ES2213023T3 - Procedimiento para la fabricacion de particulas adsorbentes de polimero fluorado. - Google Patents
Procedimiento para la fabricacion de particulas adsorbentes de polimero fluorado.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de partículas esféricas porosas de adsorbente de polímero fluorado, que comprende las etapas siguientes: (1) formación de una solución insoluble en agua de compuestos orgánicos que comprende (a) un monómero seleccionado de entre ésteres de alquilenglicol C2-4 de ácido acrílico C3-6 y divinilbenceno; (b) un monómero de vinilo polifluorado; (c) un monómero seleccionado de entre ácido acrílico, ácido metacrílico y sus ésteres; (d) un iniciador de radicales libres y (e) un material porógeno insoluble en agua y soluble en disolventes orgánicos, siendo la relación en peso de los comonómeros (a) más (b) más (c) respecto al material porógeno de 0, 5:1 a 2:1; (2) formación de una solución diluida de un agente dispersante en agua a partir de la cual se ha purgado cualquier oxígeno con gas inerte; (3) agitación y purga de gas inerte, dispersando rápidamente la solución de compuestos inorgánicos insolubles en agua de la etapa (1) en la solución acuosa diluida de la etapa (2) y, en caso necesario, ajustar la temperatura de la dispersión entre 30 y 90ºC para iniciar la copolimerización de los monómeros, siendo suficiente el nivel de energía de mezcla para dispersar la solución de compuestos orgánicos insoluble en agua en la solución de la etapa (2) en forma de gotitas de líquido con un diámetro medio no superior a 10 a 300 ìm, estando al menos el 90% de las gotitas dentro del 40% aproximadamente o por debajo del diámetro medio de partícula; (4) continuación de la agitación y de la purga de oxígeno de la dispersión de la etapa (3) durante un tiempo suficiente para efectuar la copolimerización completa de los monómeros y la formación de partículas de las gotitas en forma de partículas de polímero finamente divididas por precipitación del copolímero en las mismas; (5) separación de las partículas de copolímero finamente divididas del medio de reacción de polimerización; (6) extracción del material porógeno de las partículas de copolímero separadas de la etapa(5) lavando las partículas con disolvente orgánico inerte, formando de este modo poros dentro del polímero; y (7) secado de las partículas de copolímero poroso.
Description
Procedimiento para la fabricación de partículas
absorbentes de polímero fluorado.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la fabricación de partículas absorbentes de
polímeros fluorado y a su utilización como fase estacionaria para
llevar a cabo separaciones cromatográficas.
Los materiales de soporte para utilización en
cromatografía líquida de alto rendimiento deben ser mecánicamente
fuertes para resistir la operación a altas velocidades de flujo a
altas presiones. Además, deben ser estables en todo el amplio
intervalo de pH al que se someten dichos materiales durante la
operación normal y la regeneración. La estabilidad de las
partículas poliméricas en su entorno debería permitirles resistir
la degradación y la descomposición. Las propiedades físicas de
particular importancia para el medio cromatográfico de partículas
son: (1) la esfericidad de las partículas; (2) el área superficial
grande; (3) el gran volumen de poro y la disponibilidad; (4) el
amplio intervalo de diámetros de poro; y (5) el amplio intervalo de
diámetro de partículas.
El documento
US-A-4035316 da a conocer la
preparación de microesferas de una solución acuosa de monómero que
se compone de metacrilato de 2-hidroxietilo, ácido
metacrílico, metacrilato de trifluoroetilo y dimetacrilato de
etilenglicol.
Según un aspecto de la presente invención, una
solución insoluble en agua de compuestos orgánicos se compone de
(a) un monómero seleccionado de entre ésteres de alquilenglicol
C_{2-4} de un ácido acrílico
C_{3-6} y un divinilbenceno; (b) un monómero
polifluorado; (c) un monómero seleccionado de entre ácido acrílico,
ácido metacrílico y ésteres de los mismos; (d) un iniciador de
radicales libres; y (e) un material porógeno insoluble en agua,
soluble en disolventes orgánicos, siendo la relación en peso de los
comonómeros (a) más (b) más (c) al material porógeno de 0,5:1 a
2:1.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, las partículas se pueden obtener por polimerización de
dicha solución.
Las partículas de la invención se pueden utilizar
en un aparato médico. Se pueden recubrir con un polímero hidrófilo.
Se pueden utilizar en un procedimiento para la separación
cromatográfica de componentes separables de una solución líquida,
que comprende hacer pasar la solución líquida a través de un lecho
de las partículas.
Las partículas de la invención constituyen una
mejora de todas las partículas conocidas en relación con muchas de
sus propiedades deseadas descritas anteriormente. Además, la
superficie fluorada de determinadas partículas de la invención
presenta una polaridad poco común e inesperada que se aprovechable
para llevar a cabo separaciones cromatográficas como por ejemplo las
utilizadas para el ADN.
En particular, un procedimiento para la
preparación de partículas esféricas porosas de absorbente de
polímero fluorado, comprende las etapas siguientes:
(1) formación de una solución insoluble en agua
definida anteriormente;
(2) formación de una solución diluida de un
agente dispersante en agua a partir de la cual se ha purgado
cualquier oxígeno con gas inerte;
(3) agitación y purga de gas inerte, dispersando
rápidamente la solución de compuestos inorgánicos insolubles en
agua de la etapa (1) en la solución acuosa diluida de la etapa (2)
y, en caso necesario, ajustar la temperatura de la dispersión entre
30 y 90ºC para iniciar la copolimerización de los monómeros, siendo
suficiente el nivel de la energía de mezcla para dispersar la
solución de compuestos orgánicos insolubles en agua en la solución
de la etapa (2) en forma de gotitas de líquido con un diámetro
medio de no más de 10 a 300 \mum, estando al menos el 90% de las
gotitas dentro del 40% aproximadamente o por debajo del diámetro
medio de partícula;
(4) continuación de la agitación y de la purga de
oxígeno de la dispersión de la etapa (3) durante un tiempo
suficiente para efectuar la copolimerización completa de los
monómeros y la formación de partículas de las gotitas en forma de
partículas de polímero finamente divididas por precipitación del
copolímero en las mismas;
(5) separación de las partículas de copolímero
finamente divididas del medio de reacción de la polimerización;
(6) extracción del material porógeno de las
partículas de copolímero separadas de la etapa (5) lavando las
partículas con disolvente orgánico inerte, formando de este modo
poros dentro del polímero; y
(7) secado de las partículas de copolímero
poroso.
La invención proporciona además partículas
absorbentes preparadas por el procedimiento descrito
anteriormente.
La presente invención proporciona además
utilizaciones para las partículas según la invención como fase
estacionaria en técnicas cromatográficas. Determinadas partículas
de la invención son particularmente adecuadas para utilizar cuando
la muestra que se ha de cromatografiar es una macromolécula que
contiene nucleótidos, nucleósidos o polipéptidos, como por ejemplo
ADN, ARN o endotoxinas.
La invención se refiere a un procedimiento para
fabricar partículas absorbentes de fluoropolímero de alta calidad
mediante polimerización por suspensión en una solución acuosa que
contiene un agente dispersante convencional. Los componentes
básicos del procedimiento son (1) el sistema de polimerización
insoluble en agua, que se compone principalmente de un monómero
polifluorado, dos o más monómeros etilénicamente insaturados y un
catalizador de iniciación con radicales libres, y (2) el medio de
dispersión, que es una solución acuosa diluida que contiene un
agente dispersante convencional. Solución insoluble en agua,
significa una solución suficientemente insoluble en agua para
permitir que tenga lugar la polimerización en la suspensión. Los
monómeros etilénicamente insaturados preferidos son los monómeros
con grupos funcionales divinilo. Los monómeros no fluorados con
grupos funcionales divinilo son los más preferidos. El
poli(alcohol vinílico) y la poli(vinilpirrolidona)
son los agentes dispersantes preferidos.
La polimerización del copolímero polifluorado
para su utilización en la invención se lleva a cabo en presencia de
una solución acuosa diluida que contiene un agente dispersante, por
ejemplo poli(alcohol vinílico) o
poli(vinilpirrolidona). La función principal del agente
dispersante es ajustar la tensión superficial interfacial entre los
componentes insolubles en agua de la polimerización finamente
dispersados y la fase continua del medio acuoso. Regulando la
concentración del agente dispersante disuelto en el medio acuoso,
se puede controlar más fácilmente el tamaño de las gotitas del
sistema de polimerización dispersado y por lo tanto el tamaño de
las partículas polimerizadas resultantes.
Con tal que el agente dispersante esté
esencialmente disuelto en su totalidad en el medio acuoso, se puede
utilizar con éxito una amplia gama de pesos moleculares del agente
dispersante en la práctica de la invención. Un agente dispersante
preferido es el PVA que esté hidrolizado al menos un 80%, y más
preferentemente hidrolizado al menos un 86%, con un peso molecular
de al menos aproximadamente 1.000. El peso molecular máximo
utilizable es función de la solubildad en agua ambiente del agente
dispersante. Por ejemplo, el peso molecular del PVA utilizado no
debe exceder normalmente de 150.000 y preferentemente no debe ser
mayor de 100.000.
Para los fines de la invención, la concentración
de PVA en el medio acuoso debería estar comprendida dentro del
intervalo entre 1 y 50 ml de PVA por litro de agua. Por debajo de 1
ml/l el efecto modificador del PVA es insuficiente y por encima
aproximadamente 50 ml/l no se puede distinguir ninguna ventaja
adicional. Es deseable, desde luego, utilizar cantidades menores de
PVA para impedir el aumento de la pérdida de energía en la
viscosidad del medio acuoso.
Tal como se indicó anteriormente, el comonómero
que contiene flúor puede contener diversos sustituyentes de flúor
(F). Es preferible que el comonómero fluorado contenga al menos
tres sustituciones de F. Más preferentemente este monómero está
perfluorado. Además de estas limitaciones en su grado de
fluoración, es esencial que el comonómero fluorado sea en esencia
completamente insoluble en agua a las temperaturas de polimerización
observadas y en esencia completamente soluble en los demás
componentes del sistema de polimerización dispersado.
Los comonómeros polifluorados son aquellos que
contienen puntos activos de vinilo como por ejemplo los acrilatos,
metacrilatos, compuestos de vinilo, maleatos e itaconatos. Entre
los muchos compuestos dentro de aquellas categorías están
pentafluorestireno, itaconato de
bis-hexafluorisopropilo, maleato de
bis-hexafluorisopropilo, acrilato de
heptadecafluordecilo, metacrilato de perfluoroctilo, metacrilato de
2,2,3,3-tetrafluorpropilo, itaconato de
monotrifluoretilo, maleato de 2,2,2-trifluoretilo,
perfluoroctanoato de vinilbencilo y trifluoracetato de vinilo.
Es preferible que el componente comonómero del
copolímero polifluorado para su utilización en la invención sea un
éster de alquilenglicol C_{2-4} de un ácido
acrílico C_{3-6} (comonómero reticulante). El
comonómero reticulante debe tener al menos dos grupos vinilo. Los
comonómeros adecuados que tienen esta composición son dimetacrilato
de etilenglicol, dimetacrilato de
1,3-propilenglicol, dimetacrilato de
1,4-butanodiol, itaconato de etilenglicol,
diacrilato de etilenglicol y dimaleato de ettilenglicol. Se puede
utilizar también con este fin el divinil benceno.
Se puede utilizar también una mezcla de
comonómeros no fluorados, en la que un comonómero no fluorado tiene
al menos dos grupos vinilo, a saber, el comonómero reticulante, y
el tercer monómero, a saber, el comonómero (c), es ácido acrílico,
ácido metacrílico o un éster de un ácido acrílico o metacrílico.
Los ésteres típicos son los ésteres metílico, etílico e
hidroxietílico de estos ácidos, epóxido que contienen ésteres de
estos ácidos y aminoésteres de estos ácidos. Por lo tanto, se puede
utilizar en la síntesis un cuarto comonómero seleccionado de entre
comonómeros (c).
La presencia del comonómero (c) facilita la unión
de los ligandos para su utilización en separaciones cromatográficas
obviando la utilización de PVA como aglutinante, tal como se
describe en las patentes US nº 5.773.587 y nº 6.046.246, entre la
partícula perfluorada y el ligando. La adición de monómero (c)
tiene poco efecto sobre las propiedades de las partículas mejoradas
de la invención, como por ejemplo la estabilidad de la partícula o
el tamaño de poro.
Se ha demostrado que entre el 1 y el 30% del
dimetacrilato de etilenglicol reticulador se puede sustituir por un
tercer o cuarto monómero seleccionado de entre comonómeros (c).
Estos comonómeros se pueden seleccionar en función del grupo
funcional deseado. Por ejemplo, se pueden añadir ésteres funcionales
de ácido acrílico y ácido metecrílico, como por ejemplo se pueden
utilizar los que contienen hidroxilo, epóxido, amina, amonio
cuaternario, ácido sulfónico, etc.
Un componente esencial de la polimerización es
una fuente de radicales libres. En particular, el sistema debe
contener uno o más compuestos que se descompongan térmicamente en
las condiciones de la polimerización para formar especies con
radicales libres. Un agente con radicales libres preferido consiste
en una mezcla de
azo-bis-isobutironitrilo (AIBN) y
peróxido de benzoilo (BPO). Para este fin se necesitan desde
aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/l. Se reconoce que
concentraciones mayores se pueden operar funcionalmente. Sin
embargo, se prefiere utilizar cantidades tan pequeñas como sea
posible para disminuir la cantidad de materiales extraños en las
partículas de polímero formadas.
Los materiales porógenos adecuados son aquellos
compuestos orgánicos que son (1) químicamente inertes con respecto
a los demás componentes de la fase de polimerización, (2)
totalmente solubles en el sistema de polimerización, (3) totalmente
insolubles en la fase acuosa continua y (4) extraibles fácilmente de
las partículas polimerizadas a temperaturas relativamente bajas con
un disolvente orgánico de peso molecular bajo. El porógeno
preferido para su utilización en la invención es el ftalato de
dibutilo, que se elimina fácilmente lavando las partículas de
polímero con diclorometano. Otros porógenos adecuados incluyen
tolueno, isopropilbenceno,
2-metil-4-pentanona,
2-metil-4-pentanol y
clorobenceno.
La polimerización debería realizarse
esencialmente en ausencia completa de aire o de cualquier otra
fuente de contaminación de oxígeno, que podría conducir a
reacciones desfavorables con cualquiera de los componentes del
sistema de polimerización, especialmente los monómeros, el agente
de reticulación y el iniciador de radicales libres. Se ha
descubierto que la manera más práctica de eliminar e impedir la
introducción de oxígeno en el sistema de polimerización es purgar
continuamente el sistema de polimerización con un gas inerte antes,
durante y después de la terminación del proceso de polimerización.
Cualquier gas inerte es, desde luego, adecuado para este fin. Sin
embargo, el argón y el nitrógeno son los menos costosos y se
prefieren en la mayoría de los casos. Debido a que la
polimerización se realiza en condiciones de mezcla con energía muy
alta, el procedimiento de introducción del gas de purga no es
particularmente crítico, a condición de que sea en volumen
adecuado.
El agente dispersante funciona principalmente
para un control más preciso de la tensión interfacial entre las
gotitas de monómero dispersadas y el medio acuoso continuo. El
tamaño de la gotita se controla más principalmente por la cantidad
de energía de mezcla utilizada para dispersar el sistema de
polimerización. Por lo tanto, se requieren sólo concentraciones
relativamente bajas de PVA como agente dispersante en el medio
acuoso, p. ej.: del orden de 1 a 100 g/l. Es preferible una
concentración de PVA comprendida en el intervalo de 0,5 a 40 g/l.
Aunque se pueden utilizar concentraciones mayores, no mejoran la
funcionalidad. Debido a la necesidad de formar gotitas muy pequeñas
durante la polimerización, es deseable, desde luego, impedir
concentraciones mayores de PVA que harían al medio acuoso más
viscoso. La cantidad de aportación de energía en la polimerización
es principalmente una función del tamaño de partícula del polímero
que se desea. Por lo tanto, si se pretenden partículas mayores, se
reduce el grado de mezclado (aporte de energía). Es preferible que
se controle el tamaño de la gotita durante la polimerización para
obtener partículas de polímero comprendidas dentro del intervalo de
5 a 300 micrómetros, siendo especialmente preferidas de 20 a 100
micrómetros.
La polimerización se realiza entre 30 y 90ºC,
preferentemente entre 70 y 90ºC.
Los medios cromatográficos ideales necesitan
tener las propiedades siguientes: (1) forma esférica; (2) gran área
superficial; disponibilidad de un intervalo amplio de (3) diámetros
de poro y (4) diámetros de partícula; (5) volumen de poro elevado,
(6) resistencia mecánica elevada y (7) tanto la estabilidad química
como la mecánica en todo el intervalo de pH al que se exponen los
medios en su utilización.
La esfericidad de las partículas, más que formas
irregulares, granulares, presenta ventajas para proporcionar la
resistencia mínima al flujo mediante un lecho relleno de partículas
y la contrapresión mínima. Es menos probable que dichas partículas
de forma regular experimenten densificación durante su
utilización.
El tamaño de partícula y la distribución del
tamaño son asimismo propiedades importantes de las partículas de la
invención. En general, las partículas mayores de aproximadamente 20
micrómetros facilitan la contrapresión inferior en columnas de
relleno. Además, la anchura del pico cromatográfico y la forma del
pico obtenida con partículas mayores son normalmente más amplias que
la anchura y forma del pico obtenidas con partículas comprendidas
en el intervalo de 3 a 15 micrómetros. Las formas de pico estrecho
son deseadas con frecuencia para muchos tipos de separaciones.
El área superficial disponible de las partículas
polifluoradas producidas por el procedimiento de la invención se
prefiere normalmente que sea al menos aproximadamente de 200
m^{2}/g para obtener mayor cantidad de antígenos en el medio de
las partículas. No obstante, se pueden preparar fácilmente medios
que tienen áreas superficiales mucho más pequeñas según la
invención cambiando la cantidad de porógeno utilizado en el sistema
de polimerización y disminuyendo el tamaño de las partículas.
Simultáneamente, se necesita un volumen de poro mayor de por lo
menos 0,5 ml/g para obtener una gran área superficial.
Se debe disponer de un intervalo amplio de
tamaños de poro para diferentes procedimientos cromatográficos. Se
necesitan poros grandes para la captura eficaz de moléculas
mayores, como por ejemplo las proteínas, mientras que se necesitan
poros pequeños para la captura eficaz de partículas pequeñas. En
general, el intervalo de tamaños de poro se puede extender desde
menos de 60 \ring{A} hasta más de 1.000 \ring{A}, siendo
preferido de 300 a 800 \ring{A}. Este intervalo de tamaños está
muy disponible fácilmente utilizando el procedimiento de la
invención de ajustar la cantidad relativa y el tipo de porógeno a
las partículas de porógeno formadas.
Debido al amplio intervalo de valores de pH en el
que se utilizan los medios cromatográficos y debido a los
intervalos de pH muy altos que se encuentran con frecuencia al
regenerarlos, es necesario que sean químicamente inertes en todo el
intervalo de dichas exposiciones al pH. En particular, el medio
cromatográfico debe ser capaz de soportar el pH alto (12 ó mayor)
encontrado por la utilización de NaOH para limpiar las partículas
del medio, típicamente normal de 0,1 a 1.
Las partículas absorbentes de la invención son
bastante versátiles y se pueden utilizar como fase estacionaria
para llevar a cabo una amplia variedad de separaciones
cromatográficas. Ejemplos de separaciones cromatográficas
contempladas incluyen las separaciones en fase inversa, las
separaciones por afinidad, las separaciones en lecho expandido, la
cromatografía de intercambio iónico, la filtración en gel, la
separación en componentes cromatográficos, la extracción en fase
sólida, la filtración y otros procedimientos técnicos de
distribución, medición o recogida de componentes reconocidos de una
mezcla química, biológica o física. Las partículas se pueden
utilizar como soporte para injertar diferentes tipos de ligandos.
Se aconseja utilizar especialmente determinadas partículas en las
que la muestra que se ha de cromatografiar es ADN, ARN o
polipéptidos.
Las partículas polifluoradas de la invención se
pueden utilizar en separaciones cromatográficas, ya sea con o sin
un recubrimiento de un polímero hidrófilo, como por ejemplo
poli(alcohol vinílico).
La superficie de las partículas sin recubrir de
los Ejemplos 3 y 4 es hidrófoba, pero con una ligera polaridad,
cuya combinación de propiedades es ideal para las separaciones
cromatográficas en fase inversa. La cromatografía en fase inversa
implica la utilización de una fase estacionaria relativamente no
polar juntamente con una fase móvil muy polar que es generalmente
agua. Esta técnica se utiliza para separar solutos de polaridad
inferior. La cromatografía en fase inversa se realiza generalmente
utilizando sílice que se recubre con un silano orgánico para
proporcionar hidrofobia. Sin embargo, la sílice hidrofobizada
presenta una limitación grave al no poder ser utilizada a un pH
mayor de 11 y al no poder limpiarse con soluciones concentradas de
sosa cáustica sin disolver las partículas. Una ventaja sustancial
de las partículas polifluoradas de la invención es que no presentan
esa limitación.
La utilización de las partículas sin recubrir de
la invención se ilustra mediante el Ejemplo 28 y la estabilidad de
las partículas de la invención hacia las soluciones básicas se
presenta mediante los datos obtenidos en el Ejemplo 29 más
adelante.
Los polímeros hidrófobos adecuados para su
utilización en el recubrimiento de las partículas polifluoradas de
la invención son aquellos que no tienen carga, son solubles en
agua, no cíclicas y presentan múltiples grupo hidroxilo. Aunque
muchos de tales polímeros hidrófilos sirven para esta particular
función, se prefiere el poli(alcohol vinílico).
De forma ventajosa, los compuestos polifluorados
de la invención se pueden utilizar en dispositivos médicos con o
sin ligandos sobre sus superficies para realizar separaciones que
no están clasificadas como cromatográficas. Por ejemplo, se pueden
separar componentes de la sangre utilizando un dispositivo médico
en el que la sangre se bombea extracorporalmente a través de un
cartucho y se retorna al cuerpo. Un componente, como por ejemplo
una toxina, se eliminaría y no retornaría al cuerpo.
Debido a la estabilidad de las partículas
polifluoradas de la invención, se puede realizar la esterilización
por irradiación gamma sin destruir la partícula. Esta propiedad
hace a las partículas especialmente muy adecuadas para
utilizaciones en dispositivos médicos que se deben esterilizar.
Si se desea, se pueden introducir grupos
funcionales en las partículas polifluoradas recubiertas de PVA
haciendo reaccionar moléculas adecuadas con los grupos hidroxilo
del PVA. De este modo, se puede proporcionar grupos funcionales de
intercambio iónico catiónico fuerte a las superficies de las
partículas colocando grupos de ácido sulfónico en la superficie.
Asimismo, se puede proporcionar grupos funcionales de intercambio
iónico aniónico fuerte aplicando aminas cuaternarias. Se puede
producir un grupo funcional catiónico débil mediante la utilización
de grupos carboxílicos y se puede obtener un grupo funcional
aniónico débil mediante la utilización de aminas primarias.
Se colocaron cuatrocientos noventa ml de agua
destilada en un recipiente y se agitaron con un mezclador de
paletas de alta eficacia a 800 rpm. Se añadió gas argón en
agitación continua para purgar el oxígeno en el agua y se añadió 3,9
g de poli(alcohol vinílico) al agua. Se continuó la
agitación y la purga durante 30 minutos, durante los cuales se
redujo la agitación de la mezcla cambiando el ángulo del agitador.
Se mezclaron conjuntamente dimetacrilato de etilenglicol (50,1 g),
pentafluorestireno (39,8 g) y metacrilato de hidroxietilo (5,6 g) y
se añadieron 127 ml de ftalato de dibutilo a la mezcla, después de
lo cual se añadieron a la mezcla 0,48 g de
azo-bis-isobutironitrilo (AIBN) y
0,45 g de peróxido de benzoilo (BPI). Se agitó la mezcla a
continuación hasta que se hizo homogénea. Se añadió a continuación
rápidamente la mezcla homogénea a la solución acuosa de
poli(alcohol vinílico) y la mezcla de la polimerización
resultante se calentó aproximadamente a 80ºC. Se continuó la
agitación a 800 rpm y la purga de argón hasta que terminó la
polimerización.
En el momento de la separación las partículas del
polímero fluorado formado en el medio de la polimerización, se
lavaron sucesivamente con (1) 200 ml de agua destilada a 60ºC, (2)
200 ml de acetona a 60ºC y (3) 200 ml de una mezcla en volumen de
30/70% de agua caliente y acetona a 70ºC. Tras la terminación de
las etapas de lavado, se secaron las partículas toda la noche en una
estufa a 70ºC.
Las partículas del polímero fluorado lavadas y
secadas se calentaron a reflujo a continuación con diclorometano al
10% p. durante 6 a 7 horas a 50ºC para eliminar el material
porógeno de las partículas. Las partículas exentas de porógeno se
colocaron en un embudo de vidrio sinterizado y se enjuagaron con 50
ml de acetona por gramo de partícula, tras lo cual las partículas
enjuagadas se secaron toda la noche a 70ºC.
Las partículas polifluoradas lavadas presentaban
un tamaño de partícula medio de 51 micrómetros, un área superficial
de 300 m^{2}/g y un volumen de poro de 1,0 ml/g. Este
procedimiento fue muy eficaz en la producción de poros, bolitas
esféricas que deberían soportar una presión de 2.000 psi en una
suspensión cromatográfica.
Se realizaron asimismo variaciones de este
Ejemplo, de la forma siguiente. Se preparó un copolímero poroso de
dimetacrilato de etilenglicol, pentafluorestireno y metacrilato de
epoxietilo añadiendo gas nitrógeno a 490 ml de agua destilada
durante un periodo de 30 minutos para purgar el oxígeno del agua.
Se añadió alcohol polivinílico (3,9 g). Se mezclaron conjuntamente
pentafluorestireno (30,9 g), divinilbenceno (35,7 g), metacrilato de
epoxietilo (20,0 g) y ftalato de dibutilo (127 ml) en un recipiente
independiente. Se añadieron
azo-bis-isobutironitrilo (0,40 g) y
peróxido de benzoilo (0,30 g) a los monómeros mezclados. Se añadió
la mezcla de monómeros y catalizadores de peróxido a una mezcla
agitada de agua y PVA. Se calentó la mezcla a 80ºC en agitación a
800 rpm de un agitador a paletas, accionado a motor. Se dejo
polimerizar la mezcla durante un periodo de 4 horas después del cual
se consideró terminada la polimerización. Se separaron las
partículas de polímero del agua, se lavaron y se secaron. Se
eliminó el porógeno según se describió anteriormente.
Se realizó la polimerización como en el Ejemplo 1
excepto que la poli(vinilpirrolidona) se sustituyó por el
agente dispersante PVA. Se realizó la polimerización como en el
Ejemplo 1, excepto que las partículas se dividieron más finamente
después del secado. En el Ejemplo 1, las partículas se aglomeran
con frecuencia en el secado, pero se separaron fácilmente por
procedimientos mecánicos o ultrasónicos. La utilización de
poli(vinilpirrolidona) impidió la aglomeración.
Se pueden preparar asimismo partículas de
intercambio iónico, porosas, perfluoradas, sustituyendo un
comonómero funcional por el dimetacrilato de etilenglicol
reticulante. Un ejemplo es la sustitución de 20,0 g de ácido
metacrílico por dimetacrilato de etilenglicol. El polímero
resultante puede funcionar como intercambiador catiónico débil.
Se preparó un copolímero poroso de dimetacrilato
de etilenglicol, perfluormetacrilato de 2-(N-etil
perfluoroctano sulfoamido) y ácido metacrílico de la manera
siguiente:
Reactor cilíndrico de 1 l. equipado con un
agitador de "tipo E" (Cole Palmer, de 6 cm de diámetro y 10 cm
de altura), condensador de reflujo, tubo de entrada de gas y sonda
de temperatura sumergida. El agitador se coloca de modo que su hoja
impulsora superior esté situada justo por encima del nivel de la
fase acuosa.
3,9 g de PVA (Aldrich, 85.000 a 146.000 Datons,
97 a 99% hidrolizado) en 490 ml de agua desionizada (DI).
1,7 g de poliestireno (Aldrich, MW estándar
9.000)
171 ml de isopropil benceno (Aldrich, 99%)
68,5 g de dimetacrilato de etilenglicol (Aldrich,
98%, 100 ppm de éter metílico de hidroquinona (MEHQ)
85,6 g de etilmetacrilato de
2-(N-etil perfluoroctano sulfonamido) (Monomers,
Polymers and Dajack)
17,1 g de ácido metacrílico
0,57 g de AIBN (Aldrich, 99%)
1,14, g de BPO (Aldrich, 98%)
Se preparó la fase acuosa disolviendo previamente
el pVA en agua a aproximadamente 50ºC. Se cargó la fase acuosa al
reactor y se roció con nitrógeno durante 25 minutos.
Se disolvió previamente el poliestireno en
isopropil benceno. Se añadió a continuación la mezcla de los tres
monómeros, seguida de los iniciadores. Después de agitar durante 1
hora, apareció turbia la fase orgánica y se añadió como tal al
reactor. Bajo arrastre con nitrógeno, se agitó la mezcla a 800 rpm y
se calentó a 80ºC durante un periodo de 30 minutos. Al alcanzarse
la temperatura de reacción, la mayor parte de la fase orgánica se
aglomeró en una sola masa que se rompió en bolitas individuales
otra vez después de 25 minutos.
Después de 9 horas a la temperatura de reacción,
se dejó enfriar el sistema, se sifonó la fase acuosa y se lavaron
las bolitas de resina con 500 ml de agua desionizada, 500 ml de
acetona, 500 ml de acetona-agua (30:70), 500 ml de
agua caliente y dos veces con 500 ml de acetona.
Después del secado con aire, el peso de la resina
es 168 g.
La resina se calienta a reflujo durante 5 horas
en 1 l de cloruro de metileno, se lava con 1 l de acetona y se seca
con aire.
Las partículas del polímero fluorado lavadas y
secadas se calentaron a reflujo a continuación con diclorometano al
10% p. durante 6 a 7 h a 50ºC para eliminar el material porógeno de
las partículas. Las partículas exentas de porógeno se colocaron en
un embudo de vidrio sinterizado y se enjuagaron con 50 ml de
acetona por gramo de partículas, tras lo cual las partículas
enjuagadas se secaron toda la noche a 70ºC. Las bolitas porosas
resultantes presentaban un tamaño de partícula de 50 \mum y un
área superficial de 300 m^{2}/g.
Se preparó un copolímero poroso de dimetacrilato
de etilenglicol y pentafluorestireno según el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1, mezclando conjuntamente 55,7 g de
dimetacrilato de etilenglicol, perfluormetacrilato y 39,8 g de
pentafluorestireno. No se añadió metacrilato de etilo a la mezcla.
Este procedimiento fue también muy eficaz en la preparación de
partículas esféricas porosas de pentafluorestireno.
Se preparó un copolímero poroso de dimetacrilato
de etilenglicol y perfluormetacrilato de 2-(N-etil
perfluoroctano sulfoamido) según el Ejemplo 2, excepto que la fase
orgánica estaba compuesta de:
1,7 g de poliestireno (Aldrich, MW estándar
9.000)
171 ml de isopropil benceno (Aldrich, 99%)
85,6 g de dimetacrilato de etilenglicol (Aldrich,
98%, 100 ppm de éter metílico de hidroquinona (MEHQ)
85,6 g de etilmetacrilato de
2-(N-etil perfluoroctano sulfonamido) (Monomers,
Polymers and Dajack)
0,57 g de AIBN (Aldrich, 99%)
1,14, g de BPO (Aldrich, 98%)
El procedimiento fue muy eficaz para preparar
partículas esféricas porosas de pentafluormetacrilato.
Se realizaron variaciones de los Ejemplos 3 y 4
para demostrar la flexibilidad del procedimiento para preparar
partículas con varias morfologías de poro, como se ilustra en la
tabla siguiente:
La tabla anterior ilustra el efecto que puede
tener el tipo y la cantidad de porógeno seleccionado en diferentes
sistemas de monómeros.
Utilizando partículas secas de polímero florado
preparadas como en el Ejemplo 3, se desaglomeraron 50 g de dichas
partículas por tratamiento con ultrasonidos en metanol durante 5
minutos y se pusieron a remojo toda la noche en 150 ml de metanol.
Esta etapa de desaglomeración se realizó en lotes independientes de
2 g de resina en 20 ml de metanol.
Se colocó el sedimento de la resina de metanol en
un matraz de fondo redondo de 3 l y suficiente metanol sifonado de
manera que sólo cubriese las bolitas. Una solución de 80 g de PVA
(31.000 a 50.000 Daltons, hidrolizado al 98%) en 1 l de agua
desionizada, preparada previamente disolviendo el PVA a 50ºC, se
añadió a continuación al matraz y el lodo resultante se agitó a
temperatura ambiente durante 24 horas. Después de recoger una
muestra para análisis del contenido en PVA, la solución de la carga
se separó de las bolitas por decantación. Las bolitas se
transfirieron a un embudo fritado y se lavaron dos veces durante 10
minutos con 500 ml de agua desionizada, seguido de la eliminación
del agua por succión. Se combinaron los lavados acuosos y se
conservó una muestra para análisis del contenido en PVA. Se
devolvieron al matraz de fondo redondo las bolitas lavadas y se
añadió 1 l de agua desionizada. Se reanudó la agitación y se añadió
1 ml de solución acuosa al 50% de glutaraldehído, seguido
inmediatamente de 8 ml de HCl 5 N acuoso. Después de agitar durante
otras 24 horas a temperatura ambiente, se transfirieron las bolitas
a un embudo fritado, se purgó, se lavó tres veces con 1 l de agua
desionizada y se dejó aparte como sedimento húmedo.
Este ejemplo demuestra que las partículas
polifluoradas esféricas preparadas según la invención se pueden
recurrir fácilmente con poli(alcohol vinílico) de esta
manera.
Utilizando otra vez partículas secas de polímero
fluorado preparadas como en el Ejemplo 3, se pusieron en remojo en
metanol 50 g de partículas y se cubrieron con PVA como en el
Ejemplo 5, excepto que la concentración del PVA en solución acuosa
se aumentó a 20 g/l.
En este Ejemplo, 50 g de partículas de polímero
fluorado preparadas como en el Ejemplo 4 se recubrieron con PVA
como en el Ejemplo 5.
Se determinó la concentración de PVA midiendo la
absorbancia del complejo PVA/yodo/ácido bórico medida a 690 nm y
comparándola con la curva de calibración preparada utilizando
soluciones patrón de PVA. El intervalo lineal del análisis
calorimétrico es hasta 1 mg PVA/ml. La cantidad de PVA absorbida en
la resina se determinó por la diferencia de la concentración de la
solución de recubrimiento inicial menos la concentración de la
solución final. Los resultados se expresan en mg o g de PVA/g de
resina seca.
Para una solución de recubrimiento de PVA de 9,31
mg/ml, se diluyen muestras 100x con agua destilada. Se pipetean 2,0
ml de las muestras preparadas en 1) en la cubeta junto con 0,5 ml
de la solución de ácido bórico 0,6 M y 0,1 ml de la solución
KI/I_{2}. Se mezcla y se deja en la oscuridad durante 30+5 min.
antes de tomar la absorbancia a 690 nm. Se calcula el peso de PVA
absorbido en las bolitas de polímero fluorado mediante la relación
siguiente:
mg \ PVA/g \ resina \ - \
\frac{(C_{i})(V_{i})-(C_{f})(V_{f})}{W}
en la
que
C_{i}= Concentración (mg/ml) de solución de
recubrimiento de PVA inicial
Vi = Volumen (ml) de solución de recubrimiento de
PVA
C_{f} = Concentración (mg/ml) de solución de
recubrimiento de PVA al final del proceso de recubrimiento
V_{f} = Volumen final (ml) de solución de
recubrimiento
V_{f} puede ser mayor que V_{i} debido a la
contribución del disolvente humectante
W = Peso (g) de polímero fluorado seco utilizado
en el proceso de recubrimiento
Utilizando este procedimiento, se midió la
cantidad de PVA absorbido en los polímeros perfluorados a 0,4 g de
PVA por g del polímero fluorado seco preparado como en el Ejemplo 5
y 1,51 g de PVA del polímero fluorado seco preparado como en el
Ejemplo 7.
Este ejemplo demuestra que el polímero
polifluorado de la invención estaba bien recubierto de
poli(alcohol vinílico).
Se analizó la capacidad de albúmina de suero
humano (HSA) en el polímero fluorado preparado y recubierto con una
gran cantidad de PVA como en el Ejemplo 5. En particular, se
añadieron 4 ml de una solución de 4 mg/ml de HSA en tampón de
fosfato 20 mM a un pH 7,4 a 0,5 g de bolitas recubiertas de PVA
preparadas como en el Ejemplo 5 y se agitó el sedimento resultante
en un mezclador de lecho plano durante 16 horas a temperatura
ambiente. La concentración de HSA en el sobrenadante se determinó a
continuación utilizando el análisis de Bradford. La cantidad de
proteína unida de forma no específica a la resina, calculada por
diferencia, fue 2 mg/g de polímero fluorado seco.
Este ejemplo demuestra claramente que la proteína
se unirá al sustrato sin recubrir de la invención con mayor
eficacia que el correspondiente sustrato recubierto.
Se analizó la capacidad de HSA en las partículas
del polímero fluorado preparadas y recubiertas con una pequeña
cantidad de PVA como en el Ejemplo 5 por el mismo procedimiento que
en el Ejemplo 9. Se determinó la cantidad de HSA absorbida que fue
de 12,5 mg/g de resina seca.
El ejemplo demuestra que cuando se recubre
poli(alcohol vinílico) sobre las partículas polifluoradas de
la invención se forma un recubrimiento uniforme y eficaz.
Se analizó la capacidad de lisozimas en las
partículas de polímero fluorado preparadas y recubiertas con una
gran cantidad de PVA como en el Ejemplo 6 por el mismo
procedimiento que en el Ejemplo 9. En particular, se añadió 4 ml de
una solución de 4 mg/ml de lisozima en tampón de carbonato 20 mM a
pH 9,0 a las bolitas recubiertas de PVA preparadas como en el
Ejemplo 6. El sedimento resultante se agitó en un mezclador de
lecho plano durante 16 horas a temperatura ambiente. La
concentración de lisozima en el sobrenadante se determinó sobre la
base de la adsorción de sobrenadante a 280 nm. La cantidad de
proteína unida de forma no específica a las bolitas de polímero
fluorado, calculada por diferencia, fue de 5 mg/g de resina
seca.
Se rellenó una columna Pharmacia HR 10/30 de 10
ml con partículas de polímero fluorado preparadas como en el
Ejemplo 5 y se equilibró con tampón de fosfato 20 nM a pH 7,0. se
determinó El volumen hueco de la columna (V_{o}) midiendo el
volumen de elución (V_{e}) de Blue Dextran 2000 (inyección de 0,5
ml, 4 mg/ml, tampón de fosfato 20 mM a pH 7,0). Se cargó en la
columna con 0,05 ml de 10 mg/ml de ribonucleasa A, de ovoalbúmina y
de aldolasa y se eluyó con un tampón de equlibrado a razón de 0,02
ml/min. Así mismo, se cargaron una solución de quimiotripsinógeno A
y de albúmina de suero bovino en la columna y se eluyeron con el
tampón de equilibrado a un caudal de 0,02 ml/min. Se midieron los
volúmenes de elución de las diversas proteínas a partir del
cromatograma (detección UV) y sus coeficientes de partición
respectivos (K_{av}) calculados utilizando la siguiente
ecuación:
K_{av} = (V_{e} - V_{o})
(V_{t} -
V_{o})
en la que V_{t} es el volumen total de la
columna.
Los resultados, resumidos en la Tabla 1 a
continuación, presentan la relación inversa esperada entre el
coeficiente de partición y el peso molecular para las proteínas
globulares.
Este ejemplo se refiere a la unión de un
colorante azul a una concentración baja de partículas de polímero
fluorado recubiertas de PVA.
A 1 ml de bolitas de polímero fluorado
recubiertas de PVA preparadas como en el Ejemplo 5 se añadió una
solución de 50 micromoles (40 mg) de Cibacron Blue
F3G-A en 8,4 m l de agua y 250 microlitros de NaCl 2
M. Después de mezclar durante 30 minutos en un mezclador de lecho
plano, se añadieron 50 micromoles de Na_{2}CO_{3} y se mezcló
el sedimento por agitación durante 16 horas a 80ºC. Se lavaron a
continuación las bolitas, conservando los filtrados, en un vidrio
sinterizado con 50 ml de agua, de NaCl 1 M, de dimetilformamida, de
metanol/agua con 3% de agua (v/v), de agua, de metanol, de agua, de
NaOH 1 M y por último de fracciones de 100 ml de agua hasta que el
filtrado se hizo transparente. Se determinó la cantidad de Cibacron
Blue F3G-A unido a laresina - 15 micromol/ml
midiendo la concentración en seco de las soluciones de lavado,
determinadas por adsorbancia a 620 nm y calculando la cantidad
unida por diferencia.
Este ejemplo se refiere al colorante Cibacron
Blue F3G-A para unas partículas de polímero
fluorado estirénico recubiertas de PVA con una gran concentración
de colorante azul. Se recubrió la resina con el PVA como en el
Ejemplo 6, excepto que la cantidad de agua para disolver los 50
Mmoles de colorante azul fue 1 ml. Se aplicó el colorante como en
el Ejemplo 13. La densidad del ligando resultante fue de 25
micromoles por ml de partículas de polímero fluorado.
Este ejemplo se realizó utilizando un polímero
fluorado preparado como en el Ejemplo 13, que contenía un colorante
azul que se une con una densidad de ligando baja. Se rellenó una
columna Pharmacia HR 5/10 de 1 ml con una resina preparada como en
el Ejemplo 13 y se equilibró con tampón de fosfato de sodio (20 mM,
pH 7,4). Se cargó 4 ml de una solución de 5 mg/ml de lisozima en el
tampón de equilibrado en la resina a 1 ml/min. Se eluyó a
continuación la lisozima en la resina utilizando NaCl 1 M en tampón
de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4. La cantidad de lisozima diluída,
determinada midiendo la absorción del eluyente a 280 mm, fue de 18
mg por ml de polímero fluorado.
Este ejemplo se debería comparar con el Ejemplo
11, en el que no se unió ningún colorante azul al
poli(alcohol vinílico).
Este ejemplo se realizó utilizando un polímero
fluorado preparado de la misma manera que el Ejemplo 14, pero con
una densidad de ligando elevada. La cantidad de lisozima eluída fue
de 20 mg/ml de resina.
Se preparó un polímero fluorado utilizando el
procedimiento del Ejemplo 14 que utiliza mioglobina como proteína.
No se pudo detectar adsorción de la proteína por el polímero.
En esta prueba, se rellenó una columna de 40 cm
\times 1 cm con partículas de polímero fluorado preparadas como
en el Ejemplo 14 y se identificaron posteriormente en un intervalo
de diámetro de partícula de 63 a 82 micrómetros. Se bombeó agua en
sentido descendente en la columna y se midió la relación de
expansión del lecho (relación de la profundidad del lecho a un
caudal dado frente a la profundidad del lecho sin circulación)
H_{e}/H_{o}, a varios caudales. Los resultados se resumen en la
Tabla 2.
Estos datos ilustran la utilización ventajosa de
las partículas de la invención, que proceden de su densidad mayor,
a saber, 1,2 g/ml frente a únicamente 1,09 g/ml para las partículas
poliméricas de la técnica anterior.
Ejemplos 19 a
27
Se realizaron una serie de pruebas para
determinar la estabilidad química de la resina absorbente preparada
como en el Ejemplo 3. Para esta serie, se pusieron a remojo 200 ml
de partículas de polímero fluorado preparadas como en el Ejemplo 14
en 2 ml del disolvente indicado. Se comprobó la fuga de Cibacron
Blue F3G-A a lo largo del tiempo controlando la
adsorbancia del sobrenadante a 620 nm. En la Tabla 3 se resumen las
concentraciones de colorante en seco medidas en el sobrenadante
después de 37 días.
Partículas de polímero preparadas como en los
Ejemplos 3 y 4 se colocaron de relleno a 1.600 psi en columnas de
acero inoxidable de 250 cm de longitud y 0,46 cm de diámetro
interior. El disolvente del sedimento fue metanol/isopropanol 50/50
en volumen. El disolvente de la mezcla de prueba del gradiente fue
acetonitrilo/agua 50/50 en volumen con TFA al 0,1%. La fase móvil
fue A = agua con TFA al 0,1%, B-acetonitrilo con
TFA al 0,1%. La mezcla de prueba fue Vitamina B-12
(1,0 mg), insulina bovina (3,0 mg), ribonucleasa A (3,0 mg),
albúmina humana (3,0 mg) y tiroglobulina (3,0 mg). En la Tabla 4 se
indican los tiempos de retención (minutos) comparando la eficacia
de las partículas metacrílicas con las partículas de polímero de
pentafluorestireno de la invención.
La correlación de los datos demostró que se
obtuvieron curvas suaves, simétricas y no solapadas. Por
consiguiente, los datos demuestran claramente que tanto el polímero
de pentafluorestireno no recubierto como las partículas de polímero
metacrílico fluorado no recubiertas son medios eficaces para la
separación cromatográfica de mezclas de materiales tales como las
proteínas.
Utilizando las columnas del Ejemplo 28 rellenas
con las partículas de resina polifluorada sin recubrir, se lavaron
las columnas con 60 volúmenes de columna de solución de hidróxido
de sodio 5,0 normal, seguido de 60 volúmenes de columna de agua
desionizada. Se volvieron a inyectar a continuación los solutos y
se observó el mismo gradiente que resultó en el Ejemplo 28. En
particular, la resina de lavado cáustico presentó la misma
retención que la resina que no había experimentado dicho lavado,
ilustrando de este modo la robustez de las partículas.
En el análisis de las características del
rendimiento de los adsorbentes de la invención y la comparación de
estas características con las propiedades de otros materiales
adsorbentes ampliamente utilizados, es evidente a partir de los
datos de la Tabla 5 anterior que los adsorbentes polifluorados de la
invención son uniformemente elevados en todas las propiedades
físicas y químicas que son vitales para su función.
A partir de los datos en la Tabla 6, se puede
observar fácilmente que los adsorbentes de la invención son
químicamente estables en un muy amplio intervalo de pH y presentan
una gran estabilidad mecánica. Los adsorbentes de la invención
presentan también excelente permeabilidad a las macromoléculas y de
forma deseable, propiedades de adsorción no específicas bajas.
Además, los adsorbentes reivindicados presentan una excelente
facilidad de derivación y una excelente resistencia a los efectos
corrosivos de las soluciones de NaOH 5 N. Ningunos de los demás
adsorbentes bien conocidos presentan dicho rendimiento uniformemente
excepcional en todas las propiedades funcionalmente importantes
relacionadas.
Se cultivó a alta densidad el huésped
(DH5-alfa) transformado por el plásmido (resistente
a Amp) en un medio enriquecido y el concentrado bacteriano se
sometió a un procedimiento de lisis alcalina. Se filtró el lisado y
a continuación se precipitó con 0,7 volúmenes de alcohol
isopropílico (IPA) enfriado con hielo por centrifugación a 8000
\times g durante 45 minutos. Se utilizó el líquido de la
centrifugación como muestra que se ha de cromatografiar.
Se rellenó una columna de la serie
Vantage-L (4,4 cm d.i.) con un concentrado
etanólico que contenía aproximadamente 90 ml de las partículas
descritas en el Ejemplo 3 (50 \mum, área superficial de 300/m/gm,
sin recubrir de PVA). Se rellenó la columna a aproximadamente 20
ml/min (aproximadamente 80 cm/h de caudal lineal) y se operó a 16
ml/min. Se controló el efluente de la columna a 260 nm y se detectó
la absorbancia en un registrador gráfico. Se equilibró la columna
con EQB (fosfato de potasio 0,1 pH 7, fosfato de tetrabutilamonio
(TBAP) 2 mM y etanol al 1%) y la muestra descrita anteriormente que
se ha de cromatografiar (valor de 30 mg) no se cargó hasta que el pH
del efluente fue inferior a 9. El tampón WB1 de lavado era 93%
cloruro de sodio/TRIS/EDTA, pH 8 y etanol al 7%. Los tampones de
elución fueron los siguientes: EL1 (tampón de elución 1) fue
fosfato de potasio 0,1 M, TBAP 2 mM, etanol al 10%; EL2 (tampón de
elución 2) fue fosfato de potasio 0,1 M, TBAP 2 mM, etanol al 12,5%
y EL3 (tampón de elución 3) fue fosfato de potasio 0,1 M, TBAP 2 mM
y etanol al 10%.
Se recogió la muestra 1 durante la carga y la
etapa de reequilibrado. Ningún ADN estaba presente en las
partículas en la columna de relleno.
Se recogió la muestra 2 mientras estaba pasando
WB1 a través de la columna y contenía la mayor parte del ARN y una
pequeña cantidad del ADN circular en cortes abierto.
Se recogieron las muestras 3 y 4 durante WB1. La
muestra 3 contenía una pequeña cantidad de ADN superenrollado, más
ADN circular en cortes/abierto y la última parte del ARN. La
muestra 4 contenía una pequeña cantidad de ADN.
La pérdida de ADN se puede reducir volviendo a
cortar en el contenido etanólico de WB1 o aumentando la
concentración de TBAP, esta última se prefiere ya que ésta puede
todavía permitir la selectividad de las especies por la
concentración de etanol en las muestras 4, 5 y 7.
La muestra 5 (EL1) contenía ADN superenrollado y
vestigios de ADN no superenrollado.
La muestra 6 (EL2) contenía la mayor parte del
ADN de la que más del 90% estaba superenrollado.
La muestra 7 (EL3) contenía el ADN residual del
que al menos el 25% no estaba superenrollado.
Se añadió gas nitrógeno a 400 ml de agua
destilada durante un período de 30 minutos para purgar el oxígeno
del agua. Se añadió alcohol polivinílico (3,9 g). Se mezclaron
conjuntamente pentafluoroestireno (30,9 g), divinilbenceno (55,0 g)
y ftalato de dibutilo (127 ml). Se añadieron a la mezcla monómeros
de azo-bis-isobutironitrilo (0,40
g) y peróxido de benzoilo (0,30 g). Se añadieron la mezcla de los
monómeros y los catalizadores de peróxido a una mezcla agitada de
agua y PVA. Se calentó la mezcla a 80ºC en agitación de 800 rpm en
una agitador de paletas, accionado a motor. Se dejó polimerizar la
mezcla durante un período de 4 horas después del cual se consideró
completa la polimerización. Se separaron las partículas de polímero
del agua, se lavaron y se secaron. Se eliminó el porógeno como en
el Ejemplo 1. Las partículas resultantes fueron porosas y
presentaban un tamaño de partícula de 50 \mum.
Claims (22)
1. Procedimiento para la preparación de
partículas esféricas porosas de absorbente de polímero fluorado,
que comprende las etapas siguientes:
(1) formación de una solución insoluble en agua
de compuestos orgánicos que comprende (a) un monómero seleccionado
de entre ésteres de alquilenglicol C_{2-4} de
ácido acrílico C_{3-6} y divinilbenceno; (b) un
monómero de vinilo polifluorado; (c) un monómero seleccionado de
entre ácido acrílico, ácido metacrílico y sus ésteres; (d) un
iniciador de radicales libres y (e) un material porógeno insoluble
en agua y soluble en disolventes orgánicos, siendo la relación en
peso de los comonómeros (a) más (b) más (c) respecto al material
porógeno de 0,5:1 a 2:1;
(2) formación de una solución diluida de un
agente dispersante en agua a partir de la cual se ha purgado
cualquier oxígeno con gas inerte;
(3) agitación y purga de gas inerte, dispersando
rápidamente la solución de compuestos inorgánicos insolubles en
agua de la etapa (1) en la solución acuosa diluida de la etapa (2)
y, en caso necesario, ajustar la temperatura de la dispersión entre
30 y 90ºC para iniciar la copolimerización de los monómeros, siendo
suficiente el nivel de energía de mezcla para dispersar la solución
de compuestos orgánicos insoluble en agua en la solución de la
etapa (2) en forma de gotitas de líquido con un diámetro medio no
superior a 10 a 300 \mum, estando al menos el 90% de las gotitas
dentro del 40% aproximadamente o por debajo del diámetro medio de
partícula;
(4) continuación de la agitación y de la purga de
oxígeno de la dispersión de la etapa (3) durante un tiempo
suficiente para efectuar la copolimerización completa de los
monómeros y la formación de partículas de las gotitas en forma de
partículas de polímero finamente divididas por precipitación del
copolímero en las mismas;
(5) separación de las partículas de copolímero
finamente divididas del medio de reacción de polimerización;
(6) extracción del material porógeno de las
partículas de copolímero separadas de la etapa (5) lavando las
partículas con disolvente orgánico inerte, formando de este modo
poros dentro del polímero; y
(7) secado de las partículas de copolímero
poroso.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el monómero (a) se selecciona de entre dimetacrilato de
etilenglicol, dimetacrilato de 1,3-propilenglicol,
dimetacrilato de 1,4-butanodiol, itaconato de
etilenglicol, diacrilato de etilenglicol y dimaleato de
etilenglicol.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el monómero (b) está perfluorado.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el monómero (b) se
selecciona de entre pentafluorestireno, itaconato de
bis-hexafluorisopropilo, maleato de
bis-hexafluorisopropilo, acrilato de
heptadecafluordecilo, metacrilato de perfluoroctilo, metacrilato de
2,2,3,3-tetrafluorpropilo, itaconato de
monotrifluoretilo, maleato de 2,2,2-trifluoretilo,
perfluoroctanoato de vinilbencilo y trifluoracetato de vinilo.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el monómero (c) se
selecciona de entre ácido acrílico, ácido metacrílico, ésteres
metílico, etílico e hidroxietílico del ácido acrílico o del ácido
metacrílico, ésteres que contienen epóxido del ácido acrílico o del
ácido metacrílico y aminoésteres del ácido acrílico o del ácido
metacrílico.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el material porógeno (e) se
selecciona de entre ftalato de dibutilo, isopropilbenceno, tolueno,
2-metil-4-pentanona,
2-metil-4-pentanol,
clorobenceno y mezclas de los mismos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que se realiza a una temperatura
comprendida entre 70 y 90ºC.
8. Solución insoluble en agua de compuestos
orgánicos que comprende (a) un monómero seleccionado de entre
ésteres de alquilenglicol C_{2-4} de ácido
acrílico C_{3-6} y divinilbenceno; (b) un monómero
de vinilo polifluorado; (c) un monómero seleccionado de entre ácido
acrílico, ácido metacrílico y sus ésteres; (d) un iniciador de
radicales libres y (e) un material porógeno insoluble en agua y
soluble en disolventes orgánicos, siendo la relación en peso de los
comonómeros (a) más (b) más (c) al material porógeno de 0,5:1 a
2:1.
9. Solución según la reivindicación 8, en la que
el monómero (a) es como el definido en la reivindicación 2.
10. Solución según la reivindicación 8 o la
reivindicación 9, en la que el monómero (b) es como el definido en
la reivindicación 3 o en la reivindicación 4.
\newpage
11. Solución según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en la que el monómero (c) es como el
definido en la reivindicación 5.
12. Solución según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en la que el monómero (e) es como el
definido en la reivindicación 6.
13. Partículas que se pueden obtener por
polimerización de una solución según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12.
14. Partículas que se pueden obtener por un
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
15. Partículas según la reivindicación 13 o la
reivindicación 14, recubiertas con un polímero hidrófilo.
16. Partículas según la reivindicación 15, en las
que el polímero hidrófilo es alcohol polivinílico.
17. Procedimiento para la separación
cromatográfica de los componentes separables de una solución
líquida, que comprende hacer pasar de la solución líquida a través
de un lecho de partículas según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 16.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, que
consiste en una separación en fase inversa.
19. Procedimiento según la reivindicación 17, que
consiste en una separación por afinidad.
20. Procedimiento según la reivindicación 17, que
se realiza en un lecho expandido.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, que comprende la adsorción en las
partículas de una molécula seleccionada de entre nucleótidos,
nucleósidos y polipéptidos.
22. Dispositivo médico que comprende partículas
según la reivindicación 15 o la reivindicación 16.
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