ES2213742T3

ES2213742T3 - Animales transgenicos, celulas y lineas celulares de las mismas y utilizaciones.

Info

Publication number: ES2213742T3
Application number: ES91904013T
Authority: ES
Inventors: Mark David Noble; Parmjit Singh Jat; Dimitris Kioussis
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Medical Research Council; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Medical Research Council; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1990-02-20
Filing date: 1991-02-20
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2011-02-20
Also published as: JP3333902B2; AU676118B2; IE910572A1; CA2076345A1; EP0516664A1; DE69133355D1; CA2076345C; US5688692A; AU7328691A; GB9003791D0; ATE258226T1; DE69133355T2; DK0516664T3; WO1991013150A1; JPH05504066A; EP0516664B1; AU660604B2; AU3305395A

Abstract

LA PROVISION DE LINEAS DE CELULAS DE VIRTUALMENTE CUALQUIER TIPO DE CELULA DEL CUERPO ANIMAL, SE FACILITA GRANDEMENTE POR ANIMALES EUCARIOTICOS NO HUMANOS TRANSGENICOS DEL INVENTO, EN QUE AL MENOS ALGUNAS CELULAS TIENEN (I) UNA SECUENCIA DE INHIBICION DE LA DIFERENCIACION CROMOSOMATICAMENTE INCORPORADA BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR NO CONSTITUVO Y/O (II) UNA SECUENCIA DE INHIBICION DE LA DIFERENCIACION QUE ES ACTIVA CONDICIONALMENTE ELLA MISMA. DICHOS GENES SE INCORPORAN CROMOSOMATICAMENTE BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR, DE TAL MODO QUE LA EXPRESION DE DICHA SECUENCIA SE MANTIENE NORMALMENTE DEBAJO DE UN NIVEL EFECTIVO, PERMITIENDO ASI EL DESARROLLO NORMAL DE LA CELULA. SIN EMBARGO, SE PUEDE PREVENIR QUE LAS CELULAS TOMADAS DICHOS ANIMALES COMPLETEN LA DIFERENCIACION A UN ESTADO DE NO DIVISION EN UN CULTIVO DE TEJIDO ACTIVANDO LA EXPRESION DE DICHA SECUENCIA.

Description

Animales transgénicos, células y líneas celulares de las mismas y utilizaciones.

La presente invención se refiere a animales vertebrados no-humanos, transgénicos "condicionales", p.ej., mamíferos, en los que las células germinales y/o somáticas han incorporado en sus cromosomas una secuencia o secuencias de ácido nucleico, cuya expresión durante el desarrollo normal del animal está inhibida pero puede ser activada en cultivos de tejidos aislados. La invención también se refiere a los cultivos aislados y a su utilización para producir líneas celulares inmortalizadas. Dichas líneas celulares a su vez presentan muchas aplicaciones útiles.

El estudio de la función fisiológica a nivel celular se ha beneficiado en gran manera de la disponibilidad de líneas celulares que permiten que la experimentación bioquímica se realice en poblaciones homogéneas de células derivadas clonalmente. Dichas células se han derivado con frecuencia de tumores de origen espontáneo o experimental. Recientemente, ha sido posible utilizar manipulaciones genéticas para crear líneas celulares mediante inserción de tipos particulares de información genética en el genoma celular.

Diversos tipos de información genética son los que permiten que una generación de células comparta la propiedad para impedir que sus células pasen de un estado de diferenciación a un estado terminal de no-división. En Virology, 127, 74-82 (1983), Petit y col., describieron la utilización de SV40 en la inmortalización de fibroblastos embrionales de roedor y numerosos otros estudios han definido los genes inhibidores de la diferenciación por su capacidad para impedir que los fibroblastos entren en un fenotipo de senescencia, un fenotipo que normalmente se observa al cabo de un número limitado de divisiones fibroblásticas. En términos de generación de líneas celulares, la entrada de fibroblastos en dicho fenotipo senescente se denomina a veces "crisis" y la capacidad para recuperar las células antes de que entren en crisis proporciona un sistema de ensayo valioso para la identificación de los genes de esta familia. Como las células en las que este tipo de información genética en particular se expresa pueden establecerse como líneas de cultivo de tejidos que crecerán efectivamente durante períodos infinitos in vitro, esta familia de genes se ha denominado genes de establecimiento o genes de inmortalización (Land y col., Nature 1983, 304, 596-602, Ruley Nature 1983, 304, 602-606). Como también estos genes inhiben la diferenciación del estado terminal, son asimismo denominados genes de parada de la maduración.

Los análisis sugieren que los genes inhibidores de la diferenciación son frecuentemente miembros de una familia de oncogenes denominada familia de oncogenes nucleares. Estos oncogenes nucleares incluyen un número de oncogenes virales de los que todavía no se conocen sus homólogos celulares (p.ej., el antígeno T mayor de SV40, el antígeno T mayor del polioma, el antígeno E7 del virus papiloma humano)(Jat y Sharp, 1986, J. Virologoy 59, 746-750, Rassoulzadegan y col., 1982, Nature 30C, 713-718, 1983, PNAS 80, 4354-4358, Phelps y col., 1988, Cell 53, 539-547 y petit y col., supra) y también una serie de genes cuyos homólogos se conocen (siendo myc el mejor ejemplo). Además, algunos genes de la familia de oncogenes citoplasmáticos (o controladores del crecimiento) también inhiben la diferenciación en algunos tipos celulares. Por ejemplo, el gen src inhibe la diferenciación de las células progenitoras gliales. Sin embargo, es raro que genes que han de funcionar en la estimulación de la división celular también tengan la capacidad para inhibir los procesos de diferenciación celular.

En experimentos recientes, se han utilizado diversos procedimientos para colocar los oncogenes inmortalizadores en las células para permitir su establecimiento en líneas celulares. Por ejemplo, en Molecular and Cellular Biology, vol 6, pág. 1204-1217 (abril de 1986), Jat y col., describieron un sistema de vector lanzadera de retrovirus murino y su utilización para construir retrovirus recombinantes para la infección de células de rata Fill. Las líneas celulares resultantes que expresaban el antígeno T mayor de SV40 no fueron tumorigénicas, pero sí formaron microcolonias de forma eficaz (en agar blando). Además, utilizando dichos retrovirus recombinantes, demostraron que el antígeno T mayor de SV40 por el sólo es capaz de inmortalizar eficazmente fibroblastos primarios sin que entren en el período de crisis (Jat y Sharp, supra).

Existen diversos tipos de estrategias de transfección, siendo la más comúnmente utilizada la inserción de genes mediada por retrovirus para la introducción de elementos genéticos inmortalizadores. Estas estrategias tienen en común una serie de desventajas. En primer lugar, por ahora no es posible dirigir poblaciones de células específicas. En segundo lugar, la eficacia de la inserción de genes es baja (del orden de 1 en 10^{4} células o inferior) y en consecuencia se necesita utilizar un gran número de células para poder establecer líneas celulares con regularidad. En tercer lugar, la integración efectiva del elemento genético necesita la inducción de la división celular en el cultivo de tejidos. En cuarto lugar, antes que las células puedan utilizarse en la experimentación, se necesita un crecimiento prolongado en cultivo de tejidos y, en general, este crecimiento implica un período de tiempo en condiciones artificiales que imponen una presión altamente selectiva y artificial a las poblaciones celulares.

Sería de gran valor tener un procedimiento que permitiera a las líneas celulares establecerse a partir de una gran variedad de tipos celulares con una mayor eficiencia y fiabilidad que la disponible con la tecnología actual.

Además, todas las células del cuerpo pueden dividirse en dos clases distintas de células precursoras y células terminales. Las células precursoras (que incluyen las células progenitoras y las células madre) son células implicadas en la reposición de poblaciones celulares específicas en el cuerpo. Éstas pueden estar restringidas a la producción de únicamente un tipo de célula terminal (p.ej., los precursores del músculo esquelético están confinados a producir únicamente músculo esquelético), pueden ser bipotenciales (p.ej., las células progenitoras de granulocitos-macrófagos producen sólo granulocitos y macrófagos), o pueden producir una multiplicidad de tipos celulares (p.ej., las células madre hematopoyéticas producen todas las células de la circulación sanguínea y las células madre embrionales todo tipo de células del cuerpo). En contraste, las células terminales son células que han alcanzado un punto final de su diferenciación y ya no son capaces de generar una multiplicidad de tipos celulares o, lo que es más importante, de tomar parte en la reposición de las poblaciones del tejido dañado.

Existen sólo unos pocos ejemplos, implicando todos ellos el sistema hematopoyético, en donde se ha demostrado la existencia de un conocimiento suficiente sobre las células precursoras específicas que permita la restauración de la función del tejido normal, mediante la utilización de una forma primitiva de terapia transplantacional y precursora para reemplazar tanto las células precursoras como las células en el último estado de diferenciación. Esta forma de terapia precursora es el principio que se halla detrás del ampliamente utilizado trasplante de médula ósea. Dicho trasplante implica colocar células madre hematopoyéticas (junto con otras células) de un individuo donante en un individuo receptor que padezca una merma de algunas o de todas sus poblaciones hematopoyéticas normales (frecuentemente como resultado de la radioterapia para tratar un proceso maligno diseminado). Las células madre hematopoyéticas inyectadas colonizan la propia médula ósea del paciente y producen a continuación megacariocitos, linfocitos, macrófagos, eosinófilos y todos los otros tipos de células derivadas de esta única población de células madre.

Aunque existen muchas áreas de la práctica médica y científica actual y futura en donde esta capacidad de llevar a cabo una terapia de reemplazamiento de precursores podría ser de inestimable valor, en la actualidad, los esfuerzos en esta dirección se han visto frustrados debido a la insuficiencia de conocimientos actuales sobre la identidad de poblaciones precursoras que contribuyen al desarrollo normal de la mayoría de tejidos corporales. A pesar de los muchos años de trabajo realizado en el estudio de estas poblaciones, existen solamente un número limitado de ejemplos en donde se han identificado las poblaciones precursoras específicas y pueden manipularse en cultivo de tejidos, de tal forma más tarde sea posible su introducción en el tejido dañado. De modo similar, son pocos los ejemplos en los que se conoce la identidad de las señales moleculares que causan la división o la diferenciación de los precursores junto con las vías específicas. La obtención de dicho conocimiento, que podría ser de un gran interés para que las poblaciones de precursores del propio cuerpo sean más efectivas en su propia reposición o en la reparación del tejido dañado, se ve dificultada en gran manera por la falta de sistemas de ensayos celulares adecuados y también por la falta de materiales de fuentes adecuadas para la purificación de estas moléculas importantes.

En la patente internacional WO89/09816, McKay y col. describieron un procedimiento general para la inmortalización de células en el que se introduce un gen promotor del crecimiento en las células de vertebrados. La intención es controlar la función de este gen mediante un factor o factores externos, de modo que la función génica pueda ser regulada a voluntad. Se ha indicado que las células precursoras pueden crecer con el gen activado y a continuación se permitiría que la población resultante se diferenciara activando el gen que cambiaría las condiciones a otras "no permisivas". Además, Almazan y col., en el 18º Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Toronto, (noviembre de 1988) (ver Soc. Neurosci. Abstr. 14(2) 1988 1139), describieron la inmortalización de una célula precursora oligodendrocítica utilizando un retrovirus portador de un oncogen sensible a la temperatura.

Sin embargo, aunque la utilización de técnicas existentes para insertar genes en células precursoras ha permitido el desarrollo de líneas celulares y en particular con cualidades precursoras, en la generación de líneas celulares precursoras, no sólo se aplican los problemas inherentes a la generación de cualquier línea celular, sino que también el establecimiento de líneas celulares precursoras sufre de la dificultad adicional de que los precursores representen solamente una fracción pequeña de las células en cualquier tejido, reduciéndose en consecuencia la posibilidad de introducir satisfactoriamente la información genética requerida en dichas células.

Los animales denominados "transgénicos" se conocen desde algunos años, es decir, animales que han incorporado en su genoma un gen o genes foráneos, los cuales pueden expresarse en su nuevo entorno cromosómico para cambiar las características del animal de forma dirigida.

La primera publicación sobre animales transgénicos apareció en 1982. Palmiter y col., (Cell, 1982,29:
701-710) microinyectaron un plásmido que contenía la región promotora/reguladora de la metalotioneína I de ratón en la estructura del gen de la timidina quinasa del virus herpes. Los investigadores demostraron tanto la expresión del gen híbrido in vivo como la regulación del gen in vivo por los metales pesados. Gordon y Ruddle (Prog. Clin. Biol. Res., 1982, 85:111-124) también demostraron la heredabilidad de las secuencias de DNA inyectadas. Palmiter y col., (Nature, 1982:611-615) demostraron que los ratones transgénicos para la hormona de crecimiento, regulada por el promotor de la metalotioneína, crecían hasta alcanzar un tamaño anormalmente grande.

En 1983, McKnight y col., (Cell, 1983, 32:335-341), Lacy y col., (Cell, 1983, 34:343-358), Palmiter y col., (Science, 1983, 22:809-814), Brinster y col., (Nature, 306:332-336) y Gordon (J. Expo. Zool., 1983, 228:313-324), todos ellos publicaron resultados sobre la caracterización de animales transgénicos sin discusión del crecimiento celular del cultivo de tejidos.

En 1984, aparecieron las primeras publicaciones que indicaban que la expresión de oncogenes podía interrumpir el desarrollo normal. Brinster y col., (Cell, 1984, 37:367-379) demostraron que los ratones que expresaban el antígeno T mayor de SV40 bajo el control del promotor de la metalotioneína desarrollaban tumores del plexo coroideo. Los tumores se desarrollaron bien después del nacimiento, lo que indicaba la implicación de más de un gen, aparte del transgen, en la formación del tumor. Las líneas celulares se derivaron del tejido tumoral, pero no se ofreció ninguna discusión sobre los intentos para obtener líneas celulares del tejido pre-tumoral o de otros tejidos. Algo más tarde, Stewart y col., (Cell, 1984, 38:627-637) publicaron que los ratones que expresaban c-myc bajo el control de un promotor viral de tumor mamario inducible hormonalmente, desarrollaban adenocarcinomas mamarios. No hay discusión sobre las líneas celulares. La capacidad de utilizar las células de ratones transgénicos para el cultivo, también se discutió por Ritchies y col., (Nature, 1984, 312:517-520), quienes demostraron que era posible generar hibridomas fusionando células del bazo de ratones transgénicos para el gen kappa de inmunoglobulina con sus homólogos de fusión de hibridomas normales.

En la patente americana U.S. 4.736.866, Leder y Stewart describen mamíferos no-humanos transgénicos en los que las células germinales y somáticas contienen una secuencia oncogénica activada. Dichos animales son, inter alia, modelos de utilidad para probar fármacos anti-cancerosos gracias a su tendencia incrementada para desarrollar neoplasmas y al nivel menor de dosificación del fármaco que puede utilizarse en consecuencia en dicha prueba. Los animales presentan por ello una tendencia pronunciada a desarrollarse de forma anormal y ello elimina virtualmente su utilidad como modelos para los estudios del desarrollo de células normales o como fuentes de materiales biológicos terapéuticos.

La patente europea EP-A-0 298 807 describe la producción de animales transgénicos de los cuales se pueden obtener líneas celulares que expresen una proteína de interés, en donde dichos animales se producen utilizando una construcción que comprende una secuencia oncogénica además de elementos para su expresión, junto con un bloque de expresión que codifica y expresa la proteína de interés.

Palmiter y col., (Nature, 1985, 316:457-460), continuando los análisis anteriores de los efectos del antígeno T mayor de SV40 en ratones transgénicos, mostraron que el desarrollo de tumores del plexo coroideo requería la presencia de la región intensificadora de SV40 y que construcciones de SV40 distintas producían distintos tipos de tumores. Las líneas celulares se aislaron a partir de tumores hepatocelulares de ratones y se demostró que estas células expresaban el antígeno T en su núcleo. Los autores describieron la producción de ratones con el derivado de SV40 termosensible ts58, pero afirmaron que esta construcción no era sensible a la temperatura. A pesar de la utilización extendida del antígeno T en la creación de ratones transgénicos, así como de la utilización del mutante ts58 (=ts58) en la generación de líneas celulares condicionalmente inmortales in vitro mediante, p.ej., la inserción de un gen por retrovirus, ningún otro trabajo en los antecedentes de la técnica (incluyendo trabajos más tardíos de Palmiter y colegas) ha vuelto a utilizar este mutante.

Se puede decir que el objetivo general del trabajo con transgénicos publicado hasta ahora ha sido introducir en la línea germinal la información genética que interrumpe el desarrollo normal, generalmente de tejidos específicos. En contraste, como será evidente a continuación, la presente invención se refiere a la creación de animales transgénicos en los que el desarrollo normal no se interrumpe, pero de quienes se pueden obtener células, entre otras, en las que la activación de los transgenes en el cultivo de tejidos facilitará específicamente el estudio de células de potencialmente todos los tejidos corporales.

Así, por ejemplo, aún cuando otros laboratorios ya habían realizado construcciones genéticas en las que se utilizaba un promotor regulable (H-2K^{b}) para regular la expresión oncogénica, todavía no se ha reconocido la posibilidad de que la utilización de dichos promotores en animales transgénicos pueda permitir la expresión condicional del oncogén in vitro. El ejemplo mejor detallado se halla en los estudios que unían el promotor H-2K^{b} con el gen c-myc, descritos por Morello y col., (Oncogene Research, 1989, 4:111-125), quienes construyeron varias líneas transgénicas que portaban un gen de fusión en donde las secuencias promotoras 5'-GH-2K estaban unidas al proto-oncogen c-myc humano con el fin de determinar si la expresión de c-myc se halla en todos los tejidos y para establecer los efectos de dicha expresión de c-myc constitutivamente reforzada en estos animales transgénicos. Los autores obtuvieron 33 ratones que condujeron al establecimiento de 5 líneas transgénicas. Los autores publicaron la expresión de la construcción H-2/myc en la mayoría de órganos analizados, con una expresión máxima en los órganos linfoides y una expresión mínima en el cerebro y en el hígado. El nivel de expresión de H-2K/myc se realizó en paralelo con la expresión de H-2K. Morello y col., también observaron una ausencia de patología durante un período de 20 meses en 4 de los ratones H-2K/myc y concluyeron que se necesitaba un segundo suceso para la inmortalización con esta construcción.

En trabajos anteriores con transgénicos, Efrat y Hanahan (Mol Cell Biol., 1987, 7:192-198) examinaron la actividad específica de célula de un elemento inverso del promotor en dos linajes de ratones transgénicos, en los que se utilizó el promotor para dirigir la expresión del antígeno T a las células de los islotes beta del páncreas y la expresión del gen se examinó posteriormente en las células tumorales. También, Efrat y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:9037-9041) examinaron el comportamiento de tres líneas celulares beta-pancreáticas establecidas a partir de insulinomas derivados de ratones transgénicos que tenían un gen híbrido promotor de insulina-antígeno T de SV40. Las células tumorales beta, que se derivaron todas ellas de las células beta primarias, mantuvieron las características de células beta durante los 50 pasajes del cultivo. Los autores concluyeron que la "expresión dirigida de un oncogen con un elemento regulador específico puede utilizarse tanto para inmortalizar un tipo celular raro, como para proporcionar una selección para mantener su fenotipo diferenciado". En la presente invención, se proporciona una contribución importante a la ciencia al demostrar que dicha "expresión dirigida" no es necesaria. Como será evidente más adelante, los animales transgénicos actuales pueden ser un repositorio de tipos celulares, de donde es posible elegir y obtener a voluntad las células deseadas para la inmortalización.

En otro trabajo con transgénicos, Bieberich y col., (Mol. Cell Biol., 1987, 7:4003-4009) utilizaron también ratones transgénicos para el estudio de la función de los antígenos de clase I y hallaron que los injertos de piel de ratones transgénicos eran rechazados rápidamente por los animales de la línea parental, que el transgen de clase 1 fue inducible mediante tratamiento con interferón y suprimible mediante transformación del adenovirus humano 12.

También en 1987, Choi y col., (J. Virol., 1987, 61:3013-3019) examinaron la expresión de genes de la región temprana del virus de simio 40 bajo el control transcripcional de la repetición larga del virus de tumores mamarios de ratón. Las células cultivadas a partir de animales transgénicos mostraron expresión del gen quimérico tras su inducción con glucocorticoides. Muchos, pero no todos, los tejidos que expresaban las secuencias del virus de los simios 40 (simian virus 40) mostraron características premalignas y se desarrollaron en tumores.

En 1988, Paul y col., (Klin Wochenstr., 1988, 66, Suppl. 11.134-139; Exp Cell Res., 175, 354-365) crearon líneas de hepatocitos con crecimiento continuo al crecer las células hepáticas de ratones que expresaban las secuencias del virus SV40 dirigidas por la secuencia intensificadora de la metalotioneína de ratón. Muchos hepatocitos del hígado expresaron un fenotipo inmortalizado en cultivo y se convirtieron a un fenotipo similar al transformado con el posterior crecimiento en cultivo.

Aunque las células iniciales no fueron malignas, se diferenciaron de forma clara de las células normales en que dichas células no necesitaban la adición del factor de crecimiento epitelial en el medio definido químicamente para promover la división celular. In vivo, los ratones desarrollaron carcinomas hepatocelulares.

Mackay y col., (Kidney Int., 1988, 33:677-684 establecieron líneas celulares continuas de células epiteliales, mesangiales y endoteliales del glomérulo de una línea de ratones transgénicos para el virus de los simios 40. Estos ratones, aunque aparentemente normales al nacimiento, presentaron a los 3-4 meses de edad una esclerosis afectando un porcentaje variable de sus glomérulos. Las células derivadas de estos ratones presentaron características típicas de sus homólogos normales a pesar de su fenotipo transformado.

Langdon y col., (Oncogene Res., 1988, 3:271-279) estudiaron el crecimiento de células B-linfoides derivadas de transgénicos para E mu-myc in vitro con el fin de examinar su progresión hacia características linfomatosas. Los resultados demostraron que las células necesitaban inicialmente capas de células nodrizas de médula ósea, después de lo cual los cultivos se resolvían hacia una composición monoclonal u oligoclonal y a continuación y sólo al final lograron una autonomía de crecimiento, lo que indicaba la importancia de múltiples sucesos en el establecimiento de una autonomía de crecimiento.

En la patente internacional WO89/09816, supra, se sugiere que es posible introducir las células inmortalizadas condicionalmente en los animales descritos aquí y en consecuencia producir animales transgénicos en los que el gen promotor del crecimiento presente en dichas células se inactive a temperaturas corporales normales. Sin embargo, el trabajo descrito no recoge dicha idea y tampoco describe cómo puede llevarse a cabo dicha técnica. No hay descripción de un sistema promotor o de un oncogen condicional que produzca únicamente niveles bajos de expresión como los utilizados en la presente invención (ver más adelante), tampoco se hace ninguna descripción de la utilización de un animal transgénico estable como fuente de células, de células diferenciadas o precursoras (que más tarde pueden inmortalizarse en cultivo).

Sería muy deseable proporcionar un procedimiento para la obtención eficiente de líneas celulares a partir cualquier tejido potencial del cuerpo. Ello es un objetivo, que aparte de los problemas específicos citados anteriormente, e incluso con el inmenso interés en los animales transgénicos, no ha podido ser realizado hasta ahora.

En un aspecto de la presente invención se proporciona un animal eucariótico no-humano y transgénico cuyas células germinales y/o somáticas han incorporado una secuencia en sus cromosomas, en donde:

dicha secuencia codifica para un producto termolábil del antígeno T mayor de SV40, activable condicionalmente; y

dicha secuencia se halla bajo control de un promotor regulable,

de tal modo que dicho producto termolábil derivado del antígeno T mayor de SV40 se halle a un nivel funcional suficientemente bajo in vivo como para permitir el desarrollo normal de dichas células en el mencionado animal; y que en condiciones permisivas de cultivo en donde el promotor se activa, dicho producto tenga un nivel funcional de expresión suficiente para prevenir la diferenciación completa de células obtenidas del mencionado animal; siempre que el promotor no sea el de la vimentina o un fragmento de éste.

El promotor puede ser un promotor no-constitutivo de modo que la expresión de dicha secuencia está normalmente inhibida, permitiendo, así, el desarrollo de las células normales pero evitando que las células precursoras obtenidas del mencionado animal puedan completar su diferenciación en el cultivo de tejidos al proporcionarse las condiciones permisivas para que dicho promotor y producto inhibidor de la diferenciación activen la expresión de dicha secuencia. Respecto a estos animales transgénicos "condicionales", el término "promotor no-constitutivo", tal como se utilizó aquí, hace referencia a un sistema de promotor que: (a) puede inducirse para producir niveles de expresión de la secuencia bajo su control superiores a los obtenidos en ausencia de inducción y (b) en ausencia de inducción, no se permite una expresión detectable o, bien, sólo se permite una expresión a un nivel que no inhiba el desarrollo de las células normales. Se entenderá que puede tolerarse un sistema de promotor que "presente una fuga" o que permita u poco de expresión si el nivel de expresión no logra impedir patrones de desarrollo normales. Tal como será evidente, existen diversas vías en las que pueden mantenerse niveles de expresión bajos en los animales, aunque todavía pueda inducirse un aumento de su expresión cuando se desee. La "condicionalidad" puede lograrse utilizando diversos medios, como por ejemplo en el trabajo descrito aquí se utiliza una forma de condicionalidad doble que implica un oncogen condicional. Una condicionalidad múltiple puede, por ejemplo, depender alternativamente de la utilización de un sistema de promotor que utilice dos o más elementos genéticos reguladores, siendo necesaria la regulación de todos ellos para lograr niveles elevados de expresión, tal como se refiere en el apartado (a).

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para proporcionar un animal no-humano que porta una mutación preseleccionada y contiene células portadoras de una secuencia incorporada en sus cromosomas, tal como se definió anteriormente. Dicho procedimiento comprende: (1) la incorporación cromosómica eficaz de una secuencia tal como se definió anteriormente en al menos algunos de las células animales mencionadas, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; (2) el retro-cruzamiento de dicho animal con un progenitor animal no-humano que expresa una mutación preseleccionada y (3) la obtención de la descendencia que porta la mencionada mutación y secuencia incorporada en los cromosomas.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para el cultivo de los tipos celulares bien diferenciados, procedentes de dichos animales en cultivos de tejidos y, además, también se proporciona un procedimiento para la obtención de células precursoras a partir de tejido normal. Ello representa una importante aportación para el conocimiento de no sólo la identidad de estas células, sino también de los principios biológicos que regulan su crecimiento.

La presente invención, al lograr in vivo unos niveles de expresión bajos en ausencia de inducción, permite la creación satisfactoria de animales transgénicos en los que el desarrollo y diferenciación de los tejidos tiene lugar normalmente in vivo, proporcionando así un reservorio de material biológico para propósitos varios.

En general, la invención se refiere a animales eucariotas no-humanos transgénicos que contienen células germinales y/o somáticas con una secuencia de DNA inhibidora que se inactiva en todos o la mayoría de tejidos del animal normal y que se ha construido para presente específicamente los mínimos efectos posibles sobre el desarrollo normal del animal. La activación de la construcción genética, capaz de prevenir la diferenciación terminal, se logra preferentemente gracias a la manipulación in vitro del tejido diseccionado, aunque las construcciones pueden también activarse in vivo.

Por ello, en otro aspecto de la invención se proporciona un animal eucariota no-humano transgénico que contiene células germinales y/o somáticas en las que una secuencia inhibidora de la diferenciación que es activa condicionalmente e inducible se ha incorporado en los cromosomas bajo el control de un promotor, de modo que la expresión de la mencionada secuencia se mantiene normalmente por debajo de un nivel efectivo y así se permite el desarrollo de la célula normal pero se impide completar la diferenciación de las células precursoras obtenidas del animal y cultivadas in vitro al activar la expresión de la mencionada secuencia.

En los animales del tipo definido inmediatamente antes, la secuencia inhibidora de la diferenciación activa condicionalmente puede ser TAgts y/o el promotor puede ser un promotor no-inducible "débil", por ejemplo el promotor TK. Se sobreentenderá por el experto en la materia que la ingeniería molecular de un gran número de promotores (tal como se revisa en, por ejemplo, Levine y Manley, Cell, 1989, 59:505-408, Abel y Maniatis, Nature, 1989, 341:24-25 y Mitchell y Tijan, Science, 1989, 245:371-378, facilitará la creación de promotores no-inducibles, débiles que también son adecuadas para utilizar en la presente invención.

En otro aspecto, la invención incluye una célula aislada de un animal, tal como se definió anteriormente, o derivada de una célula aislada que ha incorporado en sus cromosomas la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación, cuya expresión a su vez puede activarse.

La invención también incluye una línea celular derivada de la mencionada célula que ha sido inmortalizada mediante la activación de la expresión de dicha secuencia inhibidora de la diferenciación.

En otro aspecto, la invención incluye una célula diferenciada derivada de una célula, tal como se definió anteriormente, al permitir su diferenciación sin la activación de la expresión de la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación, o a partir de una línea celular tal como se definió anteriormente mediante la desactivación de la expresión de la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación, o a partir de una célula tal como se definió anteriormente y en donde la expresión de la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación se ha activado, pero aún así la célula puede ser inducida a diferenciarse mediante la exposición a un factor externo y así se ha
realizado.

La invención también incluye un procedimiento para producir un animal eucariota no-humano y transgénico que contiene células en las que una secuencia inhibidora de la diferenciación se ha incorporado en sus cromosomas de forma regulable y así la expresión de dicha secuencia puede activarse aunque normalmente está inhibida, permitiendo el desarrollo normal de la célula. Dicho procedimiento comprende la incorporación efectiva de la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación bajo el control de un promotor no-constitutivo en al menos algunas células de dicho animal, o la incorporación cromosómica efectiva de la secuencia inhibidora de la diferenciación que por ella misma es activa condicionalmente e inducible en al menos algunas células del dicho animal.

La técnica utilizada para lograr la transgénesis es inmaterial para el concepto de la invención. Sin embargo, la microinyección en el estadío embrional es la vía preferida que utiliza procedimientos bien conocidos en la materia. La micro-inyección puede utilizarse en cualquier estadío de desarrollo desde el estadío unicelular a estadíos embrionales tardíos.

Los animales transgénicos pueden, sin embargo, generarse de muy diversas maneras, todas ellas se han de considerar abarcadas por presente la invención. La construcción genética puede insertarse en las células madres embrionales y estas células madre manipuladas genéticamente pueden a su vez inyectarse en los cigotos fertilizados en un estadío con un número pequeño de células. En algunos casos, las células madre embrionales se incorporan satisfactoriamente en el cigoto y las células derivadas de estas células manipuladas genéticamente pueden diferenciarse para formar muchos o todos los tipos celulares hallados en el cuerpo. En algunos animales, dichas células también contribuirán a la línea germinal, proporcionando en consecuencia un medio para generar animales completamente transgénicos como progenie a partir de las quimeras iniciales. También se ha sugerido que puede utilizarse el esperma como un vector para la creación de animales transgénicos (aunque esta afirmación es hoy en día controvertida) y por ello la posibilidad de incorporación como resultado de sucesos en un estadío de preconcepción no debería descartarse. El modo y el período de tiempo (en términos de desarrollo animal) para lograr la incorporación cromosómica de acuerdo con la invención no tiene importancia, siempre que la secuencia inhibidora de la diferenciación se halle al menos en algunas células de un animal transgénico bajo el control de un promotor no-constitutivo y de esta manera la secuencia sea regulable.

La característica central de la presente invención es el intento de evitar un nivel de expresión de la información genética introducida experimentalmente, de modo que el desarrollo se vea dificultado. Esta característica diferencia la presente invención del resto de experimentación transgénica hasta ahora publicada. Este aspecto necesario de la presente invención se logra principalmente utilizando secuencias promotoras que deben activarse específicamente, con el fin de permitir la expresión apreciable del gen inhibidor de la diferenciación. En ejemplos no-limitantes del ámbito de la presente invención, la función oncogénica se limita utilizando una secuencia oncogénica que sólo es activa condicionalmente. La invención prevé el principio de condicionalidad múltiple. Éste se puede lograr, por ejemplo, utilizando diversos elementos genéticos reguladores que, utilizados en concierto, proporcionan un sistema de promotor global tal como se definió anteriormente, o puede lograrse mediante la utilización de uno o más elementos genéticos reguladores y de secuencias similares a oncogenes condicionales que de nuevo, utilizados en concierto, logran el efecto deseado y proporcionando un sistema con las características mencionadas.

Las secuencias inhibidoras de la diferenciación relevantes para esta invención, son capaces de inhibir la diferenciación de las células precursoras. Dichas secuencias o genes incluyen oncogenes que codifican las proteínas que se localizan en el núcleo celular. Una serie de estos oncogenes nucleares tiene la capacidad para inmortalizar células (y en consecuencia rendirlas capaces de crecer durante períodos indefinidos sin entrar en un estado de diferenciación terminal) y también de inhibir la diferenciación de células precursoras en células en estadio terminal que no se dividen. Algunos de estos genes no tan sólo son de origen viral, sino que tampoco tienen, por ahora, homólogos de mamífero conocidos en el genoma normal. Por ejemplo, todavía no se conocen los homólogos de células normales del antígeno T mayor de SV40, la proteína E7 del papilomavirus humano y el antígeno T mayor de polioma, aún cuando se ha demostrado que todas estas proteínas virales son capaces de interactuar con las proteínas celulares normales de forma relacionada a la función de proteínas virales en la transformación neoplásica (Whyte P. y col., 1988, Nature 388, 124-129, De Caprio J.A. y col., 1988 Cell 54, 275-283 y Dyson N. y col., 1989 Science 243, 934-937). Algunas proteínas celulares normales que se localizan en el núcleo, como c-myc, también son capaces de inmortalizar las células y de inhibir la diferenciación de la célula precursora (Land y col., supra, Dotto G.P. y col., 1985, Nature 318, 472-475 y Dmitrovsky E. y col., 1986, Nature 311, 748-750). Además, un reducido número de oncogenes que se asocian con la regulación del crecimiento, como src, tienen la capacidad para inmortalizar e inhibir la diferenciación de poblaciones precursoras.

En líneas generales, se puede establecer que en la actualidad existen 5 grupos de genes diversos que funcionan como secuencias inhibidoras de la diferenciación en la presente invención. Algunos de los genes conocidos en cada categoría se enumeran en la Tabla de más adelante. La primera categoría de genes corresponde a los miembros de la familia de oncogenes nucleares e incluye los genes como el antígeno T mayor de SV40 y también los genes como myc y myb. La segunda categoría de genes corresponde a aquellos genes que pueden convertirse mediante mutación de genes supresores a genes inmortalizadores. El más representativo de esta categoría conocido actualmente es p53, que parece interactuar de una forma todavía desconocida con la familia de proteínas también implicada en la modulación de la actividad del producto del gen del retinoblastoma. La tercera categoría de genes corresponde a aquellos genes implicados en el control de la proliferación celular, y aparentemente también capaces de inhibir la diferenciación de algunos tipos celulares. La cuarta categoría corresponde a genes caracterizados por una molécula secretada denominada de actividad inhibidora de la diferenciación, que parece trabajar a través de los receptores de superficie celular para inhibir la diferenciación de células madres embrionales. Por último, se ha descubierto recientemente que las interacciones cooperativas entre mitógenos también pueden inhibir la diferenciación de las células precursoras. En estudios sobre la célula progenitora del astrocito oligodendrocito de tipo 2 del nervio óptico de rata, se ha hallado que la estimulación de estas células precursoras simultáneamente con el factor de crecimiento derivado de plaquetas y el factor de crecimiento de fibroblastos básico inhibe completamente la diferenciación en oligondendrocitos y permite a los progenitores 0-2A crecer indefinidamente en el cultivo de tejidos en ausencia aparente de activación mutacional de oncogenes nucleares (Bogler y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6368-6372). Estas dos series de resultados indican que puede ser posible utilizar también factores solubles, controlados por promotores no-constitutivos e inducibles, para inhibir la diferenciación de las células. En dichas circunstancias, "la secuencia inhibidora de la diferenciación" utilizada en la invención es la secuencia genética que codifica para dichos factores.

Tabla

Oncogenes nucleares

T mayor de SV40

T mayor de polioma

EIA de adenovirus

E7 y E6 de HPV

Myc

Erb A

Myb

Genes supresores tumorales que modifican mutaciones dominantes

Algunos mutantes de p53

Genes reguladores del crecimiento que inhiben la diferenciación

V-src

Genes que producen agentes inhibidores de la diferenciación

Actividad inhibidora de la diferenciación

Secuencias genéticas que codifican combinaciones de factores de crecimiento que trabajan para inhibir la diferenciación

Factor de crecimiento derivado de plaquetas + factor de crecimiento de fibroblastos básico

Recientemente, Hunter (Cell, 1990, 64:249-270) ha realizado una compilación de listas de oncogenes nucleares, que incluyen la mayoría de genes que tienen capacidad inhibidora de la diferenciación.

Las secuencias inhibidoras de la diferenciación utilizadas en la presente invención se ha incluido en el genoma de forma que se limita la función in vivo del gen inmortalizador. Por ejemplo, se puede utilizar una forma termolábil del antígeno T mayor de SV40 (TAg) (Tegtmeyer, 1975, J. Virology 15, 613-618) para que se degrade rápidamente y se inactive a la temperatura corporal normal del ratón (39,5ºC). En una realización de la presente invención este TAg termo-sensible (TAgts) se coloca bajo el control de un promotor que normalmente controla la expresión de los antígenos de Clase I del complejo principal de histocompatibilidad (Kimura y col., 1986, Cell 44, 261-272 y Baldwin Jr. A.S. y col., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 305-313). Este promotor puede activarse exponiéndose al interferón gamma, aunque normalmente está activo sólo a niveles bajos en la mayoría de tejidos corporales de animales sanos.

La intención racional de la utilización de un promotor no-constitutivo y controlable es inhibir la expresión del gen de interés, excepto cuando dicha expresión es la deseada. Los promotores no-constitutivos utilizables en la presente invención son regulables mediante el cambio de las condiciones. Bajo ciertas condiciones (no-permisivas), la función del promotor se inhibe y tiene lugar el desarrollo normal de las células. Si las condiciones cambian (p.ej., en el ejemplo referido anteriormente, mediante exposición al interferón gamma) a unas condiciones permisivas, se produce una expresión apreciable. Es un punto crítico evitar una expresión apreciable, ya que como se sabe las mutaciones revertantes de un oncogen condicional causarían probablemente un desarrollo anormal si se permitiera la expresión del oncogen en todos los tejidos y en todo momento. Unos niveles de actividad bajos de un oncogen condicional podían ser eficaces si se expresan niveles suficientemente elevados del producto génico de interés (tal como se describe en el Ejemplo 1 más adelante) y la expresión de niveles funcionales de las secuencias inhibidoras de tipo salvaje in vivo causarían la transformación tisular (tal como se ha demostrado para otros modelos transgénicos, como los descritos p.ej., en la patente americana U.S. 4736866).

Las mutaciones revertantes que ocurren mediante mutación aleatoria suceden con una frecuencia de 1 por cada 10^{6} células. Dado que el cuerpo de un animal contiene muchas más de 10^{12} células, ello significa que muchas células del cuerpo expresarán las mutaciones revertantes del gen condicional. Además, la experimentación en cultivo de tejidos indica que las mutaciones revertantes que implican otras vías de control celular pueden incluso tener lugar a frecuencias de hasta 1 por 10^{4}. En consecuencia, se esperaría que cada tejido corporal tuviera un gran número de células que estuvieran expresando el oncogen capaz de inhibir las vías normales de diferenciación. Dicha situación es incompatible con el desarrollo normal. De hecho, antes incluso de comprender este concepto crítico, se realizaron intentos no publicados por uno de los inventores (P. Jat) y colegas para crear ratones transgénicos en los que se colocó el TAgts bajo el control del promotor para la beta-actina, lo que causaba una expresión constitutiva de TAgts a un nivel razonablemente elevado en cada célula corporal. Dichas construcciones genéticas no parecen ser compatibles con la supervivencia del embrión manipulado. En consecuencia, para eludir el problema de reversión es esencial utilizar un promotor que frustre la expresión de TAgts por debajo de un nivel efectivo.

Otro sistema de promotores posibles para utilizar en la presente invención sería uno basado en un operón inducible por lactosa (lac) aislado de bacterias. El sistema inducible-lac se basa en tener sitios de unión para una proteína determinada localizada entre el promotor transcripcional y los sitios de inicio transcripcionales. Normalmente, el represor se une al operador y dificulta estéricamente la transcripción. Cuando la sustancia inductora está presente en la célula, se acompleja el receptor y se previene su unión con el operador y en consecuencia se permite la transcripción. El inductor específico utilizado es el IPTG, análogo de alo-lactosa, el cual no se metaboliza y no se da de forma natural. La lactosa puede también activar este inductor, pero la lactosa se metaboliza rápidamente y por lo tanto está presente a niveles bajos en casi todos los tejidos. El único fluido corporal que contiene niveles elevados de lactosa es la leche, lo que plantea la posibilidad de que esta construcción pueda inducirse en las células productoras de leche de hembras lactantes. Al contrario que los antígenos de Clase I, que se expresan en muchas células tanto de forma constitutiva como inducible (resultando en un nivel incrementado de expresión respecto a la situación previa a la inducción), el represor lac puede producir un control estrecho de expresión de genes inhibidores de la diferenciación utilizados en los animales transgénicos de la presente invención. El sistema lac es también, desde luego, conocido por operar en células de mamífero.

El promotor inducible lac es el único ejemplo conocido de promotor bacteriano que puede activarse por una sustancia que no causa probablemente inducción en animales de sangre caliente. Aunque, es posible imaginar que otros sistemas de promotores bacterianos análogos se descubrirán. Además, se podrían utilizar formas mutantes de promotores bacterianos, tal como se ejemplifica por la mutación lap del represor lac. Dichos promotores podrían utilizarse en el procedimiento de la presente invención.

Un ejemplo adicional de un promotor inducible es el promotor de la metalotioneína, que se activa por los metales pesados zinc y cadmio. Este promotor también se podría utilizar en el procedimiento de la presente invención.

El promotor de MMTV, que se regula por glucocorticoides, es un promotor inducible que se ha utilizado en experimentación transgénica. Este promotor, sin embargo, presenta inconvenientes ya que la producción de glucocorticoides endógena activaría la expresión de la construcción inhibidora de la diferenciación.

Al menos pueden citarse dos ventajas del sistema de promotor de Clase I, aparte de su aplicabilidad general en el reino animal (ver más adelante). En primer lugar, en aquellos tejidos en los que hay un nivel bajo de expresión de antígeno de Clase I endógena, el nivel de actividad de este promotor parece ser por regla general muy bajo para mantener una producción, es decir suficiente antígeno TAgtsA58 para interferir con el desarrollo normal. Sin embargo, la adición de un inductor (p.ej., interferón gamma) puede súper inducir la actividad de este promotor y rendir niveles de antígeno TAgtsA58 a un grado tal que pueda observarse una actividad completa del gen inhibidor de la diferenciación. Además, la utilización de este promotor permite la inducción de la expresión de TAgtsA58 en tejidos en los que normalmente no hay una expresión de antígeno de Clase I (como por ejemplo el sistema nervioso central), debido a que prácticamente todas las células tienen receptores de interferón funcionales.

Una ventaja principal de la presente invención es que los conceptos generales desarrollados pueden aplicarse a todas las especies de animales de sangre caliente. Por ejemplo, en el ejemplo referido con anterioridad, el promotor de Clase I produce normalmente niveles elevados de expresión de los genes del complejo principal de histocompatibilidad cuando las células se exponen al interferón gamma (Wallach D. y col., Nature 299, Q33-836). Esta vía de activación génica ocurre con seguridad en humanos, bovinos, ratas y ratones y en consecuencia parece probable que es común a todos los animales de sangre caliente. Además, tal como se mencionó, el promotor lac bacteriano funciona en las células de mamífero.

Los animales de la presente invención pueden utilizarse como una fuente de material para el crecimiento, identificación, purificación y análisis detallado de, las células precursoras de potencialmente todos los tejidos del cuerpo (Morston G. y col., Hemopoietic Growth Factors, A. Review Cancer Research 1988, 48, 5624-5637), entre otras células. El tejido diseccionado puede disponerse en un cultivo de tejidos en condiciones activadoras del gen inhibidor de la diferenciación y así las células precursoras pueden crecerse indefinidamente. Además, las células que normalmente no son células precursoras (como por ejemplo los fibroblastos) pueden inmortalizarse mediante manipulaciones experimentales que forman una parte de la presente invención. Tal como se indicó anteriormente, los animales de la presente invención difieren de los animales de la patente americana U.S. 4736866 en que no son adecuados para el ensayo de carcinógenos, o para el ensayo de materiales que confieran protección contra el desarrollo de neoplasmas. En general, los tejidos de los animales de la presente invención experimentan un desarrollo normal hasta el momento en que se disponen en un cultivo de tejidos. En el caso de la presente invención, se ha observado un desarrollo normal con excepción del timo (que mostró un ensanchamiento hiperplásico retrasado respecto al órgano completo) e incluso dentro del timo, la propia función de la construcción genética que previene la diferenciación terminal es condicional. Existen evidencias de que las células sometidas a condiciones de desarrollo anormal (como en la patente americana U.S. 4736866) no expresan las propiedades de las células normales y de que dichas células también están predispuestas a sufrir otras mutaciones que activen sus oncogenes. En consecuencia, las células obtenidas de los tejidos animales que expresan los oncogenes activados in vivo no son adecuadas como modelos para el estudio de células normales y en particular para el estudio de células precursoras normales. En contraste, las células aisladas de los tejidos animales descritos en la presente invención se espera que experimenten un desarrollo normal y que en un crecimiento in vitro se hallen lo más cerca posible de sus homólogas normales, una vez que la célula haya expresado una proteína inmortalizadora.

Según ello, en otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de células inmortalizadas que comprende: (a) aislar a partir de un animal de la invención células precursoras o diferenciadas con la secuencia inhibidora de la diferenciación incorporada en los cromosomas y (b) someter dichas células a las condiciones de cultivo de tejidos por lo que se activa la expresión de la secuencia inhibidora de la diferenciación.

Los niveles preventivos de la expresión de oncogenes que pueden perturbar el desarrollo normal podrían teóricamente lograrse manipulando el sistema del promotor para crear mecanismos de ajuste más finos, si cabe, que los existentes con un único elemento de control genético. Por ejemplo, un sistema de promotor teóricamente de utilidad podría ser el descrito por Reid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86:840-844, en el que el promotor de timidina quinasa (expresado constitutivamente a niveles bajos) se coloca cadena abajo de una secuencia corta (18 nucleótidos), lo que es suficiente para inducir el promotor de TK con el interferón. Esta construcción de promotor podría teóricamente utilizarse para conducir la expresión de tsA58 y por ello disminuir el nivel de expresión constitutiva basal al tiempo que se retiene la inductibilidad del interferón.

También es posible extender el principio de condicionalidad dual ofrecido aquí, en el que la expresión del mutante TAgtsA58 termolábil de SV40 se controla por los elementos del promotor del gen del antígeno de Clase I. Esto podría extenderse a la utilización de otros genes sensibles a la temperatura con la capacidad de inhibir la diferenciación normal. Además, es posible construir oncogenes quiméricos que se convierten en condicionales al contener una secuencia de un receptor hormonal que es esencial para la función oncogénica. Ejemplos de dichas proteínas se discuten por Picard y col., (Cell, 1988, 54:1073-1080) y Eilers y col., (Nature, 1989, 340:66-68), quienes produjeron la proteína E1a de adenovirus con un dominio de unión a hormonas del receptor de glucocorticoides de rata y la proteína myc con el dominio de unión del receptor de estrógeno humano, respectivamente. En ambos casos, el efecto de la proteína quimérica sobre las funciones de la célula huésped es dependiente de la unión de la hormona adecuada con la proteína quimérica.

En una realización particular de la presente invención, la secuencia inhibidora de la diferenciación o el gen utilizado es un antígeno T mayor sensible a la temperatura derivado de SV40. La utilización de este gen transmite un nivel secundario de control de la actividad génica durante el desarrollo normal, ya que la proteína codificada por este gen mutante se degrada rápidamente a temperaturas próximas a la temperatura corporal normal de un ratón. Sin embargo, tal como se describió aquí, existen suficientes evidencias para indicar que la utilización del gen sensible a la temperatura en combinación con un promotor constitutivo (es decir no-regulable) se esperaría que fuese incompatible con el desarrollo normal si el promotor fuera tan potente como, por ejemplo, el promotor de la beta-actina. Por ello, otros genes inhibidores de la diferenciación también pueden utilizarse en la presente invención, en la medida en que sean regulables por un promotor no-constitutivo que es inactivo en la mayoría o en todos los tejidos corporales con desarrollo normal.

Las células primarias utilizadas en la presente invención y descritas más adelante fueron células de la piel, del timo, del páncreas, del sistema nervioso central, de las criptas colónicas, del endotelio, del músculo esquelético y las células gliales entéricas. Sin embargo, se ha de entender que el procedimiento de la presente invención puede utilizarse para inmortalizar virtualmente cualquier tipo de células del cuerpo de un animal transgénico adecuado. Ya que las células elegidas para ejemplificar la invención proceden de tejidos en los que se ha realizado una caracterización celular extensa, se puede confirmar que las líneas celulares derivadas por el procedimiento de la presente invención expresan las propiedades esperadas de las células normales. Estas líneas celulares proporcionan, por ello, una verificación directa de la capacidad del procedimiento presente para su utilización en la producción de líneas celulares continuas de una gran variedad de tipos celulares de diversos tejidos. Además, parte del trabajo aquí descrito demuestra directamente la utilidad de los animales en la generación de cultivos en los que se facilita el estudio de nuevos tipos de células.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de la construcción genética H-2K^{b}tsA58, referida en los Ejemplos de más adelante.

La Figura 2 es un diagrama del análisis del crecimiento que demuestra que el control de la actividad biológica del gen de SV40tsA58 sucede de acuerdo con los principios de la presente invención.

La Figura 3 muestra la síntesis del DNA en diversas condiciones en los fibroblastos de corazón de ratón, de acuerdo con la invención, que portan la construcción genética de la Figura 1.

La piel se utilizó como fuente principal de fibroblastos para confirmar que los principios generales de la presente invención eran correctos. Las células de la piel se colocaron en cultivo de tejidos en condiciones de activación del promotor utilizado y a una temperatura permisiva para la expresión de la función inmortalizadora de TAgts. Estas células se crecieron durante tiempos distintos antes de ser cambiadas a condiciones no activadoras de la función del promotor, o que no eran permisivas para la función TAgts, o con ambas. Tal como se muestra en la Figura 2 para ratones transgénicos distintos, la retirada del compuesto de activación del promotor (en este caso del interferón gamma murino) se asoció con una reducción de la velocidad de crecimiento de las células. Para la mayoría de animales, el crecimiento de las células no se suprimió completamente salvo cuando las células crecieron en ausencia de interferón gamma y a 39,5ºC; esta capacidad de las células para continuar el crecimiento, aunque a una velocidad reducida, en ausencia de interferón gamma es debida probablemente al nivel bajo de expresión constitutiva de los antígenos de Clase I (Israel A. y col., Nature 322, 743-746). De hecho, es sorprendente que incluso el bajo nivel de expresión constitutiva de este promotor observado en fibroblastos normales no esté asociado con el desarrollo de ninguna de las anomalías hiperplásicas obvias de la piel. La Figura 2 también muestra que la expresión de un número de copias superior del gen de interés puede asociarse con el crecimiento lento y continuado de células, cuando las células crecen a 39,5ºC y en ausencia de interferón (cultivos derivados de animales 11 y 36 en el trabajo que se describe más adelante). Este crecimiento lento es similar al observado si las células desprovistas de interferón gamma crecen a 33ºC y probablemente es debido a un avance de actividad de las grandes cantidades de antígeno T producido (debido a la presencia de múltiples copias del gen) antes de su inactivación por degradación a esta temperatura no-permisiva.

La entrada de fibroblastos en un estado de no-división cuando se finaliza la actividad del inhibidor de la diferenciación por la retirada del interferón gamma y por el crecimiento a 39,5ºC es similar a la observada en estudios anteriores sobre los efectos de inmortalización de fibroblastos, con TAgts. En estos estudios anteriores (en los que la expresión de TAgts se controló con un LTR viral activo constitutivamente y en el que se utilizó la inserción génica mediada por retrovirus para generar líneas celulares que expresaban una sola copia del gen TAgts), las células que se cultivaron a 33ºC pudieron crecer en el cultivo de tejidos indefinidamente. En cambio, cuando las células se cambiaron a 39,5ºC, perdieron rápidamente la capacidad para llevar a cabo la división celular (Jat y Sharp, 1989 Mol. Cell Biol. 9, 1-672-1681).

La entrada de fibroblastos inmortalizados condicionalmente en un estado de no-división es de particular interés ya que este estado de no-división refleja una vía de diferenciación normal de los fibroblastos. Los fibroblastos normales experimentaron un número limitado de divisiones antes de entrar en un estado de senescencia en el que las células presentaban una función metabólica normal, con la excepción de ser refractarias a posteriores divisiones celulares (Hayflick L. y col., 1961, Exp. Cell Res. 25, 285; Todaro y col., 1963, J. Cell Biol. 17, 299-313). El fenotipo expresado por los fibroblastos inmortalizados condicionalmente cuando se cambian de condiciones permisivas a no-permisivas se asemeja al estado de senescencia normal de forma tan estrecha que son indiferenciables. Por ello, las células inmortalizadas condicionalmente pueden experimentar los sucesos de diferenciación de sus homólogos normales cuando crecen en condiciones no-permisivas.

Dos de las líneas celulares desarrolladas a partir del timo, como un ejemplo de la presente invención, se definieron como líneas celulares epiteliales gracias a la expresión de citoqueratinas. La derivación de una línea celular epitelial fue de especial interés por la importancia de estas células en el cáncer humano y la derivación de una línea celular epitelial tímica fue de gran interés debido a la importancia putativa de estas células en el desarrollo de las poblaciones de linfocitos T del timo. Se derivaron líneas celulares del timo por la tendencia de este tejido de comportarse de forma condicionada en el cultivo de tejidos y posteriormente se paró el crecimiento al cultivarse en ausencia de interferón a 39,5ºC. La condicionalidad de estas líneas celulares in vitro indica que incluso en este tejido, los niveles constitutivos que tienen lugar in vitro son insuficientes para producir niveles suficientes de TAg capaz de interferir con el proceso normal de diferenciación y control del crecimiento. Una tal observación es consistente con la hipótesis de que la generación de hiperplasia tímica in vivo se incrementó por la presencia de una infección de hepatitis en la colonia de ratones. Dicha infección pudo haber aumentado la producción de interferón en el timo, produciendo niveles de antígeno T por encima del umbral de ineficacia. Estos resultados apoyan la hipótesis de que es necesario evitar los niveles de TAgts que se expresen inadecuadamente en todas las células del cuerpo (en lugar de únicamente en aquellas células que se exponen al inductor) como consecuencia, en este caso, de la enfermedad en la colonia de
ratones).

Una línea celular del sistema nervioso, como un ejemplo más de la presente invención, es de particular interés como un precursor putativo para tumores gliales y como demostración de la utilidad potencial de las líneas celulares derivadas de transgénicos como herramientas para el estudio del control de la diferenciación. Esta línea celular expresa los antígenos específicos de astrocitos cuando se crecen en condiciones determinadas de cultivo celular, pero pueden ser inducidas a expresar un fenotipo similar al de fibroblastos en otras condiciones de cultivo de tejidos. El fundamento para la caracterización de esta línea de CNS como un precursor putativo de glioma proviene de la observación de que los gliomas humanos pueden dividirse antigénicamente en dos categorías: células que expresan la proteína fibrilar acídica de la glía (GFAP) y se derivan claramente de astrocitos y las células que no expresan la GFAP pero sí expresan la fibronectina (FN). Se ha demostrado que el clonaje de líneas que expresan GFAP puede conducir a la generación de líneas celulares GFAP-negativas que expresen fibronectina, con lo que se sugiere que es posible reconocer el linaje CNS de las células que expresan la fibronectina (que no se correlacionan con ninguna célula glial del CNS conocida). Es potencialmente relevante a estas observaciones que en algunos experimentos se indique la presencia de un subgrupo raro de astrocitos GFAP-positivos que pueden también expresar FN (que normalmente no se expresa en astrocitos). La línea celular descrita aquí puede cambiar desde un fenotipo GFAP-positivo a un fenotipo GFAP-negativo mediante el crecimiento en suero de ternera fetal. La capacidad para manipular la diferenciación de estas células proporciona un sistema de ensayo adecuado para utilizar en la purificación de señales moleculares específicas que inducen la diferenciación junto con la ruta FN-positiva GFAP-negativa.

Otra línea celular preparada mediante el procedimiento de la presente invención se derivó del páncreas. En esta línea, un pequeño porcentaje de células expresaespontáneamente insulina en todas las condiciones de cultivo y también algunas células de la línea pueden marcarse con un anticuerpo monoclonal (A2B5) utilizado para marcar células de los islotes pancreáticos. Todavía no se sabe si la expresión variable de estos marcadores con la línea celular se debe al no poder crear microentornos inductores de la diferenciación adecuados en las condiciones de cultivo tisular.

Otras cuestiones ilustradas específicamente por el trabajo presente (y aspectos relevantes de la invención) se refieren a los ejemplos respectivos de más adelante.

Los siguientes ejemplos no-limitantes se proporcionan para demostrar e ilustrar los principios de la invención.

Tal como se utiliza aquí, el término "ratón x" hace referencia al ratón número X del primer experimento descrito.

Ejemplo 1 Construcción genética de pH-2K^{b}tsA58

El recombinante pH-2K^{b}tsA58 (ver la Figura 1) se construyo uniendo el elemento 5'-promotor del gen H-2K^{b} con las secuencias codificantes de la región temprana del mutante de SV40 tsA58. El fragmento se aisló como un fragmento EcoRI-NruI de aproximadamente 4,2 Kb a partir del plásmido pH-2K^{b} (que se proporcionó por el Dr. Andrew Mellor, MRC, Londres). Este plásmido se construyó mediante clonaje delfragmento EcoRI que abarca las secuencias genómicas que codifican para el gen H-2K^{b} del cósmido 88H8 (Weiss y col., Nature 1983, 301, 671-674) en el plásmido pBR327. El DNA tsA58 se describió por Tegtmeyer 1975, J. Virology 16, 168-178. En los Ejemplos actuales, las secuencias codificantes de SV40 tsA58 se aislaron como un fragmento BGlII-BamHI de 2,6 Kb a partir de pUCSV4OtsA58, que se proporcionó por el Dr. Harmut Land (del Imperial Cancer Research Fund., Londres). Este plásmido se construyó insertando el fragmento KpnI (nucleótido 249) en el fragmento BamHI (nucleótido 2533) del DNA de tsA58, que codifica para las secuencias del antígeno T, en las dianas KpnI y BamHI de pUC19. Los extremos BglII se convirtieron en romos utilizando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I. Los dos fragmentos se ligaron con una cantidad equimolar de pUC19 que había sido digerido con EcoRI y BamHI. Los productos ligados se transformaron en JS4, un derivado recA de E. coli MC1061 (Casadaban y Cohen, 1980, J. Mol. Biol. 138, 179-207M; Sedivy y col., 1987, Cell 50, 379-389) y se aislaron las colonias resistentes a ampicilina. Se prepararon minipreps del DNA de las colonias aislada y se analizó mediante digestión con diversas endonucleasas de restricción para determinar si el fragmento del promotor se había fusionado satisfactoriamente con las secuencias codificantes del antígeno T.

Producción de ratones transgénicos que contienen fusiones H2K^{b}-TAgts

Los plásmidos H-2K^{b}-TAgtsA58 anteriores se digirieron con EcoRI y SalI para preparar los fragmentos de DNA libres de secuencias del vector. Estos fragmentos de DNA se aislaron en geles de agarosa y se inyectaron en pronúcleos machos de huevos de ratón fertilizados de una sola célula a una concentración de 1-2 \mug/ml de DNA en tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,2 mM). Los huevos que sobrevivieron a la micro-inyección se transfirieron a hembras pseudopreñadas tal como se describió en Wagner y col., (1981) P.N.A.S. 78, 5016. Los huevos se derivaron de un cruce CBA x C57BL/10. Los ratones se obtuvieron de colonias de reproducción y se criaron en un entorno controlado y mantenido en un ciclo de 10 horas en oscuridad y 14 horas con luz. Los huevos en las hembras de adopción se desarrollaron hasta el término.

Análisis de ratones transgénicos

A los 7-14 días de edad, se analizó cada cría para determinar si portaban el transgen. El DNA preparado a partir de una sección pequeña de la cola se analizó en una transferencia de banda. El DNA genómico se aisló de secciones de 0,1-0,15 cm de la cola mediante el procedimiento descrito en Sambrook y col., "Molecular Cloning" (Cold Spring, Harbor, 1989). El sedimento de ácido nucleico resultante se lavó una vez con etanol al 80%, se secó y se resuspendió en 200 \mul de Tris 10,0 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM. Se determinó la presencia de la construcción hibridando el filtro con un fragmento específico del antígeno T mayor de SV40 marcado con P^{32}. La sonda se marcó mediante el procedimiento de "random priming" de Feinberg & Vogelstein. La integridad del gen TAg se verificó mediante análisis de transferencia de Southern digiriendo 10 \mug de DNA de la cola con la enzima BamHI. El DNA digerido se fraccionó en un gel de agarosa al 0,8%, se transfirió a una membrana de Zeta Bind^{TM} (Biorad) y se hibridó con una sonda específica de SV40 según los procedimientos publicados (tal como se describe en Sambrook y col.). Las transferencias de Southern se hibridaron con una sonda del gen TAg marcada con P^{32}. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo utilizando las condiciones recomendadas por los fabricantes o mediante protocolos estándares como los descritos en Sambrook y col., supra. La transferencia de banda indicó que 34 de 88 ratones portaban el gen quimérico. El número de copias de este gen de fusión presente en el DNA de los ratones varió desde 1 a 15 copias por célula.

Los animales que contenían el gen de fusión H-2K^{b}-TAgtsA58 se desarrollaron normalmente exceptuando el desarrollo de una hiperplasia tímica. Parece ser que existe una correlación distinta entre los niveles de mRNA de TAg expresados y la rapidez de la aparición de la hiperplasia tímica. El hecho de que los dos lóbulos del timo se ensancharon por igual y que la inyección de incluso tantas células como 10^{7} células derivadas del timo en los ratones receptores (introducidas subcutánea o intraperitonealmente) no causaran en ningún caso tumores en los ratones hospedadores, se deduce que el ensanchamiento tímico observado no fue resultado de la transformación neoplásica. Además, tal como se describe más adelante, casi todas las líneas celulares estromales derivadas de estos timos ensanchados parecieron estar condicionadas por el crecimiento en cultivo. La hiperplasia tímica puede haber sido debida, al menos en parte, a la presencia de una infección por el virus de la hepatitis de ratón en la colonia animal, que habría causado la producción de interferón en los animales infectados. Por tanto, la infección por hepatitis se ha agravado probablemente por los niveles ya elevados de expresión del antígeno de Clase I en el tejido tímico, dando como resultado la expresión de TAgtsA58 a un nivel superior in vivo que el esperado para otros tejidos corporales. Una de las líneas de ratones que expresaban únicamente una copia del gen híbrido tardó mucho más en desarrollar la hiperplasia (6 meses para los heterocigotos y 3-4 meses para los homocigotos).

Tal como se describe más adelante para el crecimiento de las células en cultivo de tejidos, en los casos en donde se transcriben cantidades importante de TAgts58 (junto con la presencia de múltiples copias genéticas en el DNA de los ratones), parece ser que se presentan efectos marginales de TAgtsA58 sobre la promoción del crecimiento incluso a una temperatura permisiva. En uno de los ratones los que únicamente una copia de TAgtsA58 estaba presente en el genoma, la hiperplasia tímica se desarrolló sólo unos meses después y los ratones fueron capaces de crecer normal y eficazmente, transmitiendo la fusión H2K^{b}-Tagts58 a la descendencia.

Análisis de fibroblastos de ratones transgénicos H2K^{b}-TAtgsA58

A continuación se demuestra la importancia del cribaje de ratones que presentan niveles bajos de expresión del transgen in vivo, con el fin de que los ratones funcionen de acuerdo con la presente invención. Tal como ya se indicó, este procedimiento es antitético respecto a los procedimientos estándares de selección de animales transgénicos, en los cuales se buscan niveles elevados de expresión in vivo del transgen para tener una probabilidad máxima para interrumpir el desarrollo normal in vivo.

Para demostrar que la expresión de H2K^{b} TAgts en los tejidos de ratones transgénicos permitió la generación de líneas celulares que fueron inmortalizadas condicionalmente, se examinó el crecimiento de fibroblastos de piel. Los fibroblastos se derivaron de 5 ratones distintos, sacrificando en primer lugar el ratón mediante dislocación cervical, esterilizando el pelaje y la piel con etanol, rasurando el pelo y diseccionando cuadrados de piel. Ésta se troceó finamente con un bisturí estéril y se digirió con 500 unidades por ml de colagenasa durante 2 h a 37ºC en medio Leibovitz L-15. La tripsina se añadió a continuación a una concentración final de 3000 unidades por ml y el tejido se incubó durante 15 min a 37ºC. A continuación, la digestión enzimática se terminó mediante la adición de una solución de inhibidor de tripsina de soja (1000 unidades por mol) y DNAsa (15 unidades por ml) también preparada en L-15. El tejido se llevó a un volumen de 5 ml y se trituró suavemente con una pipeta de plástico estéril succionando arriba y abajo un total de 20 veces. Trozos no diseccionados de tejido se dejaron sedimentar y se recogieron las células del sobrenadante. Éstas se lavaron una primera vez mediante centrifugación y luego se resuspendieron en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía glutamina 2 mM y suero fetal bovino al 10% y 100 U/ml de interferón gamma recombinante. En todos los casos en los que las células se derivaron de ratones que portaban H2K^{b}TAgtsA58, los cultivos preparados de esta forma se crecieron efectivamente en frascos de cultivos de tejidos. Las células se prepararon también y se crecieron de igual manera a partir de controles normales de la misma edad y, tal como se discute más adelante, las células de ratones normales sucumbieron a la senescencia al cabo de cortos períodos de tiempo.

Los cultivos preparados a partir de ratones transgénicos de fusión H2kb-TAgts A58 se crecieron a 33ºC en presencia de 100 U/ml de interferón gamma durante 8 y 12 semanas antes de ser analizados por la condicionalidad de su crecimiento. Mucho antes, las células derivadas de los ratones que no portaban la construcción de fusión H2K^{b}-TAgtsA58 experimentaron crisis y pararon de dividirse, tal como se esperaba para fibroblastos no-inmortalizados. En todas las líneas de fibroblastos derivadas de los ratones transgénicos con la fusión H2K^{b-}TAgtsA58, el crecimiento se inhibió cuando fueron colocadas en condiciones no-permisivas. La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de formación de colonias, en los que 1000 células se plaquearon en un frasco de 6 cm en DMEM+FCS y sin interferón durante 24 h y luego se cambiaron a medio con o sin 100 U/ml de interferón gamma murino y se crecieron durante 14 días a 33ºC o 39,5ºC, durante el cual el medio se cambió dos veces por semana. El preplaqueado de 24 h en medio normal asegura que la eficiencia de plaqueado inicial sea la misma en todos los cultivos. Al cabo de 14 días, los cultivos se tiñeron con azul de metileno al 2%, etanol al 50% en agua y se contó el número de colonias obtenido. Tal como se muestra en la Figura 2, el crecimiento de las células en condiciones completamente permisivas (es decir, 33ºC, 100 U/ml de interferón gamma murino) fue superior a los obtenidos en condiciones no-permisivas.

El análisis detallado de los cultivos de fibroblastos de piel para la condicionalidad del crecimiento reveló 3 familias de cultivos, dependiendo de la capacidad de las células para crecer en condiciones completamente permisivas, semipermisivas y no-permisivas. Las condiciones permisivas se definieron para estos propósitos como el crecimiento a 33ºC en presencia de IFN-gamma. Las condiciones semipermisivas incluyeron el crecimiento a 33ºC en ausencia de IFN-gamma o a 39ºC en presencia de IFN-gamma. Y las condiciones no-permisivas correspondieron con el crecimiento a 39,5ºC en ausencia de IFN-gamma.

En los cultivos de la primera familia, el crecimiento fue completamente condicional y sólo ocurrió en condiciones permisivas. Si las células crecieron a 39,5ºC y/o crecieron en ausencia de IFN-gamma, la división celular no tuvo lugar en ensayos de crecimiento estándar o en ensayos de formación de colonias. Estos fibroblastos se comportaron en consecuencia como esperado según estudios anteriores en los que fibroblastos embrionales de rata se inmortalizaron condicionalmente con tsA58TAg mediante infección retroviral (Jat & Sharp, 1989, Mol. Cell biol, 9:3093-3096). En estos estudios previos, se ha demostrado que los fibroblastos que se inmortalizaron condicionalmente mediante la inserción génica mediada por retrovirus para crear líneas celulares que expresan el tsA58TAg continuarán proliferando sólo si se mantienen las condiciones permisivas. Tras cambiar la temperatura a una no permisiva, los fibroblastos expresaron rápidamente el fenotipo senescente expresado por los fibroblastos normales que se habían crecido durante períodos prolongados in vitro. Todos los cultivos derivados de individuos distintos en la línea H2kb-AgtsA58 de ratones produjeron resultados idénticos.

En una segunda familia de cultivos, se obtuvo un crecimiento óptimo en condiciones completamente permisivas, un menor crecimiento en condiciones semipermisivas y ausencia de crecimiento en condiciones no-permisivas. En la tercera familia, el crecimiento no cesó completamente aún cuando las células crecieron en condiciones no-permisivas, aunque el mejor crecimiento se observó en condiciones completamente permisivas y el crecimiento más lento tuvo lugar en las condiciones completamente no-permisivas.

La condicionalidad del crecimiento observado en los fibroblastos derivados de animales transgénicos se correlacionó con niveles de tsA58TAg expresados en estas células. En todos los cultivos, el nivel de tsA58TAg se redujo mediante aumento de temperatura y/o eliminación e IFN-gamma. Curiosamente, cuando la mayoría de cultivos condicionales (los derivados de la progenie de H2ts6) se crecieron a 33ºC en ausencia de IFN-gamma, condición en la cual dichas células no crecen, todavía fue posible observar niveles bajos de TAg. Esta observación se discutió con mayor detalle en el Ejemplo próximo.

Para determinar si las líneas celulares que eran condicionalmente inmortales podían convertirse en completamente inmortales mediante la introducción de un gen inhibidor de la diferenciación activo constitutivamente, se infectaron algunos de los fibroblastos aislados de ratones H2ts6 con un retrovirus que expresaba un antígeno T de SV40 de tipo salvaje y el gen de resistencia a neomicina (Jat & Sharp, J. Virol., 1986, J. Virol., 1986, 59:746-750). Las células que fueron infectadas satisfactoriamente, se seleccionaron mediante crecimiento con el antibiótico G418. Cuando estas células se cambiaron a condiciones no-permisivas, las células continuaron creciendo. Estos experimentos demuestran que una línea celular puede pasar de un estado de crecimiento condicional a uno no-condicional si se considera deseable dicho cambio.

Análisis de líneas celulares de H2K^{b}-TAgtsA58 Ratones transgénicos

(1) Este trabajo demuestra que incluso en el único ejemplo hallado en el que la construcción genética utilizada no interrumpe el desarrollo normal, los tipos celulares que han experimentado una expansión hiperplásica in vivo, continúan teniendo un crecimiento condicional in vitro.

(2) Este trabajo demuestra que las células epiteliales derivadas de ratones H2ts6 expresa la familia de proteínas filamentos intermedios que normalmente expresan in vivo, con lo que dichas células son una fuente potencialmente adecuada para la purificación de proteínas expresada por sus homólogas normales.

(3) Este trabajo demuestra que las líneas celulares epiteliales del timo derivadas de ratones H2st6 tienen la capacidad formar rosetas con los linfocitos T, con lo que dichos linfocitos son un tipo celular adecuado para el estudio y la disección bioquímica potencial de una interacción celular normal.

Debido al desarrollo de hiperplasia tímica de los ratones transgénicos de fusión H2K^{b}-TAgtsA58, fue importante caracterizar el crecimiento de células derivadas del timo. Con dicho objetivo, el tejido tímico se preparó en cultivo de la misma manera que los fibroblastos, excepto que los períodos en los que se añadieron las enzimas se limitaron a un total de 15 min de colagenasa junto con 15 min adicionales en presencia de tripsina. Estas células se crecieron en frascos de cultivo como si fueran fibroblastos de piel hasta su confluencia, después de lo cual se aislaron las líneas celulares clonales mediante clonaje de una célula por dilución limitante.

Las líneas celulares aisladas de timos de ratones transgénicos de fusión H2K^{b}-TAgtsA58 fueron condicionales en su crecimiento, parándose éste al crecerse en ausencia de interferón a 39,5ºC. La condicionalidad de estas líneas celulares in vitro indica que incluso en este tejido, los niveles endógenos de expresión de antígeno de Clase I son insuficientes para provocar niveles suficientes de antígeno T capaces de interferir con los procesos normales de diferenciación y control del crecimiento. Dicha observación es consistente con la hipótesis de que la generación de hiperplasia tímica in viv o se debía probablemente a la presencia de una infección por hepatitis en la colonia de ratones. Dicha infección habría causado un incremento en la producción de interferón en el timo, colocando los niveles de antígeno T por encima del umbral de ineficacia. Estos resultados apoyan además la importancia de utilizar un promotor no-constitutivo e inducible. Ya que en el caso contrario, un promotor constitutivo potente podría producir niveles de expresión de TAgts expresado inadecuadamente en cada célula del cuerpo en lugar de únicamente en aquellas células expuestas al inductor como consecuencia, en este caso, de la enfermedad en la colonia de ratones.

Dos de las líneas celulares derivadas del timo se caracterizaron antigénicamente y se halló que expresaban citoqueratinas mediante tinción de las células con el anticuerpo monoclonal LE61 pant-antiqueratina. Como las queratinas se expresan específicamente en las poblaciones celulares epiteliales, el marcaje de estas células con el anticuerpo LE61 indica que estas células son células epiteliales tímicas.

Las líneas celulares epiteliales del timo y positivas para citoqueratinas descritas anteriormente se unen específicamente a linfocitos-T, según se detectó mediante un ensayo estándar de roseta. Las células estromales se fijaron con timocitos recién aislados y no fraccionados a partir de ratones no transgénicos BALB/c en una proporción de 1:12. Las células se mantuvieron en un volumen pequeño (200 microlitros) y se incubaron en hielo durante 1 hora. La mezcla se centrifugó a continuación a 200 g durante 5 minutos, el sedimento se resuspendió suavemente en 1 ml de PBS y se contó el número de rosetas utilizando un hemocitómetro, considerándose un roseta 3 o más timocitos unidos a una célula estromal. En este ensayo, las líneas celulares epiteliales de timo positivas para citoqueratina formaron de forma eficiente rosetas con los linfocitos.

Análisis de una célula precursora putativa de glioma

Para generar líneas celulares del sistema nervioso central, las células se disociaron de la corteza cerebral de ratón 11 de 11 días, mediante los procedimientos descritos en Noble y col. (1984, J. Neurosci, 4, 1982-1903). Las células se crecieron en medio definido químicamente (Bottenstein y Sato, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 76, 514-517) en presencia de 10 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas [homodímero BB (suministrado por British Biotechnology) y 10 ng/ml de homodímero de PDGF AA (suministrado por Chiron Corporation)] y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (suministrado por Boehringer-Mannheim). Las células se crecieron mediante un pasaje inicial y luego se clonaron mediante dilución limitante. Se aislaron 10 clones y se caracterizó su expresión antigénica. De éstos, 1 clon consistió de células que expresaban la proteína acídica fibrilar de la glía (GFAP), una proteína del citoesqueleto expresada específicamente por los astrocitos en el SNC (Biganmai y col., 1972, Brain Res 43, 429-435). La expresión de GFAP se analizó utilizando un antisuero anti-GFAP obtenido de Dakopatts Ltd y anticuerpos fluorescentes adecuados para la segunda capa (Southern Biotechnology).

Para examinar el potencial de diferenciación del clon de células que expresaban GFAP, las células se replaquearon sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina y se trataron con diversas sustancias para inducir la diferenciación. De particular interés fueron los efectos del suero de ternera fetal, que indujo el desarrollo de un fenotipo celular GFAP. Las células GFAP expresaron la proteína fibronectina de la matriz extracelular (FN), cuya expresión se había únicamente descrito en algunas poblaciones de astrocitos poco definidas de entre las células gliales del SNC. Aunque la línea celular parental expresó tanto el GFAP como FN, algunos experimentos sugieren que en ausencia de suero esta célula parental puede presentar un fenotipo GFAP+FN.

El aislamiento de una célula con la capacidad de ser regulada entre un fenotipo GFAP+ y un fenotipo GFAP-FN+ es de gran interés a la luz de los resultados de estudios recientes sobre la expresión de antígenos en gliomas humanos. Aunque la clasificación de gliomas humanos asuma generalmente que estas células comparten un linaje cercano con las células gliales normales del SNC, el análisis antigénicos extenso de las células derivadas de gliomas no está de acuerdo con la clasificación morfológica de estos tumores (Kennedy y col., 1987, Neuropath Appl. Neurobil 13, 327-347). De forma más importante, diversos estudios indican que los gliomas pueden clasificarse en una de las dos categorías antigénicas, siendo la primera un fenotipo GFAP+ y la segunda, un fenotipo GFAP-FN+. En el trabajo de Kennedy y col., el fenotipo de glioma GFAP-FN+ se halló en casi un 90% de los cultivos celulares derivados de gliomas. El origen de estas células no está claro, aunque se ha demostrado que los clones derivados de un glioma GFAP+ pueden ser GFAP- y FN- (Westphal y col., 1988, Cancer Research 48, 731-740).

Los resultados de los gliomas humanos suscita la posibilidad sorprendente de que exista en el sistema nervioso una célula precursora con la posibilidad de diferenciarse por la vía astrocítica (GFAP+) o por la vía no glial (GFAP-FN+). La célula que se ha aislado representa la primera vez que una célula se ha aislado claramente a partir del cerebro de forma que permita el examen riguroso de esta posibilidad. La coherencia entre los muchos estudios sobre la expresión antigénica en células de glioma y los fenotipos antigénicos que pueden ser expresados por la célula aislada del ratón 11 sugiere claramente que esta línea celular es un candidato para ser una célula precursora de
gliomas.

Análisis de células pancreáticas

Las células pancreáticas se aislaron del páncreas del ratón 11 de igual forma que para las células corticales. Una pequeña proporción de células del clon examinado de forma más estrecha expresa insulina (como se demostró por los anticuerpos anti-insulina de ICN) y puede marcarse con el anticuerpo A2B5 (línea celular de hibridoma obtenida del Dr. Marshall Nirenberg del National Intitute of Health, Usa), siendo ambos marcadores de células de islotes pancreáticos (Eisenbarth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5066-5070).

Retrospectivamente se demostró que fue poco acertado aislar las células corticales y del páncreas el mismo ratón 11, ya que análisis posteriores demostraron que era uno de los ratones transgénicos menos condicionales. Los resultados preliminares indicaron sin embargo que las células corticales y del páncreas eran más condicionales que las de fibroblastos. También es de gran importancia remarcar que ni el cerebro ni el páncreas del ratón 11 mostró ninguna evidencia de grandes anomalías del desarrollo, lo que indicaba que los niveles de TAgtsA58 que podían expresarse en estas células eran insuficientes para interferir con la diferenciación in vivo. Alternativamente, podría ser que el colocar estas células en condiciones de cultivo de tejidos causara la expresión de niveles superiores de antígeno de Clase I que in vivo.

Uno de los ratones transgénicos con la construcción H2K^{b}tsA58 (Ratón nº 6) se procreó satisfactoriamente y produjo varias camadas, todas ellas con crías que portaban el genotipo original. En todos los Ejemplos siguientes, los animales transgénicos utilizados fueron una progenie heterocigota que se denominó línea H2ts6 (Ratón nº 6).

Ejemplo 2

Las células se prepararon a partir del corazón de uno de los ratones de la descendencia del ratón 6 mediante los mismos procedimientos por los que se prepararon los fibroblastos de piel de otros ratones. El ratón del que se preparó el tejido cardíaco (denominado "hija de 6") no presentó anomalías obvias en el tamaño de los órganos tras la disección.

Las células de la hija de 6 (que fueron reconocidas como probablemente fibroblastos derivados del corazón) se crecieron durante 4 meses a 33ºC en presencia de interferón gamma murino. Para análisis experimentales, las células se plaquearon en cubreobjetos cubiertos con poli-lisina a 33ºC en DMEM + suero de ternera fetal al 10%. Al día siguiente, las células se cambiaron a unas condiciones de crecimiento a 33ºC o 39ºC en presencia o ausencia de interferón gamma. Al cabo de 3 días de crecimiento en condiciones permisivas o no permisivas, se añadió bromodesoxiuridina durante 24 horas y las células se fijaron (mediante el protocolo indicado por Becton Dickinson) y se tiñeron con anticuerpos anti-bromodesoxiuridina (obtenidos de Becton Dickinson), seguido de un segundo anticuerpo conjugado con rodamina (obtenido de Southern Biotechnology) para marcar núcleos de células que han iniciado la síntesis de DNA durante las 24 horas antes. Tal como se muestra en la Figura 3, las células que crecieron a 33ºC en presencia de interferón presentaron una síntesis de DNA 20 veces superior durante el período de marcaje que las células que crecieron a 39ºC en ausencia de interferón. Las células que crecieron en condiciones semipermisivas presentaron niveles intermedios de síntesis de DNA completamente compatibles con la supervivencia.

Ejemplo 3

(1) El trabajo siguiente demostró el principio de que las células derivadas de ratones H2ts6 son condicionalmente inmortales y experimentan una ruta normal de diferenciación terminal cuando pasan de condiciones permisivas a no permisivas.

(2) Este trabajo demuestra además que es posible expresar niveles subfuncionales de producto oncogénico, confirmando así el principio de que es posible expresar niveles del producto oncogénico que no interfieran con las vías normales de desarrollo.

(3) Además, este trabajo también demuestra la necesidad de una regulación ajustada de la actividad oncogénica con el fin de mantener la actividad por debajo de un nivel que interfiera con el desarrollo normal.

Los cultivos de fibroblastos de piel de ratones H2st6 se prepararon tal como se describió en el Ejemplo 1 y presentaron el fenotipo inmortalizado condicional discutido con detalle en los Ejemplos anteriores.

Los análisis de transferencia de Western de la expresión del antígeno T en cultivos de fibroblastos derivados de ratones H2ts6 demostraron un nivel relativamente bajo de expresión de antígeno T a 33ºC en presencia o ausencia de IFN-gamma, aunque la expresión fue claramente superior en presencia de IFN-gamma. Esta observación indicó que puede ser posible observar alteraciones dramáticas en el crecimiento celular como resultado de pequeños cambios en el nivel del producto génico. Para probar esta posibilidad, se realizó un análisis de dosis-respuesta en el que el crecimiento celular y la formación de colonias se cuantificaron respecto a la concentración de IFN-gamma.

Los fibroblastos derivados de la progenie de ratones H2ts6 demostraron lapromoción del crecimiento celular por niveles de IFN-gamma tan bajos como 1 U/ml. El análisis de la formación de colonias y el análisis del número de células mostraron que la adición de 100 U/ml de IFN-gamma a estos cultivos sólo incrementó la frecuencia de la formación de colonias 3,5 veces en comparación con la observada en presencia de 1 U/ml y sólo incrementó un 40% sobre el alcanzado con la aplicación de 10 U/ml. La diferencia en los niveles de TAg a dosis distintas de IFN-gamma no fue importante, con 1 U/ml se causó un incremento de 2,5 veces sobre los niveles basales y 100 U/ml causaron aproximadamente un incremento de 6 veces sobre los niveles basales.

Ejemplo 4 Generación de líneas celulares de astrocitos

Este Ejemplo demuestra cuatro aspectos de la utilización de animales de la invención:

(1) Líneas celulares de astrocitos, que representan un tipo celular diferenciado, se generaron a partir del sistema nervioso central, un tejido en el que básicamente no existe un nivel endógeno de antígeno de clase 1 y en donde no puede detectarse producción de mRNA in vivo. Así, se demostró que la transcripción de la construcción oncogénica in vivo no es un requisito previo para la generación de una línea celular.

(2) Las líneas celulares de astrocitos expresan el marcador específico de tipo celular normal asociado con este tipo celular, demostrando así la utilidad potencial de las células derivadas de ratones H2ts6 como fuente de purificación de una proteína específica de tipo celular.

(3) Las líneas celulares astrocíticas producen una actividad mitogénica conocida por ser expresada por las células homólogas normales, indicando así que las líneas celulares astrocíticas derivadas de los ratones H2ts6 eran capaces de de promocionar la división de otro tipo celular y en consecuencia representar una fuente potencial para la purificación del factor mitogénico.

(4) Por último, las líneas celulares astrocíticas se generaron en primer lugar creciendo las células de cerebro en condiciones de cultivo de tejidos normales (no-permisivas), seguido por la purificación del tipo celular de interés y a continuación por el crecimiento de las células de interés en condiciones permisivas. Lo que demuestra que la activación de la función oncogénica puede ocurrir después de que las células han crecido en cultivo de tejidos durante un período de tiempo, demostrando así que las células ni siquiera necesitan ser inmortalizadas condicionalmente en momento de la disección inicial.

Los cultivos de astrocitos corticales se prepararon mediante procedimientos estándares (Noble y col., 1984, J. Neurosci., 4:1892-1903; Noble & Murray, 1984., EMBO J., 3:2243-2247). En resumen, se disociaron los córtex cerebrales de ratones H2ts6 recién nacidos en células aisladas mediante digestión enzimática del tejido con colagenasa al 0,25% en medio L-15 y un volumen equivalente de tripsina al 0, 25%. Los cultivos se crecieron a 37ºC en DMEM que contenía suero fetal de ternera al 10%, glutamina 2 mM y 25 \mug/ml de gentamicina. Después de 7-10 días, los cultivos se colocaron en una plataforma rotatoria durante toda la noche a 37ºC y se rotaron a velocidades justo por debajo de las formadoras de espuma en el medio (es decir, aproximadamente 60-75 rpm). Tal como se describió anteriormente (Noble y col., 1984), este procedimiento produjo cultivos que eran 95% puros astrocitos, a juzgar por la expresión de la proteína GFAP del citosqueleto específica de astrocitos (proteína fibrilar acídica de la glía) en el 95% de esta células.

Después de enriquecer los cultivos de astrocitos a una pureza >95%, se generaron líneas celulares cambiando las células a 33ºC en presencia de interferón-gamma. Las células se infectaron a continuación con un retrovirus que transporta genes para la beta-galactosidasa bacteriana y el gen de resistencia a la neomicina, utilizando el protocolo de infección estándar descrito por la utilización de este virus (Price y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 85:156-160). Un día después de la infección, las células se retiraron del frasco mediante incubación con tripsina al 0,25% (ver Noble y col., 1984, supra) y se replaquearon en medio que contenía el antibiótico G418. Con la selección, crecieron clones resistentes de células y se seleccionaron 10 clones aleatorios para el estudio posterior. Las líneas celulares clonales se generaron fácilmente de esta manera y 7 de 10 líneas celulares expresaron constitutivamente la proteína fibrilar acídica de la glía (GFAP), un marcador específico para astrocitos en el SNC.

Para examinar la capacidad de las líneas de astrocitos para producir una actividad mitogénica asociada normalmente con estas células, las células progenitoras de oligodendrocitos de tipo-2 astrocitos (O-2A) se obtuvieron de los nervios ópticos de ratas de 7 días y se plaquearon sobre monocapas de astrocitos. En experimentos anteriores (Noble & Murray, 1984) se demostró que los astrocitos, pero no las células meningeales o los fibroblastos, eran capaces de estimular la división de progenitores O-2A in vitro y que los progenitores O-2A estimulados a dividirse por el me dio condicionado expresaron una morfología bipolar particular que sólo se observó cuando estos progenitores se crecieron en presencia de monocapas de astrocitos, el medio condicionado de astrocitos o el factor de crecimiento derivado de plaquetas (el mitógeno producido por estas monocapas de astrocitos). Los progenitores O-2A que crecieron en monocapas de líneas celulares de astrocitos clonales derivados de la línea H2ts6 de ratones transgénicos fueron indiferenciables de los que crecieron en monocapas de astrocitos no-transgénicos tanto en su división como en la expresión de la morfología bipolar esperada.

Ejemplo 5 Precursores gliales del SNC

Este ejemplo demuestra que:

(1) Es posible inmortalizar directamente las células del sistema nervioso central con las características de células precursoras nuevas mediante el crecimiento de células en condiciones permisivas y que el crecimiento de las células de este modo expresa el bloqueo de la diferenciación normal asociada con la expresión de oncogenes nucleares. Así, este Ejemplo demuestra además la capacidad para generar cultivos celulares inmortalizados a partir de un tejido corporal en el que no se detecta la expresión in vivo del transgen.

(2) La división celular requiere la presencia de factores de crecimiento adecuados, lo que indica la utilidad potencial de las células derivadas de ratones H2ts6 en sistemas de ensayo para la purificación del factor de crecimiento.

(3) Las células precursoras derivadas de ratones H2ts6 pueden inducirse a experimentar la diferenciación pasándolas de condiciones permisivas a condiciones no-permisivas, lo que demuestra la utilidad potencial de estas células para permitir el crecimiento de células precursoras nuevas.

(4) Las células precursoras crecidas de acuerdo con los procedimientos de la invención también retienen la capacidad para experimentar una diferenciación normal cuando crecen en condiciones permisivas si las células se exponen a factores moleculares definidos o al medio condicionado de una fuente celular. Este Ejemplo demuestra la adecuación potencial de las células derivadas de ratones H2ts6 para utilizar en sistemas de ensayo que permitirían la purificación de factores que inducen la diferenciación celular.

Las células corticales se disociaron tal como se describió en el Ejemplo 3, excepto que las células se derivaron de ratones de 18 días y se crecieron en medio definido químicamente (los ingredientes fueron los descritos por Raff y col., Nature, 303:390-396) conteniendo 10 ng/ml de homodímero AA del factor derivado de plaquetas (Chiron Corporation), 5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Chiron Corporation) y 20 U/ml de IFN-gamma. Se pudieron realizar pasajes de los cultivos celulares fácilmente y las células de los pasajes mantenidas en las condiciones indicadas no mostraron evidencias de diferenciación en tipos de célula glial. Los cultivos contenían células bipolares que podían marcarse con el anticuerpo monoclonal A2B5 (Eisenbarth y col., 1979, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 76:4913-4917) y se parecían a los progenitores O-2A que se han descrito en cultivos de células de nervio óptico (p.ej., Raff y col., Nature, 1983, 303:390-396; Noble & Murray, 1984, EMBO J, 3:2243-2247). Los cultivos también contenían un grupo separado de células nuevas que se marcaron con anticuerpos contra el filamento intermedio de vimentina (anticuerpos de Dako-Patts, Ltd.) y con anticuerpos contra SSEA-1 (antígeno-1 embrional de estadío específico, descrito por Gooi y col., Nature, 1981, 292:156-158). Estas células nuevas expresaron una morfología muy primitiva y consistieron de células redondas y pequeñas con pocas extensiones citoplasmáticas. En experimentos anteriores con cultivos preparados a partir del córtex cerebral de embriones de rata, se habían observado células similares que invariablemente se diferenciaban en astrocitos u oligodendrocitos tras varios pasajes, a pesar de repetir el medio en los pasajes celulares. En cambio, con las células derivadas de ratones H2ts6 mantenidas en las condiciones de crecimiento descritas, se pudo fácilmente realizar pasajes repetidamente sin que estas células experimentaran diferenciación.

Mediante diversas manipulaciones in vitro, fue posible inducir la diferenciación de las células corticales derivadas de los córtex de ratones H2ts6. En todos los casos, los cultivos produjeron oligodendrocitos (que parecían derivarse de células A2B5+, siendo los oligodendrocitos A25+SSEA-1) y los astrocitos (que parecían derivarse de células SSEA-1+, siendo los astrocitos frecuentemente SSEA-1+, pero siempre A2B5-). En ambos casos la morfología celular se alteró dramáticamente. Los oligodendrocitos expresaron su aspecto multipolar normal y pudieron marcarse por anticuerpos monoclonales contra el galactocerebrósido (RAnscht y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2709-27013). La morfología celular también cambió drásticamente en el caso de la diferenciación astrocítica y las células pequeñas de aspecto primitivo SSEA-1+ se reemplazaron por células SSEA-1+ con cuerpos celulares amplios y extensas membranas celulares. Las células que experimentaron diferenciación astrocítica no sólo parecían astrocitos, sino que también expresaron GFAP.

En primer lugar, la eliminación de PDGF y de FGF dio como resultado la diferenciación y la muerte celular, demostrando así que las células que expresaban el oncogen requerían la presencia continua de factores de crecimiento adecuados con el fin de continuar el crecimiento. En segundo lugar, las células que se mantuvieron en medio de crecimiento y en presencia de factores de crecimiento también se diferenciaron si se eliminaba el IFN-gamma el medio (acabando con la expresión de TAgts). Este resultado demuestra que la expresión de TAgts es necesaria para prevenir la diferenciación incluso si las células se crecen en condiciones que permitan que las células que expresan los oncogenes continúen creciendo en un estado no diferenciado. En tercer lugar, las células que crecen en presencia de PDGF y bFGF en condiciones completamente permisivas (es decir, 33ºC, +IFN-gamma) podrían ser inducidas a diferenciarse si se exponen a un medio condicionado por astrocitos corticales purificados (preparado tal como se describe en Noble y col., 1984, J. Neurosci. 4:1892-1903), lo que demuestra la adecuación potencial de las células precursoras H2ts6 para ser utilizadas en sistemas de ensayo de la detección y purificación de agentes inductores de la diferenciación. En cuarto lugar, las células que crecen en presencia de PDGF y bFGF en condiciones completamente permisivas podrían ser inducidas a diferenciarse mediante la exposición a 10 ng/ml de factor-beta de crecimiento transformante (British Biotechnology), o mediante la exposición a 2 ng/ml de factor neurotrófico ciliar (Synergen), lo que indica la sensibilidad de las células precursoras a los agentes inductores de la diferenciación conocidos por estar presentes en el sistema nervioso central, indicando además la adecuación potencial de las células precursoras H2st6 para su utilización en sistemas de ensayo para la detección y purificación de agentes inductores de la diferenciación.

Ejemplo 6 Células endoteliales

(1) Este ejemplo demuestra además que los cultivos de células endoteliales generados a partir de ratones H2sts6 secretan una actividad promotora de diferenciación que se sabe es secretada por las células endoteliales normales. Así, este ejemplo demuestra que la utilidad potencial de las líneas celulares derivadas de H2sts6 como material que podría permitir la purificación consiguiente de una molécula que expresara una actividad biológica única.

Las colonias de células endoteliales se prepararon de la manera siguiente: Dos ratones adultos (de 2-3 meses de edad) se decapitaron bajo sometidos a un coma por CO_{2}. Los cerebros se lavaron con medio de Leibowitz L-15 que contenía 25 microgramos/ml de gentamicina y luego se colocaron en medio L-15 fresco. Cada cerebro se colocó en una placa de Petri de 30 mm que contenía unos pocos ml de L-15. El cerebelo y otras extensiones de materia blanca (cuerpo calloso, bulbo óptico) se eliminaron mediante disección. La vaina meningeal se extrajo sin dejar ninguna señal. La materia gris restante se cortó finamente con un bisturí estéril y luego se pasó a través de una aguja de calibre 19 y se incubó en colagenasa:dispasa al 0,1% (BCL) en medio L-15 durante 60 minutos a 30ºC. El tejido se centrifugó a 1000 g durante 10 min a 4ºC y luego se descartó el sobrenadante. Se añadieron 20 ml de BSA al 25% y se mezclaron sin hacer espuma, centrifugándose a continuación a 2000 g durante 20 min. Se eliminó la capa de tejido flotante junto con el sobrenadante y se eliminó con cuidado sin remover el sedimento pequeño. El sobrenadante y el tejido se mezclaron y centrifugaron de nuevo a 2000 g durante 20 min. Esta vez se eliminó la capa de tejido y de sobrenadante y los dos sedimentos se resuspendieron en 10 ml de BSA al 0,5% en medio L-15 y se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4ºC para lavar los sedimentos. El sedimento se resuspendió en colagenasa:dispasa al 0,1% en L-15 y se incubó a 30ºC durante dos horas. Después de la incubación, se añadió DNAsa a una concentración final de 10 microgramos/ml y los tejidos resultantes que contenían capilares se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4ºC. El sedimento se resuspendió de nuevo suavemente en 1 ml de DMEM sin Ca ni Mg y se dispusieron en un gradiente de Percoll y se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4ºC. (Se preparó un gradiente lineal de Percoll al 50% (Pharmacia) en PBS sin Ca ni Mg con antelación mezclando 5 partes isotónicas de Percoll [9 partes de Percoll con 1 parte de PBS 10X sin Ca ni Mg] con 5 partes de 1XPBS y se centrifugó a 26.000 g durante una hora). La parte superior del tubo contenía restos celulares y células aisladas. La parte inferior contenía glóbulos rojos, visualizados como anillos rojos, y justo por encima de este anillo se hallaban los capilares. Esta capa se extrajo con cuidado y se resuspendió en 15 ml de L-15, centrifugándose a 1000 g durante 20 min a 4ºC. El sobrenadante se eliminó y los capilares se resuspendieron suavemente en medio de crecimiento (DMEM con 4,5 g/l de glucosa complementado con glutamina 2 mM, 20% de plasma derivado del suero tal como se describió por Vogel y col. (Proc. Natl. Acad. Sci., 19878, 75:2810-2814), 10 UI/ml Heparina (Sigma), 5 ng/ml de FGF básico (Chiron Corporation) y 20 U/ml de IFN-gamma. Los capilares se sembraron en placas revestidas de 96 pocillos Vitrogen (Flow Lab) al 50% de confluencia y se incubaron con CO_{2} al 7,5%. El medio se cambió al cabo de tres días y a continuación cada dos días. Los pocillos con un solo capilar se marcaron el día 3 y se continuó el cultivo hasta la confluencia. Las células endoteliales que procedían de estos capilares crecieron como colonias con límites estrechos. Estas células pudieron dividirse en cultivo mediante pasajes mediante tripsinización suave (tripsina al 0,025% en DMEM sin Ca ni Mg que contenía EDTA 2 mM, 3 min a 30ºC) y volviéndolas a plaquear a continuación en frascos Falcon 75 cm^{2} que habían sido revestidos con gelatina mediante incubación de la superficie de crecimiento de los frascos durante toda la noche con gelatina al 2% (p/v) (Difco) en agua estéril de grado de cultivo de tejidos. Justo antes de su utilización, la gelatina se aspiró de los frascos y se lavó con el medio. Al contrario que las células endoteliales de capilares normales derivadas de cerebros de ratones, estos cultivos celulares pudieron ser divididos repetidamente mediante
pasajes.

Los cultivos de células endoteliales se examinaron para determinar si estas células producían una nueva actividad de regulación de la diferenciación respecto a sus homólogas normales. La diferenciación de los progenitores O-2A en astrocitos de tipo 2 requiere la presencia de al menos dos factores inductores adecuados, siendo éstos el factor neurotrófico ciliar y un factor desconocido que se halló en la matriz de cultivo endoteliales o meningeales (Lillien & Raff, 1990, Neuron, 5: 111-119). Nuestros propios estudios han demostrado que el factor que coopera con el factor neurotrófico ciliar para inducir la diferenciación astrocítica se secreta por diversas células endoteliales normales, pero no por otros tipos celulares. Las líneas celulares endoteliales producidas a partir de ratones transgénicos H2st6 son tan potentes como fuente de esta actividad estabilizante de la diferenciación como lo son cualquiera de las células endoteliales no-transgénicas que se han examinado.

Este ensayo utilizado para reconocer el factor derivado de células endoteliales que trabaja cooperativamente con el factor neurotrófico ciliar está indicado para la preparación de cultivos de células nerviosas de nervios de ratas de 7 días mediante procedimientos estándares (p.ej., Raff y col., 1983, Nature, 303:390-396) y para el crecimiento de estas células a una densidad de 3000-5000 células por cubreobjeto en presencia de medio definido químicamente (preparado como en Raff y col., 1983, Nature, 303:390-396), que ha sido condicionado durante 24 horas por cultivos confluentes de células endoteliales aórticas bovinas. Las células progenitoras O-2A crecidas de esta forma se convirtieron todas en astrocitos de tipo 2 a los 4 días de crecimiento in vitro, mientras que las células que crecieron en medio definido químicamente, que no está condicionado por células endoteliales, se convirtieron todas en oligodendrocitos. Los astrocitos de tipo 2 se reconocen porque son células estrelladas que son GFAP+ y también porque se marcan con el anticuerpo A2B5.

El examen del medio condicionado por las líneas celulares endoteliales preparado a partir de córtex cerebral de ratones H2ts6 demuestra que estas células endoteliales secretan una actividad biológica indiferenciable de la secretada por las células endoteliales no-transgénicas en términos tanto de efecto como de potencia.

Ejemplo 7 Células epiteliales colónicas

(1) Este ejemplo demuestra que la invención permite la inmortalización directa de una nueva categoría de células epiteliales que no han podido tratarse mediante la aplicación de procedimientos in vitro de inserción génica para la generación de líneas celulares inmortalizadas.

Se extrajeron colons de ratones H2ts6 de 14-18 días. Los colons se esterilizaron mediante lavado con hipoclorito sódico al 0,04% (en PBS). En algunos casos, se extrajeron las criptas colónicas incubando el tejido durante 1,5h en EDTA 3 mM + ditiotreitil 0,05 mM. El tejido se lavó con PBS y luego agitó manualmente, obteniéndose las criptas intactas y separadas del tejido envolvente. Estas criptas, que se visualizan como un grupo de células en forma de dedo se crecieron a continuación en un cultivo monocapa sobre un sustrato de colágeno de cola de rata en un medio Dulbecco's Modified Eagles que contenía los aditivos químicos definidos en Raff y col., (1983, Nature, 303:390-396) más suero de ternera fetal al 2% + 2UI/ml de IFN-gamma + medio condicionado al 20% (condicionado durante 24 h) a partir de la línea tumoral LIM 1863 (Whithead y col., 1987, Cancer Res., 47:2683-2689). Una vez sembradas, las criptas empezaron a propagarse las células epiteliales. Con las criptas no transgénicas, las células permanecerán viables sobre una capa nodriza de células endoteliales aórticas bovinas, aunque no puedan realizarse pasajes (Whitehead y col., 1991, J. Tissue Cult. Methods (pendiente de publicación)). En cambio, los cultivos de células derivadas de animales transgénicos pueden crecerse y dividirse mediante pasajes sin una capa nodriza, estableciéndose en consecuencia como una monocapa. En otros casos, los colons se crecieron en cultivo de explantes. El medio utilizado fue el descrito anteriormente. El medio de los cultivos se cambió de dos a tres veces por semana, con adición de interferón cada vez.

Los cultivos de criptas produjeron extensiones de células planas con una morfología epiteloide, mientras que los explantes produjeron cultivos mixtos que contenían diversos tipos de células distintas. Las células epiteloides derivadas de las criptas se marcaron con dos anticuerpos anti-queratina (LE 61 y LP 34, tal como se indicó en Lane, infra) y el marcaje mostró un patrón fibrilar característico de tinción citoplasmática.

La utilización de estos ratones ha proporcionado los medios para establecer células epiteliales colónicas en cultivo de una manera hasta imposibles y a partir de tejidos que habían sido imposibles de cultivar durante más de 24-48 horas.

La mayor parte de los tipos celulares de interés en los cultivos de explantes se describen en el ejemplo siguiente.

Ejemplo 8 Células gliales del sistema nervioso entérico

Los cultivos de explantes de colon, preparados tal como se describió en el Ejemplo anterior, contenían dos tipos celulares de interés. Una de estos tipos celulares correspondía con células pequeñas que habían sido marcadas con anticuerpos contra GFAP, identificando esta célula como una de las células gliales del sistema nervioso entérico. Con estas células se ha podido realizar pasajes fácilmente, con lo que pueden ser fácilmente convertibles en líneas celulares. Aunque existe un considerable interés en las células gliales del sistema nervioso entérico, no se han descrito líneas celulares para este tejido hasta la fecha.

El segundo tipo celular corresponde con un fenotipo de morfología similar a fibroblastos y no se puede marcar con anticuerpos anti-GFAP. Sin embargo, tras el tratamiento con el factor de crecimiento transformante-beta, estas células son inducidas a expresar la nestina, una proteína del filamento intermedio que se expresa específicamente por las células precursoras del sistema nervioso central (Lendhal, Cell, 1990, 60:585-595). El homólogo celular normal de estas células no es conocido, pero su expresión inducida de nestina sugiere la posibilidad de que estas células sean una población precursora nueva.

Ejemplo 9 Mioblastos

Este ejemplo demuestra que las líneas celulares generadas por este procedimiento de la invención retienen su capacidad para experimentar una diferenciación normal in vitro.

(2) Este ejemplo demuestra además que las líneas celulares derivadas de ratones H2ts6 tienen la capacidad de experimentar una diferenciación normal in vivo, lo que indica la utilidad potencial de las líneas celulares derivadas de ratones H2ts6 en las aplicaciones de la transplantación de células.

Los cultivos de mioblastos clonales se prepararon mediante clonaje por dilución limitante directa de células derivadas de la disección del músculo esquelético de las extremidades caudales de ratones neonatos en condiciones de cultivo de tejidos estándares para el crecimiento de células precursoras de músculo (tal como se describió, p.ej., en Morgan y col., 1987, J. Muscle Res. y Cell Motil., 8:386-396), excepto que: las células se crecieron a 33ºC en presencia de interferón-gamma. Los cultivos clonales se crecieron de forma continua durante varias semanas y se realizaron repetidos pasajes antes de la transplantación de células directamente en la masa muscular esquelética de ratones transgénicos que portan una mutación conocida del gen de la distrofina. La mutación del gen de la distrofina provoca que esta proteína tenga una localización anormal dentro de los miotubos que se forman por fusión y diferenciación de células precursoras del músculo. Las células transplantadas derivadas de ratones transgénicos podrían identificarse fácilmente porque generan miotubos esqueléticos que expresan distrofina normal. Además, las células precursoras del músculo derivadas de ratones transgénicos fueron capaces de fusionarse en miotubos multinucleados in vivo bien creciendo las células a una densidad elevada o inactivando la expresión de oncogenes mediante el crecimiento de células en condiciones no-permisivas.

Las líneas celulares de la presente invención, en las que la expresión del gen inhibidor de la diferenciación está regulada, difieren de las líneas disponibles actualmente en que es posible en teoría obtener líneas celulares de cualquier tejido corporal y seleccionarlas para obtener líneas celulares de cualquier tipo. En consecuencia, la técnica presente difiere cualitativamente de las técnicas anteriores en que la información genética se transfecta en, o infecta células de tal forma que no es posible el direccionamiento de poblaciones determinadas o la inmortalización fiable de células raras. Con esta nueva técnica, se pueden aislar células raras mediante medios disponibles en la materia (p.ej., seleccionador de células activado por fluorescencia, centrifugación por densidad, cribaje, inmunoselección con bolas magnéticas, adhesión selectiva a proteínas definidas o sustratos carbohidratos, etc.) y crecimiento en condiciones que soportan la activación del gen inhibidor de la diferenciación y en consecuencia permiten que las células raras crezcan en grandes cantidades. Cualquier utilización que incluya dichas células es por lo tanto una posibilidad práctica por primera vez; incluyendo (pero sin limitarse a) el aislamiento de componentes celulares o sustancias derivadas de dichas células raras.

Las células inmortalizadas o las células diferenciadas derivadas de animales de la invención tienen muchas utilizaciones importantes, incluyendo, entre otros, aspectos adicionales específicos siguientes de la invención:

A) Utilización de células inmortalizadas obtenidas mediante un procedimiento tal como se definió anteriormente, o de células diferenciadas derivadas, o de células aisladas de un animal de la invención y en las que la expresión de dicha secuencia inhibidora de la diferenciación se ha activado y aún así puede inducirse su diferenciación mediante la exposición a un factor externo, habiendo sido así expuestas, o de células aisladas de un animal de la invención crecidas in vitro con un gen inmortalizador no-condicional o genes de lo mismo insertados in vitro, bien como fuente de una sustancia producida por las células, opcionalmente un factor de crecimiento o de diferenciación, o un sistema de ensayo en relación con una tal sustancia (en una realización ilustrativa de esta utilización, la sustancia producida por la célula es un anticuerpo);

(B) Utilización de células inmortalizadas obtenidas mediante un procedimiento tal como se definió anteriormente, o de células diferenciadas derivadas, o de células aisladas de un animal de la invención y en las que la expresión de dicha secuencia inhibidora de la diferenciación se ha activado y aún así puede inducirse su diferenciación mediante la exposición a un factor externo, habiendo sido así expuestas, o de células aisladas de un animal de la invención crecidas in vitro con un gen inmortalizador no-condicional o genes de lo mismo insertados in vitro, en la producción de un medicamento: siendo dicho medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una condición característica de una deficiencia celular, o de una deficiencia del factor producido por la células, o de una disfunción celular mediante transplantación celular; o dicho medicamento comprende un factor producido por la célula y derivado de cualquiera de las células anteriormente mencionadas;

(C) Un aspecto muy importante de la invención es un procedimiento de terapia o profilaxis que se practica en el cuerpo de un humano o de un animal no-humano y que comprende la administración de: células inmortalizadas obtenidas mediante un procedimiento tal como se definió anteriormente, o células diferenciadas derivadas de éstas, o células aisladas de un animal de la invención y en las que la expresión de dicha secuencia inhibidora de la diferenciación se ha activado y aún así puede inducirse su diferenciación mediante la exposición a un factor externo, habiendo sido así expuestas, o de células aisladas de un animal de la invención crecidas in vitro con un gen o genes inmortalizadores no-condicionales e insertados in vitro; o un factor derivado de cualquiera de las células anteriormente mencionadas. Realizaciones particulares son los procedimientos de terapia de transplantación practicados en el cuerpo de un humano, o de un animal no humano en donde se obtienen células inmortalizadas mediante un procedimiento definido anteriormente, o células diferenciadas derivadas de lo mismo mediante la desactivación de la expresión de la secuencia inhibidora de dicha diferenciación, o células aisladas de un animal de la invención y en donde se ha activado la expresión de la mencionada secuencia inhibidora de la diferenciación, pero aún así puede inducirse la diferenciación de las células mediante la exposición a un factor externo, habiéndose así realizado, o células aisladas de un animal de la invención crecidas in vitro y con un gen o genes inmortalizadores no condicionales insertados in vitro, se transplantan en el mencionado cuerpo en condiciones que permiten la diferenciación de las células inmortalizadas o previenen la expresión de la secuencia inhibidora de la diferenciación en el caso de células diferenciadas, con la consiguiente compensación de una deficiencia o una disfunción de las células pre-existentes en el mencionado cuerpo (en dos realizaciones ilustrativas de dichos procedimientos, las células transplantadas son células productoras de insulina derivadas del páncreas de dicho animal, o células precursoras de lo mismo, siendo la terapia de transplantación para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad insulino-deficiente, o las células gliales o precursores de glías, siendo la terapia transplantacional para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso); y

(D) Utilización de células inmortalizadas que se han obtenido mediante un procedimiento definido anteriormente, de células diferenciadas derivadas de lo mismo o de células aisladas de un animal de la invención y en donde la expresión de dicha secuencia inhibidora de la diferenciación se ha activado pero aún así es posible inducir la diferenciación en dichas células mediante la exposición a un factor externo, habiéndose así expuesto, o de células aisladas de un animal de la invención que han crecido in vitro con un gen o genes inmortalizadores no condicionales insertados in vitro, en un procedimiento diagnóstico in vitro.

Las líneas celulares se utilizan rutinariamente como sistemas de ensayo en la purificación de factores que estimulan la división y la diferenciación celular. Las líneas celulares pueden utilizarse como sistemas de ensayo para la purificación de genes que regulan la división y la diferenciación. Muchos de los oncogenes establecidos se han identificado por su capacidad para convertir líneas celulares a un estado neoplásico. Los genes que inducen la diferenciación celular en tipos celulares específicos también se pueden identificar mediante transfección de material genético en células receptoras adecuadas, tal como se demostró en estudios recientes sobre la identificación de genes que controlan la diferenciación celular. Se puede imaginar, p.ej., la utilización de líneas celulares pancreáticas insulino-negativas como sistemas adecuados para la identificación de factores o genes que inducen que algunas células pancreáticas produzcan insulina.

En general, la presente invención proporciona un medio por el cual se puede producir un gran número de células diferenciadas o de células precursoras. Por ejemplo, si se necesita una gran cantidad de un tipo específico celular para utilizar en procedimientos diagnósticos, para la transplantación en un individuo o para utilizar como un medio de producción de un producto deseado (p.ej., un factor mitogénico o de diferenciación), entonces se pueden seleccionar las células adecuadas utilizando técnicas conocidas. Estas células pueden, en consecuencia, crecerse en condiciones permisivas durante un tiempo determinado. Las células pueden estudiarse en condiciones permisivas, si es posible la inducción de al menos algunos aspectos de la diferenciación. Además, las células pueden cambiarse a condiciones no permisivas compatibles con una diferenciación más extensa en las vías normales. Además, las células se pueden manipular genéticamente en cultivo de tejidos para expresar una secuencia inhibidora de la diferenciación de tipo salvaje, permitiendo así el crecimiento de un gran número de células (p.ej., con el propósito de purificar una proteína deseada producida por las células) sin la utilización continuada de las condiciones de crecimiento permisivas.

Es evidente a partir de los principios de la presente invención que las células inmortalizadas condicionalmente, obtenidas de los animales transgénicos actuales pueden introducirse (en condiciones no-permisivas) en un individuo, en donde residirán en un entorno no permisivo. La introducción de dichas células es inestimable para el desarrollo de las terapias de transplantación del precursor, en donde se transplantan muchas células precursoras en el tejido afectado con el fin de rellenar las poblaciones requeridas para la función normal. Por ejemplo, las células productoras de insulina derivadas del páncreas de un animal transgénico de la presente invención pueden implantarse quirúrgicamente en el páncreas de animales que padezcan enfermedades insulino-deficientes (como la diabetes de tipo I).

La utilización de células diseñadas genéticamente para incrementar el proceso regenerativo, o restaurar la función tisular ha adquirido un gran interés práctico. Por ejemplo, Gage y colaboradores (Science, 1988, 242, 1975) describieron la inyección de fibroblastos diseñados genéticamente para sobreproducir el factor de crecimiento nervioso en el lugar de una lesión fimbria-fórnix y más recientemente se ha demostrado que promueve la supervivencia de neuronas colinérgicas hasta unas 8 semanas (Rosenberg y col., 1989, Am. Soc. Neurosci. Abs. Nº 433.2).

Muchos tumores están relacionados histológicamente con las células halladas en estadíos tempranos del desarrollo tisular. Los animales de la presente invención proporcionan una fuente fácil de células para la identificación de precursores potenciales de células tumorales. Además de la estrategia ya discutida en relación con la identificación de una célula precursora de glioma putativa, también es posible utilizar otras tecnologías de inserción de genes (p.ej., la transfección, la electroporación, la inserción de genes mediada por retrovirus) para manipular el genoma de cualquiera de las líneas celulares aisladas de animales de la presente invención. Así, inicialmente pueden crecerse precursores específicos o tipos celulares diferenciados en un número importante como para permitir la utilización de procedimientos eficientes de inserción génica y a continuación estas células modificadas pueden utilizarse en el estudio de la transformación neoplásica de tipos celulares definidos.

Además, los animales de la presente invención proporcionan un medio de obtención de líneas celulares inmortalizadas que presentan mutaciones preseleccionadas. Un aspecto adicional de la invención es la utilización de un animal de la invención como un animal de la línea parental para el cruzamiento con un animal mutante de la línea parental que exprese una mutación preseleccionada, para la producción de un animal mutante descendiente que presente un desarrollo celular normal y del que es posible aislar las células inmortalizables que expresen dicha mutación. Preferentemente, en dicha utilización, ambos progenitores son homocigotos para sus características respectivas, que deberán presentarse en cada uno de sus descendientes, tal como se definió anteriormente. De acuerdo con la presente invención, se incluye un aspecto adicional que comprende las células inmortalizadas o inmortalizables que expresan dicha mutación preseleccionada y se derivan de una descendencia tal como se definió y se realizó anteriormente.

Será evidente para un lector experto que es posible realizar diversas modificaciones y alteraciones a las diversas realizaciones aquí discutidas y/o descritas anteriormente sin desviarse del ámbito de la presente invención.

Claims

1. Procedimiento de producción de un animal eucariota no humano transgénico, llevando el animal una construcción que comprende una secuencia codificante para una forma termosensible del producto del antígeno T mayor de SV40 que es activo condicionalmente; y

dicha secuencia está bajo el control de un promotor regulable,

de manera que dicha forma termosensible del producto del antígeno T mayor de SV40 está en un nivel funcional suficientemente bajo in vivo para permitir el desarrollo normal de dichas células en dicho animal; y

de manera que en condiciones de cultivo permisivas en las que se activa el promotor, dicho producto tenga un nivel funcional de expresión suficiente para impedir la diferenciación completa de células obtenidas de dicho animal; y

comprendiendo dicho procedimiento la incorporación cromosómica efectiva de una secuencia en al menos algunas de las células del mencionado animal.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la incorporación cromosómica se efectúa mediante la técnica de microinyección en un estadío embrional del desarrollo animal.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho promotor es un promotor de clase I HLA.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho promotor es un promotor HLA H-2K^{b}.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho promotor comprende diversos elementos reguladores genéticos en asociación operativa.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho animal es un ratón o una rata.

7. Procedimiento para proporcionar un animal eucariota no humano que lleva una mutación preseleccionada y tiene células con una secuencia incorporada cromosómicamente según se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento efectuar la incorporación cromosómica de una secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 en al menos algunas de dichas células para proporcionar un animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cruzarlo con un animal mutante no humano de parental que exprese una mutación preseleccionada y obtener la descendencia portadora de dicha mutación y de la secuencia incorporada cromosómicamente.

8. Procedimiento para establecer una célula en cultivo, comprendiendo dicho procedimiento:

extraer una célula de un animal no-humano producido de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 7;

someter la célula extraída a condiciones permisivas en cultivo en las que se active el promotor, en donde dichas condiciones llevan a un nivel funcional de expresión de dicho producto inhibidor de la diferenciación para impedir la diferenciación completa de la célula.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula pancreática, un precursor de una célula productora de insulina, una célula glial, un precursor de célula glial, una célula muscular y un precursor de célula muscular.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, que además comprende proporcionar un factor externo a dicho cultivo para inducir la diferenciación.

11. Procedimiento para producir un producto de expresión de la célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, comprendiendo el procedimiento cultivar dicha célula en condiciones que favorezcan la producción de dicho producto de expresión.