FR2924128A1 - Modulateurs de egr1 dans le traitement de l'alopecie - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du facteur de transcription Early Growth Response 1 (EGR1), ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce facteur de transcription pour le traitement de l'alopécie.L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Description

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du facteur de transcription Early Growth Response 1 (EGR1), pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col., 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagène pour les étapes IV à v et anagène tardive pour les étapes VI et VII. La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller-Rover et col., 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974).

Chez la souris et les autres mammiferes à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent synchronisés , c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région anatomique (Muller-Rover et col., 2001).

La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie. II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont : • l'alopécie androgénétique héréditaire est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ; • l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une irradiation aiguë ; • l'alopécie Areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps.

Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n' étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène.

On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux.

La demanderesse a maintenant trouvé que le gène codant pour Early Growth Response 1 était exprimé spécifiquement dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie. Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata.

EGR1 Le gène Early Growth Response 1 (ou "EGR1") code pour une protéine à doigt de zinc de type C2H2 membre de la famille EGR. Dans le contexte de l'invention, le terme gène EGR1 ou acide nucléique EGR1 signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la protéine EGR1. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant le facteur de transcription Early Growth Response 1, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour le facteur de transcription. La séquence nucléique humaine (SEQ ID No.1) et la séquence protéique humaine (SEQ ID No.2) du facteur de transcription EGR1 sont reproduites en annexe. 3 2924128

Il s'agit d'une protéine nucléaire qui fonctionne comme un facteur de transcription en modulant des gènes impliqués dans la différenciation et la mitogenèse. EGR1 est connu pour être exprimé et jouer un rôle important au cours de la morphogénèse de la dent (Karavanova, 1992). Un nombre importants de gènes et voies de signalisation, présents au cours de la morphogenèse des 5 dents, sont impliqués dans le cycle pilaire et en particulier au moment de l'entrée en anagène. Par exemple, la voie BMP contrôle la mise en place du développement des dents et l'entrée en phase de croissance du follicule pileux adulte (Botchkarev et Sharov, 2004). L'expression spécifique du facteur de transcription EGR1 dans les kératinocytes du poil et son induction au cours de l'entrée en anagène suggère qu'il joue un rôle important dans l'homéostasie du 10 follicule pileux. Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1 (EGR1), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au 15 moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine EGR1 par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm 20 correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription EGR1 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain . Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). 25 Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine EGR1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du facteur de transcription EGR1, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce 30 traitement.

Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1 (EGR1), de l'expression de son gène 35 ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine EGR1, par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm 4 2924128

correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription EGR1 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de 5 référence saine . La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie.

Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence 10 l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie.

Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour 15 le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du facteur de transcription Early Growth Response 1 (EGR1) ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler 20 l'expression ou l'activité du facteur de transcription EGR1, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant les étapes 25 suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; 30 c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine EGR1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine EGR1, de l'expression de son gène ou de l'activité 35 d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par modulation , on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité du facteur de transcription EGR1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses 5 2924128

promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine EGR1, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses 5 promoteurs. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine ; Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la 10 transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de 15 composés. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du facteur de transcription EGR1.

20 Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène EGR1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol 25 acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.

30 Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le facteur de transcription EGR1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène EGR1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou 35 encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fibroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses. 6 2924128

Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le facteur de transcription EGR1, de préférence humaine ou de mammifere. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière 5 stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.

Dans ces méthodes, l'expression du gène EGR1 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. 10 Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT- 15 PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les 20 ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en 25 milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie 30 ou chimioluminescence.

Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûEarly 35 growth response 1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. 7 2924128

On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à 5 la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des 10 microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées 15 ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous 20 forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées 25 grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).

Le facteur de transcription EGR1 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par 30 exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.

Modulateurs du facteur de transcription L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du facteur de transcription EGR1 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation 35 d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du facteur de transcription EGR1, à un patient nécessitant un tel traitement. 8 2924128

De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du facteur de transcription EGR1.

L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du facteur de transcription EGR1, 5 tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.

Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être 10 administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une 15 libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de 20 gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente 25 sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.

La composition peut comprendre une teneur en modulateur du facteur de transcription Early Growth Response 1 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. 30 La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; 35 - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; 9 2924128 - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B ; - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures :

10 La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région du dos des souris a été effectué aux jours 0, 6 et 8 de l'étude. La Figure lA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure 1B 15 est la photographie d'une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 7 de l'étude. La Figure 1C représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure 1D représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que l'ovariectomie a induit le passage en anagène 20 (Figure 1C).

La Figure 2 est un tableau 1 qui présente la modulation du niveau d'expression du facteur de transcription EGR1, exprimée par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris 25 contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés 30 et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix.

La Figure 3 est un histogramme représentant la modulation du facteur de transcription EGR1, dans la peau de la région dorsale de souris femelles exprimée par rapport au jour 0 de l'étude, au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie. Des souris femelles, dont les 35 follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariectomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0, 1, 2, 4, 6 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technique des puces Affymetrix. L'analyse de 5 Io 2924128

l'expression génique montre clairement que le gène EGR1 est induit chez les animaux entrant en anagène.

5 La Figure 4 montre l'expression, par hybridation in situ, du facteur de transcription EGR1 dans les follicules pileux en début d' anagène de la peau de la région dorsale de souris. La Figure 4A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau d'une souris, dont les follicules pileux de la région dorsale sont en anagène précoce, soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens du facteur de transcription EGR1 (contrôle négatif). La Figure 4B est la 10 photographie de la même coupe histologique contre-colorée à l'hématoxyline. Cette photographie (4B) sert à se repérer sur l'image en fond noir (4A). La Figure 4C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau d'une souris, dont les follicules pileux de la région dorsale sont en anagène précoce, soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du facteur de transcription EGR1, les structures 15 histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 4D est la photographie de la même coupe histologique contre-colorée à l'hématoxyline. Cette photographie (4D) sert à se repérer sur l'image en fond noir (4C). Les zones de marquage sont signalées par des flèches.

20 La Figure 5 montre l'expression, par hybridation in situ, du facteur de transcription EGR1 dans les follicules pileux en anagène tardive de la peau de la région dorsale de souris. La Figure 5A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau d'une souris, dont les follicules pileux de la région dorsale sont en anagène tardive, soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens du facteur de transcription EGR1 (contrôle négatif). 25 La Figure 5B est la photographie de la même coupe histologique contre-colorée à l'hématoxyline. Cette photographie (5B) sert à se repérer sur l'image en fond noir (5A). La Figure 5C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau d'une souris, dont les follicules pileux de la région dorsale sont en anagène tardive, soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du facteur de transcription EGR1, les structures 30 histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 5D est la photographie de la même coupe histologique contre-colorée à l'hématoxyline. Cette photographie (5D) sert à se repérer sur l'image en fond noir (5C). Les zones de marquage sont signalées par des flèches. L'analyse par hybridation in situ montre clairement que les transcrits sont exprimés de façon spécifique dans 35 les follicules pileux en anagène.

Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES 11 2924128

Exemple 1: Expression de EGR1 au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix.

Méthodes : 5 Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène (Chase, 1954) ont été ovariectomisées ou non au jour 1 de l'étude. L'ovariectomie pratiquée pendant la phase télogène provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène (Chanda, 2000.) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en télogène. 10 Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale au jour 0, 1, 2, 4, 6 et 8 de l'étude. Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du transcriptome par la technologie des puces Affymetrix. L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique; four 15 à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. A partir d'ADNc double brin, les ARNc marqués à la biotine sont synthétisés en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système Lab on a chip 20 d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la 25 valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation,( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide.

30 Résultats: Figure 1 : En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (1A). Chez les souris soumises à une ovariectomie, les follicules pileux restent en phase télogène jusqu'au jour 6 de l'étude (1B). Au 35 jour 8 de l'étude, les follicules pileux de la région dorsale de peau de toutes les souris soumises à l'ovariectomie sont en début de phase anagène (1C). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôle (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l'ovariectomie à induit la transition de la phase télogène à la phase anagène. La phase anagène a été initiée après le jour 6 de l'étude et est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude. 12 2924128

Figure 2 Le facteur de transcription EGR1 est exprimé en phase télogène et en phase anagène du cycle pilaire. L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (J0) et anagène (J8 5 ovariectomisé) montre que l'expression est plus forte (facteur 1.4) en anagène précoce par rapport au stade télogène. Chez les souris contrôles, l'expression du facteur de transcription EGR1 n'est pas induite mais réduite par rapport au début d'étude.

Figure 3 10 La cinétique d'expression du facteur de transcription EGR1 au cours de l'entrée phase anagène suite à l'ovariectomie indique que dans les premiers jours suivant l'ovariectomie l'expression du facteur EGR1 est réduite. De façon surprenante, lorsque la peau de la région du dos des souris ovariectomisés présente les premiers signes morphologiques de l'entrée en anagène (au jour 8 de l'étude), l'expression de facteur EGR1 est fortement induite par rapport aux jours 15 précédents. Cette induction est bien corrélée à l'entrée en phase anagène, puisque chez les animaux contrôles dont les follicules pileux de la région dorsale sont restés en télogène, l'expression du gène EGR1 n'est pas induite.

Exemple 2 : Expression de EGR1 dans les follicules pileux de peau de la région dorsale de 20 souris par hybridation in situ

Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription EGR1 par incubation du gène linéarisé (21.tg) avec 63 Ci de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, 25 Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (41.tm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon 30 d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/ l 35S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures 35 histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif. 13 2924128 RESULTATS:

Figure 4 Les images (A à c) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en tout début 5 d'anagène. Au niveau de la Figure 4A, il n'y a pas d'accumulation de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 4C montre que le facteur de transcription EGR1 est exprimé en début d'anagène et de façon spécifique dans la partie épithéliale des follicules pileux. Plus particulièrement, la colonne de kératinocytes qui se forme en anagène II juste au dessus de la 10 papille dermique est très fortement marquée (flèche pleine) et la gaine épithéliale interne qui apparait au stade anagène III est marquée (flèche hachurée).

Figure 5 Les images (A à c) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en milieu 15 d'anagène. On observe sur la Figure 5A qu'il n'y a pas d'accumulation de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 5C montre que le facteur de transcription EGR1 est exprimé en milieu d' anagène et de façon spécifique dans la partie épithéliale des follicules pileux. De façon plus précise, les gaines épithéliales interne et externe du follicule pileux en milieu d'anagène 20 tardive (IV-V) sont fortement marquées.

Conclusion L'exemple 1 indique qu'EGRl est exprimé dans la peau et, de façon surprenante, est induit au cours de la transition entre la phase télogène et la phase anagène. L'exemple 2 confirme 25 l'expression d'EGR1 dans la peau dont les follicules pileux en anagène précoce et milieu d' anagène. Egalement, il indique que le gène EGR1 est de façon surprenante spécifiquement exprimé dans les kératinocytes des follicules pileux en anagène. L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression du facteur EGR1 chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux 30 en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation de EGR1 pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de Early Growth Response 1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.

3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la protéine Early Growth Response 1, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour le facteur de transcription Early Growth Response 1, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.

5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le facteur de transcription Early Growth Response 1, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.

6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme.

7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle Ies cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour le facteur de transcription Early Growth Response 1.

8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 97Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.9. 10. Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1, ou de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. 11. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un immunoessai. 12. Méthode selon la revendication Il, dans laquelle l'immunoessai est un dosage ELISA. 13. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant. 14. Méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Early Growth Response 1, de l'expression de son gène ou de I'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.