3+ teñido) en el 50% de las secciones (p<0,05). A diferencia de las secciones obtenidas desde los ratones control, las células TUNEL positivas en estas secciones muestran un agrupamiento prominente (Figura 10). El análisis combinado TUNEL y el teñido inmunohistoquímico para un marcador superficial de linfocitos B (B220), indica que las células que manifiestan positividad TUNEL provocada por fármaco son linfocitos B (Figura 10).
La acción del Compuesto 1 frente a los linfocitos B y la mejora en la enfermedad renal mediada por autoanticuerpo hace predecible un descenso en los niveles de autoanticuerpo. El suero obtenido durante el transcurso del tratamiento fue sometido a ensayo en búsqueda de la IgG total, al igual que anti-dsDNA. Los niveles totales de inmunoglobulina no resultan alterados durante el transcurso del tratamiento (por ejemplo, después de 9 semanas de tratamiento, el control=4,0 \pm 2,2 mg(mL; Compuesto 1= 4,0 + 1,3 mg/mL, p>0,4. Como contraste, los niveles anti-dsDNA se reducen después de tres semanas de tratamiento con el Compuesto 1 (control= 733 + 546 U/mL; Compuesto 1= 496 + 513 U/mL, p<0,06). No obstante, hacia las 9 semanas de tratamiento, los niveles anti-dsDNA en los ratones tratados resultan indistinguibles de los ratones control =812 + 695 U/mL; Compuesto 1 =944 +546 U/mL; p<0,3). La pronta caída en anti-dsDNA en el contexto de IgG total no modificada, acoplada con la observación de que la deposición de Ig glomerular se reduce a través del transcurso completo del tratamiento, sugiere que las células patógenas pueden presentar una sensibilidad reforzada al Compuesto 1.
Teniendo en cuenta la naturaleza progresiva de la enfermedad en ratones NZB/W, resulta probable que el incremento eventual de anti-dsDNA corresponda a un punto caracterizado por una proliferación incrementada de linfocitos B, por ejemplo, tal como puede ser observado en la Tabla 6. Esta hipótesis está también apoyada por la observación de que administrando por partida doble la dosis del compuesto se obtiene como resultado una reducción sostenida de anti-dsDNA, con una mejoría de la enfermedad aproximadamente equivalente a la observada con la dosis más baja.
En resumen, estas observaciones vinculan el tratamiento con el Compuesto 1 a la mejoría de la enfermedad, tal como se refleja por medio de histología renal, función renal, autoanticuerpo y deposición C3, y proporcionan evidencias de que este efecto terapéutico coincide con la capacidad del compuesto para inducir muerte celular de manera selectiva en linfocitos B.
El Compuesto 1 no es tóxico
Se examinaron tejidos animales en busca de evidencias de toxicidades habitualmente asociadas con fármacos citotóxicos. El Compuesto 1 no afecta al peso en bruto de los animales y los ratones receptores del Compuesto 1 no presentan prácticas de acicalamiento alteradas o comportamientos destacadamente diferentes. El examen microscópico del corazón, hígado, pulmón, glándulas salivares intestino delgado, y útero demostró que no existían diferencias estructurales significativas entre los grupos de control y de tratamiento. Una posterior comparación de los ratones control y de tratamiento reveló que el Compuesto 1 no incrementaba el número de células apoptóticas en los órganos no linfoides. No se observó ninguna diferencia debida a pneumonitis incrementada en los pulmones de los animales sometidos a tratamiento, lo cual constituye un indicador importante de infección grave observado habitualmente en estudios animales utilizando fármacos citotóxicos (Horowitz, R.E. et al., Lab. Inves. 21:199-206 (1969) and Hahn, B.H. et al, Arthritis Rheum. 18:145-152 (1975)). La falta de pneumonitis en exceso en animales tratados constituye una fuerte evidencia frente a un efecto inmunosupresor significativo. El examen de los frotes de médula ósea reveló que no existían diferencias entre los animales control y los de tratamiento en lo que concierne a la celularidad global o en la representación proporcional de mieloides específicos y de precursores eritroides. El recuento sanguíneo periférico y los glóbulos blancos diferenciados no revelaron la existencia de descensos en plaquetas, granulocitos, linfocitos, o hematocrito. En global, no se detectó ninguna evidencia de la supresión inmune generalizada o en relación con otras toxicidades, en los ratones tratados con el Compuesto 1.
Ejemplo Comparativo 5
Para modelar el neuroblastoma en ratones, los mismos fueron transfectados con la línea celular de neuroblastoma humano SKNAS, para provocar el hecho de que las células sobre-expresen el neuroblastoma asociado con el oncogen humano N-myc. A la línea celular resultante se la denomina D2. Estas células forman tumores cuando son xenotransplantadas a ratones atímicos deficientes en linfocitos T; permitiendo obtener de esta forma un modelo animal de neuroblastoma humano.
Las pruebas in vitro en relación con las células D2 fueron llevadas a cabo para determinar su sensibilidad a la benzodiazepina. Las células D2 fueron colocadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos, a una densidad de 10.000 células por pocillo en medio de cultivo (DMEM, 10% volumen de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, 100\mu/ml de penicilina, 100\mu/ml de estreptomicina, 290\mu/ml de glutamina) y cultivadas (a 37ºC, 5% de CO_{2}) durante el transcurso de una noche. Subsiguientemente, el medio de cultivo fue intercambiado por otro medio que contenía 1% FBS. Se añadió disolvente control (dimetil sulfóxido (DMSO); concentración final 1% en volumen) o benzodiazepina a concentraciones entre 2,5 y 20\muM. Transcurridas 18 horas se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, tal como se ha descrito previamente en esta solicitud. La Figura 11 demuestra que la benzodiazepina destruye a las células D2 en base a un sistema dosis-respuesta.
Para comprobar el efecto de la benzodiazepina sobre el crecimiento del tumor neuroblastoma, se inacularon de manera aséptica, 1x10^{7} células D2 en la musculatura del muslo de cada uno de los 8 ratones hembra atímicos de seis semanas de edad (Jackson Lbas.). Con inicio una semana después de la inaculación de las células tumorales, se administró DMSO (20\mul inyectados en la cavidad peritoneal cada día) a 4 ratones y se administró benzodiazepina (2,5 mg disueltos en20 \mul de DMSO, inyectados en la cavidad peritoneal, cada día) a otros 4 ratones. Se efectuó una evaluación regular de los ratones en busca de desarrollo tumoral y, una vez presente, se midió el tamaño del tumor inicial cada día alterno. La Tabla 7 demuestra que en los ratones que habían desarrollado tumores, el tratamiento con benzodiazepina reducía, de una manera significativa, la velocidad de crecimiento del tumor.
TABLA 7
20
La administración de benzodiazepina disminuye la velocidad de crecimiento del tumor neuroblastoma en ratones atímicos (p<0,02).
De manera específica, los tumores en los ratones control se incrementaron en volumen 5 veces, durante un período promedio de 4 días, mientras que para obtener el mismo incremento de tamaño de tumor en animales tratados con benzodiazepina (p<0,02) se requerían 2 días. Estas averiguaciones apoyan la reivindicación de que la benzodiazepina es capaz de tratar las enfermedades malignas humanas en base a un modelo de ratón, Además, la benzodiazepina presenta una actividad específica frente al neuroblastoma humano, tanto in vitro como in vivo.
Ejemplo comparativo 6
En otra línea de experimentos, buscamos determinar si la benzodiazepina es capaz de destruir células tumorales que son, por otra parte, resistentes a los fármacos utilizados de manera estándar en quimioterapia. El cáncer de ovario proporciona un modelo excelente para estudiar el problema de la quimio-resistencia en ese tratamiento, siendo atribuidos los fallos a la aparición de células resistentes a la quimioterapia. La línea celular de cáncer de ovario humano A2780 es conocida por contener p53 natural, expresar bajos niveles de los factores de supervivencia bcl-2 y bcl-x_{L} y por resultar sensible al tratamiento con diclorhidrato de diamina de cis-platino (II) (CDDP), una agente utilizado habitualmente en quimioterapia para el tratamiento de cáncer de ovario. Estas células fueron transfectadas con un vector de expresión que codifica para el bcl-x_{L}, un factor de supervivencia que cuando se encuentra sobre-expresado está vinculado con el desarrollo de resistencia a la quimioterapia. A estas células transfectadas se las denomina 2B1, y a los controles transfectados del vector vacío se les denomina simplemente vector. Se obtuvo también una tercera línea celular de cáncer de ovario, designada SKOV3. Esta línea celular se caracteriza por: 1. Ser deficitaria en expresión de p53 de tipo natural; 2. Expresar niveles elevados de bcl-x_{L} endógenos; y 3. Ser relativamente resistente a las acciones citotóxicas de CDDP.
Cada una de estas líneas celulares fue mantenida utilizando condiciones de cultivo de tejido estándar en medio completo, compuesto de RPMI, 10% FBS, 100 U/ml de penicilina, 100\mu/ml de estreptomicina, 290 \mu/ml de glutamina. Cada uno de los tipos celulares fue colocado en placas en el interior de una serie de pocillos separados sobre placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, a razón de 50.000 células por pocillo. Transcurridas aproximadamente 24 horas desde la ubicación en placas, se intercambió el medio para contener el mismo medio de cultivo con tan solo el 2% de FBS. En este momento, se añadió a las células o bien disolvente control (DMSO, 1% en volumen), se incrementaron las concentraciones de Compuesto 1 (4-20 \muM) o se incrementaron las concentraciones de CDDP (6,7-66,7 \muM). Una vez transcurridas veinticuatro horas de cultivo, la totalidad de las células presentes en cada uno de los pocillos fueron extraídas utilizando tripsina-EDTA y se mezclaron con yoduro de propidio (concentración final 1\mu/ml). Transcurrido un período de incubación de 20 minutos, se analizaron las células por medio de citometría de flujo (Coulter FACS Calibur), para determinar la muerte celular en base al la integridad de la membrana de plasma, medida como la fracción de células que habían incorporado yoduro de propidio. La Figura 12 demuestra que se observó el patrón previsto de quimiosensibilidad y de resistencia hacia CDDP (A2780 y vector sensible; resistente a SKOV3 y 2B1). La Figura 13 demuestra que la benzodiazepina destruye cada uno de estos tipos, con independencia de la resistencia a CDDP. Además, la benzodiazepina destruye las células tumorales que expresan elevados niveles de factores de supervivencia (bcl-x_{L}), al igual que aquellas que resultan deficitarias en la expresión de p53.
A pesar de que la anterior invención ha sido descrita en algún detalle a través de la vía de ilustración y de ejemplos, a los efectos de claridad de comprensión, resultará evidente a los expertos en la materia que pueden efectuarse diversas modificaciones y cambios. Por consiguiente, la descripción y los ejemplos no deberían ser construidos en el sentido de limitar la cobertura de la invención, tal como se manifiesta en las reivindicaciones anexas.

Claims (11)

1. Utilización de un compuesto benzodiazepina para la fabricación de un medicamento para ser utilizado en el tratamiento de un trastorno autoinmune asociado con una incapacidad de las células de sufrir muerte celular a través de necrosis o apoptosis en un sujeto, en donde el compuesto benzodiazepina se selecciona a partir de compuestos de la siguiente fórmula:
21
sus en sus enantiómeros; y sales farmacéuticamente aceptables; donde:
R_{1} es:
Un grupo alifático que tiene de 1 a 20 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno; o
Un grupo arilo que tiene hasta 20 átomos de carbono y hasta 20 átomos de hidrógeno;
R_{2} es:
Un grupo alifático que tiene de 1 a 20 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno;
Un grupo arilo que tiene hasta 20 átomos de carbono y hasta 20 átomos de hidrógeno;
-NH_{2};
-NHC(=O)-R_{5;}
fluoro;
hidroxi;
alcoxi C_{1-4};
carbonilo C_{1-4};
carboxi C_{1-4};
éter C_{1-4};
un grupo fenólico;
un grupo amino;
un grupo amido;
un grupo nitro;
un grupo N-hidroxi; o
un grupo nitroso;
cada uno de R_{3} y R_{4} es, independientemente,
hidrógeno;
hidroxi;
alcoxi C_{1-4};
halo;
amino;
amino sustituido con alquilo C_{1-4};
acetilamino;
hidroxiamino;
un grupo alifático que tiene 1 - 8 átomos de carbono y 1 - 20 átomos de hidrógeno.
Un grupo arilo que tiene de 6 a 14 átomos de carbono;
Un grupo heterocíclico que tiene un anillo de 3-6 elementos, aromático o no aromático, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados a partir de nitrógeno, oxígeno y azufre;
R_{5} es:
Un grupo arilo que tiene de 6 a 14 átomos de carbono;
Un grupo heterocíclico que tiene un anillo de 3 a 6 elementos, aromático o no aromático, que contiene uno o más heteroátomos, seleccionado de entre nitrógeno, oxígeno y azufre;
-R_{6}-NH-C(=O)-R_{7};
o
-R_{6}-C(=O)-NH-R_{7};
en donde:
R_{6} es:
Un grupo de unión alifático de 1 a 6 átomos de carbono; y
R_{7} es:
Un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno;
Un grupo arilo que tiene de 6 a 14 átomos de carbono; o
Un grupo heterocíclico que tiene un anillo aromático o no aromático de 3 a 6 miembros, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados a partir de nitrógeno, oxígeno y azufre.
2. Utilización según la reivindicación 1, en donde el compuesto benzodiazepina se selecciona de entre compuestos de fórmula:
22
sus enantiómeros,
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la benzodiazepina induce apoptosis en un ensayo de suero bajo.
4. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la muerte celular es apoptótica.
5. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en donde la muerte celular es necrótica.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el trastorno toinmune es: lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren, enfermedad injerto-contra- huésped o miastenia grave.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el medicamento se administra por vía oral, parenteral, tópica o intranasal.
8. Compuesto benzodiazepina seleccionado a partir de compuestos de fórmula:
23
sus enantiómeros
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
9. Composición farmacéutica que comprende un compuesto benzodiazepina según la reivindicación 8 y un soporte.
10. Compuesto benzodiazepina según la reivindicación 8 para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, mediante terapia.
11. Compuesto benzodiazepina según la reivindicación 8, para utilizar en un procedimiento de tratamiento de un trastorno autoinmune asociado con una incapacidad de las células de sufrir muerte celular, a través de ya sea necrosis o apoptosis en un sujeto.
ES00928586T 1999-04-30 2000-04-27 Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis. Expired - Lifetime ES2214273T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13176199P 1999-04-30 1999-04-30
US131761P 1999-04-30
US16551199P 1999-11-15 1999-11-15
US165511P 1999-11-15
US19185500P 2000-03-24 2000-03-24
US191855P 2000-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2214273T3 true ES2214273T3 (es) 2004-09-16

Family

ID=27384197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00928586T Expired - Lifetime ES2214273T3 (es) 1999-04-30 2000-04-27 Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis.

Country Status (13)

Country Link
US (5) US7125866B1 (es)
EP (4) EP1398033B1 (es)
JP (1) JP5127096B2 (es)
AT (2) ATE258439T1 (es)
AU (2) AU782447C (es)
CA (1) CA2372150C (es)
DE (2) DE60007960T2 (es)
DK (1) DK1143946T3 (es)
ES (1) ES2214273T3 (es)
IL (2) IL146222A0 (es)
MX (1) MXPA01011052A (es)
PT (1) PT1143946E (es)
WO (1) WO2000066106A2 (es)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2785803B1 (fr) * 1998-11-17 2005-03-25 Sanofi Sa Utilisation d'une substance se liant au recepteur peripherique des benzodiazepines dans le traitement des stress cutanes
US20040176358A1 (en) * 1999-04-30 2004-09-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7276348B2 (en) 1999-04-30 2007-10-02 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to F1F0-ATPase inhibitors and targets thereof
US20060025388A1 (en) * 1999-04-30 2006-02-02 Glick Gary D Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US20050113460A1 (en) * 1999-04-30 2005-05-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7144880B2 (en) * 1999-04-30 2006-12-05 Regents Of The University Of Michigan Compositions relating to novel compounds and targets thereof
US20030119029A1 (en) * 1999-04-30 2003-06-26 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
DE60007960T2 (de) * 1999-04-30 2004-10-21 Univ Michigan Ann Arbor Therapeutische Anwendungen von pro-apoptotischen Benzodiazepinen
US20070122353A1 (en) 2001-05-24 2007-05-31 Hale Ron L Drug condensation aerosols and kits
US7766013B2 (en) 2001-06-05 2010-08-03 Alexza Pharmaceuticals, Inc. Aerosol generating method and device
AU2002332560B2 (en) * 2001-08-15 2006-01-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
NZ532463A (en) 2001-11-13 2007-02-23 Dimensional Pharm Inc Substituted 1,4-benzodiazepines and uses thereof for the treatment of cancer
GB0221923D0 (en) * 2002-09-20 2002-10-30 Arrow Therapeutics Ltd Chemical compounds
NZ538870A (en) 2002-09-20 2007-04-27 Arrow Therapeutics Ltd Benzodiazepine derivatives and pharmaceutical compositions containing them
AU2004255153B2 (en) * 2003-05-01 2007-11-22 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
JP5172146B2 (ja) * 2003-05-09 2013-03-27 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 癌を標的化するための組成物及び方法
ATE520935T1 (de) 2003-05-21 2011-09-15 Alexza Pharmaceuticals Inc Verwendung einer schicht aus festem brennstoff, verfahren zum erstellen einer solchen schicht und zugehörige heizvorrichtung
US20050120397A1 (en) * 2003-11-24 2005-06-02 Hermann Steller Compounds and methods for regulation of spermatid differentiation
US20070293482A1 (en) * 2004-03-19 2007-12-20 Novartis Pharmaceuticals Corporation Process for Preparing Benzodiazepines
US20050272723A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-08 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
US20060052369A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7638624B2 (en) 2005-01-03 2009-12-29 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and derivatives
JP2008545757A (ja) * 2005-06-01 2008-12-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 溶媒和されていないベンゾジアゼピン組成物および方法
RU2008112661A (ru) * 2005-09-02 2009-10-10 Тиботек Фармасьютикалз Лтд. (Ie) Бензодиазепины в качестве ингибиторов hcv
CA2622592A1 (en) * 2005-09-19 2007-03-29 Arrow Therapeutics Limited Benzodiazepine derivatives for treating hepatitis c infection
US20070105844A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Regents Of The University Of Michigan Therapeutic compositions and methods
AU2006308655B2 (en) 2005-11-01 2010-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Novel 1,4-benzodiazepine-2,5-diones with therapeutic properties
WO2007110337A1 (en) 2006-03-29 2007-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridine and pyrimidine derivatives as mglur2 antagonists
US7759338B2 (en) * 2006-04-27 2010-07-20 The Regents Of The University Of Michigan Soluble 1,4 benzodiazepine compounds and stable salts thereof
EP2418206A3 (en) 2006-06-09 2012-06-27 The Regents of the University of Michigan Benzodiazepine derivatives useful in the treatment of autoimmune disorders
US20100021928A1 (en) * 2006-06-26 2010-01-28 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods and kits for diagnosing cancer
AR065374A1 (es) * 2007-02-16 2009-06-03 Tibotec Pharm Ltd 1, 1-DIOXO-1-TIA-5, 10-DIAZADIBENZOCICLOHEPTENOS uTILES COMO INHIBIDORES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C, METODOS PARA SU PREPARACION, UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LOS COMPRENDE Y SU USO EN LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA INHIBIR LA REPLICACION DEL VHC.
WO2008112661A2 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Alexza Pharmaceuticals, Inc. Heating unit for use in a drug delivery device
BRPI0808653A2 (pt) * 2007-03-09 2014-08-19 Univ Michigan Composições e métodos referindo-se a novos compostos e alvos dos mesmos.
BRPI0811204A8 (pt) * 2007-05-10 2015-09-22 Bristol Myers Squibb Co Tetra-hidroibenzo-1,4-diazepinas substituídas por arila e heteroarila e uso das mesmas para bloquear a recaptação de norepinefrina, dopamina e serotonina
CN101855203B (zh) * 2007-09-14 2014-03-19 密执安州立大学董事会 F1f0-atp合成酶抑制剂以及相关的方法
JP5539212B2 (ja) 2007-11-06 2014-07-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 皮膚症状の治療に有用なベンゾジアゼピノン化合物
GB2456562A (en) * 2008-01-18 2009-07-22 Petra Technology Ltd Treatment of HIV/AIDS
EP2145873A1 (fr) * 2008-06-17 2010-01-20 Commissariat A L'energie Atomique Nouveaux composés ayant une activité protectrice vis-à-vis de l'action de toxines et de virus au mode d'action intracellulaire
WO2010030891A2 (en) 2008-09-11 2010-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Aryl guanidine f1f0-atpase inhibitors and related methods
WO2010121164A2 (en) 2009-04-17 2010-10-21 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepinone compounds and their use in treating cancer
US9075060B2 (en) 2009-06-16 2015-07-07 Technion Research & Development Foundation Limited Methods for diagnosing oral or oral-pharyngeal cancer
JP2013505258A (ja) * 2009-09-18 2013-02-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン ベンゾジアゼピノン化合物およびそれを使用する治療方法
WO2011062766A2 (en) 2009-11-17 2011-05-26 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepine-2,5-diones and related compounds with therapeutic properties
CA2915237C (en) 2009-11-17 2017-10-10 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepine-2,5-diones and related compounds with therapeutic properties
CN102190631B (zh) * 2010-03-10 2014-10-29 中国人民解放军63975部队 苯二氮卓化合物的制备方法
TWI530489B (zh) 2011-03-22 2016-04-21 必治妥美雅史谷比公司 雙（氟烷基）－１，４－苯二氮呯酮化合物
EP2897954B1 (en) 2012-09-21 2016-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Fluoroalkyl-1,4-benzodiazepinone compounds
WO2014047393A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Bristol-Myers Squibb Company N-substituted bis(fluoroalkyl)-1,4-benzodiazepinone compounds as notch inhibitors
WO2014047370A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Fluoroalkyl dibenzodiazepinone compounds
US9242941B2 (en) 2012-09-21 2016-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Alkyl, fluoroalkyl-1,4-benzodiazepinone compounds
TWI614238B (zh) 2012-09-21 2018-02-11 必治妥美雅史谷比公司 雙（氟烷基）－１，４－苯并二氮呯酮化合物及其前藥
WO2014047369A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Substituted 1,5-benzodiazepinone compounds
US9249157B2 (en) 2012-09-21 2016-02-02 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic heterocycle compounds
US9427442B2 (en) 2012-09-21 2016-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Fluoroalkyl and fluorocycloalkyl 1,4-benzodiazepinone compounds
CN104968648A (zh) 2012-09-21 2015-10-07 百时美施贵宝公司 1,4-苯并二氮杂*酮化合物的前药
WO2014165718A1 (en) 2013-04-04 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for the treatment of proliferative diseases
ES2886766T3 (es) 2015-03-31 2021-12-20 Enanta Pharm Inc Derivados del ácido biliar como agonistas de FXR/TGR5 y métodos de uso de estos
JP7112324B2 (ja) 2015-07-22 2022-08-03 エナンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｓｖ阻害剤としてのベンゾジアゼピン誘導体
CN108699077B (zh) 2016-01-15 2021-03-02 英安塔制药有限公司 作为rsv抑制剂的杂环化合物
CN105693634B (zh) * 2016-03-17 2018-12-11 清华大学 化合物及其用途
WO2017189652A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives as fxr agonists and methods of use thereof
WO2017189651A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives as fxr agonists and methods of use thereof
US10080743B2 (en) 2016-04-26 2018-09-25 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives as FXR agonists and methods of use thereof
CN109906223A (zh) 2016-10-04 2019-06-18 英安塔制药有限公司 异噁唑类似物作为fxr激动剂及其使用方法
US10597391B2 (en) 2016-10-26 2020-03-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Urea-containing isoxazole derivatives as FXR agonists and methods of use thereof
US10398706B2 (en) 2017-01-06 2019-09-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Heteroaryldiazepine derivatives as RSV inhibitors
JP7076459B2 (ja) 2017-02-16 2022-05-27 エナンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ベンゾジアゼピン誘導体の製造プロセス
WO2018226801A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Aryldiazepine derivatives as rsv inhibitors
US11091501B2 (en) 2017-06-30 2021-08-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds as RSV inhibitors
WO2019006291A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. HETEROCYCLIC COMPOUNDS AS RSV INHIBITORS
CN111386118B (zh) 2017-09-29 2023-05-09 英安塔制药有限公司 作为rsv抑制剂的组合药物剂
US10647711B2 (en) 2017-11-13 2020-05-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Azepin-2-one derivatives as RSV inhibitors
AU2018365174B2 (en) 2017-11-13 2023-03-30 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Processes for the resolution of benzodiazepin-2-one and benzoazepin-2-one derivatives
US10689391B2 (en) 2017-12-12 2020-06-23 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole analogs as FXR agonists and methods of use thereof
WO2019160813A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives as fxr agonists and methods of use thereof
US10975094B2 (en) 2018-04-11 2021-04-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds as RSV inhibitors
EP3941525A4 (en) 2019-03-18 2022-12-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. BENZODIAZEPIN DERIVATIVES AS RSV INHIBITORS
WO2020210246A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 Enanta Pharmaceuticals, Inc, Heterocyclic compounds as rsv inhibitors
US11555032B2 (en) 2019-05-13 2023-01-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives as FXR agonists and methods of use thereof
US11505558B1 (en) 2019-10-04 2022-11-22 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Antiviral heterocyclic compounds
KR20220101083A (ko) 2019-10-04 2022-07-19 이난타 파마슈티칼스, 인코포레이티드 항바이러스 헤테로사이클릭 화합물
UY39032A (es) 2020-01-24 2021-07-30 Enanta Pharm Inc Compuestos heterocíclicos como agentes antivirales
US11534439B2 (en) 2020-07-07 2022-12-27 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Dihydroquinoxaline and dihydropyridopyrazine derivatives as RSV inhibitors
WO2022086840A1 (en) 2020-10-19 2022-04-28 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds as anti-viral agents
AU2022227674A1 (en) 2021-02-26 2023-09-21 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Antiviral heterocyclic compounds
CN117263873A (zh) * 2022-06-15 2023-12-22 复旦大学 1,4-苯二氮䓬类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2457405A (en) * 1945-09-25 1948-12-28 Monsanto Chemicals Halo nitroparaffin modified aminoplasts
DE1810423U (de) 1960-01-05 1960-04-28 Kaiserslautern Guss Armatur Schornsteinreinigungsverschluss.
US3374264A (en) * 1962-10-04 1968-03-19 Hoffmann La Roche N-haloacetyl-anthranilic acids and esters
US3261828A (en) 1962-10-04 1966-07-19 Hoffmann La Roche 3h-1,4-benzodiazepine-2,5(1h,4h)-dione compounds
FR1497456A (fr) * 1964-06-15 1967-10-13 Clin Byla Ets Ortho-amino aryl cétimines, composés hétérocycliques qui s'y rattachent et prépaation de ces divers corps
NO120269B (es) * 1965-11-02 1970-09-28 Hoffmann La Roche
US3384635A (en) 1966-09-28 1968-05-21 Sterling Drug Inc 1, 4-benzodiazepine derivatives
US3415814A (en) 1966-09-28 1968-12-10 Sterling Drug Inc 4-(cyclopropylmethyl)-3h-1,4-benzodiazepine-2,5(1h,4h)-dione
AT280290B (de) * 1967-11-24 1970-04-10 Boehringer Sohn Ingelheim Verfahren zur Herstellung von neuen 1-Phenyl-4-alkyl-3H-1,4-benzodiazepin-2,5-[1H,4H]-dionen
US4108852A (en) * 1969-03-18 1978-08-22 Knoll Ag. Process for preparing 1,5-benzodiazepine-2-ones
USRE30293E (en) * 1969-03-18 1980-06-03 Knoll A.G. Process for preparing 1,5-benzodiazepine-2-ones
CH559729A5 (es) 1970-10-23 1975-03-14 Hoechst Ag
GB1324469A (en) * 1970-10-28 1973-07-25 Knoll Ag Derivatives of benzodiazepines
US3806594A (en) * 1972-11-24 1974-04-23 Abbott Lab Method of reducing involuntary movements associated with cerebral palsy using clorazepate dipotassium
ZA7464B (en) * 1973-01-16 1974-11-27 J Voorhees Treatment of proliferating skin diseases with papavine alkaloids
IE38931B1 (en) 1973-03-09 1978-07-05 Lipha Triazolobenzodiazepines
US4110327A (en) * 1974-05-09 1978-08-29 Toyama Chemical Co., Ltd. 2,3 Diketo-piperazinocarbonylamino alkanoic acids and derivatives
US4076823A (en) 1977-08-18 1978-02-28 E. R. Squibb & Sons, Inc. Triazolo-2,4-benzodiazepines
JPS59112984A (ja) * 1982-12-21 1984-06-29 Shionogi & Co Ltd １，４−ベンゾジアゼピン誘導体
US4495101A (en) 1983-04-28 1985-01-22 American Home Products Corporation Antiinflammatory 5H-tetrazolo (5,1-c)(1,4)benzodiazepine derivatives
US4551480A (en) * 1983-06-21 1985-11-05 Stiefel Laboratories, Inc. Compositions for the treatment of psoriasis
US4894366A (en) * 1984-12-03 1990-01-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US4820834A (en) * 1984-06-26 1989-04-11 Merck & Co., Inc. Benzodiazepine analogs
US5004741A (en) * 1984-06-26 1991-04-02 Merck & Co., Inc. Methods of antagonizing CCK or gastrin with benzodiazepine analogs
DE3435974A1 (de) * 1984-10-01 1986-04-10 Boehringer Ingelheim KG, 6507 Ingelheim Diazepine enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen mit paf-antagonistischer wirkung
FR2591596B1 (fr) 1985-12-13 1988-09-09 Roussel Uclaf Nouvelles 4h-triazolo(4,3-a)(1,4)benzodiazepines, leur procede de preparation, leur application comme medicaments et les compositions les renfermant
GB8608080D0 (en) * 1986-04-02 1986-05-08 Fujisawa Pharmaceutical Co Solid dispersion composition
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4751223A (en) 1986-10-14 1988-06-14 Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Inc. Antiinflammatory and analgesic aminoalkyl tetracyclic benzodiazepines
US4898861A (en) * 1987-03-26 1990-02-06 Hoffmann-La Roche Inc. Method for inhibiting the proliferation of tumor cells
US5147872A (en) * 1987-06-09 1992-09-15 Golwyn Daniel H Treatment of immunologically based disorders, specifically psoriasis
US4970207A (en) * 1988-07-07 1990-11-13 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Benzodiazepine derivatives
WO1990013332A1 (en) 1989-05-11 1990-11-15 Cedars-Sinai Medical Center Stent with sustained drug delivery
US5258510A (en) * 1989-10-20 1993-11-02 Otsuka Pharma Co Ltd Benzoheterocyclic compounds
US5041438A (en) 1989-10-30 1991-08-20 Hoffmann-La Roche Inc. Method for treating retroviral infections with benzodiazepine compounds
US5324726A (en) 1989-12-18 1994-06-28 Merck & Co., Inc. Benzodiazepine analogs
EP0470246B1 (en) 1990-02-28 1995-06-28 Medtronic, Inc. Intralumenal drug eluting prosthesis
ATE145208T1 (de) * 1990-07-06 1996-11-15 Yoshitomi Pharmaceutical Kondensierte thiophenverbindungen und deren verwendung
GB9015879D0 (en) * 1990-07-19 1990-09-05 Fujisawa Pharmaceutical Co Benzodiazepine derivatives
BR9200951A (pt) * 1991-03-21 1992-11-17 Hoffmann La Roche Compostos, processo para sua producao,preparacoes farmaceuticas e uso
JPH07504908A (ja) 1992-03-16 1995-06-01 メルク　シヤープ　エンド　ドーム　リミテツド ベンゾジアゼピン誘導体，該誘導体を含有する組成物及び治療におけるその使用
US5599352A (en) 1992-03-19 1997-02-04 Medtronic, Inc. Method of making a drug eluting stent
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
GB9307527D0 (en) * 1993-04-13 1993-06-02 Fujisawa Pharmaceutical Co New venzamide derivatives,processes for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US5391566A (en) * 1993-07-20 1995-02-21 Merck & Co., Inc. Benzimidazolinones substituted with phenoxyphenylacetic acid derivatives
US6524832B1 (en) * 1994-02-04 2003-02-25 Arch Development Corporation DNA damaging agents in combination with tyrosine kinase inhibitors
US5444092A (en) * 1994-07-20 1995-08-22 Collins; Jerry Method and composition for treating psoriasis
WO1996004254A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Benzodiazepine derivatives
CA2195973A1 (en) * 1994-08-18 1996-02-29 David A. Claremon N-2,3-dihydro-1-(2-propyl)-2-oxo-5-phenyl-1h-1,4-benzodiazepines
US5618792A (en) 1994-11-21 1997-04-08 Cortech, Inc. Substituted heterocyclic compounds useful as inhibitors of (serine proteases) human neutrophil elastase
AU5752696A (en) 1995-05-18 1996-11-29 Regents Of The University Of Michigan, The Dna binding antibodies
US5677282A (en) * 1995-06-07 1997-10-14 Proscript, Inc. Amino acid amides of 1,3,4-thiadiazoles as matrix metalloproteinase
US5692337A (en) * 1995-06-07 1997-12-02 Motz, Jr.; Ronald W. Collapsible plant shelter
US5962337A (en) 1995-06-29 1999-10-05 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial 1,4-benzodiazepin-2,5-dione library
RU2096044C1 (ru) 1995-07-19 1997-11-20 Малое предприятие "Ветта" Ветеринарный имплантируемый препарат для регулирования биологического ритма животных
US5776946A (en) 1995-08-28 1998-07-07 Mcgeer; Patrick L. Peripheral benzodiazepine receptor ligands as antiinflammatory agents
US6004942A (en) 1995-08-30 1999-12-21 The Regents Of The University Of California Methods for treating arthritis by administering an apoptosis regulator
ATE214055T1 (de) * 1995-09-21 2002-03-15 Inst Med Molecular Design Inc Retinoid-potenzierende verbindungen
US6579854B1 (en) * 1996-08-14 2003-06-17 Vanderbilt University Diagnosis and management of infection caused by chlamydia
UA60311C2 (uk) * 1996-10-02 2003-10-15 Смітклайн Бічам Корпорейшн Антагоністи рецептора вітронектину, спосіб одержання цих сполук та фармацевтична композиція
US7351421B2 (en) * 1996-11-05 2008-04-01 Hsing-Wen Sung Drug-eluting stent having collagen drug carrier chemically treated with genipin
PT945445E (pt) * 1996-12-10 2004-01-30 Zeria Pharm Co Ltd Derivados de 1,5-benzodiazepina
US6074859A (en) * 1997-07-08 2000-06-13 Kikkoman Corporation Mutant-type bioluminescent protein, and process for producing the mutant-type bioluminescent protein
NZ502362A (en) * 1997-10-08 2001-05-25 Isotechnika Inc Deuterated cyclosporine A derivatives and their use as immunomodulating agents
US6100254A (en) * 1997-10-10 2000-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibitors of protein tyrosine kinases
FR2772271B1 (fr) 1997-12-11 2000-09-01 Union Pharma Scient Appl Nouvelle association pharmaceutique a activite analgesique
US6206914B1 (en) * 1998-04-30 2001-03-27 Medtronic, Inc. Implantable system with drug-eluting cells for on-demand local drug delivery
WO1999058117A1 (fr) 1998-05-13 1999-11-18 Sanofi-Synthelabo Utilisation de composes reduisant l'apoptose
FR2779963A1 (fr) 1998-06-22 1999-12-24 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines en therapie du cancer
US6277844B1 (en) 1998-09-14 2001-08-21 Sydney Spector Compound for selective treatment of malignant cells by inhibiting cell cycle progression, decreasing Bcl2, and increasing apoptosis
US20030044776A1 (en) 1998-09-25 2003-03-06 James A. Dykens Compositions and methods for identifying agents that alter mitochondrial permeability transition pores
FR2785803B1 (fr) 1998-11-17 2005-03-25 Sanofi Sa Utilisation d'une substance se liant au recepteur peripherique des benzodiazepines dans le traitement des stress cutanes
US7175953B2 (en) * 1999-04-09 2007-02-13 Institute Fuer Diagnostik Forschung Short-warp peptide-dye conjugate as contrast agent for optical diagnostic
US7144880B2 (en) * 1999-04-30 2006-12-05 Regents Of The University Of Michigan Compositions relating to novel compounds and targets thereof
US20030119029A1 (en) * 1999-04-30 2003-06-26 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
US20060025388A1 (en) 1999-04-30 2006-02-02 Glick Gary D Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
DE60007960T2 (de) 1999-04-30 2004-10-21 Univ Michigan Ann Arbor Therapeutische Anwendungen von pro-apoptotischen Benzodiazepinen
US7276348B2 (en) * 1999-04-30 2007-10-02 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to F1F0-ATPase inhibitors and targets thereof
US20050113460A1 (en) 1999-04-30 2005-05-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US20040176358A1 (en) * 1999-04-30 2004-09-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
AU5826100A (en) 1999-07-13 2001-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Benzazepinones and quinazolines
US6524623B1 (en) * 1999-11-12 2003-02-25 Milton Hodosh Therapeutic compositions and methods of use thereof
EP1280559B1 (en) * 2000-05-11 2006-03-08 Eastman Chemical Company Acylated cyclodextrin guest inclusion complexes
US20020048566A1 (en) * 2000-09-14 2002-04-25 El-Deiry Wafik S. Modulation of cellular apoptosis and methods for treating cancer
CA2432825A1 (en) 2000-12-15 2002-06-20 Emory University Nonpeptide agonists and antagonists of vasopressin receptors
EP1392663A2 (fr) * 2001-06-07 2004-03-03 Neuro3D Inhibiteurs des phosphodiesterases des nucleotides cycliques, preparation et utilisations de ces inhibiteurs
AU2002332560B2 (en) 2001-08-15 2006-01-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
EP1450901A4 (en) * 2001-12-10 2005-05-25 Bristol Myers Squibb Co (1-PHENYL-2-HETEROARYL) ETHYL-GUANIDINE COMPOUNDS AS AN INHIBITORS OF MITOCHONDRIAL F1F0 ATP HYDROLASE
US20040009972A1 (en) * 2002-06-17 2004-01-15 Ding Charles Z. Benzodiazepine inhibitors of mitochondial F1F0 ATP hydrolase and methods of inhibiting F1F0 ATP hydrolase
US7150433B2 (en) * 2002-08-16 2006-12-19 Toyota Motor Sales, U.S.A., Inc. Aircraft bolster trays
US20040087489A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-06 Antonio Ruiz Compositions and methods for the treatment of mycobacterial infections
WO2004043362A2 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Acyl guanidine compounds and use thereof
AU2003293405A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-23 Vela Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical composition of 1-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methyl-5-ethyl-7-methoxy-8-hydroxy-5h-2,3-benzodiazepine and uses thereof
CA2508914A1 (en) 2002-12-04 2004-06-17 Gene Logic Inc. Modulators of melanocortin receptor
AU2004255153B2 (en) 2003-05-01 2007-11-22 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7351241B2 (en) * 2003-06-02 2008-04-01 Carl Zeiss Meditec Ag Method and apparatus for precision working of material
US20090275099A1 (en) 2004-04-27 2009-11-05 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
US20050272723A1 (en) 2004-04-27 2005-12-08 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
WO2006007532A2 (en) 2004-07-01 2006-01-19 Synta Pharmaceuticals Corp. 2-substituted heteroaryl compounds
US20060052369A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7638624B2 (en) * 2005-01-03 2009-12-29 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and derivatives
JP2008545757A (ja) * 2005-06-01 2008-12-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 溶媒和されていないベンゾジアゼピン組成物および方法
WO2007050587A2 (en) 2005-10-26 2007-05-03 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic compositions and methods
US20070105844A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Regents Of The University Of Michigan Therapeutic compositions and methods
AU2006308655B2 (en) * 2005-11-01 2010-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Novel 1,4-benzodiazepine-2,5-diones with therapeutic properties
US7759338B2 (en) * 2006-04-27 2010-07-20 The Regents Of The University Of Michigan Soluble 1,4 benzodiazepine compounds and stable salts thereof
EP2418206A3 (en) 2006-06-09 2012-06-27 The Regents of the University of Michigan Benzodiazepine derivatives useful in the treatment of autoimmune disorders
BRPI0808653A2 (pt) 2007-03-09 2014-08-19 Univ Michigan Composições e métodos referindo-se a novos compostos e alvos dos mesmos.
CN101855203B (zh) 2007-09-14 2014-03-19 密执安州立大学董事会 F1f0-atp合成酶抑制剂以及相关的方法
JP5539212B2 (ja) 2007-11-06 2014-07-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 皮膚症状の治療に有用なベンゾジアゼピノン化合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2062583B1 (en) 2012-12-26
US8809323B2 (en) 2014-08-19
US7125866B1 (en) 2006-10-24
AU782447C (en) 2006-07-13
WO2000066106A2 (en) 2000-11-09
US20090012065A1 (en) 2009-01-08
EP1398033B1 (en) 2009-06-17
EP1143946B1 (en) 2004-01-28
EP2359831A2 (en) 2011-08-24
EP1143946A2 (en) 2001-10-17
EP1398033A2 (en) 2004-03-17
EP2359831A3 (en) 2012-02-01
MXPA01011052A (es) 2002-11-22
US20140038947A1 (en) 2014-02-06
AU2005227385C1 (en) 2009-05-21
US20010016583A1 (en) 2001-08-23
WO2000066106A9 (en) 2002-04-18
IL146222A (en) 2008-06-05
WO2000066106A3 (en) 2001-08-16
US20070036854A1 (en) 2007-02-15
DK1143946T3 (da) 2004-06-07
EP2062583A3 (en) 2009-12-30
ATE258439T1 (de) 2004-02-15
CA2372150A1 (en) 2000-11-09
US7220739B2 (en) 2007-05-22
ATE433752T1 (de) 2009-07-15
DE60042425D1 (de) 2009-07-30
EP2062583A2 (en) 2009-05-27
JP5127096B2 (ja) 2013-01-23
DE60007960D1 (de) 2004-03-04
AU2005227385B2 (en) 2008-12-11
IL146222A0 (en) 2002-07-25
DE60007960T2 (de) 2004-10-21
JP2002543121A (ja) 2002-12-17
AU4680200A (en) 2000-11-17
AU2005227385A1 (en) 2005-12-01
AU782447B2 (en) 2005-07-28
CA2372150C (en) 2011-08-30
EP1398033A3 (en) 2004-06-30
PT1143946E (pt) 2004-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2214273T3 (es) Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis.
US20030119029A1 (en) Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
AU2005323519B2 (en) Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
US7572788B2 (en) Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
AU2002332560B2 (en) Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
US20040241781A1 (en) Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
AU2004255153B2 (en) Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
AU2002332560A1 (en) Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
US20040176358A1 (en) Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
AU2006201605B2 (en) Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof