ES2205830T3 - Egr-1 para la preparacion de un medicamento para tratar heridas. - Google Patents

Abstract

El uso de una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas en un mamífero, incluyendo el ser humano.

Description

Egr-1 para la preparación de un medicamento para tratar heridas.

Este invento se refiere al uso de polinucleótidos que codifican para el factor de transcripción de respuesta de crecimiento temprano-1 (Egr-1) en la fabricación de un medicamento para técnicas de terapia génica para la cicatrización de heridas y estados asociados. Más particularmente, se refiere a un nuevo uso del tratamiento de heridas, cicatrización de heridas y estados asociados tales como en el tratamiento de úlceras dérmicas que se derivan de isquemia y neuropatía asociada con diabetes, enfermedad oclusiva arterial periférica, trombosis de venas profundas, insuficiencia venosa crónica y llagas por presión, reducción de cicatrices postoperatorias asociadas con, por ejemplo, cataratas, procedimientos de injertos de piel en quemaduras, soriasis, aceleración de remodelación y regeneración tisular; reparación de tejidos duros, por ejemplo hueso, reparación de tejido blando, por ejemplo tendón, ligamento, músculo, promoción de la angiogénesis, reendotelización que sigue a una angioplastia coronaria transluminal percutánea, inhibición de hipertrofía cardíaca ventricular izquierda, modulación de la calcificación de la pared vascular y la promoción de la neuroregeneración.

Utilidades adicionales pueden incluir la inhibición de estados fibróticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar y hepática, y prevención de alopecia.

Los documentos de patente WO 94/23030 y US 5.206.152 describen las secuencias de ADN que codifican para las proteínas Egr-1 junto con métodos y materiales inmunológicos para la detección de proteínas Egr y métodos y materiales de hibridación para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos relacionados con la proteína Egr.

La cicatrización de la piel implica un amplio intervalo de acontecimientos celulares, moleculares, fisiológicos y bioquímicos. Durante el proceso de cicatrización, las células migran a los sitios de la herida en los que proliferan y sintetizan componentes de la matriz extracelular para reconstituir un tejido muy similar al original sin lesionar. Esta actividad se regula por mediadores secretados desde las células del borde de la herida tales como factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF) y otras citoquinas. Los efectos beneficiosos de estos agentes en las células han sido demostrados tanto in vitro como in vivo (revisados por Moulin, Eur. J. Cell Biol. 68; 1-7, 1995), que incluyen los beneficios de administrar PDGF en modelos de diabetes en ratas (Brown y otros J. Surg. Res. 56; 562-570, 1994).

Durante los últimos cinco años se ha demostrado que numerosos factores de crecimiento aceleran la proliferación celular in vitro y que promueven la cicatrización de heridas en modelos animales. El TGF beta ha recibido la mayor atención en el contexto de reparación de heridas ya que promueve la proliferación de células, diferenciación y la producción de matriz. El TGF beta administrado bien tópica o bien sistémicamente acelera la velocidad de la reparación de heridas cutáneas en modelos animales. (Ashcroft y otros Nature Medicine, 3; 1209-1215, 1997; Sporn y Roberts J. Cell Biol. 119; 1017-1021, 1997; Beck y otros J. Clin. Invest. 92; 2841-2849, 1993). Igualmente se ha documentado que el PDGF promueve la reepitelización y la revascularización en tejido isquémico y animales diabéticos (Uhl y otros Langenbecks Archiv fur Chirurgie-Supplement-Kongressband 114; 705-708, 1997 y revisado en Dirks y Bloemers Mol. Biol. Reports 22; 1-24, 1996).

El factor de transcripción Egr-1 es un regulador potencial de mas de 30 genes y juega un papel en el crecimiento, desarrollo y diferenciación (revisado en Liu y otros Crit. Rev. Oncogenesis 7; 101-125, 1996; Khachigian y Collins Circ. Res. 81; 457-461, 1997). El Egr-1 se induce tras una lesión al endotelio vascular (por ejemplo Khachigian y otros Science; 271, 1427-1431, 1996) y las dianas para la activación transcripcional son numerosos genes incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento A derivado de plaquetas (PDGF-A), el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), la inducción de PDGF A, PDGF B, TGF beta, bFGF, activador de uro-plasminógeno (u-PA), factor tisular e factor de crecimiento 2 de tipo insulina (IGF-2). El documento de patente WO 97/32979 proporciona un método de inhibir la proliferación de células que comprende inhibir la inducción o disminuir la expresión de Egr-1 o disminuir la acumulación nuclear o la actividad del producto génico de Egr-1 para reducir la incidencia de restenosis en un sujeto.

El complejo de transcripción que media la inducción del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es dependiente de AP2 y no de Egr-1 directamente (Gille y otros EMBO J 16; 750-759, 1997). Sin embargo, el PDGF B aumenta directamente la expresión de VEGF (Finkenzeller Oncogene 15; 669-676, 1997). La transcripción del mRNA de VEGF está potenciada por un número de factores incluyendo PDGF B, bFGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), EGF, factor de necrosis tumoral (TNF) alfa y TGF beta1. El VEGF ha sido usado para promover la reendotelización en la arteria lesionada por un catéter balón. Los datos obtenidos en conejos demostraron una clara pasividad de los stents metálicos impulsada por VEGF que efectúa una inhibición de la formación nueva de la túnica intima in-stent, una disminución en el acontecimiento de la oclusión trombótica, una aceleración de la reendotelización de la prótesis y un aumento en la actividad vasomotora (van Belle, E. y otros, Bichem. Biophys. Res. Comm., 235; 311-316, 1997; van Belle, E. y otros, J. Am. Coll. Cardiol., 29;1371-1379, 1997; Asahara, T., y otros, Circulation, 94; 3291-3302, 1997). La aprobación por el NIH para un estudio piloto de VEGF para promover la reendotelización en humanos fue concedida en 1996. Además, se ha demostrado también que el HGF promueve la reendotelización después de una angioplastia con catéter balón en un modelo de rata de lesión en la arteria carótida (Nakamura y otros., Resumen 1681, American Heart Association Meeting; Dallas, 1998). Se ha demostrado que en modelos animales, la pasividad impulsada por VEGF, inhibe la formación de túnica íntima nueva, acelera la reendotelización y aumenta la actividad vasomotora (Asahara y otros Circulation; 94, 3291-3302).

Le expresión de VEGF has sido documentada en cicatrización de heridas y piel soriática, ambos estados en los que el TGF alfa y su ligando, el receptor de EGF (EGFr) están aumentados. La expresión de EGF induce el Egr-1 (Iwami y otros Am. J. Physiol. 270; H2100-2107, 1996; Fang y otros Calcified Tissue International 57; 450-455, 1995; J.Neuroscience Res. 36; 58-65, 1993). Actualmente hay una evidencia anecdótica de que el Egr-1 puede activar la expresión de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) en linfocitos B estimulados con ésteres de forbol (Maltzman y otros Mol. Cell. Biol. 16; 2283-2294, 1996) y puede activar la expresión del TNF alfa en virtud de la presencia de un sitio de unión de Egr-1 en el promotor del TNF alfa (Kramer y otros Biochim. Biophys. Acta 1219; 413-421, 1994) Finalmente, los ratones deficientes en Egr-1 son infértiles y deficientes en hormona luteinizante (LH) (Lee y otros, Science 273; 1219-1221, 1996) lo que implica que el promotor de LH puede ser también una diana para la activación del Egr-1.

La carga ósea, estiramiento mecánico y flujo de fluidos de células de tipo osteoblástico MC3T3E1 inducen Egr-1 (Dolce y otros Archs. Oral Biol. 41; 1101-1118, 1996; Ogata J. Cell Physiol. 170; 27-34, 1997) con una activación concomitante de factores de crecimiento. La expresión de Egr-1 predomina en el cartílago y hueso del ratón en desarrollo (McMahon y otros Development 108; 281-287) y ha sido implicado en la regulación del crecimiento y diferenciación de células osteoblásticas (Chaudhary y otros Mol. Cell. Biochem. 156; 69-77, 1996). Egr-1 y el factor de transcripción de tipo dedos de zinc de tumor de Wilm 1 (WT1) íntimamente relacionado ha sido implicado en la regulación de la osteoclastogénesis (Kukita y otros Endocrinology 138; 4384-4389, 1997) y ambas prostaciclina E2 (PGE2) y EGF se inducen por Egr-1 (Fang y otros Calcified Tissue International 57; 450-455, 1995; Fang y otros Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 54; 109-114, 1996). La calcificación vascular es un proceso regulado activamente similar a la formación ósea que implica células y factores que se conoce que son importantes en la regulación del metabolismo óseo (revisado en Dermer y otros Trends Cardiovasc. Med. 4; 45-49, 1994). Los reguladores de la osteoblastogénesis y/u osteoclastogénesis pueden modular el grado de calcificación de la pared vascular.

Estímulos hipertróficos tales como carga hemodinámica y angiotensina II pueden usarse para impulsar la producción de dominante negativo de Egr-1 bajo el control de un promotor específico de miocitos y tienen aplicación en el tratamiento de fallo cardíaco.

El Egr-1 es esencial para la expresión de las células de Schwann del receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGF) (Nikam y otros Mol. Cell. Neurosciences 6; 337-348, 1995). El NGF induce la expresión de Egr-1 con una activación concomitante de factores de crecimiento (Kendall y otros Brain Research. Molecular Brain Research. 25; 73-79, 1994; Kujubu y otros Journal of Neuroscience Research 36; 58-65, 1993).

Se considera también que el Egr-1 tiene un papel en el estrés por corte del fluido. La activación por estrés de corte de fluidos de la transcripción del Egr-1 en células endoteliales y epiteliales humanas cultivadas se ha encontrado que está mediada por vía de la ruta de la proteína quinasa activada por mitógenos-quinasa relacionada con señal extracelular 1/2 (Schwachtgen y otros, 1998, J. Clin. Invest. 101 (11): 2540-2549).

Ahora se ha encontrado que la administración de un polinucleótido que codifica para el factor de transcripción Egr-1 en un sitio de herida, y subsiguiente expresión del mismo, promueve la cicatrización acelerada.

Así, según un primer aspecto del presente invento, se proporciona el uso de una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido del factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las heridas en un mamífero, incluyendo el ser humano.

Para la evasión de cualquier duda, la referencia a un polinucleótido es equivalente a cualquier referencia a una molécula de ácido nucleico.

Según un segundo aspecto, el invento proporciona una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las heridas.

En un tercer aspecto, el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para el Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables del mismo para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las heridas.

El presente invento se refiere así al uso terapéutico en el tratamiento de heridas de polinucleótidos que codifican para el factor de transcripción Egr-1. El invento se refiere también al uso terapéutico en el tratamiento de heridas de un factor de transcripción Egr-1 en sí mismo, como se describe en mayor detalle a continuación.

El invento se refiere al uso de los polipéptidos Egr-1 y secuencias de ácidos nucleicos que codifican para Egr-1 de cualquier origen o especie. Las secuencias proteicas están altamente conservadas entre especies, por ejemplo con 98% de homología entre rata y ratón. La secuencia de ADN de Egr-1 murina es conocida (Cell, 53 37-43 (1988)). La secuencia aminoacídica deducida muestra un marco de lectura abierto largo con un codon de parada (TAA) en la posición 1858. La secuencia aminoacídica deducida predice un polipéptido de 533 aminoácidos con un peso molecular de 56.596. Las secuencias correspondientes de otras especies pueden ser obtenidas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante cribado de bibliotecas genómicas o de cADN usando como sondas secuencias oligonucleotídicas basadas en o que se derivan de la secuencia de Egr-1 murina. Se sabe que el Egr-1 humano está localizado en el cromosoma 5, más precisamente en 5q23-31 (Cell 53, 37-43). La secuencia de cADN del Egr-1 humano está descrita en Nucleic Acids Research 18 p4283, 1990. La similitud entre las secuencias de ratón y de humano es de 87% y 94% en los niveles de nucleósidos y de proteína, respectivamente.

Las referencias a los polipéptidos y polinucleótidos de Egr-1 descritos de aquí en adelante son generalmente aplicables a las secuencias de cualquier origen, incluyendo el ADN de Egr-1 murino y las secuencias aminoacídicas correspondientes como está publicado en Cell, 53 37-43 (1988) y la secuencia humana como está publicada en Nucleic Acids Research 18 p4283, 1990 y a secuencias de otras especies. Como se describirá a continuación, el término Egr-1 también incluye variantes, fragmentos y análogos de Egr-1. Más preferiblemente, se usa la secuencia humana.

Las siguientes explicaciones ilustrativas se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados aquí. Las explicaciones son proporcionadas como una ventaja y no son limitantes del invento.

"El tratamiento de heridas" incluye el tratamiento de estados asociados con heridas, cicatrización de heridas y estados asociados y la terapia que promueve, aumenta o acelera la cicatrización de tejidos e incluye el tratamiento de úlceras de las extremidades en la diabetes y la enfermedad oclusiva arterial periférica, cicatrización postoperatoria, quemaduras, soriasis, aceleración de la remodelación tisular y reparación ósea y la promoción de la angiogénesis, reendotelización que sigue a la angioplastia coronaria transluminal percutánea, inhibición de la hipertrofia cardíaca ventricular izquierda, modulación de la calcificación de la pared vascular, y promoción de la neuroregeneración. Ello incluye además la inhibición de estados fibróticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar y hepática, y prevención de la alopecia.

Un "fragmento biológicamente activo" de Egr-1 como se refiere aquí es un fragmento que tiene actividad Egr-1, incluyendo propiedades de cicatrización de heridas según el presente invento.

"Un elemento genético" significa generalmente un polinucleótido que comprende una región que codifica para un polipéptido, o una región polinucleotídica que regula la replicación, la transcripción o la traducción u otros procesos importantes para la expresión del polipéptido en una célula hospedante, o un polinucleótido que comprende tanto una región que codifica para un polipéptido como una región unida operativamente al mismo que regula la expresión. Los elementos genéticos puede estar comprendidos dentro de un vector que replica como un elemento episomal; esto es, como una molécula físicamente independiente del genoma de la célula hospedante. Pueden estar comprendidos dentro de plásmidos. Los elementos genéticos pueden estar también comprendidos dentro de un genoma de la célula hospedante; no en sus estados naturales sino, más bien, después de manipulación tal como aislamiento, clonación e introducción en una célula hospedante en la forma de ADN purificado o en un vector, entre otros.

Una "célula hospedante" es una célula que ha sido transformada o transfectada, o es capaz de una transformación o transfección por una secuencia polinucleotídica exógena.

"Identidad", como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de afinidad de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, como se determina por el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias, la identidad puede ser fácilmente calculada (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing; Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Mientras que existe un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, el término es bien conocido para los profesionales expertos (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad entre las secuencias incluye, pero no se limita a lo descrito en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math, 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad están codificados en programas computerizados. Los métodos de programas computerizados preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, programa de empaquetamiento GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic acid Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F. y otros, J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)).

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir que, si está presente en la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido presente de manera natural o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término aquí. Como parte de o después del aislamiento, tales polinucleótidos pueden unirse a otros polinucleótidos, tales como ADNs, para mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o expresión en un hospedante, por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, solos o unidos a otras secuencias polinucleótidicas tales como en forma de vectores, pueden ser introducidos en células hospedantes, en cultivos o en organismos completos. Introducidos en células hopedantes en cultivo o en organismos completos, tales ADNs aún serían aislados, como se usa el término aquí, porque no estarían en su forma o entorno presente de manera natural, que no son composiciones presentes de manera natural, y ahí permanecen los polinucleótidos o polipéptidos aislados dentro del significado de ese término como se emplea aquí.

Los "polinucleótidos" se refieren generalmente a cualquier poliribonucleótido o polidesoxirebonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN o cADN modificado. Así, por ejemplo, los polinucleótidos como se usan aquí se refieren a, entre otros, ADN de hebra única y doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra única y doble o regiones de hebra única, doble y triple, ARN de hebra única y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de hebras únicas y dobles, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra única o, más típicamente, de hebra doble, o hebra triple, o una mezcla de regiones de hebra única y doble. Además, un polinucleótido como se usa aquí se refiere a regiones de tres hebras que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todo de una o más moléculas, pero más típicamente implican sólo una región de alguna de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice frecuentemente es un oligonucleótido. Como se usa aquí, el término polinucleótido incluye ADNs o ARNs como se describe anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Así, ADNs o ARNs con esqueletos modificados en lo que respecta a estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como pretende el término aquí. Por otro lado, ADNs o ARNs que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos como el término usado aquí. Se apreciará que una gran variedad de modificaciones han sido hechas al ADN y ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. El término polinucleótido como se emplea aquí abarca tales formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas, entre otras. Los polinucleótidos abarcan polinucleótidos cortos frecuentemente referidos como oligonucleótido(s).

Los "polipéptido(s)", como se usan aquí, incluyen todos los polipéptidos como se describe a continuación. La estructura básica de los polipéptidos es bien conocida y ha sido descrita en innumerables libros de texto y otras publicaciones en la técnica. En este contexto, el término se usa aquí para referirse a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos el uno al otro en una cadena lineal mediante enlaces peptídicos. Como se usa aquí, el término se refiere tanto a las cadenas cortas, que son también comúnmente referidas en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente son referidas en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Se apreciará que los polipéptidos contienen frecuentemente aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos comúnmente referidos como los 20 aminoácidos presentes de manera natural, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden estar modificados en un polipéptido dado, tanto mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, como también mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Aún las modificaciones comunes que tiene lugar de manera natural en los polipéptidos son demasiado numerosas para listarlas exhaustivamente aquí, pero están bien descritas en textos básicos y en monográficos más detallados, así como en una biblioteca de trabajos de investigación voluminosa, y son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en polipéptidos para usar en el presente invento están, por nombrar unos pocos ejemplos ilustrativos, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamientos, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de enlaces cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, iodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tales como arginilación, y ubiquitinación. Tales modificaciones son bien conocidas por aquellos con experiencia y han sido descritas en gran detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, están descritas en la mayoría de los textos básicos, tales como, por ejemplo PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993). Muchas revisiones detalladas están disponibles sobre este tema, tales como, por ejemplo, aquellas proporcionadas por Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL
COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983);Seifter y otros, Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) y Rattan y otros, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad.Sci. 663: 48-62 (1992). Se apreciará, como es bien conocido y como se observa anteriormente, que los polipéptidos no son siempre totalmente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser generalmente resultado de eventos postraduccionales, incluyendo eventos de procesamiento natural y eventos producidos por manipulación humana que no tienen lugar de manera natural. Los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden sintetizarse mediante procesos naturales no traduccionales y también, por métodos totalmente sintéticos. Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales aminoacídicas o los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo de un grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente, es común en polipéptidos presentes de manera natural y sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes también en polipéptidos del presente invento. Por ejemplo, el residuo amino terminal de polipéptidos hechos en E. coli u otras células, previo al procesamiento proteolítico, casi invariablemente será la N-formilmetionina. Durante la modificación postraduccional del péptido, un residuo de metionina en el extremo NH_{2}- puede ser delecionado. Consecuentemente, este invento contempla el uso de tanto la variante aminoterminal que contiene metionina como la que no contiene metionina de la proteína del invento. Las modificaciones que tienen lugar en un polipéptido serán frecuentemente una función de cómo está hecho. Para polipéptidos hechos expresando un gen clonado en un hospedante, por ejemplo, la naturaleza y alcance de las modificaciones estarán determinadas en gran parte por la capacidad de modificación postraduccional de la célula hospedante y las señales de modificación presentes en la secuencia aminoacídica del polipéptido. Por ejemplo, como es bien conocido, frecuentemente la glicosilación no tiene lugar en bacterias hospedantes tales como, por ejemplo, E. coli. Consecuentemente, cuando se desea la glicosilación, se debería expresar un polipéptido en un hospedante glicosilante, generalmente una célula eucariota. Las células de insecto frecuentemente llevan a cabo las mismas glicosilaciones postraduccionales como las células de mamífero y, por esta razón, los sistemas de expresión en células de insecto han sido desarrollados para expresar eficazmente proteínas de mamífero que tienen patrones naturales de glicosilación, entre otros. Similares consideraciones se aplican a otras modificaciones. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. En general, como se usa aquí, el término polipéptido abarca todas tales modificaciones, particularmente aquellas que están presentes en polipéptidos sintetizados de modo recombinante expresando un polinucleótido en una célula hospedante.

La(s) "variante(s)" de polinucleótidos o polipéptidos, como se usa el término aquí, son polinucleótidos o polipéptidos que difieren de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente. Las variantes en este sentido se describen a continuación y en otra parte en la presente descripción en mayor detalle. (1) Un polinucleótido que difiere en secuencia nucleotídica de otro, polinucleótido de referencia. Generalmente las diferencias son limitadas de modo que las secuencias nucleotídicas de la referencia y la variante son íntimamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Como se observa a continuación, los cambios en la secuencia nucleotídica de la variante pueden ser silenciosos. Esto es, que pueden no alterar los aminoácidos codificados por el polinucleótido. En los casos en que las alteraciones se limitan a cambios silenciosos de este tipo, una variante polinucleotídica codificará para un nucleótido con la misma secuencia aminoacídica como la referencia. También como se observa a continuación, los cambios en la secuencia nucleotídica de la variante polinucleotídica puede alterar la secuencia aminoacídica de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Tales cambios nucleotídicos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se trata a continuación. (2) Un polipéptido que difiere en la secuencia aminoacídica de otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de modo que las secuencias de la referencia y la variante son íntimamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y el polipéptido de referencia pueden diferenciarse en la secuencia aminoacídica por una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones, que pueden estar presentes en cualquier combinación.

"Tratamiento/terapia" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El tratamiento puede ser con respecto a un estado existente o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo).

"Comprender/tener" abarca cualquier cosa que consiste en un rasgo/característica específico, así como cualquier cosa con ese rasgo/característica, pero que también tiene uno o más rasgos/características adicionales. Así en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos/proteína que comprende/tiene una secuencia dada, la secuencia misma está abarcada, como lo están secuencias más largas.

"Homólogo" se usa para abarcar cualquier variante de una molécula biológicamente activa que tiene una o más actividades biológicas de esa molécula.

El invento se refiere a los usos terapéuticos de moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica para un polipéptido Egr-1. El invento se refiere también a usos terapéuticos de fragmentos de dicha secuencia polinucleotídica que codifica para fragmentos biológicamente activos de Egr-1 o variantes de la secuencia polinucleotídica que, en virtud de la degeneración del código genético, codifica para fragmentos funcionales, es decir, biológicamente activos, de Egr-1, y a variantes alélicas funcionalmente equivalentes y secuencias relacionadas modificadas por una sustitución, adición y/o deleción de bases única o múltiple, que codifican para polipéptidos que tienen actividad Egr-1.

Estos pueden ser obtenidos mediante procedimientos de clonaje estándar conocidos por las personas expertas en la técnica.

Los polinucleótidos que codifican para el factor de transcripción Egr-1 pueden estar en la forma de ADN, cADN o ARN, tales como mARN obtenidos mediante clonación o producidos por técnicas sintéticas químicas. El ADN puede ser de hebra única o doble. El ADN de hebra única puede ser la hebra codificante u homosentido, o puede ser la hebra no codificante o antisentido. Para uso terapéutico, el polinucleótido está en una forma capaz de ser expresada a un factor de transcripción Egr-1 funcional en el sitio de la herida en el sujeto que se ha de tratar. Los polinucleótidos pueden ser usados también para la producción in vitro del polipéptido Egr-1 para administración en un aspecto terapéutico adicional del invento, como se describe en detalle a continuación.

Los polinucleótidos del presente invento que codifican para un polipéptido del factor de transcripción Egr-1 pueden incluir, pero no se limitan a, la secuencia codificante para el polipéptido Egr-1 o fragmentos biológicamente activos del mismo. Así, el polinucleótido puede ser proporcionado junto con secuencias no codificantes adicionales; incluyendo, por ejemplo pero no limitado a ello, secuencias en 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripción (incluyendo señales de terminación, por ejemplo), unión a ribosomas, elementos de estabilización del mARN, y secuencias codificantes adicionales que codifican para aminoácidos adicionales, tales como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales. Los polinucleótidos del invento incluyen también, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural para el Egr-1 y sus elementos genéticos asociados de manera natural.

De acuerdo con lo anterior, el término "polinucleótido que codifica para un polipéptido" como se usa aquí abarca los polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica para un polipéptido del factor de transcripción Egr-1. El término abarca los polinucleótidos que incluyen una región continua única o regiones discontinuas que codifican para el polipéptido (por ejemplo, interrumpido por un fago o una secuencia de inserción o de edición integradas) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

El presente invento se refiere además a variantes de los polinucleótidos anteriormente descritas aquí que codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido. Una variante del polinucleótido puede ser una variante presente de manera natural tal como una variante alélica presente de manera natural, o puede ser una variante que no se conozca que esté presente de manera natural. Tales variantes que no están presentes de manera natural pueden ser hechas mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a polinucleótido, células u organismos.

Entre las variantes a este respecto están las variantes que difieren de los polinucleótidos anteriormente mencionados por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones codificantes o no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones aminoacídicas conservativas o no conservativas.

Las realizaciones adicionales preferidas del invento son polinucleótidos que son al menos 70% idénticos a lo largo de su longitud total a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica expuesta en Cell 53 37-43 (1988) (la secuencia de ratón), más preferiblemente al menos 70% idénticas a lo largo de la longitud total a un polinucleótido que codifica para secuencia de cADN humana y los polinucleótidos complementarios a la misma (la secuencia humana) en Nucleic Acids Research 18 4283, 1990 y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Alternativamente, los más altamente preferidos son los polinucleótidos que comprenden una región que es al menos un 80% idéntica a lo largo de su longitud total a la de un polinucleótido que codifica para un polipéptido del presente invento. A este respecto, los polinucleótidos que son al menos un 90% idénticos a lo largo de su longitud total al mismo son particularmente preferidos, y entre esos polinucleótidos particularmente preferidos, aquellos con al menos 95% son especialmente preferidos. Adicionalmente, aquellos con al menos un 97% son sumamente preferidos entre aquellos con al menos 95%, y entre éstos aquellos con al menos un 98% y al menos un 99% son en particular sumamente preferidos, siendo con al menos un 99% los más preferidos.

Las realizaciones preferidas a este respecto son, por otro lado, polinucleótidos que codifican para polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o actividad como el polipéptido maduro de Egr-1 codificado por la secuencia de ADN murina en Cell 53 37-43 (1988), más preferiblemente los codificados por la secuencia humana en Nucleic Acids Research 18 4283, 1990.

El presente invento se refiere además a los polinucleótidos que hibridan con las secuencias anteriormente descritas aquí. A este respecto, el presente invento se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos anteriormente descritos aquí. Como se usa aquí, el término "condiciones rigurosas" significa que la hibridación tendrá lugar si hay al menos un 95% y preferiblemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Preferiblemente, las secuencias que hibridan de esta manera con la secuencia del invento codifican para un polipéptido que tiene la actividad biológica del Egr-1.

Los polinucleótidos pueden codificar para un polipéptido que es la proteína madura mas aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo terminal. Tales secuencias adicionales pueden jugar un papel por ejemplo, pueden alargar o acortar la vida media de una proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o para producción, entre otras cosas. Como es el caso generalmente in vivo, los aminoácidos adicionales pueden ser procesados y eliminados de la proteína madura por enzimas celulares.

Los polinucleótidos para uso en la fabricación de un medicamento para el aspecto de terapia génica del invento pueden ser proporcionados solos, o como parte de un vector, tales como un vector de expresión, ejemplos que son bien conocidos en la técnica.

Un polinucleótido que codifica para el Egr-1 puede usarse terapéuticamente en la fabricación de un medicamento para el uso del invento por medio de terapia génica en el que los polinucleótidos que van a ser administrados a un sitio de herida o a otros tejidos son necesarios para la cicatrización en una forma en que es capaz de dirigir la producción de Egr-1, o un fragmento biológicamente activo del mismo, in situ. Se cree que el Egr-1 actúa para promover la cicatrización de heridas activando genes implicados en la cicatrización de heridas, tales como genes para VEGF, PDGF, EGF, TGF beta, factor de crecimiento de fibroblastos básico, UPA y factor tisular.

Preferiblemente en terapia génica, el polinucleótido que va a ser administrado de tal modo que se exprese en el sujeto que va a ser tratado por ejemplo en la forma de una molécula de ADN recombinante comprende un polinucleótido que codifica para el Egr-1 unido operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que controla la expresión, tal como en un vector de expresión. Tal vector incluirá así las señales de control transcripcional apropiadas incluyendo una región promotora capaz de expresar la secuencia codificante, siendo dicho promotor operativo en el sujeto que va a ser tratado. Así para terapia génica humana, el promotor, término que incluye no sólo la secuencia necesaria para dirigir a la ARN polimerasa al sitio de inicio de la transcripción, sino también, si es apropiado, otras secuencias operativas o controladoras que incluyen potenciadores, es preferiblemente una secuencia promotora humana de un gen humano, o de un gen que está expresado típicamente en humanos, tales como el promotor de citomegalovirus humano (CMV). Entre los promotores eucariotas conocidos adecuados a este respecto están el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de la timidina quinasa de HSV, los promotores tempranos y tardíos de SV40, los promotores de LTRs retrovirales, tales como aquellos del virus del sarcoma de Rous ("RSV"), y promotores de metalotioneína, tales como el promotor de la metalotioneína-1 de ratón.

Como se trata en más detalle a continuación, el promotor Egr-1 nativo puede ser usado. Los presentes inventores han encontrado que la secuencia publicada proporcionada para el promotor Egr-1 humano no es correcta y han proporcionado una secuencia nueva con diversas diferencias de dicha secuencia publicada.

Una secuencia polinucleotídica y secuencia de control transcripcional pueden ser proporcionadas clonadas en un vector plasmídico replicable, basado en plásmidos disponibles comercialmente, tales como pBR322, o puede ser construida de plásmidos disponibles mediante aplicación rutinaria de procedimientos publicados, bien conocidos.

El vector puede incluir también señales de control transcripcional, situados 3' a la secuencia codificante Egr-1, y también señales de poliadenilación, reconocibles en el sujeto que va a ser tratado, tal como, por ejemplo, las secuencias correspondientes de virus tales como, para tratamiento humano, el virus SV40. Otras secuencias de control transcripcional son bien conocidas en la técnica y pueden ser usadas.

Los vectores de expresión pueden incluir también marcadores de selección, tales como para resistencia a antibióticos, que permiten a los vectores que se propaguen.

Los vectores de expresión capaces de sintetizar Egr-1 in situ pueden ser introducidos en el sitio de la herida directamente mediante métodos físicos. Ejemplos de estos incluyen aplicaciones tópicas de vectores de ácidos nucleicos "desnudos" en un vehículo apropiado por ejemplo en disolución en un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como tampón fosfato salino (PBS), o administración del vector mediante métodos físicos tales como bombardeo de partículas, también conocido como tecnología de "pistolas génicas", de acuerdo con métodos conocidos en la técnica por ejemplo como se describen en el documento de patente norteamericana US-5371015 en el que las partículas inertes, tales como bolitas de oro recubiertas con el vector son aceleradas a velocidades suficientes para permitirles penetrar la superficie en el sitio de la herida, por ejemplo, células de la piel, por medio de descargas a alta presión a partir de un dispositivo proyector. (Las partículas recubiertas con una molécula de ácidos nucleicos del presente invento están dentro del alcance del presente invento, como son los aparatos que comprenden tales partículas).

Otros métodos físicos de administrar el ADN directamente al recipiente incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsiembra.

Es particularmente preferido el modo de reparto de microsiembra que es un sistema para repartir el material genético en células in situ en un paciente. Este método está descrito en el documento de patente norteamericana US Patent Nº 5.697.901.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica para Egr-1 para usar en la fabricación de un medicamento para el uso del invento puede ser también administrado por medio de vectores de reparto. Estos incluyen vectores de reparto virales, tales como vectores de reparto adenovirales o retrovirales conocidos en la técnica.

Otros vectores de reparto no virales incluyen vectores de reparto lipídico, incluyendo vehículos de reparto de liposomas, conocidos en la técnica.

Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el Egr-1 puede ser también administrada al sitio de la herida por medio de células hospedantes transformadas. Tales células incluyen células recogidas del sujeto, en las que la secuencia de ácidos nucleicos se introduce por métodos de transferencia génica conocidos en la técnica, seguidas por el crecimiento de las células transformadas en cultivo e injertadas al sujeto.

Las construcciones de expresión tales como las descritas anteriormente pueden ser usadas en una variedad de maneras en el uso del presente invento. Así, pueden ser administradas directamente al sitio de la herida en el sujeto, o pueden ser usadas para preparar el factor de transcripción Egr-1 recombinante mismo que puede ser entonces administrado al sitio de la herida como se trata en más detalle a continuación. El invento también se refiere al uso de construcciones que comprenden el polinucleótido o polinucleótidos de Egr-1 del presente invento o elementos genéticos definidos de aquí en adelante, en los usos terapéuticos del invento. Estas construcciones pueden ser usadas per se en los métodos terapéuticos del invento o pueden ser usados para preparar un polipéptido Egr-1 para usar en los métodos terapéuticos del invento descritos en mayor detalle a continuación.

El vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector de un fago de hebra única o doble, un vector de virus ARN o virus ADN de hebra única o doble, dependiendo de si el vector va a se administrado directamente al sitio de la herida (es decir, mediante síntesis de Egr-1 in situ), o si va a ser usada para síntesis de Egr-1 recombinante. Los plásmidos de partida descritos aquí están, bien disponibles comercialmente, bien disponibles públicamente, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles mediante aplicación rutinaria de procedimientos publicados, bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que pueden ser usados de acuerdo con el presente invento son bien conocidos y están fácilmente disponibles para aquellos con experiencia en la técnica.

Generalmente, los vectores para expresar un polipéptido Egr-1 para usar en el invento comprenden regiones de control que actúan en cis eficaces en lo que se refiere a la expresión en un hospedante unido operativamente al polinucleótido que va a ser expresado. Los factores que actúan en trans apropiados son, bien suministrados por el hospedante, bien suministrados por un vector complementario o bien suministrado por el vector mismo tras la introducción en el hospedante.

En ciertas realizaciones a este respecto, los vectores mantienen la expresión específica. Para la producción de Egr-1 recombinante, tal expresión específica puede ser una expresión inducible o expresión sólo en ciertos tipos de células o ambas inducible y específicas de células. Son particularmente preferidos entre los vectores inducibles los vectores que pueden ser inducidos para la expresión por factores ambientales que son fáciles de manipular, tales como la temperatura y aditivos nutricionales. Una variedad de vectores adecuados a este aspecto del invento, que incluyen vectores de expresión constitutivos e inducibles para usar en hospedantes procariotas y eucariotas, son bien conocidos y son empleados rutinariamente por aquellos con experiencia en la técnica.

Una gran variedad de vectores de expresión pueden ser usados para expresar el Egr-1 para usar en el invento. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores de cromosomas, de episomas y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos de cromosomas de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, de virus de vaccinia, adenovirus, virus pox de ave, virus de pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos, todos puede ser usados para expresión de acuerdo con este aspecto del presente invento. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un polipéptido en un hospedante puede ser usado para expresión a este respecto.

La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

La secuencia de ácidos nucleicos en el vector de expresión está unida operativamente a la(s) secuencia(s) de control de la expresión apropiada(s), incluyendo, por ejemplo, un promotor que dirija la transcripción del mARN. Representantes de tales promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, para expresión recombinante, y los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de LTRs retrovirales para expresión in situ.

En general, las construcciones de expresión contendrán sitios para el inicio y terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los tránscritos maduros expresados por las construcciones incluirán un sitio AUG de inicio de la traducción al inicio y un codon de terminación apropiadamente posicionado en el extremo del polipéptido que va a ser traducido.

Además, las construcciones pueden contener regiones de control que regulan así como que engendran la expresión. Generalmente, de acuerdo con muchos procedimientos practicados de modo común, tales regiones operarán controlando la transcripción, tales como factores de transcripción, sitios de unión al represor y terminación, entre otros.

Los vectores para la propagación y expresión incluirán generalmente marcadores de selección y regiones de amplificación, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A
LABORATORY MANUAL, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Ejemplos representativos de hospedantes apropiados para la expresión recombinante de Egr-1 incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, E. coli, estreptomices y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales.

Los siguientes vectores, que están disponibles comercialmente, se proporcionan a modo de ejemplo. Entre los vectores preferidos para usar en bacterias están el pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia, y pBR322 (ATCC 37017). Entre los vectores eucarióticos preferidos están los pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Estos vectores que pueden usarse tanto para expresión recombinante como para expresión in situ están listados únicamente a modo de ilustración de los muchos vectores disponibles comercialmente y bien conocidos que están disponibles para aquellos con experiencia en la técnica para usar de acuerdo con este aspecto del presente invento. Se apreciará que cualquier otro plásmido o vector adecuado para, por ejemplo, introducción, mantenimiento, propagación o expresión de un polinucleótido o polipéptido para usar en la terapia del invento en un hospedante puede ser usado en este aspecto del invento.

Ejemplos de vectores para usar en este aspecto del invento incluyen vectores de expresión en los que la secuencia de cADN del Egr-1 se inserta en un plásmido mediante el cual la expresión génica es impulsada desde el promotor-potenciador de citomegalovirus temprano inmediato humano (Foecking and Hofstetter, Cell, 45, 101-105, 1986). Tales plásmidos de expresión pueden contener señales de procesamiento de ARN de SV40 tales como señales de poliadenilación y de terminación. Construcciones de expresión que usan el promotor CMV y que están disponibles comercialmente son pCDM8, pcADN1 y derivados, pcADN3 y derivados (Invitrogen). Otros vectores de expresión disponibles que pueden ser usados son pSVK3 y pSVL que contienen el promotor y el sitio de corte y empalme del mARN y las señales de poliadenilación del SV40 (pSVK3) y señales de procesamiento VP1 del SV40 (pSVL; vectores de Pharmacia).

Las regiones promotoras pueden ser seleccionadas de cualquier gen deseado usando vectores que contienen una unidad de transcripción reportera a la que le falta la región promotora, tal como una unidad de transcripción de la cloranfenicol acetil transferasa ("CAT"), aguas abajo del sitio o sitios de restricción para introducir un fragmento del promotor candidato, es decir, un fragmento que puede contener un promotor. Como es bien conocido, la introducción en el vector de un fragmento que contiene el promotor en el sitio de restricción aguas arriba del gen cat engendra la producción de la actividad CAT, que puede ser detectada mediante ensayos CAT estándar. Los vectores adecuados a este fin son bien conocidos y fácilmente disponibles, tales como pKK232-8 y pCM7. Los promotores para le expresión de polinucleótidos para usar en la terapia del presente invento incluyen no sólo promotores bien conocidos y fácilmente disponibles, sino también promotores que pueden ser obtenidos fácilmente mediante las técnicas anteriores, usando un gen reportero; para expresión in situ, sería deseable que tal promotor fuera reconocido en el sujeto que se va a tratar.

Entre los promotores procariotas conocidos adecuados para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la terapia del presente invento están los promotores de E. coli lacI y lacZ, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores Pr y PL de lambda y el promotor trp.

Los vectores de expresión recombinantes incluirán, por ejemplo, orígenes de replicación, un promotor derivado preferiblemente de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo, y un marcador de selección para permitir el aislamiento de un vector que contiene células después de la exposición al vector.

Los polinucleótidos para usar en el invento, que codifican para la secuencia estructural heteróloga de un polipéptido del invento serán insertadas generalmente en el vector usando técnicas estándar de modo que estén operablemente unidas al promotor para expresión. El polinucleótido se posicionará de modo que el sitio de inicio de la transcripción esté localizado apropiadamente 5' de un sitio de unión a ribosoma. El sitio de unión a ribosoma estará 5' al AUG que inicia la traducción del polipéptido que va a ser expresado.

Generalmente, no habrá otros marcos de lectura abierta que empiecen con un codon de iniciación, normalmente AUG, y que se encuentre entre el sitio de unión al ribosoma y el codon de iniciación. También, generalmente, habrá un codon de parada de la traducción en el extremo del polipéptido y habrá una señal de poliadenilación en construcciones para usar en hospedantes eucariotas. La señal de terminación de la transcripción dispuesta apropiadamente en el extremo 3' de la región transcrita puede estar también incluida en la construcción polinucleotídica.

Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el medio extracelular, las señales de secreción apropiadas pueden incorporarse en el polipéptido expresado cuando se sintetiza de modo recombinante. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede ser añadida al extremo N- o C- terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula hospedante, durante la purificación o durante el subsiguiente manejo y almacenaje. También, la región puede ser añadida también al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden ser eliminadas previo a la preparación final del polipéptido. La adición de los restos peptídicos a polipéptidos para engendrar la secreción o excreción, para mejorar la estabilidad o para facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de la inmunoglobulina que es útil para solubilizar o purificar polipéptidos. Típicamente las células son entonces recogidas mediante centrifugación, rotas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante conservado para una purificación adicional.

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Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden ser rotas mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o uso de agentes de lisis celular, tales métodos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Los vectores de expresión en mamíferos pueden comprender un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, regiones de poliadenilación, sitios de corte y empalme de donantes y aceptores, secuencias de terminación transcripcionales, y secuencias flanquentes en 5' no transcritas que son necesarias para la expresión.

Para preparar los polipéptidos Egr-1 para usar en el invento se pueden usar hospedantes modificados por ingeniería genética. La introducción de polinulceótidos en la célula hospedante puede ser efectuada mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspado, introducción balística, infección u otros métodos. Tales métodos están descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis y otros BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^{nd} ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1(1989).

Las proteínas maduras pueden ser expresadas en las células hospedantes incluyendo células de mamíferos tales como células CHO, en levaduras, en bacterias, o en otras células bajo el control de promotores adecuados. Sistemas de traducción libres de células pueden ser también empleados para producir tales proteínas usando ARNs derivados de construcciones de ADN del presente invento. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usar con hospedantes procariotas y eucariotas están descritos por Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^{nd} ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1(1989).

Los polipéptidos pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografia en fosfocelulosa, cromatografia de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografia en hidroxiapatito y cromatografía en lectina. Más preferiblemente, se emplea la cromatografía líquida de alto rendimiento para purificación. Las técnicas bien conocidas para el plegado proteico pueden ser empleadas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o purificación.

Para terapia, un polinucleótido que codifica para Egr-1, por ejemplo, en la forma de un vector recombinante, puede ser purificado mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como por medio de cromatografía en columna como se describe en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^{nd} ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Como se indica anteriormente, el Egr-1 puede ser administrado en el sitio de la herida bien como un ácido nucleico que codifica para Egr-1 que se transcribe y traduce a Egr-1 en el sitio mismo de la herida en una forma de terapia génica, o bien el factor de transcripción mismo puede ser administrado directamente.

Así, según un cuarto aspecto del invento, se proporciona el uso de un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento del mismo biológicamente activo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas en un mamífero, incluyendo humanos.

En un quinto aspecto, el invento proporciona el uso de un factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo para la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento de las heridas y en cicatrización de heridas.

En un sexto aspecto, el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende el factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables del mismo para el uso en el tratamiento de las heridas.

Como se usa aquí, el término "polipéptido factor de transcripción Egr-1" incluye el factor de transcripción Egr-1 producido de modo natural y recombinante, análogos del polipéptidos naturales, sintéticos y biológicamente activos o variantes o derivados del mismo o fragmentos biológicamente activos del mismo y variantes, derivados y análogos de dichos fragmentos.

La proteína factor de transcripción Egr-1 incluyendo fragmentos biológicamente activos del factor de transcripción Egr-1 puede ser generada y/o aislada mediante técnicas generales conocidas en la técnica.

El Egr-1 y los fragmentos anteriormente mencionados y derivados de los mismos para usar en el invento pueden extraerse de fuentes naturales mediante métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen purificación por medio de cromatografía de afinidad de secuencias específicas de ADN usando métodos tales como los descritos en Briggs y otros, Science 234, 47-52, 1986, usando un oligonucleótido de unión a ADN que reconoce Egr-1. El polipéptido puede prepararse también mediante métodos de tecnología de ADN recombinante conocidos en la técnica como se describe anteriormente, es decir, mediante la expresión en células hospedantes de las construcciones descritas. Alternativamente, los polipéptidos del invento pueden ser producidos sintéticamente mediante sintetizadores peptídicos convencionales.

El invento también se refiere a los usos de los fragmentos, análogos y derivados de Egr-1. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" significan un polipéptido que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica como tal polipéptido. Así, un análogo incluye una proproteína que puede ser activada por corte de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

El fragmento, derivado o análogo del polipéptido puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos aminoacídicos están sustituidos con un residuo aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente, un residuo aminoacídico conservado) y tal residuo aminoacídico sustituido puede estar codificado o no por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilénglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para purificación del polipéptido maduro o una secuencia proproteica. Tales fragmentos, derivados y análogos se considera que están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas aquí.

Entre las variantes preferidas están aquellas que varían desde el Egr-1 presente de manera natural mediante sustituciones aminoacídicas conservativas. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Vistos típicamente como sustituciones conservativas son los remplazamientos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile: intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, cambio de los residuos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, cambio de los residuos básicos Lys y Arg y remplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.

Además, particularmente preferidos en este respecto son variantes, análogos, derivados y fragmentos, y variantes, análogos y derivados de los fragmentos, que tienen la secuencia aminoacídica del polipéptido en el que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 ó residuos no aminoacídicos se sustituyen, eliminan o añaden, en cualquier combinación. Especialmente preferidos entre estos son las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido del presente invento. También, especialmente preferidos en este respecto son las sustituciones conservativas.

Los fragmentos particularmente preferidos son los fragmentos biológicamente activos, es decir, fragmentos que conservan las propiedades de cicatrización de las heridas del polipéptido parental.

Los polipéptidos y polinucleótidos útiles en el presente invento son proporcionados preferiblemente en una forma aislada, y son preferiblemente purificados para la homogeneidad.

Los polipéptidos Egr-1 para usar en el presente invento incluyen el polipéptido Egr-1 así como polipéptidos que tienen al menos el 70% de identidad, preferiblemente al menos 80% de identidad y más preferiblemente al menos 90% más identidad y todavía más preferible al menos 95% de similitud (todavía más preferiblemente al menos 99% de identidad) a la secuencia polipeptídica murina como está expuesta en Cell 53 37-43 (1988) y a los polipéptidos codificados por la secuencia humana y también incluyen porciones de tales polipéptidos con tal porción del polipéptido que contiene generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Los fragmentos o porciones de los polipéptidos útiles en la terapia del presente invento se pueden emplear para producir el correspondiente polipéptido de tamaño completo mediante síntesis peptídica; por tanto, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de tamaño completo. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos útiles en el presente invento se pueden usar para sintetizar polinucleótidos de tamaño completo útiles en el presente invento.

El invento también se refiere al uso de fragmentos de un polipéptido Egr-1 definido anteriormente y fragmentos de variantes y derivados del mismo.

En este respecto, un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica que es totalmente la misma como parte pero no toda la secuencia aminoacídica de polipéptidos Egr-1 y variantes o derivados del mismo.

Tales fragmentos pueden " estar libres", es decir, que no forman parte de o están fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos, o ellos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más largo del que ellos forman una parte o región. Cuando están comprendidos dentro de un polipéptido mayor, los fragmentos tratados ahora más preferiblemente forman una región continua única. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido único más largo. Por ejemplo, ciertas realizaciones preferidas se refieren a un fragmento de un polipéptido del presente invento comprendido dentro de un polipéptido precursor designado para expresión en un hospedante y que tiene regiones pre y pro polipeptídicas heterólogas fusionadas al extremo amino del fragmento y una región adicional fusionada al extremo carboxilo del fragmento. Por lo tanto, fragmentos en un aspecto del significado pretendido aquí, se refieren a la porción o porciones de un polipéptido de fusión o proteína de fusión derivada de un polipéptido del presente invento.

También preferidos en este aspecto del invento son fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales del polipéptido útil en la terapia del presente invento. Las realizaciones preferidas del invento en este respecto incluyen fragmentos que comprenden regiones que forman alfa-hélice y alfa-hélice, regiones que forman beta-lámina y beta-lámina, regiones que forman giro y giro, regiones que forman enrollamiento y enrollamiento, regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficies, región de unión al sustrato, y regiones de índice antigénico elevado del polipéptido del presente invento, y combinaciones de tales fragmentos.

Las regiones preferidas son aquellas que median actividades del polipéptido del presente invento. Más altamente preferidos en este aspecto son fragmentos que tienen una actividad química, biológica u otra del polipéptido del presente invento, incluyendo aquellos con una actividad similar o una actividad mejorada, o con una actividad indeseable disminuida. Fragmentos polipeptídicos preferidos adicionales son aquellos que comprenden o contienen determinantes antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en un humano.

Se apreciará que el invento también se refiere a, entre otros, polinucleótidos que codifican para los fragmentos mencionados anteriormente, polinucleótidos que hibridan con polinucleótidos que codifican para los fragmentos, particularmente aquellos que hibridan en condiciones rigurosas, y polinucleótidos, tales como cebadores de PCR, para amplificar polinucleótidos que codifican para los fragmentos. En este respecto, los polinucleótidos preferidos son aquellos que corresponden a los fragmentos preferidos, como se trata anteriormente.

Realizaciones adicionales de este aspecto del invento incluye variantes, análogos o derivados de los mismos útiles biológicamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, o fragmentos de los mismos, que incluyen fragmentos de las variantes, análogos y derivados y composiciones que comprenden el mismo. Las variantes biológicamente activas, análogos o fragmentos se incluyen en el alcance del presente invento.

El invento también se refiere a las composiciones que comprenden los polinucleótidos o polipéptidos tratados anteriormente. Por tanto, los polinucleótidos o polipéptidos del presente invento se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Tales excipientes pueden incluir, pero no están limitados a salino, salino tamponado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

Los polipéptidos y polinucleótidos se pueden emplear en el presente invento bien solos o en conjunción con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en cualquier modo eficaz y conveniente, eficaz para alcanzar los sitios de las heridas incluyendo, por ejemplo, administración por rutas tópicas, intravenosas, intramusculares, intranasales o intradérmicas entre otros. Generalmente, las composiciones se aplicarán localmente en la herida o estado asociado.

En terapia o como un profiláctico, el agente activo puede ser administrado a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Alternativamente, la composición puede ser formulada para aplicación tópica por ejemplo en la forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos para ojos, gotas para los ojos, gotas para los oídos, colutorios, apósitos impregnados e hilos de sutura y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales apropiados, que incluyen, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en ungüentos y cremas. Tales formulaciones tópicas pueden también contener vehículos compatibles convencionales, por ejemplo cremas o bases de ungüento, y etanol u oleilalcohol para lociones. Tales vehículos pueden constituir desde alrededor del 1% a alrededor del 98% en peso de la formulación; más normalmente constituirán hasta alrededor del 80% en peso de la formulación.

Para administración a mamíferos, y particularmente humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo irá desde 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier acontecimiento determinará la dosificación real que sea más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son un ejemplo del caso promedio. Ahí pueden ser, desde luego, ejemplos individuales en los que intervalos de dosificaciones superiores o inferiores son supuestas, y tales están dentro del alcance de este invento.

Como séptimo aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un factor de transcripción Egr-1 o una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para Egr-1 junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables del mismo para el uso en el tratamiento de las heridas.

La ventaja terapéutica de usar factores de transcripción en la cicatrización acelerada de heridas está en la activación de múltiples genes diana que promueven la cicatrización acelerada. El Egr-1 es activado de modo natural en respuesta a las heridas y el aumento de la respuesta natural es también una ventaja. El tratamiento está basado en ADN y proporciona un sistema de reparto fiable y reproducible.

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En los casos en que se usa un polinucleótido Egr-1 en el uso terapéutico del invento, el polinucleótido puede ser usado como parte de una construcción de expresión, por ejemplo, en la forma de un vector de expresión. En tal uso, la construcción se introduce en el sitio de la herida en el que el Egr-1 es producido in situ. Las construcciones usadas pueden ser vectores estándares y/o sistemas de reparto de genes, tales como liposomas, sistemas de reparto mediado por receptor y vectores virales.

El presente invento es adecuado para todos los aspectos de cicatrización de heridas incluyendo úlceras de extremidades en diabetes y enfermedad oclusiva arterial periférica, cicatrización postoperatoria, quemaduras y soriasis.

Como se describe anteriormente, los polipéptidos ácidos nucleicos de Egr-1 del presente invento pueden ser administrados localmente al sitio de daño tisular mediante cualquier método conveniente por ejemplo, mediante administración tópica. Un método de reparto de productos de ácidos nucleicos es usar tecnología de pistolas génicas en el que la molécula de ácidos nucleicos aislado de Egr-1 por ejemplo en la forma de cADN o en un vector de expresión se inmoviliza sobre partículas de oro y se disparada directamente sobre el sitio de la herida. Así, como un aspecto preferido del presente invento, se proporciona el uso de una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para Egr-1 en una pistola génica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas. Además, se proporciona una composición adecuada para terapia de pistola génica que comprende un factor de transcripción Egr-1 que codifica para secuencias y partículas de oro.

El reparto preferido de ácidos nucleicos o polipéptido del invento es sin embargo, mediante microsiembra como se describe en el documento de patente norteamericana 5.697.901.

Como se menciona previamente, el polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo pueden estar bajo el control de al menos una parte de un promotor nativo de Egr-1, preferiblemente el promotor Egr-1 humano.

El promotor murino Egr-1 ha sido aislado y secuenciado (Morris, Nucleic Acid Research, 16: 8835-8846). Las secuencias reguladoras potenciales incluyen un elemento AAATA (una homología tipo "TATA") en la posición -26 a -22; una caja CCAAT en las posiciones -337 a -333: cinco elementos de respuesta a suero (SREs) en las posiciones -110 a -91, -342 a -324, -358 a -339, -374 a -355 y -412 a -393; dos sitios AP1 en las posiciones -610 a -603 y -867 a -860; cuatro sitios Sp1 en las posiciones -285 a -280, -649 a -644, -700 a -695 y -719 a -714; y dos elementos de respuesta a cAMP en las posiciones -138 a -131 y -631 a -624. El Egr-1 se ha mostrado que se une al promotor Egr-1 murino y que disminuye la transcripción de su propia expresión. La secuencia de este promotor se proporciona en la Figura 9 de los dibujos que se acompañan.

Se comprende menos acerca de la regulación del promotor Egr-1 humano. Una supuesta secuencia Egr-1 humana ha sido proporcionada. 695 nucleótidos de la secuencia aguas arriba han sido identificados relativos al sitio de inicio del mARN en la posición +1. Esta secuencia aguas arriba comprende un elemento AAATA (una homología tipo "TATA") en la posición -26 a -22, y numerosos elementos reguladores potenciales incluyendo dos sitios Sp1 en las posiciones -505 a -499, y -647 a -642; dos elementos de respuesta a AMP cíclico en las posiciones -134 a -127 y -630 a -623, cinco elementos de respuesta a suero (SREs) en las posiciones -108 a -89, -344 a -326, -359 a -340, -376 a -357 y -410 a -394; un sitio de unión a Egr-1 (EBS) en la posición - 597 a -589 y un elemento de respuesta a acetato de tetradecanoil forbol (TPA) (sitio de unión a AP1) en la posición -609 a - 602. Se sabe que el sitio de unión a TPA es funcional ya que el TPA estimula la expresión a partir de un plásmido que expresa el gen de la cloranfenicol acetil transferasa. Los SRE 3 y 4 se ha demostrado que median la respuesta del promotor de Egr-1 para el estrés por corte y pueden conferir respuesta al estrés por corte sobre el promotor SV40. La deleción de los EBS a partir del elemento promotor humano lleva a un aumento en la respuesta a estrés por corte de este promotor, abogando por un papel de Egr-1 en disminuir la actividad a partir del promotor humano.

Los presentes inventores han encontrado que la secuencia publicada proporcionada para el promotor Egr-1 humano no es correcta y han proporcionado una nueva secuencia con diversas diferencias a partir de dicha secuencia publicada. Estas diferencias en secuencia no podrían haber sido predichas por adelantado y al menos algunas de ellas se considera que son funcionalmente significativas. Adicionalmente, los presentes inventores han proporcionado una secuencia completa, mientras que la secuencia promotora de Egr-1 humana documentada incluye diversos huecos.

Así, la molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para el Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo puede estar unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que:

a)

tiene una hebra que comprende la secuencia proporcionada en la Figura 7 para la GW SEQ; o

b)

tiene una hebra que comprende una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones relativas a GW SEQ, pero que no comprende la secuencia mostrada en al Figura 7 como ON SEQ y que tampoco comprende la secuencia mostrada en al Figura 9.

Según un octavo aspecto del presente invento, se proporciona una molécula de ácidos nucleicos que:

a) tiene una hebra que comprende la secuencia proporcionada en la Figura 7 para GW SEQ;

b) tiene una hebra que comprende una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones relativas a GW SEQ, pero que no comprenden la secuencia mostrada en la Figura 7 como ON SEQ y que tampoco comprende la secuencia mostrada en la Figura 9; o

c) tiene una hebra que híbrida con una hebra como se describe en a) o b) anteriormente, y que está unida operativamente a la molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para el Egr-1 o un fragmento biológicamente activo para el uso del invento.

Las moléculas dentro del alcance de a), b) o c) anteriores se describirán ahora en mayor detalle:

a) Una molécula de ácidos nucleicos que tiene la secuencia proporcionada en la Figura 7 para la GW SEQ

Se puede observar que la GW SEQ mostrada en la Figura 7 tiene varias regiones enmarcadas. Estas se cree que son funcionalmente significativas. Sin estar vinculadas a la teoría, supuestas funciones de las diversas regiones enmarcadas mostradas en la Figura 7 se describen a continuación:

Sp1 (dos regiones)

Sp1 indica una secuencia para la unión al factor de transcripción Sp1 y homólogos.

cAMP RE (dos regiones)

cAMP RE indica una secuencia para la unión del factor de transcripción ATF y homólogos. Este se induce mediante cAMP y la secuencia está por tanto referida como un elemento de respuesta a cAMP.

TPA RE

TPA RE indica una secuencia para la unión del factor de transcripción AP1 y homólogos. Este se induce, por ejemplo, por el éster de forbol TPA y la secuencia está por tanto referida como un elemento de respuesta a TPA.

EBS

EBS indica una secuencia para la unión al factor de transcripción Egr-1 y homólogos.

SER (SRE5, SRE4, SRE3, SRE2, SRE1)

SRE indica una secuencia que proporciona sensibilidad al suero (es decir, un elemento de respuesta a suero). Junto con el Ets asociado (transformación específica E26) los sitios de unión a los elementos de respuesta a suero unen factores de transcripción tales como SRF, Elk-1 y/o F-ACT1, así como homólogos del mismo.

TATA

La caja TATA se cree que se requiere para el ensamblaje del complejo transcripcional, que comprende muchos factores de transcripción requeridos para la iniciación de la transcripción. No necesita incluir la secuencia exacta "TATA" puesto que ésta es una secuencia consenso, y un cierto grado de variación puede tener lugar.

La GW SEQ tiene diversas diferencias de secuencia relativas a la secuencia de Egr-1 humano publicada (designada aquí como "ON SEQ"). Las diferencias se tratarán ahora con respecto al alineamiento de las secuencias GW SEQ y ON SEQ mostradas en la Figura 7.

Como se puede observar de la Figura 7, la GW SEQ tiene cinco nucleótidos que están cambiados de los nucleótidos específicos proporcionados en las posiciones correspondientes para la ON SEQ. Estas pueden considerarse como sustituciones relativas al ON SEQ. Dos de éstas están presentes en las regiones que están enmarcadas. Estas dos sustituciones son la sustitución de una G por una T y la sustitución de una G por una C. Están presentes en la primera caja cAMP RE y en la caja SRE3 respectivamente.

La GW SEQ tiene también diversos nucleótidos adicionales relativos a la ON SEQ (es decir nucleótidos que no están identificados especialmente en la ON SEQ). Estos pueden ser considerados como inserciones relativas a la ON SEQ. Cuatro de estas están presentes en la caja SRE5. (Tres de éstas son inserciones de una A y una es una inserción de una C).

La GW SEQ tiene una deleción relativa a la ON SEQ. Es la deleción de una G. Ésta no está en una región enmarcada. Está situada entre la segunda caja SP1 y la caja SRE5.

Las moléculas dentro del alcance del apartado a) anterior pueden tener por supuesto secuencias adicionales aguas arriba y/o aguas abajo relativas a GW SEQ. Por ejemplo, una o más regiones implicadas en la transcripción/traducción o la regulación de la misma puede proporcionarse. Una región codificante puede también proporcionarse (preferiblemente que codifique para el Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo). Las regiones adicionales se tratan en mayor detalle más adelante.

b) Una molécula de ácidos nucleicos que tiene una hebra que comprende una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones relativas a GW SEQ, pero que no comprende la secuencia mostrada en la Figura 7 como ON SEQ y que tampoco comprende la secuencia mostrada en la Figura 9

Los cambios en la secuencia nucleotídica pueden ser hechos relativos a la molécula que comprende GW SEQ para proporcionar otras moléculas que son aún de utilidad.

Tales cambios están dentro del alcance del presente invento. Incluyen variantes alélicas y no alélicas.

Las variantes preferidas dentro del alcance del apartado b) anterior comprenderán normalmente una o más regiones reguladoras que tienen una función que corresponde a la función de una o más regiones enmarcadas mostradas para la GW SEQ (aún si esa función está aumentada o disminuida relativo a una o más regiones enmarcadas mostradas para el GW SEQ). Más preferiblemente, tales moléculas tendrán una o más regiones que tienen las mismas secuencias como una o más de las regiones enmarcadas mostradas para GW SEQ.

Idealmente, las variantes dentro del alcance del apartado b) anteriores tendrán una identidad de secuencia sustancial con todo o parte de dicha GW SEQ a lo largo de la longitud de dicha GW SEQ o parte de la misma.

Si una variante tiene una o más regiones correspondientes a una o más de las regiones enmarcadas mostradas en la Figura 7 para la GW SEQ, se prefiere que no haya diferencias relativas a dichas regiones enmarcadas o sólo unas pocas diferencias (por ejemplo, puede ser generalmente preferido tener un máximo de sólo 1, 2 ó 3 diferencias con respecto a una región enmarcada dada). Puede haber más cambios de secuencia fuera de las regiones enmarcadas. Así, las variantes pueden tener relativamente grados de identidad de secuencia bajos con la parte correspondiente de la GW SEQ con respecto a las regiones que no están enmarcadas en la Figura 7. Efectivamente, algunas variantes pueden no tener una o más regiones correspondientes a una o más regiones fuera de dichas regiones enmarcadas con respecto a las GW SEQ.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas del octavo aspecto del presente invento incluirán una o más regiones reguladoras capaces de alterar el nivel de transcripción de Egr-1 en mamíferos (más preferiblemente en humanos) en respuesta a condiciones in vivo. Así, tales moléculas de ácidos nucleicos pueden administrarse a mamíferos para proporcionar Egr-1 en una manera que permita que su expresión sea regulada al nivel de la transcripción (estas moléculas de ácidos nucleicos incluirán por tanto generalmente una región que codifica para una sustancia que tiene actividad Egr-1).

Uno o más elementos de respuesta a suero (SREs) pueden estar presentes. Idealmente, uno o más de éstos serán elementos de respuesta a estrés por corte (SSREs). Estas son regiones que confieren sensibilidad a estrés por corte en la transcripción.

Una pluralidad de SSREs pueden cooperar para facilitar la sensibilidad al estrés por corte. Idealmente, éstos están asociados con/incluyen uno o más sitios Ets. Sin embargo, en algunos casos, es posible que sólo un SSRE necesite estar presente (preferiblemente junto con un sitio Ets) para proporcionar un grado de sensibilidad a estrés por corte.

Un SSRE preferido está indicado en la Figura 7 como SRE5 para "GW SEQ". Los presentes inventores han demostrado que éste es funcional, mientras que la secuencia SRE5 mostrada con respecto a la ON SEQ no es funcional. El SRE5 mismo, así como las variantes de SRE5 capaces de proporcionar sensibilidad de estrés por corte están dentro del alcance del presente invento. Tales variantes incluyen preferiblemente al menos una de las diferencias nucleotídicas presentes en el SRE5 de la GW SEQ relativa al SRE5 de la ON SEQ.

Otros SSREs preferidos son los SRE3 y SRE4 como se muestran en la Figura 7 para la GW SEQ, así como variantes de las mismas capaces de proporcionar sensibilidad al estrés por corte.

Más preferiblemente, todos los tres SRE3, SRE4 y SRE5 (o variantes de los mismos capaces de proporcionar sensibilidad a estrés por corte) están presentes.

Sin tener en cuenta si los SRE particulares están o no presentes, una molécula de ácidos nucleicos del décimo aspecto del presente invento incluirá convenientemente una caja TATA (que no incluirá necesariamente la secuencia consenso "TATA"). Incluirá también normalmente una caja CCAAT (que no incluirá necesariamente la secuencia consenso "CCAAT").

Al menos una, y preferiblemente dos, regiones de unión a Sp1 estarán también normalmente presentes. Las regiones de unión a Sp1 pueden ser cada una o ambas de las secuencias de unión a Sp1 mostradas en la Figura 7 para la GW SEQ.

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Una región de respuesta a cAMP puede estar presente. Preferiblemente, tales regiones comprenden las secuencias mostradas en la Figura 7 que tienen la designación cAMP RE con respecto de la GW SEQ. Más preferida es la primera cAMP RE mostrada en la Figura 7 para la GW SEQ. Éstas pueden permitir la regulación de la transcripción por cAMP.

Un sitio de unión a Egr-1 (EBS) puede estar presente. Esto se cree que tiene un papel importante en disminuir la transcripción de Egr-1 una vez que los niveles de Egr-1 excedan un cierto umbral. Así, el Egr-1 puede limitar su propia expresión después de la estimulación del estrés por corte. Un EBS estará generalmente incluido si se desea limitar los niveles de Egr-1 de esta manera. El EBS puede tener la secuencia mostrada en la Figura 7 para la GW SEQ como EBS.

Se pueden hacer cambios nucleotídicos a un EBS dado para proporcionar variantes del mismo. Por ejemplo, las variantes pueden proporcionarse con una afinidad reducida por el Egr-1 relativo al EBS mostrado en la Figura 7 para la GW SEQ. Una variante tal es la EBS mostrada en la Figura 8. En algunos casos, un EBS funcional puede no estar presente y por lo tanto la regulación por Egr-1 puede suprimirse completamente (por ejemplo puede hacerse una deleción completa de un EBS). También pueden hacerse cambios nucleotídicos a un EBS para proporcionar una afinidad aumentada para el Egr-1. Esto es útil si se desea tener una autorregulación aumentada de la expresión de

\hbox{Egr-1.}

c) Una molécula de ácidos nucleicos que tiene una hebra que híbrida con una hebra como se describe en los apartados a) o b) anteriores

Las moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridar con una o más de las moléculas de ácidos nucleicos tratadas anteriormente están también abarcadas por el décimo aspecto del presente invento. Tales moléculas de ácidos nucleicos son referidas aquí como moléculas de ácidos nucleicos "hibridantes". Idealmente, las moléculas hibridantes del presente invento son de al menos 10 nucleótidos de longitud y preferiblemente son de al menos 25, al menos 50, y al menos 100, o al menos 200 nucleótidos de longitud.

Una molécula de ácidos nucleicos hibridante del presente invento puede tener un alto grado de identidad de secuencia a lo largo de su longitud con una molécula de ácidos nucleicos complementaria a un ácido nucleico dentro del alcance de los apartados a) o b) anteriores (por ejemplo, al menos un 50%, al menos un 75%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad), aunque esto no es esencial. Cuanto mayor es el grado de identidad de secuencia que una molécula dada de ácidos nucleicos de hebra única tiene con otra molécula de ácidos nucleicos de hebra única, mayor es la probabilidad de que hibride con una molécula de ácidos nucleicos de hebra única que es complementaria a la otra molécula de ácidos nucleicos de hebra única en condiciones apropiadas.

Las moléculas hibridantes preferidas hibridan en condiciones de moderada o alta rigurosidad. Las condiciones de hibridación se tratan en detalle en las páginas 1.101-1.110 y 11.45-11.61 de Sambrook y otros (Molecular Cloning, 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Un ejemplo de condiciones de hibridación que pueden usarse implica usar una disolución de prelavado de SSC 5 X, SDS 0,5%, EDTA (pH 8.0) 1,0 mM e intentar hibridar durante toda la noche a 55ºC usando SSC 5X. Sin embargo, hay muchas otras posibilidades. Algunas de éstas están listadas en la Tabla 1 del documento de patente WO98/45435, por ejemplo (véanse especialmente las condiciones expuestas en A-F de esa tabla y, menos preferiblemente aquellas listadas en G a L o M a R).

Otra aproximación es determinar la Tm para un dúplex perfecto dado (es decir, sin errores de emparejamiento) de una cierta longitud en condiciones dadas y entonces realizar el intento de hibridación con una sola hebra del dúplex en esas condiciones, pero a una temperatura suficientemente por debajo de la Tm para permitir la formación de un intervalo de híbridos estables a una velocidad aceptable, aunque aún se requiera un grado razonable de especificidad de hibridación. La Tm para tal dúplex puede determinarse empíricamente proporcionando el dúplex e incrementando gradualmente la temperatura hasta que se alcanza la Tm. La Tm puede estimarse también por ejemplo usando : Tm = 81,5 + 16,6 (log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(fracción G+C)- (600/N), en la que N es la longitud de la cadena (ésta fórmula es razonablemente precisa para las concentraciones de Na^{+} de 1 M o menos y para longitudes polinucleotídicas de 14 a 70, pero es menos precisa cuando estos parámetros no se satisfacen). Para moléculas de ácidos nucleicos mayores de 200 nucleótidos en longitud, la hibridación puede, por ejemplo ser llevada a cabo a 15 hasta 25ºC por debajo de la Tm de un híbrido perfecto (es decir sin errores de emparejamiento) en las condiciones dadas. Sin embargo, según se disminuye la longitud, la Tm se disminuye de modo que a veces no es conveniente llevar a cabo la hibridación a la Tm –25ºC. La hibridación con moléculas de ácidos nucleicos más cortas se lleva a cabo por lo tanto a sólo 5ºC hasta 10ºC por debajo de la Tm. Las condiciones de moderada o alta rigurosidad permitirán normalmente sólo una pequeña proporción de errores de emparejamiento. Como experiencia, por cada 1% de errores de emparejamiento, hay una reducción de la Tm de alrededor de 1- 1,5ºC. Preferiblemente, las condiciones de hibridación se eligen para permitir menos del 25% de errores de emparejamiento. La hibridación puede ser seguida de lavados para aumentar la rigurosidad. Así, los lavados iniciales pueden estar en condiciones de baja rigurosidad, pero éstas pueden ser seguidas de lavados con mayor rigurosidad, hasta la rigurosidad de las condiciones a las que se realizó la hibridación.

La discusión anterior de las condiciones de hibridación se proporciona como orientación general pero no pretende ser limitante. Esto es porque una persona experta será capaz de variar parámetros como sea apropiado para proporcionar condiciones de hibridación adecuadas, y puede tener en cuenta variables tales como longitud polinucleotídica, composiciones de bases, naturaleza del dúplex (es decir ADN/ADN, ARN/ARN o ADN/ARN), tipo de iones presentes, etc.

Más preferiblemente, las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes del décimo aspecto del presente invento hibridan con una molécula de ADN que tiene la secuencia mostrada en la Figura 7 para la GW SEQ o para una o más de las regiones enmarcadas mostradas en la Figura 7.

Las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes pueden ser útiles como sondas o cebadores, por ejemplo.

Se pueden usar sondas para purificar y/o identificar ácidos nucleicos. Pueden usarse en diagnosis. Por ejemplo, las sondas pueden usarse para determinar si un individuo tiene o no defectos en su genoma que puedan afectar la transcripción del Egr-1 o la regulación de tal transcripción. Tales defectos pueden hacer al individuo propenso a diversos trastornos que pueden ser tratados usando tratamientos del presente invento. Por ejemplo, la cicatrización de heridas puede estar perjudicada mediante mutaciones en uno o más de los SREs. Tales mutaciones pueden identificarse usando sondas que hibridan con un mayor grado de especificidad a uno o más de los SREs mostrados para la GW SEQ que del SRE mutante correspondiente (o viceversa).

Idealmente, las moléculas hibridantes del octavo aspecto del presente invento hibridan más rigurosamente con una molécula de ADN que tiene la secuencia mostrada en la Figura 7 para la GW SEQ o con una o más de las regiones enmarcadas de la misma que con una molécula de ADN que tiene la secuencia mostrada en la Figura 7 para la ON SEQ o con una o más de las regiones enmarcadas de las mismas. Por ejemplo, las moléculas hibridantes pueden diseñarse con un alto grado de especificidad para una o más de las regiones SRE3, SRE5 y cAMP mostradas para la GW SEQ en la Figura 7 (todas estas regiones tienen diferencias en la secuencia a partir de las regiones correspondientes de ON SEQ).

Las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes dentro del alcance del décimo aspecto del presente invento incluyen cebadores. Los cebadores son útiles para amplificar ácidos nucleicos o partes del mismo, por ejemplo mediante técnicas de PCR.

Además de ser útiles como sondas o cebadores, las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes del décimo aspecto del presente invento pueden usarse como moléculas antisentido para alterar la expresión. Esta técnica puede ser usada en la terapia antisentido. Las moléculas antisentido pueden ser usadas por ejemplo para bloquear o reducir la expresión de Egr-1 impidiendo o reduciendo el nivel de transcripción. Alternativamente, pueden usarse para impedir o reducir la regulación de la transcripción de Egr-1 por un regulador dado uniéndose a una región a la que el regulador se uniría normalmente.

Es importante observar que las moléculas de ácidos nucleicos para usar en el presente invento incluyen no sólo aquellas con estructuras de ADN o ARN clásicas, sino también variantes con esqueletos modificados (no fosfodiéster) por ejemplo, derivados de morfolino y ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), que contienen un esqueleto pseudopeptídico basado en N-(2-aminoetil)glicina (véase Nielsen, P.E., Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure, 24 167-83 (1995)). Las variantes de ácidos nucleicos con esqueletos modificados pueden tener una estabilidad aumentada relativa a los ácidos nucleicos sin modificar y son particularmente útiles en los casos en que se desea una hibridación a largo plazo (por ejemplo en terapia antisentido).

De la discusión anterior, se apreciará que un gran número de ácidos nucleicos están dentro del alcance del décimo aspecto del presente invento. A menos que el contexto indique de otra manera, las moléculas de ácidos nucleicos del décimo aspecto del presente invento pueden tener por tanto una o más de las siguientes características:

1) Pueden estar en la forma de ADN o ARN (incluyendo variantes de estructuras de ADN o ARN presentes de manera natural, que tienen bases presentes de manera no natural y/o esqueletos presentes de manera no natural).

2) Pueden ser de hebra única o de doble hebra (ambas hebras dadas y su complementaria están incluidas, estén o no asociadas).

3) Pueden proporcionarse en forma recombinante, es decir, unidas covalentemente a una secuencia flanqueante en 5' y/o 3' heteróloga para proporcionar una molécula quimérica (por ejemplo un vector) que no está presente en la naturaleza.

4) Pueden proporcionarse sin las secuencias flanqueantes en 5' y/o 3' que están presentes de manera natural en la naturaleza.

5) Pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura (por ejemplo en forma aislada). Esto puede hacerse por ejemplo usando sondas para aislar moléculas clonadas que tienen una secuencia diana deseada o usando técnicas de síntesis química. Así, los ácidos nucleicos pueden proporcionarse en una forma que está sustancialmente libre de proteínas contaminantes y/o de otros ácidos nucleicos.

6) Pueden proporcionarse con intrones (por ejemplo, como genes de tamaño completo) o sin intrones.

Diversos usos del décimo aspecto del presente invento serán tratados ahora en mayor detalle.

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Las moléculas de ácidos nucleicos del octavo aspecto del presente invento pueden comprender cualquier secuencia codificante deseada. Por ejemplo, uno o más de los elementos de respuesta a suero pueden estar unidos operativamente con una secuencia codificante que no está normalmente asociada con tales elementos. Esto puede ser útil por ejemplo en la cicatrización de heridas si se desea proprocionar sensibilidad al suero con respeto a un agente terapéutico dado codificado por la secuencia codificante que no demuestra normalmente sensibilidad al suero.

Se prefiere sin embargo que las moléculas de ácidos nucleicos del octavo aspecto del presente invento comprendan una secuencia codificante para el Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Idealmente, las moléculas de ácidos nucleicos del octavo aspecto del presente invento incluyen una región promotora y pueden usarse para proporcionar Egr-1 permitiendo la transcripción del mARN del Egr-1. Esto puede traducirse mediante ribosomas presentes en un hospedante. Así, las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser administradas a un sujeto (preferiblemente un humano u otro mamífero) de modo que el Egr-1 adicional pueda ser sintetizado en el sujeto, o (menos preferiblemente) pueden ser usados para preparar el Egr-1 mismo, que puede ser entonces administrado al sujeto.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas del octavo aspecto del presente invento para administrar a un sujeto se pueden transcribir de tal manera, de modo que la transcripción pueda ser regulada por uno o más factores que regulan la transcripción del Egr-1 en el sujeto.

Por ejemplo, uno o más SSREs pueden ser proporcionados (como se trata anteriormente) para proporcionar la transcripción del Egr-1 con sensibilidad al estrés por corte. Esto es particularmente ventajoso en los casos en que las moléculas de ácidos nucleicos del décimo aspecto del presente invento se administran al paciente (mejor que administrar el Egr-1 mismo). La sensibilidad al estrés por corte es beneficiosa en los casos en que las moléculas de ácidos nucleicos del décimo aspecto del presente invento se usan in vivo para tratar las heridas. Esto es porque el estrés por corte en los sitios de las heridas puede dar como resultado que los factores se unan al SSREs que pueden estimular el incremento de transcripción de Egr-1. Los niveles aumentados de Egr-1 resultantes pueden acelerar la cicatrización de las heridas.

En algunos casos, se puede desear reducir el nivel de sensibilidad al estrés por corte. Por ejemplo, se puede desear reducir el tratamiento de las heridas por esta ruta (posiblemente para reducir la cicatrización). Alternativamente se puede desear reducir el riesgo de problemas cardiovasculares asociados con la sensibilidad al estrés por corte.

El décimo aspecto del presente invento es también útil aquí. Proporciona por primera vez las secuencias completas de cinco SREs humanos asociados con la regulación de la transcripción del Egr-1 humana. Uno o más de estos pueden ser mutados para reducir el nivel de sensibilidad por estrés al corte relativo al obtenido usando uno o más de los SREs mostrados en la Figura 7 para GW SEQ.

En otros casos, se puede desear incrementar el nivel de sensibilidad al estrés por corte proporcionando mutaciones en uno o más de los cinco SREs para aumentar el nivel de sensibilidad al estrés por corte relativa a la obtenida usando los SREs mostrados para GW SEQ en la Figura 7. Tales mutaciones pueden ser útiles por ejemplo, en la aceleración del tratamiento de las heridas.

Las moléculas de ácidos nucleicos del octavo aspecto del presente invento pueden estar en forma de vectores, aunque esto no es esencial. Pueden ser administradas a un paciente por métodos físicos. Tales métodos incluyen la aplicación tópica del vector de ácidos nucleicos "desnudo" en un vehículo apropiado - por ejemplo en disolución en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como fosfato salino tamponado (PBS). Tales métodos incluyen el bombardeo de partículas (que también es conocido como tecnología "pistola génica" y está descrito en el documento de patente norteamericana US-5371015. Aquí, partículas inertes, tales como bolitas de oro recubiertas con ácidos nucleicos se aceleran a velocidades suficientes para permitirles penetrar la superficie en el sitio de la herida (por ejemplo piel) por medio de descargas en alta presión a partir de un dispositivo proyector (partículas recubiertas con una molécula de ácidos nucleicos del presente invento están dentro del alcance del presente invento, como los están los dispositivos que comprenden tales partículas). Otros métodos físicos para administrar el ADN directamente a un recipiente incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsiembra. Particularmente preferido es el modo de reparto de microsiembra. Esto se describe en el documento de patente norteamericana US-5697901.

Las moléculas de ácidos nucleicos del octavo aspecto del invento se pueden también administrar por medio de vectores de reparto especializados.

Cualquier vector adecuado para la terapia génica puede ser usado. Las aproximaciones por terapia génica se tratan por ejemplo por Verna y otros en Nature 389: 239-242. Ambos sistemas virales y no virales se pueden usar.

Los sistemas basados en virus incluyen sistemas retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales asociados a adenovirus, sistemas basados en virus del herpes y en virus vacuna.

Los sistemas basados en no virales incluyen la administración directa de ácidos nucleicos y sistemas basados en liposoma.

Una secuencia de ácidos nucleicos del octavo aspecto del presente invento pueden ser incluso administrada por medio de células hospedantes transformadas. Tales células incluyen células recogidas de un sujeto. Las moléculas de ácidos nucleicos del presente invento se pueden introducir en tales células in vitro y las células transformadas se pueden devolver más tarde al sujeto. Las moléculas de ácidos nucleicos necesitan no ser introducidas como vectores puesto que se pueden introducir moléculas de ácidos nucleicos no vectores. Algunas de tales moléculas se pueden integrar en ácidos nucleicos ya presentes en la célula hospedante mediante eventos de recombinación homóloga.

El presente invento también incluye dentro de su alcance sistemas de expresión que pueden ser usados para proporcionar polipéptidos (por ejemplo Egr-1) para el uso del invento.

Los vectores de expresión preferidos son los vectores eucarióticos. Sin embargo, también se pueden usar vectores procarióticos. Los vectores adecuados incluirán generalmente una secuencia codificante unida a una o más secuencias reguladoras. Preferiblemente, las secuencias codificantes que codifican para el Egr-1.

Muchos sistemas de expresión diferentes son conocidos y tratados, por ejemplo en Sambrook y otros (Molcecular Cloninng, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Se apreciará a partir de la discusión precedente que los ácidos nucleicos para el décimo aspecto del presente invento (que pueden estar presente en la forma de vectores) pueden usarse en diversas aplicaciones terapéuticas, como pueden los polipéptidos producidos usando tales ácidos nucleicos. El presente invento incluye por lo tanto dentro de su alcance composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden dichos ácidos nucleicos o polipéptidos, opcionalmente en combinación con un vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a salino, salino tamponado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

Los polipéptidos y los ácidos nucleicos pueden ser empleados en el presente invento sea solos o junto con otras sustancias, tales como sustancias terapéuticas. Por ejemplo los represores de Egr-1 pueden ser administrados (tales como NAB1 y/o NAB2) en ciertas circunstancias (por ejemplo, si se desea minimizar la cicatrización, inhibir la restenosis, modular la calcificación de la pared vascular y/o inhibir la proliferación celular (por ejemplo en cánceres)). En los casos en que dos o más agentes activos tienen que ser administrados esto puede ser hecho como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial.

Las composiciones farmacéuticas del presente invento pueden ser administradas de cualquier manera eficaz, incluyendo por ejemplo, la administración por rutas tópicas, intravenosas, intramusculares, intranasales o intradérmicas entre otras. Generalmente se prefiere que las composiciones se apliquen localmente -por ejemplo en o cerca de un sitio de herida o estado asociado. Sin embargo se puede usar la administración sistémica.

Un agente activo puede ser administrado a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril. Esto es, de modo preferible, sustancialmente isotónica con los fluidos corporales del paciente (por ejemplo con sangre del paciente).

Alternativamente la composición puede ser formulada para aplicación tópica por ejemplo en la forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos para ojos, gotas para ojos, gotas para el oído, colutorios, apósitos impregnados e hilos de sutura y aerosoles. Puede contener aditivos, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en ungüentos y cremas. Tales formulaciones tópicas pueden también contener vehículos compatibles, por ejemplo bases de cremas o ungüentos, y etanol u oleilalcohol para lociones. Tales vehículos pueden constituir desde alrededor de 1% a alrededor de 98% en peso de la formulación. Más normalmente constituyen hasta alrededor del 80% en peso de la formulación.

Más preferiblemente, composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos del presente invento están adaptadas para la administración mediante tecnología de "pistolas génicas". Así, los ácidos nucleicos pueden estar asociados con partículas (por ejemplo bolitas de oro) que pueden ser usadas como proyectiles.

Para administración a mamíferos, y particularmente humanos, se espera que el nivel de dosificación diario de un agente activo sea desde 0,01 mg/kg hasta 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. En la práctica, un médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y ésta puede variar bien con la edad, el peso o estado del individuo particular. Si se desarrollan efectos secundarios, la dosificación se puede reducir de acuerdo con una buena práctica clínica.

Los aspectos preferidos de cada aspecto del invento son como para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. Los documentos de la técnica anterior aquí mencionados están incorporados en su más completa extensión permitida por la ley.

El presente invento se describirá ahora por medio de ejemplos sólo con referencia a las figuras que se acompañan, en las que:

Las Figs. 1a y b muestran la expresión de Egr-1 de VEGF;

La Figura 1c y d muestran la expresión de Egr-1 de TGF-B1;

La Figura 1e y f muestran la expresión de Egr-1 de PDGF A;

La Figura 2a muestra el efecto de Egr-1 en la contracción de la herida excisional de rata.

La Figura 2b muestra el efecto de la transfección del ADN de Egr-1 en la histología de cicatrización de las heridas excisionales de rata;

La Figura 2c muestra el efecto del Egr-1 en la deposición del colágeno en las heridas excisionales de rata.

La Figura 2d muestra el efecto del Egr-1 en el perfil angiogénico en las heridas excisionales de rata usando la inmunotinción de vWF;

La Figura 3a muestra la optimización de la relación lípido:ADN (v/p) para la transfección del plásmido testigo de luciferasa pGL3 en el sistema de cocultivo de angiogénesis usando Mirus TransIT (Cambridge Biosciences);

La Figura 3b muestra el efecto del Egr-1 en la angiogénesis;

La Figura 4a muestra las muestras para la carga ósea usando análisis por transferencia Western;

La Figura 4b muestra el análisis de la transferencia Western de la proteína Egr-1 en células óseas TE85 humanas expuestas para cargar;

La Figura 4c muestra un análisis ELISA de PDGF BB producido por células óseas TE85 después de exponerlas a la carga;

La Figura 4d muestra la detección de VEGF y TGF-B1 después de la transfección de CMV-TGF-B1 en células ROS;

La Figura 4e muestra la detección de VEGF y TGF-B1 después de la transfección de CMV-TGF-B1 en células MC3tE1;

La Figura 5 muestra el efecto de Egr-1 sobre los niveles de fosfatasa alcalina en un modelo de roedor de formación ósea ectópica.

La Figura 6a muestra una tinción por anticuerpo anti-Egr-1 de células de músculo liso humanas transfectadas con CMV-Egr-1;

La Figura 6b muestra una tinción por anticuerpo anti-Egr-1 de células de músculo liso porcinas transfectadas con el ADN del CMV Egr-1;

La Figura 6c muestra la optimización de la transfección del testigo de luciferasa pGL3 enSMC humanas mediante Fugene;

La Figura 6d muestra la optimización de la transfección del testigo luciferasa pGL3 en SMC porcinas mediante Fugene;

La Figura 6e muestra la activación de la producción/secreción de VEGF mediante transfección de CMV-Egr-1 en SMC humanas;

La Figura 6f muestra la activación de la producción/secreción de HGF mediante transfección de CMV-Egr-1 en SMC humanas;

La Figura 6g muestra la activación de la producción/secreción mediante tranfección de CMV-Egr-1 en SMC humanas;

La Figura 6h muestra la inmunotinción de la proteína Egr-1 en la pared vascular pre y post-lesión.

La Figura 7 muestra una comparación de dos secuencias nucleotídicas indicadas como GW SEQ y ON SEQ respectivamente. La ON SEQ es el promotor de respuesta del crecimiento temprana-1 publicada (Sakamoto y otros Oncogene 6; 867-871, 1991), y GW SEQ es una secuencia de acuerdo con el invento, que contiene un número de inserciones/deleciones de bases como se muestra y sustituciones (en negrita-subrayadas).

La Figura 8 muestra una variante de la secuencia mostrada en la Figura 7, variante que tiene una región EBS modificada. La mutación en el sitio de unión al Egr-1 (EBS) se muestra en negrita-subrayada.

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La Figura 9 muestra la secuencia 5' aguas arriba publicada del gen Egr-1 de ratón (Morris, Nucleic Acids Research, 16: 8835-8846). Los nucleótidos están numerados desde el sitio cap= +1. Los elementos TATA y CCAAT putativos están enmarcados.

Los elementos reguladores potenciales están subrayados e indicados en la figura. El subrayado punteado muestra la posición de 29-mer usados para estudios de extensión de cebadores;

La Figura 10 muestra la activación de SRE5 mediante transfección transiente de pFA-MEK1.

Ejemplos

Los ejemplos 1 y 2 describen el reparto por pistola génica de los ADNs de los plásmidos de expresión de la \beta-galactosidasa y el Egr-1, acomplejados con partículas de oro, a la piel de roedores.

a) Preparación de la instalación de tuberías

El equipo de la preparación de las tuberías fue montado en una cabina de flujo de aire laminar, y limpiado con I.M.S. 70% y secado al aire en la cabina. La tubería de la vía del gas desde el cilindro de nitrógeno al equipo de la tubería de preparación fue autoclavada y un filtro Gelman en línea de 0,2 \mum unido. La tubería autoclavada se conectó a la entrada de gas en el equipo de preparación mediante un conector con llave de paso, y se dejó fluir el gas a su través a 0,2 litros/minuto para secar la tubería completamente.

La tubería de reparto de partículas se unió al equipo de preparación y se dejó fluir el gas a su través como antes para secar completamente el interior de la tubería. Cualquier humedad residual en la tubería tendrá como resultado una unión escasa o desigual de las partículas de oro a las paredes de la tubería y puede afectar adversamente al resultado de cualquier experimento.

b) Preparación de bolitas microvehículo de ADN- oro

Las bolitas de oro de 1,0 \mum fueron obtenidas de Bio-Rad UK. Una alícuota de bolitas de oro (53 mg) fue pesada en un tubo de microfuga, y se añadieron 100 \mul de espermidina 0,05 M y el tubo se agitó suavemente.

Se añadieron 100 \mul de una disolución de ADN que contenía 100-120 \mug de ADN plasmídico que expresa bien Egr-1 o bien \beta-galactosidasa seguido de 100 \mul de CaCl_{2} 1 M añadido por goteo mientras se agitaba. Esta mezcla se dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugó. El sobrenadante fue eliminado y el precipitado de oro se lavó tres veces en EtOH absoluto.

Las partículas de oro fueron finalmente resuspendidas en etanol absoluto que contenía 0,1 mg/ml de polivinilpirrolidona (PVP).

La estimación de la eficacia de recubrimiento del ADN a los microvehículos de oro, y la liberación en disolución acuosa: todas las muestras (material de partida, sobrenadante postprecipitación, seguido de la formación de un complejo ADN/oro, y el material eluido) fueron ensayados en lo que respecta a ADN en un "GeneQuant" (Pharmacia). El ADN residual postprecipitación dió una medida del material sin unir, y la relación de material unido: material de partida se consideró que era la eficacia de recubrimiento.

c) Cargar la suspensión de ADN/microvehículo en la tubería de reparto de oro

La suspensión de partículas de oro en etanol/PVP fue luego cargada en la tubería de reparto usando una jeringa, y la suspensión se dejó reposar durante 3-5 minutos en la tubería. Durante este tiempo, las partículas precipitaron en la cara interna de la tubería dejando que el etanol fuera eliminado mediante la jeringa. Cuando el etanol había sido eliminado, la tubería fue rotada para distribuir equitativamente las partículas de oro sobre la cara interna de la tubería. Después de 2-3 minutos de rotación, el gas nitrógeno se pasó a través de la tubería a una velocidad de 0,1 litros/minuto para eliminar el etanol residual y dejar que las partículas de oro se adhirieran. Después de 10 minutos, la tubería se retiró, se cortó en longitudes apropiadas usando la cuchilla proporcionada (Bio-Rad UK), y la tubería cortada fue cargada en la pistola génica.

La expresión y actividad de Egr-1 fue determinada usando inmunohistoquímica estándar con preparaciones de anticuerpos disponibles comercialmente para la detección de Egr-1 (Santa Cruz), y los productos génicos diana del Egr-1 (Santa Cruz o R&D systems) y la expresión fue monitorizada desde 1-7 días. El testigo negativo fue sin ADN.

Ejemplo 1 Reparto de ADN de Egr-1 a piel de roedores sin herir 1.1 Métodos

Un plásmido de expresión que comprende el cADN de Egr-1 impulsado desde el promotor de citomegalovirus
humano (hCMV; Houston y otros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19; 281-289, 1999) fue repartido sobre las espaldas de ratones sin herir vía reparto de partículas mediado por pistola génica Los complejos oro/ADN fueron preparados como se describe anteriormente y 0,5-1,0 \mug de ADN fueron repartidos por animal usando una presión de pistola génica de 2,41 KPa (350 psi) y un tamaño de partículas de oro de 1,6 micras. Los animales fueron sacrificados a día 0, 1, 2 y 6 días después del reparto de ADN y la piel fue embebida en OCT y congelada al instante en hielo seco/hexano. Las secciones fueron preparadas a 0,7 \mum y los factores de crecimiento diana de Egr-1 fueron examinados mediante inmunotinción usando anticuerpos dirigidos frente a VEGF, PDGF A, TGF\beta y Egr-1.

1.2 Resultados

Los datos inmunohistoquímicos se muestran para la activación de Egr-1 de VEGF (Figuras 1a. y 1b.), TGF\beta (Figuras 1c. y 1d.), PDGF A (Figuras 1e. y 1f.). Los resultados muestran el dramático aumento de la proteína VEGF a días 1 y 2, disminuyendo a día 6, el aumento de TGF\beta a día 6 pero no a los días 1 y 2, y un rápido aumento del PDGF A a 2 horas después del reparto del ADN de Egr-1 (designado día 0).

1.3 Conclusión

Estos datos confirman que el Egr-1 puede activar la expresión de los factores de crecimiento diana in vivo, algunos de los cuales están descritos aquí. Estos datos ilustran que la activación del Egr-1 de los factores de crecimiento tiene lugar a lo largo de una escala de tiempo separada temporalmente.

Habiendo confirmado la activación de los genes diana de Egr-1 usando piel de roedores sin herir (Ejemplo 1), el reparto por pistola génica de Egr-1 y \beta-galactosidasa de heridas excisionales de rata fueron realizadas para evaluar el efecto del Egr-1 en la velocidad de cicatrización.

Ejemplo 2 Uso del factor de transcripción Egr-1 para promover la cicatrización de heridas en roedores 2.1 Métodos 2.1.1 construcciones plasmídicas

Los plásmidos de expresión usados en este estudio fueron la \beta-galactosidasa impulsada por CMV y el Egr-1 impulsado por CMV (Houston y otros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 19; 281-289, 1999). Los plásmidos fueron propagados en Escherichia coli XL-2 Blue MR y el ADN fue preparado usando kits para maxipreps de Quiagen.

2.1.2 Transferencia génica mediada por partículas

Dieciocho ratas macho Sprague Dawley que pesaron 250 g fueron anestesiadas en isoflorano en una mezcla 2:1 de oxígeno/óxido nitroso. Dos sitios de transfección (8 cm desde el cráneo, 1,5 cm a cada lado de la columna vertebral) sobre el dorso de la rata fueron preparados recortando primero el pellejo, luego afeitando con una cuchilla de afeitar. Dos transfecciones fueron llevadas a cabo por sitio de herida, 8 mm aparte, acelerando los complejos plásmido/oro de bien el Egr-1 o bien la \beta-galactosidasa en la piel a 2,41 KPa (350 psi). La cantidad total de ADN no fue menos que 1,7 \mug por transfección (igualando 3,4 \mug por herida).

2.1.3 Modelo de cicatrización de heridas excisionales

Veinticuatro horas postransfección los animales fueron anestesiados y 2 heridas excisionales de grosor completo fueron hechas (8 mm de diámetro) usando una cuchilla de biopsias en los sitios exactos de la transfección (véase a continuación). Inmediatamente después de la herida cada herida fue capturada usando un sistema de cámara/vídeo y se dejó que los animales se recuperaran después de la anestesia. A días 2, 4 y 6 después de la herida 6 animales fueron muertos y cada herida capturada de nuevo usando el mismo sistema de cámara/vídeo. Después de la captura, las heridas fueron diseccionadas y recogidas para histología e inmunohistoquímica de rutina.

2.1.4 Análisis de cicatrización i) Valoración macroscópica

El área herida fue determinada usando un análisis de imagen y la cicatrización expresada como un aumento en el porcentaje del área herida original. Las significancias estadísticas de las diferencias entre los grupos tratados y testigo fueron evaluadas usando un ensayo Mann-Whitney a la par.

ii) Valoración microscópica Análisis histológico

Cada herida por punto de tiempo después de la disección fue biseccionada horizontalmente. Una mitad fue colocada en 4% de paraformaldehído durante 24 horas y procesada para histología en cera. Las secciones de 5 \mum de cada herida fueron cortadas usando un microtomo y las secciones teñidas con van Geison. Usando esta tinción histológica, marcadores clave de cicatrización de heridas fueron valorados incluyendo la reepitelización y contenido en colágeno y se hicieron comparaciones entre las secciones tratadas y las testigo.

Inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica y el análisis de imagen fueron realizadas para cuantificar las diferencias observadas usando histología rutinaria. Una vez congeladas en OCT, la segunda mitad de cada herida fue seccionada a 7 \mum usando un criostato. Dos secciones de cada herida fueron fijadas en acetona enfriada en hielo y una inmunotinción fluorescente fue realizada con anticuerpos primarios frente a colágeno I y factor von Willebrand (vWF). Inmediatamente después de la inmunotinción cada portaobjetos fue colocado bajo el microscopio de fluorescencia y el área herida capturada usando un aumento de 25 x. La imagen fue integrada y un umbral establecido para minimizar el fondo. El área y la intensidad de tinción fueron medidas usando análisis de imagen y representadas como una gráfica. Diferencias estadísticamente significativas entre los grupos tratados y testigo fueron evaluadas usando un ensayo no paramétrico Mann-Whitney.

2.2 Resultados 2.2.1 Efecto de Egr-1 en la cicatrización de heridas excisionales (i) Contracción de la herida

El grosor completo de heridas excisionales dérmicas de 8 mm de diámetro en rata se contrajeron ligeramente más rápido en respuesta a la transfección de Egr-1 comparado con el testigo (\beta-galactosidasa) hasta 6 días después de la herida. Aumentos en la contracción estadísticamente significativos (p<0,05) tuvieron lugar a día 6 después de la herida en los casos en que las heridas tratadas con Egr-1 se contrajeron hasta un área 7% más pequeñas que el testigo (Figuras 2a).

(ii) Análisis histológico

Las secciones de heridas teñidas con van Gieson mostraron diferencias marcadas en la histología de heridas a los 4 y 6 días después de la herida. A los 2 días después de la herida hubo una pequeña diferencia entre las heridas transfectadas con Egr-1 y con \beta-galactosidasa. Ambos tratamientos mostraron células mononucleares en el sitio de la herida indicando la respuesta inflamatoria temprana, con una formación temprana de costra, pero no una reepitelización. A los 4 días después de la herida la reepitelización aún no había comenzado, sin embargo las heridas transfectadas con Egr-1 tenían mas colágeno dentro del sitio de la herida comparado con la \beta-galactosidasa. A los 6 días después de la herida las heridas tratadas con Egr-1 tenían una granulación tisular más madura mostrando marcadamente más colágeno dentro del sitio de herida comparado con la \beta-galactosidasa, hasta una extensión en la que gruesas fibras de colágeno claras se podían observar. La reepitelización fue completa en un 50% de las heridas tratadas con Egr-1 comparado con 0% en \beta-galactosidasa. Histológicamente, las heridas tratadas con Egr-1 mostraron una cicatrización acelerada comparada con la \beta-galactosidasa (Figura 2b.).

(iii) Cuantificación del efecto del Egr-1 en deposición de colágeno usando inmunohistoquímica y análisis de imagen

La inmunotinción del colágeno I fue realizada en criosecciones de 7 \mum de heridas tratadas con Egr-1 o \beta-galactosidasa y la tinción cuantificada usando análisis de imagen. Las heridas tratadas con \beta-galactosidasa tuvieron significativamente más colágeno a los 2 días después de la herida comparado con Egr-1. A los 4 y 6 días después de la herida las heridas transfectadas con Egr-1 tuvieron más deposición de colágeno que el testigo (\beta-galactosidasa) que confirma los hallazgos vistos usando histología en cera rutinaria. La transfección de Egr-1 aumentó la cantidad de deposición de colágeno a días 4 y 6 después de la herida (Figuras 2c.).

(iv) Cuantificación del efecto de Egr-1 en la angiogénesis usando inmunohistoquímica y análisis de imagen

La angiogénesis fue cuantificada usando una inmunotinción con factor von Willebrand sobre criosecciones de la herida y un análisis de imagen para medir el área de tinción positiva dentro del sito de la herida. A los 2 días después de la herida las heridas transfectadas con Egr-1 tuvieron significativamente (p<0,01) más vasos sanguíneos nuevos comparados con el testigo (\beta-galactosidasa). A los días 4 y 6 después de la herida ambas heridas transfectadas con Egr-1 y \beta-galactosidasa tuvieron niveles similares de angiogénesis. La transfección de ADN que expresa Egr-1 promovió la angiogénesis dos días antes que el testigo (Figura 2d.)

2.3 Conclusiones

La transfección de heridas excisionales en rata aceleró la cicatrización aumentando la velocidad de contracción, reepitelización y deposición de colágeno. La transfección de Egr-1 también promovió la angiogénesis a los 2 días después de la herida.

Ejemplo 3 Uso del factor de transcripción Egr-1 para promover la angiogénesis 3.1 Métodos

El Egr-1 bajo el control del promotor hCMV (Houston y otros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19; 281-289, 1999) fue transfectado en un sistema de cocultivo celular humano diseñado para mediar la angiogénesis in vitro. El kit de angiogénesis (TCS Biologicals) fue usado como se describe de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando la proteína VEGF (2 ng/ml) y la suramina (20 \muM) como testigos positivos y negativos respectivamente para angiogénesis.

La optimización de la transfección en el sistema de cocultivo fue realizada usando la luciferasa testigo pGL3 (Promega) con 1,0 \mug y 0,5 \mug de CMV-\beta gal como un plásmido normalizador para la transfección testigo. Dos relaciones de lípido:ADN (v/p) fueron usadas; 2:1 y 4:1 (Figura 3a.). El ADN de CMV Egr-1 fue transfectado a 0,5, 1,0, 1,5 y 2,5 \mug por pocillo en triplicados en una placa de microvaloración de 24 pocillos usando el reactivo Mirus Transit (Cambridge Biosciencies) a una relación de 2:1 v/p de ADN. El testigo positivo de proteína VEGF y el testigo negativo de suramina fueron añadidos a los pocillos por triplicado. Después de 11 días de cocultivo, se determinó la angiogénesis mediante la tinción de células para el marcador celular endotelial PECAM-1 y la visualización usando el sustrato BCIP/NBT.

Las imágenes representativas de formación de túbulos usando todas cuatro dosis de plásmidos de expresión de Egr-1 junto con VEGF (testigo positivo) y suramina (testigo negativo) fueron capturadas y procesadas mediante análisis de imagen usando un analizador de imagen Quantimet 600 y el software associado.

3.2 Resultados

La angiogénesis como se describe mediante la formación de túbulos visibles bajo el microscopio óptico fue detectable después de 11 días de cocultivo. El marcador angiogénico se presenta usando análisis de imagen como se ilustra del pocillo entero y los resultados son presentados como túbulos por unidad de área frente al tratamiento (Figura 3b.).

La formación de túbulos disminuida (células tratadas con suramina) y formación de túbulos aumentada (células tratadas con la proteína VEGF) están presentadas. El Egr-1 se mostró que promueve la formación de túbulos potenciada en una forma dosis dependiente inversa.

3.3 Conclusiones

En el sistema de cocultivo, la expresión del factor de transcripción Egr-1 es angiogénica. Esto apoya y está apoyado por datos del Ejemplo 1, mediante los cuales el Egr-1 se muestra que aumenta la expresión del factor de crecimiento (por ejemplo VEGF) cuando se reparte mediante pistola génica en piel de ratón y datos del Ejemplo 5, en el que la transfección de Egr-1 se muestra que aumenta la cantidad de VEGF producida en células de músculo liso vascular humanas. La respuesta dosis inversa de Egr-1 como un estímulo pro-angiogénico es consistente con resultados obtenidos en el Ejemplo 6 y con la noción de que el Egr-1 puede disminuir su propia producción (Cao, X. y otros, J. Biol. Chem., 268; 16949-16957, 1993; Schwachtgen, J.-L. y otros, J. Clin. Invest., 101, 254-259, 1998).

Ejemplo 4 Uso del factor de transcripción Egr-1 para promover la osteogénesis in vitro 4.1 Carga ósea y determinación de los factores de crecimiento 4.1.1 Métodos

Las células usadas fueron TE85, un línea celular de tipo osteoblástico derivada de osteosarcoma. Capas de células subconfluyentes fueron tripsinizadas y resuspendidas en medio DMEM que contiene suero de ternera fetal (FCS) 10% y antibióticos penicilina-estreptomicina (PS) 1%. La suspensión celular fue sembrada en un sustrado de carga (18 x 18 mm cuadrados de plástico tratado para cultivo tisular). Se dejaron las células durante toda la noche a que se unieran. Una vez unidos los sustratos de carga y las células unidas transferidas a frascos que contenían medio DMEM con FCS 2% y PS 1% durante 24 h más antes de la estimulación de carga.

Había cuatros conjuntos de condiciones para cada punto de tiempo descrito en la Figura 4a.:

[1]. Carga (200 ciclos de 2000 microtorciones a 3232 microtorciones por segundo).

[2]. Testigo (sin carga).

[3]. Testigo positivo (PMA 100 ng/ml durante 1 hr).

[4]. Soluto testigo.

Para la carga celular, las células fueron transferidas asépticamente desde condiciones de cultivo tisular estándar en la cámara de carga. La duración de la carga de las células en la cámara fue de 4 minutos. Después de la carga, las células fueron devueltas a sus condiciones de cultivo anteriores. Las células testigo tratadas fueron tratadas exactamente de la misma manera excepto en que no se aplicó carga a la cámara.

Los resultados fueron analizados mediante dos métodos diferentes. Primero, la presencia del factor de transcripción de Egr-1 fue determinada mediante el análisis por transferencia Western de los precipitados celulares recogidos después de los experimentos de carga (Figura 4b). En segundo lugar, la presencia de los factores de crecimiento secretados fueron determinados mediante ensayo de ELISA de medio de cultivo celular (Figura 4c).

4.1.2 Conclusiones

Estos resultados muestran en condiciones de carga ósea que el factor de transcripción Egr-1 se produce en células de tipo osteoblástico derivado de osteosarcoma humano. La aplicación de carga ósea a células TE85 humanas estimula la producción y la secreción de factores de crecimiento, un ejemplo del cual es PDGF B.

4.2 Transfección de CMV TGF-\beta1 en células MC3T3E1 y ROS seguidas de ensayos de ELISA de TGF-\beta1 humano y VEGF de ratón de sobrenadantes de cultivo celular 4.2.1 Materiales (i) Transfección

Las células de osteoblastos de ratón (MC3T3E1) y células de osteosarcoma de rata (ROS 17/2,8) fueron usadas sembradas en placas de 6 pocillos.

Las células MC3T3E1 fueron cultivadas en medio MEM-\alpha, medio esencial mínimo eagle, modificación alfa (Sigma), suero de ternera fetal 10% (Life Technologies), L-glutamina 1% (Life Technologies), penicilina-estreptomicina 1% (Life Technologies).

Las células ROS fueron cultivadas en medio F12 HAM, F-12 HAM con glutamina (Life Technologies), suero de ternera fetal 10% (Life Technologies), penicilina-estreptomicina 1% (Life Technologies).

Las células fueron transfectadas usando Fugene (Boehringer Mannheim) con un plásmido que expresa CMV TGF-\beta1 como está descrito (Benn, S.I. y otros, J. Clin. Invest., 98; 2894-2902, 1996). La transfección en células fue llevada a cabo como se describe:

1) Una placa de seis pocillos fue preparada con 2 x 10^{5} células por pocillo y fueron dejadas durante toda la noche, hasta el 50-70% de confluencia.

2) El siguiente día se añadieron 94 \mul de medio libre de suero (SFM) y 6 \mul de Fugene a cada uno de los 6 tubos eppendorf y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min.

3) A 6 tubos separados, no se añadió ADN a 2 tubos, mientras que se añadieron 4 \mug de CMV-TGF-\beta1 a los 4 tubos restantes.

4) La mezcla Fugene/SFM de la etapa 2) fue añadida por goteo a los tubos de la etapa 3) Los tubos fueron agitados con golpes suaves varias veces y luego incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente.

5) Las mezclas de transfección Fugene/SFM/ADN fueron añadidas por goteo a sus pocillos respectivos, mientras que se agitaba la placa de 6 pocillos, la placa fue incubada a 37ºC durante 48 horas.

6) Los sobrenadantes de cultivo celular fueron alicuotados y almacenados a -20ºC.

El protocolo anterior fue realizado para ambas células MC3T3E1 y células ROS.

La presencia de TGF-\beta1 y VEGF en el sobrenadante del cultivo celular fue detectado mediante ELISA (R&D Systemas) usando un sistema de detección del color basado en estreptavidina-HRP.

4.2.2 Resultados

La producción y detección de TGF-\beta1 y VEGF después de la transfección de CMV-TGF-\beta1 se muestra en las células ROS (Figura 3) y células MC3T3E1 (Figura 4). Estos datos muestran que un gen diana de Egr-1, en este ejemplo TGF-\beta1 ha activado la producción de VEGF.

4.3 Conclusión

La expresión del Egr-1 y la activación de los genes diana del Egr-1 pueden activar sinérgicamente el VEGF.

Ejemplo 5 Uso del factor de transcripción Egr-1 para promover la osteogénesis in vivo 5.1 Formación ósea ectópica en rata

La implantación subcutánea de posibles compuestos inductores óseos en roedores representa el sistema de ensayo biológico más extensamente estudiado de uso actual (Wozney, J.M., Cell. Mol. Biol., 131-167, 1993). El uso de una matriz vehículo potencia la reproducibilidad y sensibilidad de la respuesta de inducción ósea. En este sistema de ensayo (Reddi, A.H. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69; 1601-1605, 1972; Sampath, T.K., ibid, 78; 7599-7603, 1981) la matriz vehículo se deriva de la porción diafisaria de los huesos largos de rata que han sido molidos en partículas de un tamaño particular, subsiguientemente desmineralizados y su actividad biológica eliminada mediante extracción de guanidinio. El vehículo restante consiste principalmente de colágeno óseo sin capacidad osteoinductora. El compuesto o sustancia que ha de ser analizada se deposita entonces sobre la matriz mediante precipitación con alcohol, diálisis frente a agua o liofilización. Esta combinación de matriz se implanta entonces en los tejidos subcutáneos de la rata durante un número de días (12 días en este experimento). Los implantes son entonces ensayados histológicamente y bioquímicamente en lo que respecta a su capacidad para inducir la formación ósea (Sampath, T.K. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 80; 6591-6595, 1983; Sampath, T.K. y otros, ibid, 84; 7109-7113, 1987; Wang, E. ibid, 85; 9484-9488; Wang, E. y otros, ibid, 87; 2220-2224; Sampath, T.K. y otros, J. Cell. Biol., 98; 2192-2197, 1984).

5.5.1 Métodos experimentales

Veinte ratas macho Sprague Dawley (edad 42-49 días, peso 170-220 g) fueron repartidas aleatoriamente para recibir dos implantes insertados subcutáneamente sobre el torax dorsal bajo anestesia por halotano. Los implantes comprenden uno de cuatro tratamientos:

\bullet

Testigo negativo- vehículo solo (matriz ósea extraída con guanidinio desmineralizada DGBM)

\bullet

ADN de CMV Egr-1; 500 \mug sobre vehículo DGBM

\bullet

ADN de CMV Egr-1; 500 \mug mas proteína morfogénica ósea recombinante (BMP)4; 5 \mug en vehículo DGBM, (siendo usada la BMP4 por sus efectos quimiotácticos)

\bullet

Proteína BMP4 recombinante 5 \mug sobre vehículo DGBM

El día de la inserción fue considerado como el día 0 y a día 12 postoperativamente todas las ratas fueron muertas usando un método aprobado por un programa 1, los implantes fueron retirados, limpiados del tejido blando y divididos en mitades iguales. Una mitad fue colocada en formalina 10% para examen histológico y la otra mitad fue congelada y almacenada a -20 grados centígrados. Este ejemplo fue entonces ensayado en lo que respecta al contenido en calcio y actividad fosfatasa alcalina.

5.1. Preparación de hueso de rata desmineralizado

Los husos diafisarios de los fémures, tibias y húmeros de ratas Sprague Dawley adultas fueron retirados, desnudados de tejido blando y las cavidades medulares irrigadas con salino normal. El hueso fue entonces limpiado de grasa mediante agitación en 100 ml de cloroformo:metanol (2:1) durante 30 min. Esta etapa se repitió una vez antes de secar al aire en un horno de secado. Los husos óseos fueron congelados en nitrógeno líquido y pulverizados en un micromolino CRC. El polvo resultante fue tamizado para dejar un tamaño de partícula discreto de 75-425 \mum y luego desmineralizado en HCl 0,5 durante 3 horas con agitación constante. La mezcla fue entonces centrifugada durante 30 minutos a 19.000 rpm (Kontron Centriks T124, Rotor A8.24) a 15 grados centígrados. El precipitado fue resupendido en 100 ml de agua, agitado durante una hora y centrifugado. Esta etapa fue repetida después. El precipitado fue entonces resuspendido en 100 ml de etanol, agitado durante una hora y centrifugado. El etanol fue evaporado y la muestra resuspendida en hidrocloruro de guanidinio 4M/ Tris 50 mM, pH 7,4 y agitado durante toda la noche. Una centrifugación adicional fue llevada a cabo con el precipitado resuspendido en 50 ml de agua, agitado durante una hora y centrifugado. Esta etapa fue repetida dos veces más. La muestra fue entonces secada durante toda la noche en un horno de secado. El ADN fue añadido al hueso mediante mezcla mecánica y liofilización.

5.2 Examen histológico

Después de una fijación inicial en formalina, las muestras fueron embebidas en metacrilato de metilo y secciones de 1 \mum cortadas y teñidas con von Kossa y azul de toluidina. Tres secciones no adyacentes de cada implante fueron luego evaluadas mediante un especialista histopatólogo que no vio la sustancia de ensayo ni los promedios de evaluación.

Un sistema marcador estándar en lo que respecta a hueso y cartílago fue usado;

+/- tentativa de identificación de hueso o cartílago

1. > 10% de cada sección cartílago nuevo o hueso

2. >25% de cada sección cartílago nuevo o hueso

3. >50% de cada sección cartílago nuevo o hueso

4. >75% de cada sección cartílago nuevo o hueso

5. >80% de cada sección cartílago nuevo o hueso

5.3 Ensayo bioquímico

El tejido fue homogeneizado en 2 ml de sucrosa 0,25 M-NaHCO_{3} 3 mM enfriada en hielo. Los homogenados fueron centrifugados a 12.000 g durante 15 min a 2 grados centígrados y los sobrenadantes recogidos para ensayos enzimáticos. La actividad fosfatasa alcalina fue determinada usando un ensayo colorimétrico con p-nitrofenil fosfatasa (PNP) como el sustrato. Después de la incubación de las muestras de ensayo con PNP a 37 grados centígrados, se determinó la densidad óptica a 405 nm en un lector de placas de microvaloración estándar.

5.4 Resultados

Los resultados se presentan en la Figura 5. Los datos fueron analizados tratando los dos sitios de implantes para cada rata como independientes el uno del otro. Las medianas y los intervalos intercuartiles (IQR) se presentan debido a los números bajos y la distribución sesgada de los datos. Los ensayos de Kruskal Wallis han sido llevados a cabo sobre las variables anteriores y se ha encontrado que los niveles de fosfatasa alcalina difieren significativamente el uno del otro.

La formación ósea fue positiva en lo que respecta a un implante en cinco sitios de implantes en sólo un grupo (ADN de CMV Egr-1/BMP). El experimento inicial usó un único punto de tiempo por ensayo de 12 días, que fue elegido para dar resultados predictivos tempranos. En estos niveles de puntos de tiempo de actividad fosfatasa alcalina son significativamente elevados en grupos de ADN de CMV Egr-1 y ADN de CMV Egr-1/BMP4 sobre los testigos. Tal aumento temporal en actividad fosfatasa alcalina se observa típicamente (como un precursor para la formación ósea) con sustancias tales como BMP que estimulan el aumento en la formación ósea hasta un pico a 10-15 días y la caída después. Esto representa el aumento observado en la fase más temprana de la osificación econdrial. El contenido en calcio no muestra diferencias significativas en las muestras ensayadas hasta ahora aunque se ha observado una calcificación temprana en un número de muestras histológicas en el grupo CMV-Egr-1/BMP4. Esto puede explicarse debido a la escala de tiempo de la biopsia en la que la calcificación está sólo empezando.

5.5 Conclusión

El Egr-1 aumenta los niveles de fosfatasa alcalina en un modelo de roedor de formación ósea ectópica y puede promover la formación ósea localizada.

Ejemplo 6 Uso del factor de transcripción Egr-1 para promover la reendotelización después de una angioplastia coronaria transluminal percutánea in vitro 6.1 Métodos

Las células de músculo liso vascular humano o porcino (SMC; Clonetics) fueron descongeladas, mantenidas en medio y pasadas hasta no más del pase 4 según las instrucciones del fabricante. Las SMC fueron transfectadas con un plásmido de expresión que comprende el cADN de Egr-1 expresado del promotor CMV Houston y otros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19; 218-289, 1999). El ADN que expresa Egr-1 fue transfectado en SMC usando Fugene (Boehringer Mannheim) después de optimización de SMC con el vector reportero luciferasa pGL3 testigo (Promega) o Mirus Transit (Cambridge Biosciences) ambos protocolos de transfección usaron \beta-galactosidasa como un plásmido normalizador para la transfección testigo.

6.2 Resultados

El ADN del CMV Egr-1 fue transfectado en SMC humano y la proteína Egr-1 fue detectada mediante inmunohistoquímica usando un anticuerpo policlonal (Santa Cruz) y detección de peroxidasa (Sigma y Vector Laboratories). Las SMC humanas transfectadas con ADN de CMV-Egr-1 (panel derecho) o transfectadas con testigo falso (panel izquierdo) se muestran en la Figura 6a., y las SMC porcinas transfectadas con ADN de CMV Egr-1 (panel derecho) o transfectadas con testigo falso (panel izquierdo) se muestran en la Figura 6b. La expresión de la proteína Egr-1 se detecta como una tinción marrón. La optimización de la transfección de ADN fue lograda usando Fugene 6 (para una caracterización adicional in vitro, Figura 6c.) y Mirus Transit (para estudios in vivo subsiguientes, Figura 6d). A partir de estos datos, 4 \mug de ADN de CMV-Egr-1 fueron usados rutinariamente para experimentos de activación del factor de crecimiento usando una relación lípido:ADN de 3:1. Una relación lípido:ADN de 3:1 fue usada también para experimentos de reparto génico in vivo.

La activación de Egr-1 de tres factores de crecimiento fue analizada mediante un ensayo ELISA de sobrenadantes celulares. La producción de VEGF (Figura 6e.), HGF (Figura 6f.) y PDGF-AB (Figura 6g.) fueron todas aumentadas como consecuencia de la activación de Egr-1. Hubo una respuesta a la dosis de activación y una respuesta a la dosis inversa por encima de una cierta concentración de ADN [Egr-1] como se muestra previamente en el Ejemplo 3.

6.3 Conclusión

La proteína Egr-1 se expresa en SMC después de la transfección de un ADN de CMV Egr-1. La transfección de Egr-1 aumenta la producción/secreción de PDGF, HGF y VEGF derivados de SMC.

Ejemplo 7 La secuencia promotora Egr-1

El fragmento promotor de Egr-1 humano que abarca los nt. -674 hata +12 fue sintetizado mediante PCR en una reacción que contiene 0,5 \mug de ADN genómico placental humano como un molde, 0,4 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 25 pmoles del cebador directo (5'-GGC CAC GCG TCG TCG GTT CGC TCT CAC GGT CCC-3', el sitio de restricción Mlu I está subrayado), 25 pmoles del cebador inverso 5'-GCA GCT CGA GGC TGG ATC TCT CGC GAC TCC-3' (el sitio Xho I está subrayado) y la ADN polimerasa Vent (NEB). El fragmento de PCR fue cortado con Mlu I y Xho I, purificado en gel de agarosa y clonado entre los sitios Mlu I y Xho I en el sitio de clonaje múltiple del vector pGL3 básico (Promega).

La secuencia completa se ha derivado ahora dejando que se completen los "huecos" dentro de la secuencia publicada. Esto se muestra en la Figura 7, en la que la secuencia completa como se deriva de los inventores (GW SEQ) se compara con la secuencia previamente publicada (ON SEQ). Esta secuencia promotora es funcional y ha sido investigada en estudios de estrés por corte en células endoteliales.

Una diferencia importante entre la secuencia publicada del promotor Egr-1 humano y la secuencia que se describe aquí (Figura 8), se encuentra en dos SREs no reconocidos previamente. Mientras que la secuencia de SRE5 y la SRE1 como está publicado no unen el factor de respuesta a suero (SRF) y no son funcionales (Nurrish SJ, Treisman R, Mol Cell Biol 1995, 15 (8): 4076-85), los autores han encontrado que están de acuerdo con la secuencia consenso SRE (Figura 7).

Los autores se han concentrado en SRE5. El SRE5 nuevo con sus sitios de unión del factor de transcripción Ets asociados fue sintetizado como un oligonucleótido de doble hebra e insertado en el sitio Nhe I aguas arriba de un vector de promotor mínimo de SV40 (pSV40).

La SRE5 tiene la secuencia:

AG

GCTGCGACCCGGAAATGCCATATAAGAAGCAGGAAGGATCCCCCCGCCG

G

CGACGCTGGGCCTTTAGGTATATTCTTCGTCCTTCCTAGGGGGGCGGCC

GA

Los 2 sitios ETS están en negrita, los SRE están subrayados. El AG protuberante se usa para clonar en el sitio Nhe parcialmente relleno del promotor pGLE.

El plásmido reportero resultante pSVSRE5 fue transfectado transientemente en células HeLa junto con plásmidos pFA-dbd (construcción que codifica para el dominio de unión a ADN Gal 4 (dbd)) o pFA-MEK1 (construcción que codifica para una proteína de fusión del dominio de unión a ADN Gal4 (dbd) y para el dominio quinasa de la MAP quinasa quinasa MEK1). La proteína de fusión Gal4-MEK está constitutivamente activa y fosforila Elk1 y SRF, unida a SRE5.

Los resultados mostrados en la Figura 10 muestran que la secuencia SRE5 aislada se activa en 3-veces por la presencia de MEK1, mientras que el promotor SV40 muestra sólo la activación mínima.

Los resultados indican que el SRE5 nuevo es funcional.

Claims (16)

1. El uso de una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas en un mamífero, incluyendo el ser humano.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el Egr-1 es el Egr-1 humano.

3. El uso según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la molécula de ácidos nucleicos que comprende dicha secuencia que codifica para un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo está unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que controla la expresión.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que controla la expresión:

a) tiene una hebra que comprende la secuencia proporcionada en la Figura 7 para GW SEQ; o

b) tiene una hebra que comprende una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones relativas a la GW SEQ, pero que no comprende la secuencia mostrada en la Figura 7 como ON SEQ y que tampoco comprende la secuencia mostrada en la Figura 9.

5. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula de ácidos nucleicos se dispone para administración a mamíferos mediante métodos físicos.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que la molécula de ácidos nucleicos se dispone para administración al mamífero mediante bombardeo de partículas.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que la molécula de ácidos nucleidos es inmovilizada sobre partículas de oro.

8. El uso según la reivindicación 5, en el que la molécula de ácidos nucleicos se dispone para administración mediante microsiembra.

9. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula de ácidos nucleicos está en un vector.

10. El uso según en la reivindicación 9, en el que la molécula de ácidos nucleicos está en una célula.

11. El uso de un polipéptido factor de transcripción Egr-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas en un mamífero, incluyendo el ser humano.

12. El uso según la reivindicación 11, en el que el Egr-1 o el fragmento biológicamente activo del mismo es producido de modo natural, sintético o recombinante.

13. El uso según la reivindicación 11 o reivindicación 12, en el que el Egr-1 es el Egr-1 humano.

14. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el tratamiento de heridas es el tratamiento de las úlceras de extremidades en diabetes y de la enfermedad oclusiva arterial periférica, cicatrización postoperatoria, quemaduras y soriasis.

15. El uso según la reivindicación 1, en el que el tratamiento de heridas implica la promoción de la angiogénesis.

16. El uso según la reivindicación 1, en el que el tratamiento de las heridas implica la promoción de la osteogénesis.