JP2000055897A - 充填剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質の選択的非吸着性を有し、薬物と
の分離能、耐久性が高く、使用ｐＨ範囲の広い血清試料
直接注入型の充填剤並びに除タンパク処理用充填剤また
は除タンパク前処理用充填剤及びその製造方法の提供。 【解決手段】 非架橋性モノマー、架橋性モノマー及び
前記モノマー類を溶解し、重合反応には不活性でかつ重
合体を溶解しない希釈剤の混合物を水性懸濁重合により
製造した多孔性架橋重合体（疎水性粒子）の表面に、３
ｍｅｑ／ｇ以上のアルコール性水酸基を有する、粒径が
１〜５００ミクロン、細孔径が４０〜１２０オングスト
ロームの多孔性架橋重合体からなる充填剤、その製造方
法及び液体クロマトグラフ用充填剤、除タンパク処理用
充填剤または除タンパク前処理用充填剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、選択的吸着または
非吸着用充填剤に関する。更に詳しくは、薬品、生体試
料の液体クロマトグラフィーによる分離分析や、薬物と
タンパク質を多量に含む生体試料中の除タンパク処理用
充填剤または除タンパク前処理用充填剤と、その製造方
法及びその使用法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来からクロマトグラフィー、特に液体
クロマトグラフィー（ＬＣということもある。）が血清
などの生体試料中に含まれる薬物の分析等に広く利用さ
れている。しかし血清などのように、タンパク質を多量
に含む生体試料の中に含まれる薬物のＬＣ分析において
は、このタンパク質の影響により分析カラムの分離能な
どが低下したり、分析カラムの寿命が短くなったりす
る。そのため試料の前処理として除タンパク操作が求め
られており、このような前処理操作は時間と労力を要し
煩雑である。またこのような前処理操作は分離精度ある
いは確度を損なう可能性を有している。

【０００３】そこで近年、除タンパク操作を行うことな
く直接血清試料などを注入し、この試料中に含まれる各
種薬物を分離・定量することが可能な充填剤が開発さ
れ、実用化されている（萩中 淳、薬物研究の進歩、
９、１２１〜１３１、（１９９３））。これらの充填剤
はいずれも、多孔性ガラスやシリカゲルを担体として、
その細孔の内側に疎水性を付与し、充填剤表面に親水性
を付与したものである。かかる充填剤では血清中の疎水
性巨大分子であるタンパク質（アルブミンやグロブリ
ン）は細孔内に入らず、かつ親水性の充填剤表面（細孔
外面）に吸着されることなく、カラムを素通りする。一
方薬物のような比較的小さな疎水性の分子は、疎水性の
細孔内表面に吸着され、分離されることになる。

【０００４】かかる充填剤の具体例として特開昭６０−
５６２５６号公報は、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基
を化学結合させたシリカ充填剤の外表面にタンパク質を
コートした充填剤を用いる提案がなされている。この充
填剤は、ＯＤＳ基結合シリカ充填剤充填カラムにウシ血
清アルブミンあるいは家兎血漿タンパクを吸着、変性さ
せることにより得られる。またこれと同様な性能を有す
る充填剤を製造する方法として、特開昭６１−６５１５
９号公報、及び特開平１−１２３１４５号公報に開示さ
れた発明がある。これらの方法は、充填剤の内表面及
び外表面に疎水性基を導入する。ついで、それ自身が
細孔内に侵入できない巨大分子である酵素を用いて外表
面の疎水性基だけを切断する。その後外表面に親水性
基を導入するというものである。

【０００５】具体的には、例えばグリセリルプロピル基
を導入した多孔性シリカを出発原料とし、これにカルボ
ニルジイミダゾールを介してオリゴペプチド（グリシル
−フェニルアラニル−フェニルアラニンなど）を結合さ
せ、タンパク質加水分解酵素であるカルボキシペプチタ
ーゼＡを用いて加水分解を行うことにより外表面のフェ
ニルアラニン側鎖を切断する方法が特開昭６１−６５１
５９号公報に提案されている。その結果、内表面には疎
水性リガンドとしてグリシル−フェニルアラニル−アラ
ニンが残り、外表面は親水性のグリシル−グリセリルプ
ロピル基となる。また多孔性シリカゲルの内表面のシラ
ノール基が、外表面のシラノール基に比べ反応性が低い
ことを利用し、多孔性シリカゲル粒子の内表面との反応
が実質的に無視できるように緩和な反応条件下で、該粒
子の外表面のシラノール基に親水性基を結合させる。次
に内表面のシラノール基との反応が円滑に進行する強い
反応条件下でシラノール基に疎水性基を結合させること
により、内表面には疎水性基、そして外表面には親水性
基を持つ充填剤が得られれることが特開平３−１０７７
５９号公報に提案されている。

【０００６】しかしながら、上述した充填剤の内、タン
パク質をコートしたＯＤＳシリカ充填剤では、使用が長
期間にわたると吸着・変性したタンパクが溶離を起こす
ことがあり、高分離効率のカラムが得られないなど、耐
久性や分離性能の点で問題を有している。また充填剤の
内表面及び外表面に疎水性基を有する化合物を導入し、
酵素反応を利用し外表面の疎水性基を切断する方法は、
工程が複雑化すると共に得られた充填剤の特性にバラツ
キが生じやすい欠点がある。これらのこれまで提案され
た血清試料直接注入型充填剤は、いずれもシリカゲルを
出発原料として使用したもので使用ｐＨ範囲が制限され
ており、また残存するシラノール基の影響を受け再現性
に乏しいなど、従来のシリカ系充填剤と共通の欠点を有
している。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来のシリカ系充填剤の持つ欠点を解決したものであり、
タンパク質の選択的非吸着性を有し、薬物との分離能、
耐久性が高く、使用ｐＨ範囲の広い血清試料直接注入型
の充填剤並びに除タンパク処理用充填剤または除タンパ
ク前処理用充填剤及びその製造方法を開発することを目
的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、［１］ 疎水
性粒子の表面に、アルコール性水酸基を有する、粒径が
１〜５００ミクロン、細孔径が４０〜１２０オングスト
ロームの多孔性架橋重合体からなる充填剤、［２］ 前
記アルコール性水酸基が３ｍｅｑ／ｇ以上有する多孔性
架橋重合体である前記［１］に記載の充填剤、

【０００９】［３］ 疎水性粒子の表面にエポキシ基と
反応性を有する官能基が導入された、粒径が１〜５００
ミクロン、細孔径が４０〜１２０オングストロームの多
孔性架橋重合体にエポキシ化合物を反応させ、疎水性粒
子表面にアルコール性水酸基を導入することを特徴とす
る充填剤の製造方法、［４］ 疎水性粒子が、非架橋性
モノマー、架橋性モノマー及び前記モノマー類を溶解
し、重合反応には不活性でかつ重合体を溶解しない希釈
剤の混合物を水性懸濁重合により製造した多孔性架橋重
合体である前記［３］に記載の充填剤の製造方法、
［５］ 疎水性粒子が、化学的修飾法によりエポキシ基
と反応する官能基を導入した多孔性架橋重合体である前
記［３］または［４］に記載の充填剤の製造方法、
［６］ 疎水性粒子が、非架橋性モノマー及び架橋性モ
ノマーのうち少なくともその１つのモノマーがエポキシ
基と反応する官能基を有するモノマーを共重合させ、エ
ポキシ基と反応する官能基が導入された多孔性架橋重合
体とした前記［３］または［４］に記載の充填剤の製造
方法、［７］ エポキシ化合物がグリシドールである前
記［３］〜［６］に記載の充填剤の製造方法、

【００１０】［８］ 前記［１］〜［７］のいずれかに
記載の充填剤からなる液体クロマトグラフ用、除タンパ
ク処理用または除タンパク前処理用充填剤、及び［９］
前記［１］〜［７］のいずれかに記載の充填剤を、液
体クロマトグラフ用充填剤、除タンパク処理用充填剤ま
たは除タンパク前処理用充填剤として使用する方法、を
開発することにより上記の目的を達成した。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の充填剤は、疎水性粒子の
表面にアルコール性水酸基を有する多孔性架橋重合体か
らなる。多孔性架橋重合体を構成するモノマーは実質的
には疎水性を示すモノマーからなり、化学修飾法などに
より疎水性粒子表面にエポキシ化合物と反応する官能基
を導入し、これをエポキシ化合物と反応させることによ
り粒子表面を親水性とし、細孔内表面を実質的に疎水性
の状態に保持したクロマトグラフ用充填剤である。ただ
しここで「疎水性」と「親水性」とはあくまで実質的な
ものであって、生体試料直接注入型充填剤あるいは除タ
ンパク前処理用充填剤としては、疎水性のタンパク質が
粒子表面で実質的に吸着されずに本発明充填剤のカラム
内を通過し、疎水性の薬物が充填剤細孔内表面で吸着さ
れる程度の「親水性」、「疎水性」を有していれば良
い。

【００１２】そしてそれは非架橋性モノマーと架橋性モ
ノマーを共重合して得られた多孔性架橋重合体粒子にエ
ポキシ化合物を反応させることにより、主として粒子表
面はエポキシ基との反応によりアルコール性水酸基で覆
われ、粒子内部は実質的に疎水性のモノマー類の組成基
からなっているもので、多孔性架橋重合体表面は親水性
となり、粒子内部は疎水性となり、粒子自体が２つの異
なった性質を有することになる。したがって本発明の充
填剤は、エポキシ化合物との反応によりアルコール性水
酸基を有する、粒径が１〜５００ミクロン、細孔径が４
０〜１２０オングストロームの多孔性架橋重合体からな
る充填剤により達成されることが明らかとなった。

【００１３】本発明の充填剤は、粒子表面にエポキシ基
と反応性を有する官能基が導入された、粒径が１〜５０
０ミクロン、細孔径が４０〜１２０オングストロームの
多孔性架橋重合体（疎水性粒子）にエポキシ化合物を反
応させることにより製造することができる。該多孔性架
橋重合体（疎水性粒子）は、非架橋性モノマー、架橋性
モノマー及び前記モノマー類を溶解し、重合反応には不
活性でかつ重合体を溶解しない希釈剤とからなる混合物
を公知の水性懸濁重合により容易に製造することができ
る。

【００１４】本発明で使用できる非架橋性モノマーとし
ては、実質的に疎水性を示すものであれば特に限定する
必要はなく、例えばスチレン、メチルスチレン、クロル
メチルスチレンのようなスチレン系モノマー；酢酸ビニ
ル、プロピオン酸ビニルのようなカルボン酸ビニル系モ
ノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）
アクリレート、プロピル（メタ）アクリレートなどが挙
げられる。上記多孔性架橋重合体（疎水性粒子）が疎水
性を保持できる範囲でかつ本発明の効果が損なわれない
量に限り、グリシジル（メタ）アクリレート、２−ヒド
ロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプ
ロピル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メ
タ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）ア
クリレートなど；マレイン酸、無水マレイン酸、２，３
−ジメチル無水マレイン酸、ジメチルマレイン酸、ジエ
チルマレイン酸のようなマレイン酸（エステル）系モノ
マー；（メタ）アクリル酸、クロトン酸などのカルボキ
シル基を有するモノマーなどを組み合わせて用いること
ができる。

【００１５】架橋性モノマーとしては、上記非架橋性モ
ノマーと共重合可能な例えば、エチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、プロピレングリコール（メタ）アク
リレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリ
レートのようなジ（メタ）アクリレートのような（メ
タ）アクリル酸エステル類；トリメチロールプロパント
リ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ
（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ
（メタ）アクリレートのような多価アルコールのポリ
（メタ）アクリレート；ジビニルベンゼン、ジビニルト
ルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレンなどの
２個以上のビニル基を有する芳香族系炭化水素などを用
いる。この非架橋性モノマーに対する、架橋性モノマー
の配合比は、モノマー類の種類、目的とする多孔性架橋
重合体の性質により一概に決定することはできないが、
通常は非架橋性モノマー１００重量部に対し、３０〜２
５０重量部、好ましくは７０〜１８０重量部程度であ
る。

【００１６】多孔性架橋重合体はあらかじめ、エポキシ
基と反応する官能基を有する非架橋性モノマーを架橋性
モノマーと公知の水性懸濁重合で共重合することにより
官能基に導入しておいてもよい。この組み合わせは多数
あるので用途、使用条件などに応じ適切な組み合わせを
選ぶことができる。この場合、多孔性架橋重合体が実質
的に疎水性を有するようにエポキシ化合物と反応する官
能基を有するモノマーの量を制限しておくことが大切で
ある。例えば２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレー
ト、グリセロールモノ（メタ）アクリレートのような水
酸基を持つ非架橋性モノマーをエチレングリコール（メ
タ）アクリレート、ジビニルベンゼンのような架橋性モ
ノマーと共重合することにより多孔性架橋重合体にエポ
キシ基と反応する官能基を付与してもよい。あるいは
（メタ）アクリル酸、クロトン酸のようなカルボキシル
基を有する非架橋性モノマーをエチレングリコール（メ
タ）アクリレート、ジビニルベンゼンのような架橋性モ
ノマーと共重合することによって、エポキシ基と反応す
る官能基であるカルボキシ基を有する多孔性架橋重合体
を製造してもよい。

【００１７】非架橋性モノマー及び架橋性モノマーのモ
ノマー類にエポキシ基と反応する官能基を有するモノマ
ーを有していない場合あるいはエポキシ基と反応する官
能基含有量がエポキシ化合物と反応させた時に水酸基含
有量を少なくとも３ｍｅｑ／ｇを達成できない組成の場
合には、重合反応終了後の多孔性架橋重合体に対してエ
ポキシ基と反応する官能基の導入を化学的修飾法で行う
ことが必要である。

【００１８】このエポキシ基と反応する官能基を導入す
る化学的修飾方法は公知の多数の方法があり、例えば限
定するわけではないが、 １）クロロメチルスチレンのようなクロロメチル基を持
つ非架橋性モノマーをエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、ジビニルベンゼンのような架橋性モノマー
と共重合することによって、クロロメチル基を持つ多孔
性架橋重合体を製造し、これを後でエポキシ基と反応す
る官能基に修飾する方法 ２）スチレンとジビニルベンゼンとの共重合によって得
られるような芳香族系の多孔性架橋重合体の粒子を濃硫
酸あるいはクロルスルホン酸と反応させることによりス
ルホン基を導入する方法、 ３）メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレートのようなアクリル酸エステルの非架橋性モノマ
ーとエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジビ
ニルベンゼンのような架橋性モノマーと共重合すること
によって得られた多孔性架橋重合体を加水分解すること
によりカルボキシル基を導入する方法、

【００１９】４）酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルのよ
うなカルボン酸ビニル系の非架橋性モノマーとエチレン
グリコールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン
のような架橋性モノマーと共重合することによって得ら
れた多孔性架橋重合体粒子を加水分解して水酸基を導入
する方法、 ５）グリシジル（メタ）アクリレートのようなエポキシ
基を有する非架橋性モノマーとエチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼンのような架橋
性モノマーとを共重合することにより得られた多孔性架
橋重合体粒子をアンモニアあるいはプロパンジアミンの
ようなアミノアルカン類と反応させることによりアミノ
基を導入する方法、 ６）グリシジル（メタ）アクリレートのようなエポキシ
基を有する非架橋性モノマーとエチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼンのような架橋
性モノマーとを共重合することによって得られた多孔性
架橋重合体粒子をポリエチレンイミンのような化合物と
反応させることによりイミノ基を導入する方法などがあ
り、処理の簡便性、確実性、充填剤の性能などから上記
２）の方法が好ましい。

【００２０】多孔性架橋重合体の多孔性を確保するた
め、重合に際し多孔形成剤として上記のモノマー類に希
釈剤を配合して行うことが必要である。該希釈剤として
は、原料モノマー類を溶解可能で、原料モノマー類とは
反応条件において均一に混合可能であるにもかかわらず
その重合体は溶解できないものであり、重合反応には不
活性な有機溶媒が使用できる。このような有機溶媒とし
ては、モノマー類の種類により異なるが、例えばトルエ
ン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼンの
ような芳香族系炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オク
タン、デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアル
コール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコールのよ
うなアルコール類；ジクロルメタン、ジクロルエタン、
トリクロルエタンのような脂肪族ハロゲン化炭化水素
類；酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、フタ
ル酸ジエチルのような脂肪族あるいは芳香族エステルな
どが用いられる。希釈剤の配合比は、モノマー類の種
類、目的とする多孔性架橋重合体の細孔サイズ及びその
密度などにより変わり一概に決定することはできない
が、通常はモノマー類１００重量部に対し、５０〜２０
０重量部程度混合して重合する。

【００２１】この場合に用いる重合開始剤としては、ラ
ジカルを発生する公知のラジカル重合開始剤を使用で
き、特に疎水性の重合開始剤であればそれ以外の制限は
ない。このような重合開始剤としては、過酸化ベンゾイ
ル、過酸化ラウロイルなどのような過酸化物系開始
剤、；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，
２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）の
ようなアゾ系開始剤のいずれも使用することができる。

【００２２】重合反応は適当な分散安定剤を含んだ水性
媒体中での通常の水性懸濁重合を適用することができ
る。この場合の分散安定剤としては、ゼラチン、ポリビ
ニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースのような
水溶性高分子化合物、アニオン、カチオン、非イオン性
の各種界面活性剤、炭酸カルシウム、りん酸カルシウム
のような難水溶性無機塩を用いることができる。これら
分散安定剤と共に、重合性モノマー類の水への溶解を抑
制するために、塩析剤として塩化ナトリウム、塩化カル
シウム、硫酸カリウムのような水溶性無機塩を併用する
ことができる。

【００２３】重合反応は、例えば上記のモノマー類、重
合開始剤及び希釈剤の混合物を、分散安定剤、更に必要
に応じて塩析剤の溶解した水相に添加し、窒素置換後、
攪拌しながら４０〜１００℃に加熱することにより懸濁
重合を行う。得られた多孔性架橋重合体粒子は、水また
は熱水で、更に有機溶媒などで洗浄し、粒子に付着して
いる分散安定剤さらには粒子内に存在している希釈剤及
び未反応モノマー類などを除去する。更に必要に応じて
粒子を分級することにより基材粒子が得られる。粒径は
目的により相当の幅があるので特に限定されないが通常
は１〜５００ミクロン、好ましくは２〜２００ミクロン
であり、細孔径は実質的にタンパク質を浸透させない口
径を持つ多孔性架橋重合体粒子であり、生体試料直接注
入型充填剤あるいは除タンパク処理用充填剤または除タ
ンパク前処理用充填剤である時は、エポキシ化合物と反
応した結果４０〜１２０オングストローム、更に好まし
くは６０〜１００オングストロームの細孔径を持つ多孔
性架橋重合体粒子である。

【００２４】このようにして得られた多孔性架橋重合体
粒子（化学修飾後の粒子も含む）はエポキシ基と反応す
る官能基を持つ重合体粒子である。この疎水性粒子にエ
ポキシ化合物、好ましくはグリシドールを反応させるこ
とにより、該粒子の外表面がアルコール性水酸基で覆わ
れ、細孔内は疎水性である２種類の性質を併せ持つ構造
の多孔性架橋重合体粒子となる。上記のエポキシ基と反
応する官能基としては、例えばスルホン基、カルボキシ
ル基、水酸基、アミノ基、イミノ基、クロロメチル基な
どを挙げることができる。充填剤とするためには、上記
の多孔性架橋重合体の粒子表面にある水酸基などのエポ
キシ化合物と反応する官能基をエポキシ化合物、特にグ
リシドールと反応させ、粒子外表面をアルコール性の水
酸基で覆い、外表面の親水性を高め、タンパク質の該粒
子への吸着や保持を防止する。

【００２５】該疎水性粒子の官能基とエポキシ化合物、
特にグリシドールとの反応は、該粒子とグリシドールを
分散混合することによって行うことができる。分散混合
の方法としてはグリシドールの単独溶液、あるいはグリ
シドールと相溶性のある有機溶媒に溶解したグリシドー
ル溶液に該粒子を分散混合することにより、またはグリ
シドールに相溶性ある有機溶媒に該粒子を分散混合した
中にグリシドールを添加する方法などにより行うことが
できる。グリシドールを添加する方法は特に限定され
ず、一括して添加する方法、数回に分割して添加する方
法、滴下して添加する方法、更には他の有機溶媒に溶解
したものを一括して添加する方法、これを数回に分けて
添加する方法などいずれの方法であってもよい。グリシ
ドールと相溶性ある有機溶媒としては、該粒子を混合分
散することができ、該粒子の持つ官能基とグリシドール
のエポキシ基との反応には不活性であれば特に限定する
ものでなく、例えばジメチルホルムアミド、ジオキサン
などを挙げることができる。

【００２６】上記のグリシドールと多孔性架橋重合体粒
子との反応に関して必要であれば適宜触媒を用いること
ができる。触媒としては、塩酸、硫酸のような無機強
酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのような強アル
カリ、トリエチルベンジルアンモニウムクロライドやテ
トラメチルアンモニウムクロライドのような四級アンモ
ニウム塩、ベンジルジメチルアミンやトリブチルアミン
のような三級アミン、２−メチル−４−エチルイミダー
ルや２−メチルイミダゾールのようなイミダゾール化合
物、更には三フッ化ホウ素、ホウフッ化亜鉛、塩化スズ
のようなルイス酸などを挙げることができる。本発明の
充填剤は、グリシドールとの反応によりアルコール性水
酸基が少なくとも３ｍｅｑ／ｇ、好ましくは５ｍｅｑ／
ｇ、より好ましくは８ｍｅｑ／ｇを有するように反応さ
せることが必要である。

【００２７】このような充填剤は、タンパク質のような
高分子のものはアルコール性水酸基により排除され吸着
されず、一方低分子の薬物は該充填剤に吸着され、それ
ぞれ分離される。充填剤として３ｍｅｑ／ｇ未満の水酸
基ではクロマトグラフ用充填剤としての分離能が不十分
となる。このような作用を有する本クロマトグラフ用充
填剤は、エポキシ化合物で処理する時に主として充填剤
粒子表面の官能基がエポキシ化合物と反応して、多孔性
架橋重合体粒子表面がアルコール基で覆われ親水性とな
り、一方粒子細孔内面は実質的に疎水性の性質を保持す
るため、細孔内に侵入できない疎水性の巨大分子である
タンパク質は粒子表面で吸着されずにカラムを素通り
し、比較的小さな分子の薬物は細孔内に侵入しここに吸
着されるため分離作用が発揮できるものと推定してい
る。本発明の充填剤は生体試料直接注入型クロマトグラ
フ用充填剤として、また除タンパク処理用充填剤または
除タンパク前処理用充填剤として極めて有効に使用でき
る。

【００２８】

【実施例】（実施例１） （工程１）多孔性架橋重合体粒子の重合 スチレン（非架橋性モノマー）１００ｇ、ジビニルベン
ゼン（架橋性モノマー）１５０ｇ及び２，２’−アゾビ
スイソブチロニトリル（重合開始剤）２．５ｇをトルエ
ン（希釈剤）２５０ｇに溶解した。この混合物を１．５
リットルの２％ポリビニルアルコール水溶液中に添加し
て、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下において６０
℃で６時間懸濁重合を行った。重合終了後生成物を熱水
及びアセトンで順次洗浄し、乾燥して粒径が１〜２０ミ
クロンの範囲の多孔性架橋重合体粒子を得た。得られた
多孔性架橋重合体は、ＮＩＰＰＯＮ ＰＮＥＵＭＡＴＩ
Ｃ ＭＦＧ社製、ＭＩＮＩ ＧＬＡＳＳＩＦＩＥＲを用
いて５〜１０ミクロンの粒度に調整した。

【００２９】（工程２）エポキシ基と反応する官能基の
導入 エポキシ基と反応する官能基を化学修飾するために、粒
度調整を行った該粒子３ｇに、氷酢酸７．５ｍｌを加え
混合した後、濃硫酸７５ｍｌを加え攪拌しながら７０℃
で５時間反応させた。反応終了後、グラスフィルターで
ろ過し、水洗して、スルホン基の導入された多孔性架橋
重合体粒子を得た。

【００３０】（工程３）グリシドールとの反応 グリシドールと反応させることにより、前記多孔性架橋
重合体の粒子表面をアルコール性水酸基基で覆うため
に、スルホン基の導入された粒子１ｇに対し３ｍｌのグ
リシドールを加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了
後、グラスフィルターでろ過し、水洗し、メタノールで
洗浄して本発明の充填剤を得た。反応終了後の粒子の重
量増加分から計算して、アルコール性水酸基の導入量は
約８ｍｅｑ／ｇと算定された。

【００３１】（実施例２）実施例１で作製した充填剤
を、内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍの液体クロマトグラ
フ用ステンレスカラムに充填した。このカラムを用いて
ヒト管理血清、カルバマゼピン及びヒト管理血清にカル
バマゼピンを添加したものの分離状況を調べた。移動相
は１００ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ −１００ｍＭ−Ｎａ₂ Ｈ
ＰＯ₄ −ＣＨ ₃ ＣＮ（４−４−２）を０．６ｍＬ／ｍｉ
ｎで送液し、検出はＵＶ ２５４ｎｍで行った。得られ
たクロマトグラムを図１、図２及び図３に示した。図１
ではヒト管理血清中のタンパク質のピークが注入後直ち
に溶出し、良好な除タンパク能を示している。図２では
カルバマゼピンのみを注入した時のピークであり、カル
バマゼピンがカラム内に保持され、遅れて溶出している
ことを示している。図３はヒト管理血清中のタンパク質
のピーク後に、カルバマゼピンのピークが見られ、血清
成分と良好に分離していることが見られる。

【００３２】 ［実験条件］ 溶離液 ：１００ｍＭ りん酸緩衝液／２０％アセトニトリル 流速 ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ 圧力 ：２２ｋｇ／ｃｍ² 検出器 ：ＵＶ ２５４×３２ サンプル及びサンプル量 図１ ：ヒト管理血清 ：８０μＬ 図２ ：カルバマゼピン：２０μＬ 図３ ：ヒト管理血清 ：８０μＬ＋カルバマゼピン：２０μＬ

【００３３】

【発明の効果】本発明の充填剤は、エポキシ基と反応す
る官能基を有する多孔性架橋重合体を基体とし、これに
エポキシ化合物を反応させることにより得られたもので
あって、酵素反応を用いずに製造するものである。また
原料的にシラノール基の影響を受けない有機高分子を使
用しているため、バラツキが小さく、極めて広いｐＨ領
域で安定に使用可能なクロマトグラフ用充填剤である。
製造は簡便でかつ再現性のある充填剤が得られる。更に
本発明の充填剤は高効率の分離能を有し、耐久性が高
く、血清試料直接注入型充填剤としてもまた除タンパク
処理用充填剤または除タンパク前処理用充填剤としても
極めて優れた性能を有するものである。本発明の充填剤
の効果としては、 １．充填剤が酵素反応などを用いることなく、化学反応
のみで簡便に製造することができること。 ２．今までのものは、シリカゲルを原料としていたが、
ポリマーゲルであるのでシリカゲルの持つ欠点が解消さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２のヒト管理血清中のタンパク質の溶出
状況のクロマトグラム。

【図２】実施例２において、カルバマゼピンのみのクロ
マトグラム。

【図３】ヒト管理血清中にカルバマゼピンを添加した時
のクロマトグラム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 広志 東京都港区芝大門一丁目13番９号 昭和電 工株式会社内 Ｆターム(参考） 4D017 AA11 BA07 CA13 CA14 CB01 DA03 DB02 EA01 4G066 AB03A AC14C BA09 BA20 CA20 DA11 FA08 FA09

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 疎水性粒子の表面にアルコール性水酸基
   を有する、粒径が１〜５００ミクロン、細孔径が４０〜
   １２０オングストロームの多孔性架橋重合体からなる充
   填剤。
2. 【請求項２】 前記アルコール性水酸基が３ｍｅｑ／ｇ
   以上有する多孔性架橋重合体である請求項１に記載の充
   填剤。
3. 【請求項３】 疎水性粒子の表面にエポキシ基と反応性
   を有する官能基が導入された、粒径が１〜５００ミクロ
   ン、細孔径が４０〜１２０オングストロームの多孔性架
   橋重合体にエポキシ化合物を反応させ、疎水性粒子の表
   面にアルコール性水酸基を導入することを特徴とする充
   填剤の製造方法。
4. 【請求項４】 疎水性粒子が、非架橋性モノマー、架橋
   性モノマー及び前記モノマー類を溶解し、重合反応には
   不活性でかつ重合体を溶解しない希釈剤の混合物を水性
   懸濁重合により製造した多孔性架橋重合体である請求項
   ３に記載の充填剤の製造方法。
5. 【請求項５】 疎水性粒子が、化学的修飾法によりエポ
   キシ基と反応する官能基を導入した多孔性架橋重合体で
   ある請求項３または４に記載の充填剤の製造方法。
6. 【請求項６】 疎水性粒子が、非架橋性モノマー及び架
   橋性モノマーのうち少なくともその１つのモノマーがエ
   ポキシ基と反応する官能基を有するモノマーを共重合さ
   せ、エポキシ基と反応する官能基が導入された多孔性架
   橋重合体とした請求項３または４に記載の充填剤の製造
   方法。
7. 【請求項７】 エポキシ化合物がグリシドールである請
   求項３〜６のいずれか１項に記載の充填剤の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の充
   填剤からなる液体クロマトグラフ用、除タンパク処理用
   または除タンパク前処理用充填剤。
9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の充
   填剤を、液体クロマトグラフ用充填剤、除タンパク処理
   用充填剤または除タンパク前処理用充填剤として使用す
   る方法。